bioactives et de l’activité antioxydante des deux extraits ...

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE LARBI BEN M'HIDI OUM EL-BOUAGHI

FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

N° d’ordre ….... N° de série ……

Mémoire Présenté pour l’obtention du diplôme de

MASTER En

BIOLOGIE Option : Biochimie appliquée

Thème

Contribution à l’étude des substances

bioactives et de l’activité antioxydante des

deux extraits des graines de Nigella sativa

Présenté par:

Bechegaoui Leila et Zerzi Fatima

Devant le jury: Président: Dr.Hamadouche Nadira MCA. Université d’Oum El Bouaghi Rapporteur: Dr. Mosbah Camélia MCB à l’université d’Oum El Bouaghi Examinatrice : Dr.Bouhbila Aziz M.C.B à l’université d’Oum El Bouaghi

Année universitaire: 2018-2019

Remerciements

Nous tenons tout d’abord à remercier

Dieu le tout puissant et miséricordieux

pour son guide, qui m’a donné la force et

la patience d’accomplir ce travail

Mes premiers profonds remerciements

à mon directeur de mémoire Mosbah

Camélia pour son encadrement, son

assistance et à l’intérêt qu’elle m’a

apporté quant à la réalisation de ce

travail qui ne serait pas réalisé sans sa

précieuse aide.

En second lieu, Nous remercions tous

les membres de jury qui ont accepté de

juger ce Travail.

Nous remercions très sincèrement

toutes les personnes qui d’une façon

ou

d’une autre, ont participé à l’élaboration

de ce travail.

Nous tenons aussi à remercier tous

nos collègues de la promotion de

2018-2019 et nous leur souhaitons

beaucoup de réussite

Leila Fatima

Dédicace

Avec mes sentiments de gratitudes les plus

profonds, Je vous dédie, mes chers parents, ce

modeste travail. Je pourrais

jamais être à la hauteur de vos sacrifices et

patience. Je pris

Dieu pour qu’il vous accorde santé et une

longue vie.

Mes très chères sœurs :Habiba, Souad et

Soumiaqui m’a toujours encouragée,

Mon très cher frère :Bilel

A mes petites chères : petit prince Ishak et ma

belle princesse Oumaima

A mon binôme : Fatima

Mes camarades de la promo de Biochimie

Appliquée 2018/2019

Leila

Dédicace

Je dédie ce travail:

Les deux personnes les plus chères à mon coeur,

mon père et ma Mère, qui m'ont soutenue dans

mes études, et pour leurs encouragements et

leur amour.

Atout ma famille

A mon binôme : Leila

Mes amis et mes collègues

Fatima

Table des matières

Liste des tableaux

Liste des figures

Liste des abréviations

Introduction…………………………………………………………………………………01

Première partie : Revue bibliographique

Chapitre 1 : Description Botanique

1. Nigella sativa ………………………………………………………… ………………….02 1.1. Généralités ……………………………………………………………………………....02 1.2. Description botanique de la Nigelle……………………………………………………..02 1.3. Classification de NS ……………………………………………………………….........04 1.4. Les différentes espèces ……………………………………………………………………….....05 1.5. Culture de Nigella sativa ………………………………………………………………...05

1.6. L’utilisation de Nigella Sativa………………………………………………………………......07

Chapitre 2: Compositions chimiques

1. Métabolites secondaires ........................................................................................................................ 09

