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Véronique PAQUIS-FLUCKLINGER

IRCAN, UMR 7284 / INSERM U1081 / UNS Service de Génétique Médicale, CHU de Nice

Centre de Référence des Pathologies Mitochondriales

“Diagnostic génétique des suspicions de maladies mitochondriales: exome first?”

SFEIM, Paris, 18 Novembre 2019

Centre de Référence

Maladies Mitochondriales

Maladies mitochondriales (MM) : rappels (I)

Le diagnostic positif repose

sur le diagnostic génétique

Tous les modes de transmission possibles

(Ar, AD, lié à l’X, cytoplasmique, de novo)

CII

CIII CIV CV

CI CIII CV

CII CIV

ADP + Pi ATP

L’ADNmt code pour 13 protéines sur la centaine

impliquées dans la composition et la biogénèse de la CR

Plus de 400 gènes nucléaires responsables de MM (sans « master genes »)

Un protéome mitochondrial contrôlé par 1500 gènes

Hétérogénéité génétique +++

Maladies mitochondriales (MM) : rappels (II)

Pas de corrélation phénotype/génotype Opa1

AOD

AO « plus » Atrophie optique +

atteinte neuromusculaire

myopathie mitochondriale avec

instabilité de l’ADNmt

Hudson et al., 2008, Brain Amati-Bonneau et al . 2008 Brain

Yu-Wai-Man et al, 2010, Brain

m.3243A>G

CPEO MELAS

MIDD

Plus d’un patient sur 2 en impasse diagnostique

Déficits de la CR primaires et secondaires

Expression « tissu spécifique »

Whole exome sequencing (WES)

2-3% du génome, exons et jonctions exons/introns

85% des mutations responsables de maladies monogéniques

Taux de succès pour l’ensemble des maladies mendéliennes 25 à 50%

Premier succès

d’identification d’un

gène responsable de

maladie mitochondriale

en 2010

30 à 50 000 variants par patient

Cohorte Nombre

de cas Population Méthode Rendement

Taylor et al., 2014 53 Enfants/Adultes WES 52.8%

Ohtake et al., 2014 104 Enfants WES 43.3%

Wortmann et al., 2015 109 Enfants WES 38.5%

Kohda et al., 2016 142 Début pédiatrique WES 34.5%

Pronicka et al., 2016 113 Enfants WES 59.3%

Theunissen et al., 2018 117 Enfants/Adultes

77% < 18 ans ADNmt

WES 20%

49%*

* 31% des gènes identifiés

n’étaient pas dans MitoCarta

Cohortes de patients suspects de MM et WES Les succès du WES

Taux de succès entre 35 et 59%

Nettement supérieur à celui du séquençage classique (11%) (Neveling et al., 2013)

Nombreux biais d’interprétation liés

- À l’âge de la population (enfants versus adultes)

- A l’histoire familiale et aux prélèvements disponibles, trios…

- Aux critères de sélection de la population : importance des RCP++

2

80% <18 ans au moment du diagnostic

117 patients (0-50 ans)

Mitochondrial Disease Criteria (MDC)

(Morava et al., 2006)

Groupe 1 MDC>5

Groupe 2 MDC<5

NGS ADNmt : rendement de 20%

(Sur les 23 patients+ : 9 LHON, 2

MELAS et 5 MIDD)

WES : rendement de 49%

Les limites du WES

Taux d’échec entre 41 et 65%

Différentes raisons liées

- aux critères de sélection de la population : importance des RCP++

- aux mutations localisées dans les régions non codantes => WGS

- à la problématique de hiérarchisation des variants et aux VUS (variant

of unknown signification)

Les scénarios possibles (I)

1 2 3

4 5 6

4

- Tableau néonatal de

défaillance multiviscérale

COQ2

c.437G>A (p.Ser146Asn) hmz

Total variants

Rare variants

shared by the 2 patients

NS/SS/I

Fine search (OMIM, Litterature, etc…)

Homozygous variants

II-1: 63842

II-2: 64127

4817

540

1

15

Les scénarios possibles (II)

Sélection des variations Htz

Sélection des variations

potentiellement pathogènes

(NS/SS/I)

308

1

Exclusion des polymorphismes

7058

23430

6 Gènes avec 2 variations chez le cas index

mais pas chez la sœur et la mère

Gènes codant pour des protéines mito

MDH2

c.398C>T (p.Pro133Leu)

c.620C>T (p.Pro207Leu)

Chez le cas index : 38533 variants

- Tableau très sévère dès

les premiers mois de vie

avec hypotonie, RPM, ISP,

épilepsie réfractaire,

rétinite pigmentaire

citrate

2-oxoglutarate

succinate fumarate

malate

oxaloacetate

NAD+

NADH

Lactate Pyruvate LDH

PC

MDH2 : malate déshydrogénase mitochondriale

Reference

Sequence

c.398C>T

(p.Pro133Leu)

c.620C>T

(p.Pro207Leu)

Subject

Father

Mother

Sister

S1 II

I 1 2

1 2

Family 1

c.398C>T

(p.Pro133Leu)

c.596delG

(p.Gly199Alafs*10)

c.398C>T

(p.Pro133Leu)

c.109G>A

(p.Gly37Arg)

S2 II

I 1 2

1

Family 2

S3 II

I 1 2

1

Family 3

Les scénarios possibles (II)

Les scénarios possibles (III)

Total variants

Index case

Rare variants

653

24

NS/SS/I

8 403

70786

67 Homozygous variants

?????

