Licence pro QSR2A

TOXICOLOGIEMéthodes de détection des contaminants

chimiques dans les alimentsIntroduction1. Les mycotoxines2. Les substances antimicrobiennes3. Les pesticides4. Les composés N-nitrosés5. Les métaux lourds

2. Les substances antimicrobiennes2.1. Définitions• Antibiotique

• Désinfectant

• Antiseptique

2.2. Causes de leur présence dans les aliments

2. Les substances antimicrobiennes2.3. Conséquences sur la santé du consommateur

2.4. Conséquences industrielles

2. Les substances antimicrobiennes2.5. Détection par méthode microbiologique• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :L’échantillon à analyser, est déposé sur une boîte de Petri ensemencée avec un micro-organisme test sensible aux substances à activité antibiotique (avec une concentration de micro-organismes de l’ordre de 104/ml de milieu). La croissance de ce micro-organisme est appréciée dans les conditions optimales de culture du micro-organisme. Si l’échantillon contient des traces d’antibiotiques, il en résulte une croissance ralentie ou inhibée du micro-organisme test autour de l’échantillon. Le résultat est donné par la taille des zones d’inhibition, dépendant de la nature et de la concentration des substances présentes dans l’échantillon.Les échantillons prélevés de façon aussi aseptique que possible sont transportés, de préférence congelés, dans les meilleurs délais au laboratoire. Une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre et de 2 cm de long est prélevée à l’aide d’un emporte-pièce. Huit rondelles de 2 mm sont découpées à partir de cette carotte. Les rondelles d’échantillons sont réparties à la périphérie des boîtes de Petri, à 1 cm au moins du bord de la boîte. Deux rondelles d’un même échantillon sont déposées diamétralement opposées sur chacune des boîtes de Petri ce qui permet d’analyser simultanément trois échantillons.Au centre de chaque boîte de Petri est déposé un disque de papier filtre imprégné de la solution d’antibiotiques de référence correspondant (témoin positif).Les échantillons positifs (c’est-à-dire avec présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon) sont ceux qui donnent une zone d’inhibition au moins égale à 2 mm de largeur.

2. Les substances antimicrobiennes2.5. Détection par méthode microbiologique• Dans les viandes et les produits d’aquaculture :

2. Les substances antimicrobiennes2.5. Détection par méthode microbiologique• Dans le lait : étape de dépistage par méthode d’acidificationLe principe des tests d’acidification est de détecter la présence de traces d’antibiotiques par l’évolution du changement de couleur d’un indicateur de pH, due à la croissance d’un micro-organisme spécifié. Si l’échantillon contient des substances inhibitrices, la croissance du micro-organisme est inhibée ou ralentie et l’indicateur coloré ne vire pas ou plus lentement. Le résultat est apprécié par comparaison avec un échantillon témoin dépourvu d’antibiotique.La bactérie de référence utilisée dans ce test est une souche de Streptococcus thermophilus.Les échantillons sont conservés au voisinage de 0°C jusqu’au lendemain au plus tard ou congelés pour des délais plus longs. Le test se fait en tube de 2 ml de lait qui subit dans un premier tempsun traitement thermique (5 min, 100 °C) afin de réduire les inhibiteurs naturels et le nombre de micro-organismes contenus initialement dans le lait. Ce traitement vise à favoriser par la suite la croissance de la bactérie test. Puis, les échantillons sont ensemencés avec 1 ml de la culture d’épreuve contenant le micro-organisme de référence et l’indicateur de pH (pourpre de bromocrésol). La croissance bactérienne est appréciée, après incubation pendant 2 h 30 à 45 oC, par rapport à un témoin positif contenant de la pénicilline et un témoin négatif.Résultats des témoins : Résultats des essais :(+)

(-)

2. Les substances antimicrobiennes2.5. Détection par méthode microbiologique• Dans le lait : étape de confirmation par méthode de diffusion

Si, sur au moins une des trois boîtes, un échantillon présente une zone d’inhibition de 10 mm minimum, le résultat est positif (c’est-à-dire qu’il y a présence de traces d’antibiotiques dans l’échantillon). Les témoins positifs doivent présenter une zone d’inhibition d’au moins 12 mm.

2. Les substances antimicrobiennes2.5. Détection par méthode microbiologique• Dans le lait : méthode officielle de l’interprofession laitièreLe test Copan se présente sous forme de microplaques à 96 puits contenant un milieu de culture ensemencé avec des spores de B. stearothermophilus, et du pourpre de bromocresol comme indicateur de pH (principe du test d’acidification). On ajoute 0,1 ml de lait à tester dans chaque puit en réservant un puit par plaque pour un témoin négatif et un témoin positif. L’incubation se fait à 64°C, en étuve ou au bain-marie, pendant un temps prédéterminé pour chaque lot de boîtes et correspondant au virage du violet au jaune pour le témoin négatif (2 h 45 environ). Les résultats sont obtenus par lecture automatique. Les avantages de cette méthodologie résident dans une meilleure homogénéité des résultats avec ceux obtenus par d’autres tests, une meilleure reproductibilité de la méthode (inter-jours et inter-laboratoires).Dans tous les cas, pour compenser l’excès de sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques, les tests de confirmation par diffusion en gélose sont conservés.Les techniques de microbiologie sont des méthodes qualitatives qui permettent la détection d’un large spectre de résidus d’antibiotiques dans les aliments. Elles ne permettent pas l’identificationprécise des substances à activité antibiotique ; cependant, selon les micro-organismes tests et les milieux de culture, des résultats positifs orientent vers une famille présumée d’antibiotiques.

2. Les substances antimicrobiennes

2. Les substances antimicrobiennes2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes2.6. Titrage par méthode microbiologique

2. Les substances antimicrobiennes2.7. Autres méthodesIl existe des plans de contrôle spécifiques utilisant des techniques chromatographiques éventuellement couplées à de la spectrométrie de masse (recherche de chloramphénicol par CG/SM et CL/SM-SM, nitrofuranes par CL/SM-SM, sulfamides par CCM et CLHP, quinolones par CCM et CL/SM-SM).Jusqu’à une époque récente, en France comme dans la plupart des autres pays européens, les échantillons positifs avec les tests de dépistage qualitatifs ne faisaient pas systématiquement l’objet d’analyses complémentaires de confirmation (identification et dosage). Mais pour que le contrôle des résidus d’antibiotiques soit en conformité avec les impératifs de la décision 2002/657/CE et du règlement 2377/90 relatif aux LMR, des méthodes spécifiques sont progressivement mises en place. C’est ainsi qu’il est prévu, tant pour la viande que pour le lait, à titre expérimental dans un premier temps, un essai d’identification et quantification des antibiotiques responsables d’un résultat positif avec les méthodes microbiologiques, au moyen d’une méthode basée sur une technique de pointe, la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM-SM), mise au point par le Laboratoire national de référence.Aujourd’hui, les limites de ces différentes approches viennent de ce que les méthodes de dépistage microbiologiques sont très (trop) générales, donnant des résultats positifs avec des substances qui ne sont pas toujours des antibiotiques sensu stricto (les professionnels de la filière laitière parlent « d’inhibiteurs », naturels ou non), alors que les méthodes physico-chimiques (CL/SM-SM), ne reconnaissent que les molécules dont on a mis le spectre de masse en mémoire.