1.1. Composés phénoliques ………………………………………………………………….09

1.1.1. Flavonoïdes ………………………………………………………………………..…..09

1.1.1.1. Structure des flavonoïdes……………………………………………… .. … ...... …...10

1.1.1.2. Classification des flavonoïdes…………………………………………………….…10

1.2. Les huiles essentielles ………………………………………………………………...…11

1.3. Saponosides. ………………………………………………………………………….…12

1.4. Alcaloïdes………………………………………………………………………………..12

2. Compositions générales…………………………………………………………..………13

2.1. Protéines, Lipides et glucides…………………………………………………………...13

2.2. Minéraux…………………………………………………………………………………13

2.3. Vitamines………………………………………………………………………………...14

2.4. 2.4. Les huiles fixes……………………………………………………………………....14

Chapitre 3 : propriétés Pharmacologie

1. Les activités de Nigella Sativa……………………………………………………………15 1.1. Activité antibactériennes ………………………………………………………………...15

1.2. Activité respiratoire……………………………………………………………………...15

1.3. Activité antioxydante……………………………………………………………………16

1.3.1. Stress oxydatif…………………………………………………………………………16

1.3.1.1. Les radicaux libres de la biologie……………………………………………………17

1.3.1.2. Les conséquences du stress oxydant…………………………………………………17

1.3.1.3. Antioxydants…………………………………………………………………………17

1.4. Autres activités…………………………………………………………………………..20

2. Toxicité de Nigella sativa…………………………………………………………………………20

Deuxième partie : Expérimentale

Chapitre 4 : Matériels et méthodes

1. Matériel et Méthodes…………………………………………………………………….22 1.1. Matériel végétale ………………………………………………………………………22

1.2. Analyse qualitative…………………………………………………………………….22

1.2.1. Screening photochimique……………………………………………………………22

1.2.1.1. Tests des métabolites secondaires …………………………………………………22

1.3. Analyse quantitative……………………………………………………………………25

1.3.1. Extraction des composées phénoliques………………………………………………25

1.3.2. Calcul du rendement………………………………………………………………….27

1.3.3. Dosage spectrophotométrie des composés phénoliques des fractions de NS…………29

1.3.3.1. Dosage des polyphénols totaux……………………………………………………29

1.3.3.2. Dosage des flavonoïdes…………………………………………………………….30

1.4. Activité antioxydante in vitro …………………………………………………………31

1.4.1. Piégeage du radicale libre DPPH………………………………………………………31

1.4.2. Réduction du fer : FRAP ………………………………………………………………32

Chapitre 5 : Résultats et discussion

1. Analyse qualitative………………………………………………………………………..34 1.1. Screening phytochimique………………………………………………………………. 34 2. Analyse quantitative………………………………………………………………………..36 2.1. Extraction des flavonoïdes et détermination du rendement de l’extraction……………..36 2.2. Quantification des composés phénoliques ………………………………………………38 2.2.1. Résultats de dosage des composés phénoliques totaux ……………………………....38 2.2.2 Résultats de dosage des flavonoïdes.…………………………………………………..3 9 2.3. Activité antioxydante des extraits de NS………………………………………………..40 2.3.1. Piégeage du radical libre DPPH………………………………………………………40 2.3.2. Pouvoir réducteur de Fer FRAP……………………………………………………....44 Conclusion

Références bibliographiques

Résumé

Abstract

ملخصAnnexes


A: Absorbance

ACT: acétate d’éthyle

BUT: butanolique

CAT: Catalase

DL50 : Dose létale 50

DPPH : 2 ,2-diphenyl -1-picryl hydrazyl

EAc : Extrait d’acétate d’éthyle des graines de Nigella sativa

EAq : Extrait aqueux des graines de Nigella sativa

EAG: Equivalent Acide Gallique

ED: Extrait délipidé

EC50: Concentration efficace médiane

ECh: Extrait du chloroforme des graines de Nigella sativa

EHx: Extrait d’hexane des graines de Nigella sativa

EnD: Extrait non délipidé

EQ: Equivalent Quercétine

ELL: Extraction liquide-liquide

ESL: Extraction solide-liquide

GPX : glutathion peroxydase

GSH: Glutathion réduit

H2O2 : peroxyde d’hydrogène

HE : huile essentielle

IC50 : Concentration inhibitrice demi-maximale


NS: Nigella sativa.$

PI: pourcentage d’inhibition

Rd : rendement

RL: Radicale Libre

ROS: espèces réactives de l’oxygène

SOD: Super Oxyde Dismutase

TCA: Trichloro-acetic acid

TQ: Thymoquinone

UV: Ultra-violet

Liste des figures

Numéro de Titre page la figure

01 Aspect morphologique de la plante Nigella sativa. 03

02 Le cycle végétatif de la Nigelle aux milieux 07

03 Structure générale du noyau des flavonoïdes. 10

04 Structure chimique des principaux alcaloïdes de N. Sativa. 13

05 Balance radicaux libres /antioxydants. 16

06 Les étapes d’extraction. (photo originale). 25

07 Extraction à l’acétate d’éthyle. (photo originale). 26

08 l’extraction au n-butanol. (photo originale). 27

Schéma résumant les étapes de l’extraction des graines de Nigella Sativa par

09 les solvants organiques. 28

10 Spectrophotométrie. (photo originale). 30

11 Mécanisme d’action de DPPH.

31

Les résultats de Screening phytochimique.

35

12

13 le rendement d’extraction des fractions des graines de Nigella sativa 37

Liste des figures

14 Droite d'étalonnage de l’acide gallique

38

15 Droite d'étalonnage de la quercétine.

39

16 Résultat d’activité antioxydante DPPH (ACT, BUT) 40

17 Pourcentage d’inhibition de DPPH par la fraction ACT de Nigella 41

sativa.