Genes encoding mitochondrial proteins

- Encéphalopathie de début

néonatal très sévère

(Leigh)

- Déficit en CI dans le

muscle et les fibroblastes

3

Centre de Référence

des maladies mitochondriales

CALISSON: Coordonnateur : Nice Constitutif :Marseille Compétence : Lyon, Montpellier, Toulouse

Tableau clinique évocateur

(MELAS, POLG..)

OUI Analyse ciblée

(PCR-RFLP, Sanger…)

NON

Biopsie tissulaire + fibros Prélèvement sanguin, urinaire et/ou

Histologie

Spectroscopie

+/- BN-PAGE

ADNmt: XL +/- SB, qPCR

Clinique, paraclinique (IRM, EMG…)

Suspicion de MM RCP

(hebdomadaires, bimensuelles…)

CALISSON

Négatif

WGS / PFMG2025

RNA-seq

Analyses fonctionnelles

sur gène(s) candidats

NGS ADNmt

Positif

5-15%

Négatif

WES

Positif

40% Négatif

Panel V4 (366 gènes)

Positif

10-20%

RCP

(hebdomadaires, bimensuelles…)

CALISSON

Etude sur fibre musculaire isolée pour l’analyse

des variants de l’ADNmt

COX/SDH

VUS hétéroplasmiques de l ’ADNmt

COX-négatives sur biopsie congelée 0

3000

6000

0

40

80

12

0

16

0

20

0

24

0

28

0

32

0

36

0

40

0

44

0

48

0

52

0

56

0

60

0

Fluorescent PCR-RFLP

mutant wild type

-20

0

20

40

60

80

100

120

cox+ cox-

P <0,0001

Le niveau

d’hétéroplasmie du

variant est quantifié

dans chaque fibre

isolée

Les fibres COX-négatives et

COX-positives sont isolées

par microdissection laser

m.15958A>T

40

50

60

70

80

90

100

cox+ cox-

P 0,0002

m.5703G>A

-20

0

20

40

60

80

100

120

cox+ cox-

P <0,0001

2

0

3

0

4

0

5

0

6

0

7

0

8

0

9

0

10

0

cox+ cox-

m.4935A>G

P 0,1425

10 20 30 40 50 60 70 80 90

100 110

cox+ cox-

m.12293G>A

P <0,0001

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100 110

cox+ cox-

m.9166T>C

P <0,0001

-20

0

20

40

60

80

100

120

cox+ cox-

m.590A>G

P <0,0001

-20

0

20

40

60

80

100

120

cox+ cox-

m.4327T>C

P <0,0001

-20

0

20

40

60

80

100

120

cox+ cox-

m.5672 T>C

P <0,0001

Significantly higher (P < 0.05) heteroplasmic level in COX-deficient fibers

compared with COX-positive fibers for 7 variants

Etude sur fibres isolées

No significant

difference

CALISSON

80 patients suspects de MM*

24 enfants – 56 adultes

NGS ADNmt 1/24 enfants (4.1%)

14/56 adultes (25%)

* Prélèvements tissulaires 63/80

Positif

Négatif

65 patients

Panel 281 gènes

5/23 enfants (21.7%)

3/42 adultes (7.1%)

Positif

125 patients (78 <1 an)

Panel 132 gènes

Positif

19 patients (15.2%)

Pas de réelle plus value à utiliser

des panels plus larges

Quels panels de gènes? Panels versus WES

4

ADNmt négatif

CALISSON

WES sur une série de patients

suspects de maladie mitochondriale

Tableaux cliniques, à début précoce ou tardif, évoquant une maladie

mitochondriale

Déficit de la chaîne respiratoire et/ou une instabilité de l’ADNmt et/ou

des anomalies histologiques (muscle et/ou foie)

53 familles (91 sujets)

Gènes candidats/panel négatifs

10 gènes sur 21 ne codent pas pour des protéines mitochondriales

CALISSON

WES sur une série de patients

suspects de maladie mitochondriale : résultats

3 mutations de novo

3 correspondent à des nouveaux gènes qui n’auraient pas permis de

confirmer le diagnostic sans transfert vers l’équipe de recherche

21 gènes différents (40%)

21 diagnostics positifs sur 53 patients (40%)

Gène(s) identifié(s) / famille Variants retrouvés Hérité ou De

Novo

BCS1L BCS1 Homolog, Ubiquinol-Cytochrome C Reductase Complex

Chaperone

c.185G>C (p.Trp62Ser) Htz Hérité

c.550C>T (p.Arg184Cys) Htz Hérité

CACNA1A Calcium Voltage-Gated Channel Subunit Alpha1 A c.4046G>A (p.Arg1349Gln) Htz De Novo

