Les molécules bioactives du lait: ingrédients laitiers de demain · BSA Immunoglobulines...

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Les molécules bioactives du lait: ingrédients laitiers de demain

Centre STELA25 ans d’excellence

Vendredi le 11 juin 2010Hotel Palace-Royal,

Yves Pouliot & Sylvie Gauthier Yves Pouliot & Sylvie Gauthier

Centre STELA, Institut des Centre STELA, Institut des NutraceutiquesNutraceutiques et Aliments et Aliments Fonctionnels (INAF), Université Laval, Québec, QC, Fonctionnels (INAF), Université Laval, Québec, QC, Canada G1K 7P4Canada G1K 7P4

Québec, Qc

Matière à réflexion…1. Ce n’est pas parce qu’une chose est

impossible à réaliser aujourd’hui qu’il ne f t t ill faut pas y travailler…

2. Le développement de nouvelles connaissances est un processus long et complexe et risqué…

3. Il y aura toujours quelqu’un ou quelque chose sur votre route pour remettre en doute vos convictions!

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Introduction"I believe that this nation should commit itself to achieving the goal, before this decade is out, of landing a

Tout un pari!!!

man on the moon and returning him safely to the Earth." — Pres. Kennedy, May 25, 1961

débuts timides de la NASA (1er octobre 1958)

échec des vols non-habités (5) vers la lunefond de guerre froide avec l’ex-URSS (course à l’armement nucléaire…)

Introduction

20 juillet 1969

26 juillet 1969

15 septembre 1969

3

IntroductionRetombées insoupçonnées…La NASA…Après plus de 50 ans d’existence… des inventions qui touchent plusieurs aspects de notre quotidien…

HACCPHACCP

Introduction

Le marché du lait de consommation (lait et crème) représente 38,9 % de la production c è e) ep ése te 38,9 % de a p oduct o laitière (29,5 millions d'hectolitres), tandis que le marché du lait de transformation (ex. : beurre, fromage, yogourt et crème glacée) constitue 61,1 % de la production ou 46,2 millions d'hectolitres de laitd hectolitres de lait.

http://www4.agr.gc.ca/

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Introduction

Alors… pourquoi développer des

bioactifs laitiers?bioactifs laitiers?

Introduction

Les attributs santé des constituants du lait sont encore peu exploités

Toute cette quête scientifique permet de former de futurs professionnels pour le secteur laitier

Ceci nous permet de mieux comprendre le lait comme aliment et système complexe

Les conditions actuelles (marchés) ne sont pas favorables mais qui sait? (Qui aurait prédit en 1985 que, 25 ans plus tard, l’industrie laitière serait ce qu’elle est aujourd’hui ?)

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Les molécules bioactives du lait:

… ingrédients laitiers de demain!

Peptides bioactifs

Facteurs de croissance

Constituants de la MFGM

Les peptides bioactifs laitiers Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys

Val

Ala

GlyThrTrpTyrSerLeuAlaMetAlaAlaSerAspIleSerLeu

LeuA

1 10

2030

H2N-5

15

25Gln (D)

Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln LysVal

Ala

GlyThrTrpTyrSerLeuAlaMetAlaAlaSerAspIleSerLeu

LeuA

1 10

2030

H2N-5

15

25Gln (D) ACE

80

Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu Arg Val Tyr Val Glu

40

Glu LeuLys

Pro

ThrProGluGlyAspLeuGluIleLeuLeuGlnLysTrpGlu5060

Asn

Gly

Glu Cys Ala Gln Lys Lys Ile Ile Ala Glu Lys Ile Pro

70 Ala

Glu

Val

LysThr

PheLysIleAspAlaLeuAsnGluAsnLysValVal LeuLeuAsp

ThrAsp Tyr Lys Lys Tyr Leu Leu Phe Cys Met Glu Asn Ser Ala

90

35 45

55

6575

8595

Leu (W)His (C)

Asp (A)

Val (?)