18 Pourcentage d’inhibition de DPPH par la fraction BUT extraits de 41

Nigella sativa.

19 les valeurs d’IC50 des fractions ACT et BUT de Nigella sativa 42

20 Courbe de réduction de fer par la fraction ACT de Nigella sativa 44

21 Courbe de réduction de fer par la fraction BUT de Nigella sativa 44

22 Les valeurs d’EC50 des fractions ACT et BUT de Nigella sativa 45

Liste des tableaux

Numéro

du tableau Titre Page

01 les noms connus de Nigella sativa dans certains pays (Negre, 1962).

02

02 Classification botanique de Nigelle Sativa. 04

les différentes espèces de Nigella (Sorvig, 1981 ; Zohary, 1983 ; Jansen,

03 1999Anonyme, 2004 ; Orsi- Llinares, 2005 ; Kokoska, 2011). 05

04 Classification des flavonoïdes. 10

05 Composition en oligo-élément des graines de Nigella sativa (Sultan, 2009) 14

composition des graines de Nigella sativa (ALJassir, 1992 ; Ansari et al.,

1988 ;Babayan et al., 1978 ; Hashim , & EL-Kiey ; Rathee et al ( 1982)) .

14

06

07 Les systèmes de défense antioxydant. 18

Les résultats de screening phytochimique effectués sur les graines de

08 Nigella Sativa. 35

09 Aspects, couleurs et rendements des fractions des graines de N sativa. 37

10 Dosage des polyphénols totaux dans les fractions des graines de Nigella

39

sativa

11 Dosage des flavonoïdes dans les fractions des graines de Nigella sativa. 39

Introuduction

Introduction

Depuis des milliers d’années, l’homme utilisé des plantes trouvées dans la nature, pour

nourriture traiter et soigner des maladies (Sanago, 2006).

Les plantes médicinales sont des drogues végétales dont au moins une partie possède des

propriétés médicamenteuses (Farnsworth et al ., 1986)

Actuellement, l’organisation mondiale de la santé (OMS) estime qu’environ 80% des

habitants de la terre ont recours aux préparations traditionnelles à base de plantes en tant que

soins de santé primaire (Lhuillier, 2007).

La science moderne, en analysant et étudiant les effets thérapeutique des plantes pour

préciser, comparer et classer les plantes à effets similaires ; on appelle plante médicinales

toutes plantes médicales renfermant un ou plusieurs principes actifs capables de prévenir,

soulager ou guérir des maladies (Schauenberg., 2005).

Ces nombreux principes actifs ou certains sont issus du métabolisme secondaire. Les

plantes produisent déjà 70% de nos médicaments, déjà environ 170000 molécules bioactives

ont été identifiées à partie de plantes (Chaabiw, 2008).

Ces plantes possèdent plusieurs propriétés pharmacologiques telles que le pouvoir

antioxydant, anti-inflammatoire, antibactérienne. Elle fait l’objet de notre recherche sur

l’étude de l’activité antioxydante de la Nigelle. Pour montre la nigelle commerciale contient

Des métabolites secondaires particulièrement polyphénols et flavonoïdes. Ces derniers qui

donnent la capacité antioxydante pour cette espèce.

Les buts de notre travail a été entrepris afin de réaliser une étude phytochimique, ainsi

détecter le dosage des polyphénols et des flavonoïdes et rendre clair de l’activité

antioxydante des fractions d’extrait méthanolique des graines de Nigelle Sative L in vitro, qui

préparé par macération. Ainsi correspondant à l’extraction des huiles essentielles des graines

de la Nigelle.

Chapitre 1:Description Botanique

1. Nigella sativa

1.1. Généralité

Nigella sativa L est une plante herbacée appartenant à la famille des Renonculacées

(Guignard, 2001). C’est une herbe originaire de l’Europe méridionale et de l’Asie

occidentale, du moyen orient et de l’inde (Mokkedem, 2004 ; Teuscher et al, 2005, Paul

Fournier).

La Nigelle a connu plusieurs noms selon les pays et les régions dans lesquelles elle était

utilisée (Tableau 01).

Tableau 01 : les noms connu de Nigella sativa dans certains pays (Negre, 1962)

Langue Synonymes de NS

Nigella sativa ; Nigella truncat ; Nigella cretica

En Latin

Blac seed, blac cumin,

En Anglais

Le cumin noir, le sésame noir, la poivrette, le faux cumin, la neille,

les cheveux de vénus ou encore la nigelle

En France

Sinouj, Sanouz, Habbah sauda, Habbet el beraka, Kamun aswad.