CHCHD10 Coiled-Coil-Helix-Coiled-Coil-Helix Domain Containing 10 c.176C>T (p.Ser59Leu) Htz Hérité

CHRND Cholinergic Receptor Nicotinic Delta Subunit c.481G>A (p.Asp161Asn) Htz Hérité

c.769T>C (p.Cys257Arg) Htz Hérité

COQ2 Coenzyme Q2, Polyprenyltransferase c.437G>A (p.Ser146Asn) Hmz Hérité

EIF2B4 Eukaryotic Translation Initiation Factor 2B Subunit Delta c.673C>G (p.Pro225Ala) Hmz Hérité

EPCAM et

SLC3A1

Epithelial Cell Adhesion Molecule et Solute Carrier Family 3

Member 1

c.347G>A (p.Cys116Tyr) Hmz Hérité

c.1870A>G (p.Thr624Ala) Hmz Hérité

GARS Glycyl-TRNA Synthetase c.1622C>G (p.Thr541Arg) Htz ?

GJB1 Gap Junction Protein Beta 1 c.688C>T (p.Arg230Cys) Htz Hérité

KIF1A Kinesin Family Member 1A c.935C>T (p.Thr312Ile) De Novo

MDH2 Malate Dehydrogenase 2 c.398C>T (p.Pro133Leu) Htz Hérité

c.620C>T (p.Pro207Leu) Htz Hérité

MTO1 Mitochondrial TRNA Translation Optimization 1 c.1390C>T (p.Arg464Cys) Hmz Hérité

NDUFA10 NADH:Ubiquinone Oxidoreductase Subunit A10 c.415C>T (p.Arg139Cys) Hmz Hérité

OPA1 OPA1, Mitochondrial Dynamin Like GTPase c.1892_1893delAT (p.His631Argfs*3) Htz Hérité

PIGA Phosphatidylinositol Glycan Anchor Biosynthesis Class A c.823C>T(p.Arg275Trp) Hémiz Hérité

PLA2G6 Phospholipase A2 Group VI c.109C>T (p.Arg37*) Htz De Novo

c.1748T>C (p.Met583Thr) Htz Hérité

SERAC1 Serine Active Site Containing 1 c.1822_1828+10delTCAGCAGGTATTCACT

CinsACCAACAGG Hmz Hérité

SLC13A5 Solute Carrier Family 13 Member 5 c.148T>C (p.Cys50Arg) Hmz Hérité

ST3GAL5 ST3 Beta-Galactoside Alpha-2,3-Sialyltransferase 5 c.862C>T (p.Arg288*) Hmz Hérité

ZC4H2 Zinc Finger C4H2-Type Containing c.631C>T (p.Arg211Trp) Hémiz Hérité

Whole genome sequencing (WGS)

Hiérarchisation des variants?

Identification de

mutations dans les

régions codantes et non

codantes, incluant les

variants structuraux

=> Plan France Médecine Génomique 2025

Interprétation Identitovigilance Validation Ségrégation familiale

LABORATOIRE EXPERT

Centres de référence/compétence Prescription encadrée

NGS (ADNmt + panel nucléaire + WES)

Whole Génome

Plateforme AURAGEN PFMG 2025

Négatif

Centre de référence Prescription encadrée

RCP

Professionnels pour les RCP

• Neurologue ou neuropédiatre affilié à un Centre de Référence

• Généticien moléculaire du laboratoire expert

• Généticien clinicien • Anatomopathologiste • +/- Radiologue

Circuit de prescription et rendu des résultats

Spécialistes

Généticien

Positif

CALISSON

Conclusions

Pour le diagnostic en 2020 : WES first!

Place de la biopsie musculaire

Meilleur rendement 40% vs 10 à 20% pour les panels

Pour éviter la mise à jour régulière des panels

Importance des RCP

Attente résultats PFMG 2025 pour WGS first?

CALISSON

Etudes fonctionnelles à développer

5

Service de Génétique Médicale, CHU de Nice

Centre de Référence des Maladies Mitochondriales

Sylvie Bannwarth

Annabelle Chaussenot

Konstantina Fragaki

Samira Saadi

Gaëlle Auge

Christelle Camuso

Bernadette Chafino

Charlotte Cochaud

Sandra Foustoul

Elamine Zereg

Godelieve Morel

Morgane Plutino

Véronique Paquis-Flucklinger

IRCAN, CNRS UMR 7284/INSERM U1081/UNS Faculté de Médecine

CALISSON

Marseille Sharam Attarian

Jean Pouget

Brigitte Chabrol

Aline Cano

René Valéro

Lyon

Nathalie Guffon

Alain Fouilhoux

Cécile Acquaviva

Toulouse

Patrick Calvas

Montpellier

Pierre Labauge

Cécilia Marelli

Agathe Roubertie

Services d’anatomopathologie