80

Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu Arg Val Tyr Val Glu

40

Glu LeuLys

Pro

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Asn

Gly

Glu Cys Ala Gln Lys Lys Ile Ile Ala Glu Lys Ile Pro

70 Ala

Glu

Val

LysThr

PheLysIleAspAlaLeuAsnGluAsnLysValVal LeuLeuAsp

ThrAsp Tyr Lys Lys Tyr Leu Leu Phe Cys Met Glu Asn Ser Ala

90

35 45

55

6575

8595

Leu (W)His (C)

Asp (A)

Val (?)

↓ cholestérol

Opioïde

100 110 Pro

GluGlnSerLeuAlaCysGlnCysLeuValArgThrProGluValAsp

AspGlu Ala Leu Glu Lys Phe Asp Lys Ala Leu Lys Ala Leu Pro Met

His

IleArgLeuSerPheAsnProThrGlnLeuGluGluGlnCysHisIle

120

130

140

150160

HOOC-

105

115125

135

145

155162

SHVal (A)

Glu (?)100 110 Pro

GluGlnSerLeuAlaCysGlnCysLeuValArgThrProGluValAsp

AspGlu Ala Leu Glu Lys Phe Asp Lys Ala Leu Lys Ala Leu Pro Met

His

IleArgLeuSerPheAsnProThrGlnLeuGluGluGlnCysHisIle

120

130

140

150160

HOOC-

105

115125

135

145

155162

SHVal (A)

Glu (?)

ACE

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Hydrolysats et peptides: les «obstacles»

Peptides bioactifs

la dilution / le faible rendement!

l’amertume!

l’absence de marchés!

le coût!

Caséines (82%)

Niveaud’activité

Concentration(g/L)

Le lait: source peptides bioactifs

Caséines (82%)αSβk

Protéines du lactosérum (18%)β-Lactoglobulineα-Lactalbumine

--

+/-

++

10-1210-123-4

2-41-1.5α Lactalbumine

BSAImmunoglobulinesLactoferrineLactoperoxydase

++++++

++++++++

1 1.50.1-0.40.6-1.0<0.001<0.001

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Phosphopeptides β-CasomorphinCaseinomacropeptide

Glycomacropeptide Lactorphin Lactoferricin

Enzymatic hydrolysis bioreactor

β-Casein κ-Casein αS-casein α-Lactalbumin β-Lactoglobulin Lactoferrin

Ultrafiltration – Microfiltration – Chromatography – ElectrophoresisImmunoglobulins

Lactoperoxydase

Caseinates Phosphocaseinates Defatted whey

“Cracking” du lait (Maubois et Ollivier, 1998)

Neutralization UltracentrifugationMicrofiltration

MicrofiltrationCentrifugation Lipoproteins

Caseins

Enzymatic Biologic coagulation Ionic

ElectrodialysisNanofiltration

Ultrafiltration Permeate Ultrafiltration Demineralized Whey

Membrane fermentor Whey protein Concentrate

WheySkimmilk

Concentrate

Biomass biometabolites Enzymatic hydrolysis

Bioreactor

DryingDrying Peptidic

Hydrolysate

Milk powder Milk proteins Whey proteins Lipids Sugar

Medical foods Bioactive Peptides

UltrafiltrationChromatographyElectrophoresisNanofiltration

Le développement de peptides bioactifs…

Protéine du lait

L’approche classique:

Hydrolyse/Fractionnement

Screening bioactivité

Peptide bioactif

Caractérisation/Identif. peptides

Validation avec peptide de synthèse Mise à l’échelle

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Cible Propriétés Source

Le lait: source peptides bioactifs

Système cardio-vasculaire

Inhibiteur de l’ACEHypocholesterolemiantAntioxydantAnti-inflammatoire

Protéines du lactosérumCaséines

Systèmeimmunitaire

Synthèse du glutathionStimulation des NKAnti-inflammatoire

Protéines du lactosérum

Système osseux Transport de minéraux Caséines (Phosphopeptides)Système osseux Transport de minéraux Caséines (Phosphopeptides)

Système gastro-intestinal

Anti-inflammatoireProduction de CCK Fonction hépatique

Protéines du lactosérumCaséines (GMP)

Inhibiteurs de l’ACE (antihypertensifs)