En arabes

1.1.2. Description de Nigelle Sativa :

C’est une plantes annuelle herbacée d’une hauteur moyenne de 30 à60cm de hauteur, de

croissance rapide, qui possède :

Des feuilles pennatisquées, divisées en lobes étroits, sont lancéolées à linéaires et

présentent des onglets nectarifères. Elles ressemblent à des pattes d’araignée ou bien

s’apparentent au fenouil, d’où son surnom « fleur de fenouil ». Les feuilles inférieures

sont petites et pétaloïdes et les supérieures sont longues. Elles sont disposées en face à

face.

La tige est dressée, rameuse, côtelée et anguleuse.

Les petites fleurs sans involucre comportent 5sépales pétaloïdes blancs ou

2


verdâtres(le calice),5 pétales plus petits de nombreuses étamines insérées sur réceptacle

(la corolle), et, entre les deux une couronne constituée de 5 à10 feuilles à onglets et

nectarifères, et de 4 à 7carpelles soudés.

La plante est hermaphrodite à reproduction autonome.

Le fruit correspondant à l’ensemble des follicules soudés forme la capsule contenant

plusieurs graines triangulaires blanchâtres qui, lorsque la capsule s’ouvre à maturité,

exposées à l’air deviennent noires.

Les graines sont ovoïdes et mesurent 2 à 3,5 mm ; elles présentent 3 ou 4 angles avec

une face supérieure finement granuleuse et réticulée.

(Bonnier ,1990 ; Guignard ,2001 Ghedira, 2006)

Fig. 01 : Aspect morphologique de la plante Nigella sativa (Guignard, 2001).

3


Tableau 02 : Classification botanique de Nigelle Sativa (Zohary, 1983)

Classification botanique de Nigelle Sativa

Règne Plantae

Sous-règne Tracheobionta

Division Magnoliophyta (angiosperme)

Classe Magnoliopsida (dicotylédone)

Ordre Ranunculales

Famille Ranunculaceae

Genre Nigella

Espèce Nigella sativa L

4


Tableau 03 : les différentes espèces de Nigella (Sorvig, 1981 ; Zohary, 1983 ; Jansen,

1999(1); Orsi- Llinares, 2005 ; Kokoska, 2011).

5

Noms

Localisation

Description

Nigella damascena L.

est appelée aussi

N.aristata, N. cretensis,

N. latifolia, N.

tenuiflora, N.

Tuberculata

-En France : dans le midi,

dans l’ouest et dans le sud-

ouest.

-En Europe : en Suisse, en

Belgique et en région

méditerranéenne.

-Hors Europe : dans le nord

de l’Afrique, dans les iles de

Madère et des canaries.

Plante herbacée annuelle, jusqu'à 60 cm de

hauteur. Cette fleur se distingue des 4

autres espèces par son involucre à longues

lanières enchevêtrées disposé

immédiatement sous la fleur.

Nigella orientalis L.

est appelée aussi

Nigella strum flavum,

Nigella strum orientale.

Sud-ouest de l’Asie.

-En Europe.

plante herbacée annuelle, peut aller jusqu'à

45 cm de haut ou aussi bas que 10 cm,

simple ou peu ramifiée.


Nigella hispanica L.

est appelée aussi N.

amoena, N. gallica, N.

confusa.

En France : midi et sud-ouest.

-En Europe : Espagne et

Portugal.

-Hors Europe : Afrique du

Nord.

plante annuelle, jusqu’à 35 cm de haut,

dressée, peu ramifiée et non involucrée.

Nigella arvensis L.

est appelée aussi

N.aristata, N. cretensis,

N. latifolia, N.

tenuiflora, N.

Tuberculata.

-En France : présente

principalement sur les sols

calcaires elle est cependant

rare dans l’ouest et le centre.

-En Europe : Europe centrale

et méridionale.

-Hors Europe : Asie

occidentale, Nord de

l’Afrique.

Plante herbacée annuelle jusqu'à 45 cm,

très légèrement ramifiée; à grande fleur

isolée sans involucre.

1.1.3. Culture de Nigella Sativa

Nigella sativa est une plante cultivée très largement en dehors de l’Europe : en

Russie, Turquie, Egypte, Arabie saoudite, Ethiopie, Afrique du nord, Syrie, dans

les Balkans, en Moyen et Extrême Orient, Inde, Bangladesh, au Sri Lanka. Le

principal pays producteur est l’Egypte( Fabienne ;2005).

6


1.1.3.1. Culture en Algérie

La nigelle est très peu cultivée en Algèrie, elle est limitée à l’échelle traditionnelle dans

les régions de : Ouargla, Biskra, Timimoun, Adrar, Médéa et Skikda, (Mokkedem, 2004 ;

Bousiba, 2004 ; Benkaci, 2007).

Fig.02 : Le cycle végétatif de la Nigelle.

1.1.4. Utilisation de Nigella Sativa

La nigelle tient une place importante parmi les plantes médicinales les plus utilisées et

ce, depuis plus que 2000 ans. La nigelle a été trouvée sur la tombe de Toutankhamon, elle

était considérée par les Egyptien de l’antiquité comme une panacée. Les nombreuses vertus

thérapeutiques d’huile de cette plante semblaient déjà être connues. Pour preuve, des

archéologues ont découvert un flacon d’huile de nigelle dans la tombe de ce pharaon, d’où

l’attribution du nom de « remède des Pharaons », « trésor des Pharaons ». Chez les Grecs

anciens, la nigelle était considérée comme un remède précieux dans le traitement des

affections hépatiques et digestives. (Ghedira et Le Jeune, 2010).

En fait, cette plante a occupé une place spéciale pour son grand spectre d'application

médicale dans la civilisation islamique, dû au proverbe du Prophète Mohamed satisfaction et

salut de Dieu sur lui, avait dit : « Soignez- vous en utilisant la graine noire c’est un remède

contre tous les maux à l’exception de la mort ». Pour cette raison, plusieurs savants

musulmans s’intéressèrent à cette graine (Meziti, 2009).

7


Par leur nature aromatique, les graines de N. sativa sont très utilisées comme épices de

cuisson, en boulangerie et récemment en industrie pharmaceutique (préparations de sirops ou

pommade) et cosmétiques (Cheikh-Rouhou., (2008); Meddah et al; Mehta et al Salih et al

.,(2009).

Elle est employée aussi pour stimuler les fonctions immunitaires de l'intestin, des reins, du

foie, de la circulation sanguine et est indiquée pour le bienêtre général. Ensuite, elle est

utilisée du fait de ses propriétés thérapeutiques, en tant que remède contre de multiples maux

tels que l’asthme, l’eczéma, les mycoses, le psoriasis, l’acné, les brûlures, le rhumatisme, les

douleurs articulaires, le vertige, le mal de dent, le rhume, et certains cancers comme le cancer

du côlon, etc…( Houghton et al. 1995 ; Cihan Toparslan ;2012 ,(3)).

La graine et l’huile de cumin noir, prises seules ou en plus d’autres médicaments, sont

efficaces contre l’alopécie, le vitiligo et d’autres problèmes dermatologiques.Et sont ajoutées à des médicaments astringents pour lutter contre les désordres intestinaux (Aggarwal et

Kunnumakkara, 2009).

8

Chapitre 2: Composés chimiques

Les composés chimiques de NS

1. Métabolites secondaire

Les métabolites secondaires appartiennent à des groupes chimiques très variés tels les

alcaloïdes, les terpènes, les composés phénoliques, etc. (Marouf, 2000; Macheix et al ., 2005).

1.1. Les composes phénoliques

Près de 8000 composés naturels appartiennent à cette famille; ils ont en commun un noyau

benzénique portant au moins un groupement hydroxyl. Selon le nombre d’unités phénoliques

présents, on les classe en composés phénoliques simples et polyphénols. Par abus, on les

appelle indifféremment composés phénoliques ou polyphénols et comprennent

essentiellement les phénols simples, les acides phénoliques, les stilbènes, les flavonoïdes, les

tanins hydrolysables et condensés, les coumarines, les lignanes les lignines et les xanthones

(Stalikas, 2007).

1.1.1. Les flavonoïdes

Les flavonoïdes sont les pigments des végétaux ; ils sont responsables de la coloration des

fleurs, des fruits et parfois des feuilles. Ils sont aussi universellement présents dans la cuticule

foliaire et dans les cellules épidermiques des feuilles assurant la protection des tissus contre

les effets nocifs du rayonnement UV. Les flavonoïdes constituent un large groupe de

composés polyphénols comprenant les flavones, les flavonols, les aurones, les chalcones et

leurs hétérosides. Dans la Nigelle on retrouve des hétérosides de flavonols. (Bruneton, 1999;

Merforti., 1997).