Peptides bioactifs & Système cardiovasculaire

Angiotensin plasmatique FoieAngiotensin plasmatique

Angiotensin I

Angiotensin II

ACE His-Leu-OH

Pressionartérielle

FoieRénine

Rein

Vasoconstriction des artérioles

Pression artérielle

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Peption ® (caséine αs1 f23-34)


Source: www.dmv-international.com/scripts/getbin.asp?path



Peption ®

Source: www.dmv-international.com/scripts/getbin.asp?path

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Laits fermentés Calpis


«Lactic acid bacteria of Lactobacillus helveticus having specific bacteriological properties, the bacteria, when cultured in a medium of animal milk containing 9 wt % solid of non-fat milk, producing tripeptides Val-Pro-Pro (VPP) and Ile-Pro-Pro (IPP) in an amount of 60 .mu.g in terms of Val-Pro-Pro per ml medium, and the bacteria exhibiting extracellular proteinase activity of not lower than 400 U/OD.sub.590.»

Source: http://www.calpis.net/corporate/divisions/func_food/index.html


Calpis/Ameal Peptide

What is AmealPeptide®


p

AmealPeptide® is a branded ingredient name for a combination of two peptides derived from nonfat milk. Each of these natural bioactive peptides is composed of threeamino acids: valine-proline-proline (VPP) and isoleucine-proline-proline (IPP). While AmealPeptide® is derived from nonfat milk its beneficial derived from nonfat milk, its beneficial effects cannot be experienced simply by drinking milk. The functional benefits are a result of our proprietary derivation process using natural enzymes.

Source: http://www.calpis.net/corporate/divisions/func_food/index.html

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Evolus 2 - for the sake of your heart

The Evolus Double Effect range of functional


The Evolus Double Effect range of functional products helps lower cholesterol and control blood pressure

Plant sterol to lower cholesterolThe plant sterol added to Valio Evolus® Double Effect product range lowers the total cholesterol and the LDL cholesterol, but not the beneficial HDL cholesterol. Numerous clinical studies have shown h l l h h l l l i ffthat plant sterol has a cholesterol-lowering effect.

Peptides help control blood pressurePeptides are created when milk protein is degraded into smaller components fermentation of the Valio Evolus® Double Effect products using Valio’s patented method. The efficacy of the effective agents has been verified in five clinical studies. http://www.valio.fi/portal/page/portal/valiocom

Peptides bioactifs & Système cardiovasculaire Inhibiteurs de l’ACE (antihypertensifs)Lactotripeptides

TensVida™'s essence

DSM’ t Vid ™ t i ifi d i tid

unlimited DSM

DSM’s tensVida™ contains specific dairy peptides, which are proven to help control blood pressure to maintain a healthy heart.

•The active peptide responsible for the blood pressure lowering effect is the so called ‘lactotripeptide’ Isoleucine-Proline-Proline (IPP).

•While lactotripeptides are present in normal dairy products, they are inactive within the original milk products, they are inactive within the original milk protein. To become effective, these peptides first need to be released through enzymatic pre-digestion (by cutting the protein chain). tensVida™ contains these released lactotripeptides.

Source: http://www.dsm.com/le/en_US/tensquard/html/lactotripeptide_tensvida.htm

NutrAward for the most innovative, evidence-based health and nutrition ingredient (HIE, 2009)

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Peptides bioactifs & Système cardiovasculaire Molécules pro- et anti-inflammatoires

Vasodilatation

Anti-inflammatory

Anti-oxidant

Growth inhibition

Anti-thrombotic

Constriction

Pro-inflammatory

Pro-oxidant

Growth promotion

Pro-thrombotic

AcethylcholineBradykinin Angiotensin-IINitric oxide Endothelin-1

O2.-

ONOO-

Anti-thrombotic Pro-thrombotic


Effets sur l’endothélium / (production de NO)

«NOP-47 was discovered by Glanbia Nutritionals as part of their search for naturally derived whey peptide fragments that promote health and sports performance. A form of the NOP-47 was previously shown to increase nitric oxide production in specialized cells that line the inner wall of blood vessels. "The new patent-pending NOP-47 peptide is based on a core scientific platform of bioactive peptide technology which has been developed over several years. NOP-47 is proprietary to Glanbia and offers a clinically substantiated, natural ingredient for products targeting circulatory health and sports nutrition."