En 1997, trois nouveaux flavonoïdes triglycosylées ont été isolés à partir des graines de NS

et leurs structures ont été déterminées (Merfort et al ., 1997)

1. quercétine 3-glycosyl (1→2) galactosyl (1→2) glucoside

2. kæmpférol 3-glycosyl (1→2) galactosyl (1→2) glucoside

3. quercétine 3-(6-feruloglucosyl) (1→2) galactosyl (1→2) glucoside.

9


1.1.1.1. La structure des flavonoïdes

Les flavonoïdes sont des dérivés benzo-γ-pyran (Skerget et al, 2005). Ce sont des composés

qui ont en commun la structure du diphényl propane C6-C3 C6 ; les trois carbones servant de

jonction entre les deux noyaux benzéniques notés (aromatique) A et B forment généralement

un hétérocycle oxygéné C (Wollgast & Anklam, 2000). L’existence des différentes classes

structurales des flavonoïdes serait fonction des modifications de l’hétérocycle C.

Fig. 03 : Structure générale du noyau des flavonoïdes (Heim et al ., 2002).

Tableau 04 : Classification des flavonoïdes.

10

Classe Formule

Flavanols

Flavonols


Flavanones

Isoflavones

Anthocyanes

1.2. Les huiles essentielles

Les huiles essentielles sont des substances huileuses, volatiles et odorantes qui sont

sécrétées par les plantes aromatiques (Iserin et al ., 2007). Ces huiles sont Produites par de

nombreuses plantes et présentes sous forme de minuscules gouttelettes dans les feuilles, la

peaudes fruits, la résine, les branches, les bois. (Padrini et lucheroni, 1996).

En réalité, une huile essentielle est l’ensemble de tout cela, car il s’agit d’un produit

odorant, généralement de composition complexe, obtenu à partir d’une matière première

végétale botaniquement définie, soit par entraînement à la vapeur d’eau, soit par distillation

sèche, soit par un procédé mécanique approprié sans chauffage. L’huile essentielle est le plus

souvent séparée de la phase aqueuse par un procédé physique n’entraînant pas de changement

significatif à sa composition (Clarke, 2008).

Il est important de distinguer entre les huiles essentielles, les huiles fixes (huile

d’olive….) et les graisses contenus dans les végétaux. En effet :

11


Seules les huiles essentielles sont volatiles, ce qui les différencie des huiles fixes et

des graisses.

Elles se distinguent des huiles fixes par leurs compositions chimiques et leurs

caractéristiques physiques.

Elles sont fréquemment associées à d’autres substances comme les gommes et les

résines.

D’ailleurs elles tendent elles-mêmes à se résinifier par exposition à l’air.

1.3. Saponosides

Les saponosides sont des hétérosides de stérols ou de triterpènes; ils sont très largement

distribués dans les végétaux. Ils libèrent par hydrolyse un ou plusieursoses et une génine

(sapogénine). (Greenich, 1880).

Une de leurs caractéristiques est leur propriété tensioactive : les saponosides se dissolvent

dans l’eau en formant des solutions moussantes. (Bruneton, 1999)

En 1882, Greenisch est isolée au XIXème siècle la première saponine de nigelle sativa qui

nommée mélanthine, dont l’aglycone est l’hédéragénine (Greenish, 1980).

Une étude ultérieur Kumora et Haut (2001) ont aussi confirmés Dans tous les cas, les

saponines trouvées dans les graines de Nigelle ont pour aglycone l’hédéragénine, une génine

triterpénique.Kumara et Huat (2001).

Depuis, plusieurs autres saponosides apparentées à l’α-hédérine ont été isolées par , Taskin

2005 et collaborateur à partir de l’extrait méthanolique, avec l’élucidation de leurs structures

par des méthodes chimiques et spectrales ; 3-O-β-D-xyl (1-3)-α-L-rha- (1-2)-α-L-ara-28-O-α-

L-rha(1-4)-β-D-glu(1-6) -β-D-glu–hédéragénine,3-O-α-L-rha-(1-2)α-L-ara-28-O-α-L-rha(1-

4)-β-D-glu(1-6)-β-D-glu-hédéragénine,k3-O-β-D-xyl(1-3)-α-L-rha-(1-2)-α-L-ara-

hédéragénine. uinone (Benkaci-Ali et al ., 2007).

1.4. Les alcaloïdes

Les alcaloïdes, composés azotés basiques, sont des substances organiques d'origine naturelle,

(le plus souvent d’origine végétale), hétérocyclique avec l’azote comme hétéroatome, de

structure moléculaire complexe plus ou moins basique et doué de propriétés physiologiques

prononcées même à faible dose (Bruneton, 1999 ; Zenk et Juenger, 2007). A faibles doses,

12


certains présentent des activités thérapeutiques mais à fortes doses, ils peuvent être très

toxiques.

Fig. 04: Structure chimique des principaux alcaloïdes de NS. (Atta-ur-Rahan, M et al .,

1995).

2. Les compositions générales (métabolite primaire classique)

2.1. Protéines, lipides et glucides

La composition générale de ces graines montre une teneur relativement importante en

protéines (16-21%) avec dominance de l’acide glutamique (22,4%), d’acide aspartique

(10,05%) et d’arginine (9,18%) (Al-Gaby, 1998) (Nergiz et Ünal, 1991). En lipides (30-

37%) et en glucides (33-34%).

2.2. Les Minéraux

La composition minérale de la graine de Nigella sativa ont rapporté que sa teneur en

potassium est importante (1,18 % de poids total de la graine) et que le calcium, le fer, le

sodium représentent 0,188 ; 0,0575 et 0,0853 % respectivement.

Les minéraux (de la graine de nigelle sativa dont les quels le potassium, le calcium, le

magnésium sont les plus abondants (783, 572, 253 mg/kg du poids sèche de la graine

respectivement). (Cheikh-Rouhou et al, 2007, Sultan et al ., 2009).

13


Tableau 05: Composition en oligo-élément des graines de Nigella sativa (Sultan, 2009).

Minéraux Valeur nutritive pour 100g

Potassium 808g

Calcium 570g

Phosphore 543g

Magnésium 265g

Sodium 17,6g

Fer 9,70g

2.3. Les vitamines La composition en vitamines a été déterminée et révèle la présence des vitamines B1, B2,

B6, PP et de l’acide folique (Nergiz et Ötles, 1993).

Ces mêmes chercheurs ont pu également identifier d’autres vitamines liposolubles; la β-

carotène (0,05%) et la vitamine K1 (0,1%).

Dans une étude ultérieur, Al-Saleh et son équipe (2006) ont affirmé après l'analyse par

HPLC démontre que les teneurs en α et γ-tocophérols sont relativement élevées: de 5, 65 à

11,39 et de 2,26 à 6,95 mg/kg respectivement (Al-Saleh et al ., 2006).

Tableau 06 : composition des graines de Nigella sativa (ALJassir, 1992 ; Ansari et al ., 1988

;Babayan et al., 1978 ; Hashim , & EL-Kiey ; Rathee et al ( 1982))

Constituant Quantité(%)

Lipides 30-35

Protéines 16-21

Glucides 33-34

Fibres alimentaires 4,5-6,5

Sels minéraux 3,7-7

2.4. Les huiles fixes

Les huiles fixes représentent 37,9-39,2% du poids de la graine. Elle est constituée

principalement de lipides neutres 96,1%-97,2%, de lipides polaires 3% et de

phospholipides 0,32-1,05% (Ramadan et Mörsel, 2002a).

14

Chapitre 3: Propriétés Pharmacologique

1. Les activités de Nigella Sativa

Depuis un siècle, de nombreux travaux ont porté sur l’étude de Nigella sativa, notamment

sur les effets dus aux extraits de la graine de cette espèce. Ces travaux montrent que cette

espèce riche en plusieurs propriétés pharmacologiques pour la médecine moderne, parmi ces

effets on souligne les plus importants :

1.1. Activité antibactérienne

L’activité antibactérienne de NS a été montrée contre plusieurs souches bactériennes telles

que ; Staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia

coli, Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis, (Hanafy et Hatem., 1991 ; Sokmen 1999 ;

Morsi, 2000).

En 1991, Hanafy et Hatem ont étudiés l’extrait par le diéthyle éther de la graine de nigelle

sur plusieurs micro-organismes. Une inhibition de leur croissance dépendante de la

concentration de l’extrait a été observée (Hanafy et al ., 1991).

Ainsi que cette étude a réalisé par Agrawal, Mashhadian et Rakhshandeh sur des différents

extraits des graines de Nigella sativa ; qui sont trouvés un large spectre d’inhibition vis-à-vis

de nombreuses souches bactériennes des graines de Nigella sativa (Agrawal et al ., 1979 ;

Aljabre et al., 2005 Mashhadian et Rakhshandeh., 2005).