Study Results: For this study, 5 grams of a “concentrated” form of NOP-47 was given to subjects once per day for 2 weeks. The study showed a 28 percent increase in artery dilation measured by ultrasound and also significantly increased peak forearm blood flow. Blood chemistry tests proved that NOP-47 increased nitric oxide levels compared to the placebo.»

Source: http://www.glanbiaingredients.com/europe/news.cfm?id=27&action=displayNews

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Peptides bioactifs & Stress

Lactium® est obtenu par hydrolyse des caséines du lait

Le principe actif du Lactium® est un décapeptide (Caséine αs1-91-100) dont l’activité biologique est

té b di é i ( i l ti ) iapparentée aux benzodiazépines (anxiolytiques) mais qui possède l’avantage de ne pas produire d’effets secondaires ni d’accoutumance.

Source: http://www.ingredia-nutritional.fr/


Source: http://www.ingredia-nutritional.fr/

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Source: http://www.nature-labo.com/produit.asp?ID=154

Peptides bioactifs - SOMMAIRE

Produit (Cie) Peptide(s) Activité Évidences cliniques?*q

Peption (DMV) αs-CN f23-34 ACE-inhibition

Ameal peptide (Calpis) VPP, IPP ACE-inhibition

Evolus (Valio) VPP, IPP ACE-inhibition

tensVida (DSM) IPP ACE-inhibition

NOP-47 (Glanbia) ? Vasodilatation (NO)

Lactium (Ingredia) αs-CN f91-100 Anxiolytique

* Échelle comparative et approximative du nombre de données cliniques publiées sur le peptide

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Les défis …Les allergies aux protéines du lait

«De 3 % à 4% de la population adulte souffre d'allergies alimentaires… Plus de 14 % des enfants allergiques au lait de vache le sont également aux protéines de

Peptides bioactifs - CONCLUSION

% des enfants allergiques au lait de vache le sont également aux protéines de soya. ... 76 % des cas d'allergie au lait sont résolus avant l'âge de 5 ans…» (http://www.aqaa.qc.ca/)

Les équivalents non-laitiers«According to a recent market research conducted by Frost & Sullivan, the heart health market is dominated by four ingredients: phytosterols; omega-3s; beta-glucans and soy proteins» (Nutraingredients.com , 05-11-2009)

Le positionnement réglementaireAllégations… i.e., d’abord faire la démonstration de l’efficacité ET de l’inocuité(non-toxicite) des peptides bioactifs…

Le prix…

Facteurs de croissance du lait

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EGF Epidermial growth factor

Stimulent cellules epidermiales, epitheliales & embryonnairesFavorisent cicatrisation & resorption osseuseInhibent sécrétions gastriques

BTC Betacelluline


IGF-I Isulin-like growth factor

Stimulent plusieurs types de cellulesIGF-I plus mitogène que IGF-IIEffets physiologiques apparentés à l’insulineIGF-II

TGF-β Transforming growth factor- β

Stimule cellules de tissus connectifsInhibe cellules épithéliales & lymphocytesImpliqué dans embryogénèse, cicatrisation, formation des os & cartilages immunitécartilages, immunité

PGDF Platelet-derived growth factor

Développement de l’embryon, cellules mesenchymiques, angiogénèse, cicatrisation

FGF2 Fibroblast growth factor

Stimulent plusieurs types de cellulesAngiogénèese, cicactrisation, hématopoièse

Gauthier et al. (2005)

Concentration (ng/mL)

Colostrum Lait


EGF ~ 300 ~150

BTC < 5 < 5

IGF-I 100-2000 5-100

IGF-II 150-500 5-100

TGF-β1 10-50 < 5

TGF-β2 150-1150 10-70

FGF2 n.d. <1

PGDF n.d. n.d.

Pouliot & Gauthier (2005)

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Facteurs de croissance du lait: les «obstacles»


la dilution / le faible rendement!

le manque de connaissances!

le coût!

le lobbying du mouvement anti-lait (IGF-I)!

Extraction des facteurs de croissance…

Maubois et al., 2003: Method for obtaining a TGF-β enriched protein fraction in activated form, protein fraction and therapeutic applications (Brevet)and therapeutic applications (Brevet)

Procédé:Isolat de protéines de lactosérum natifPrécipitation acideTraitement thermiqueMicrofiltrationSéchage

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Facteurs de croissance & Psoriasis

Advitech has developed and patented a Advitech has developed and patented a proprietary technology platform (XP-828L) to extract and concentrate growth factors and other peptides and minor fractions from milk proteins. Dermylex™ is the first product generated by this platform.g y p f

PSORIASIS CLINICAL BACKGROUND

Psoriasis:is a chronic recurrent hyperproliferative


is a chronic, recurrent, hyperproliferative inflammatory skin disorder of unknown cause;

plaque psoriasis (psoriasis vulgaris) accounts for 85 to 95% of all forms of psoriasis;

affects 3-5% of the general population;

Over production of Th1-related cytokines(IL-2 and IFN-γ)

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EFFICACY RESULTS


DAY 1 DAY 56 DAY 112

SOURCE: DR. Y POULIN MD, CRDQ, & R. BISSONNETTE INNOVADERM, 2005

Procédé vs efficacité Caractérisation,

Facteurs de croissance & QUESTIONS!!!

Procédé vs efficacité d’extraction?

XP-828LUn produit actif

contre le psoriasis

TGF-β2, activité?

?

?

?Digestibilité?Absorption?

Toxicité?

Autres activités biologiques??

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Facteurs de croissance du lait bovin : extraction, caractérisation et activités biologiques

Projet CRSNG-RDC Université Laval – Advitech inc.

Facteurs de croissance & LE PROJET…

AXE 1Mise au point de nouvelles stratégies d’extraction des

facteurs de croissance du lait bovin

AXE 2Évaluation des propriétés anti-

inflammatoires des facteurs de croissance du lait bovin

(Gauthier, S.F.; Pouliot, Y., Turgeon, S.L., Poubelle, P.)(2005-2009)

• 6 sous-projets • 3 sous-projets

• 1 stagiaire post-doct.• 3 étudiants Ph.D.• 1 étudiant M.Sc.

• 1 stagiaire post-doct.• 2 étudiants Ph.D.

1. Nouveau brevet & application

2 Prod ction d GFX à ti d l t é id

Facteurs de croissance & … RETOMBÉES

2. Production de GFX à partir de lactosérum acide

3. Nouvel ingrédient par chromato-héparine

4. Nouveaux outils pour caractériser le GFX et la

bioéquivalence des IPLs

5. Identification des composés bioactifs du GFX

6. Digestibilité du GFX

7. Bioactivité du GFX

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Process for the selective fractionation of growth factors from bovine milk, whey and colostrum (US Patent)David P. Lachkar, Eric Lamiot, Yves Pouliot, Sylvie L. Turgeon, Sylvie F. Gauthier, Christina Juneau.


MélangeMélange

CentrifugationCentrifugation

Colostrum 5% et 10% STColostrum 5% et 10% STAgitation 2h à 4Agitation 2h à 4ºCºC

1 nuit à 41 nuit à 4ºCºC12,000g 12,000g --15 min15 min

Polysaccharide 1% et 2% STPolysaccharide 1% et 2% STAgitation 30 min à 80Agitation 30 min à 80ºCºC

Lait

Acide (HCl)pH 4,6 Lactosérum acide


SéparationCaséinesNeutralisation

Clarification

Ultrafiltration

Isolat (IPL)

(Rocafi, 2008)

GFX

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103% 114% 104%

Digestibilité du TGF-β2 (Essais à l’aide du TIM-1)

103% 114% 104%

(Nabil, 2010)


Digestibilité de l’IGF-I (Essais à l’aide du TIM-1)

*** ***75% 46%

0%

(Nabil, 2010)

23

Facteurs de croissance & … RETOMBÉES Effets anti-inflammatoires… (0-800 mg/kg/j)

(Rusu, 2010)


Effets anti-inflammatoires… (80 mg/kg/j)

Sham

Sham

TNBS TNBS TNBS +WPE 80 TNBS +WPE 80

(Rusu, 2010)

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IFN-γ

IL-2

Inflammation•Psoriasis•IBD•Arthritis

TGF-β


IgE

B cell

IL-4IL-10

IL-2

IL-2

Th1

Th2

IL-2

AllergiesAtopic Dermatitis

TGF-β

TGF-β

APC T-cell

Proposed mechanism of action of XP-828LXP-828L is believed to block the activation of the differentiation of T-cells by the Antigen Presenting Cells (APC);Without this activation, there is no over proliferation of Th1 and no excessive production of pro-inflammatory cytokines like IL-2 and IFN-γ;This lead to an immune regulation.

Proposed mechanism of action 47Advitechnaturally

Facteurs de croissance du lait...

Ingrédient laitier de demain?

Oui certainement, mais …

encore beaucoup de connaissances, de méthodologies et de procédés à développer…

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Constituants de la MFGM

6060 70% of milk’s70% of milk’s

The milk fat globule membrane (MFGM)

Cream is a emulsion

MFGMMFGM

6060--70% of milk s 70% of milk s phospholipidsphospholipids

Cream is a emulsion (O/W) stabilized by the MFGM1 2 3

(Evers et al., 2008)(Robenek & Severs, 2008)

26


Plusieurs travaux* ont mis en évidence le potentiel santé de divers composés issus de la MFGM

Effets santé des constituants de la MFGM

Effet bénéfique des lipides mineurs sur la santé cardiovasculaire

Effet hypocholestérolémiant d’un phospholipide de la MFGMMFGM

*(Astaire et al., 2003; Noh & Koo, 2003; Noh & Koo, 2004; Spitsberg, 2005; Rombaut & Dewettinck, 2006; Singh, 2006; Dewettinck et al., 2008)

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Cream

Producing buttermilk

FMGGFMGG ButterButtermilk

MCMC

http://www.foodsci.uoguelph.ca/dairyedu/ (Morin et al.,2006)

Les constituants de la MFGM

Les constituants de la MFGM à partir du babeurre: les «obstacles»

le babeurre n’est pas neutre (flaveur)

l b b ’ t «f bl »le babeurre n’est pas «fromageable»

La MFGM du babeurre n’est pas «fractionable»

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Extraire la MFGM du babeurre?

Les micelles de caséine et les fragments de MFGM sont de taille semblables!MFGM sont de taille semblables!

Dissocier les micelles de caséine (ajout de citrate, hydrolyse enzymatique…) ne facilite pas la séparation par membranes. On peut cependant «laver » la crème avant barattage.

La pasteurisation de la crème complique le fractionnement du babeurre!


(Gassi, Famelart & Lopez, 2008)

29

Extraire la MFGM du babeurre?

IMPOSSIBLE?

Alors, tentons de valoriser le babeurre dans son intégralité!

Comme complexe protéique avec le lactosérum… (fromagerie agents texturants)(fromagerie, agents texturants)

Comme ingrédient santé… (propriétés hypocholestérolémiantes, antioxydantes, etc.)

Conclusion

Des opportunités sont encore inexploitées…

α-lactalbumine

Immunoglobulines

Colostrum ( et ses peptides)Colostrum ( ... et ses peptides)

30

Les prochaines générations de bioactifs laitiers seront issues de produits laitiers complets (fromages laits

Bioactifs laitiers - VISION

issues de produits laitiers complets (fromages, laits fermentés)

Il deviendra impératif de mieux comprendre l’impact de la digestion gastro-intestinale sur l’expression des effets santé des bioactifs laitiers

Il sera essentiel que les bioactifs soient perçus comme laitiers par le consommateur d’aliments-santé!

Conclusion

31

Épilogue…

Il est relativement facileIl est relativement facile d’entrevoir l’avenir …

…le plus difficile …

…c’est de savoir à quel moment cet avenir se réalisera!!!

(Merlin l’Enchanteur)

Merci!!!

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