L’huile de la Nigelle possède également un pouvoir inhibiteur supérieur à celui de la

gentamicine sur une vingtaine de souches de Listeria monocytogenes (Nair et al ., 2005).

L’huile essentielle et la thymoquinone ont des activités antimicrobiennes vis-à- vis de

nombreuses bactéries résistantes aux antibiotiques et vis-à-vis de Staphylococcus Aureus,

Shigella spp. Vibrio cholerae et Escherichia coli, entre autres (Aboulela., 1996 ; EL-Fatatry.,

& EL-Alfy,., 1995 ; Ferdous, et al ., 1992 ; Hanafy., & Hatem;1991).fy et al., 1991).

1.2. Activité respiratoires

Nigella sativa est l’une des plantes les plus utilisées pour le traitement des maladies

respiratoires. El Tahir et al 1993 peuvent montrer que les huiles essentielles de NS est

responsable d’une augmentation (dose dépendante) de la fréquence respiratoire et de la

pression intra-trachéale chez le cobaye par l’administration intraveineuse.

15


Une autre étude a apparait que l’extrait brut méthanolique des graines de Nigella sativa

exerce un effet spasmolytique et broncho-dilatateur avec implication probable de bloqueurs

des canaux calciques.

Il y a les investigations d’autres chercheurs ont montrés que le Nigellone

(polythymoquinone) est un agent protecteur efficace contre l’asthme et la bronchite, en

inhibant efficacement la libération de l’histamine (Gilani et al ., 2004).

L’action des graines de Nigella sativa sur le système respiratoire est probablement la

résultante de plusieurs effets : cholinergiques (Boskabady et Shahabi, 1997), inhibition des

récepteurs H1 de l’histamine (Boskabady et Shiravi, 2000) et antagonisme du calcium (Gilani

et al ., 2001, Boskabady et Shirmohammadi, 2002 ; Boskabady et al.,2004).

1.3. Activité antioxydante

1.3.1. Stress oxydatif

Le stress oxydant se définit quand il y a un déséquilibre entre la production des espèces

radicalaires et les capacités de défense antioxydante de l’organisme. C’est une situation où la

cellule ne contrôle plus la présence excessive des espèces radicalaire toxiques. (Beaudeux et

al ., 2011 ; Ríos-Arrabal et al., 2013).

Le stress oxydant est la principale cause initiale de plusieurs maladies. C’est le facteur

potentialisant l’apparition des maladies plurifactorielles telles que le diabète, la maladie

d’alzheimer, les rhumatismes et les maladies cardiovasculaires (Alain dit Philippe B et al.,

2011).

Fig.05 Balance radicaux libres /antioxydants (Shimizu, 2004).

16


1.3.1.1. .1. Les radicaux libres de la biologie

Un radical libre est une espèce chimique, atome ou molécule très réactive contenant un ou

plusieurs électrons non paires dans ses orbitales, cet électron lui confère une certain instabilité

et haute réactivité (demi-vie courte) (Ortiz et al., 2013). Les espèces radicalaires vont tenter

de rapparier leurs électrons célibataires en agressant toute molécule stable la plus proche de se

faire arracher un électron nécessaire pour acquérir la stabilité.et la molécule attaquée devient

elle -même un radical libre (Martinez-Cayuela, 1995).

On peut distinguer les radicaux primaires, qui ont un rôle physiologique particulier et les

radicaux secondaires, issus de la réaction des radicaux primaires avec des entités

biochimiques cellulaires (lipides, protéines, glucides…) (Belkheiri, 2010).

Ces radicaux primaires dérivent de l'oxygène par des réductions à un électron tels l'anion

superoxyde O2 •- et le radical hydroxyle OH•, ou de l'azote tel le monoxyde d'azote NO•.

D'autres espèces dérivées de l'oxygène dites espèces actives de l'oxygène, comme l'oxygène

singulet 1O2, le peroxyde d'hydrogène (H2O2) ou le nitroperoxyde ONOOH (Favier, 2003).

1.3.1.2. .2. Les conséquences du stress oxydant

La production excessive de radicaux libres provoque des lésions directes de molécules

biologiques suivantes :

Protéines. (Koechlin-Ramonatxo C., 2006 ; Haleng J et al ., 2007).

l'ADN. (Favier A ., 2003;Valco M et al ., 2004; Koechlin-Ramonatxo C., 2006

lipides. (Esterbauer H et al . ,1992).

1.3.1.3. Antioxydants

Les antioxydants peuvent être définis comme "une substance qui retarde, empêche ou

élimine les dommages oxydatifs à une molécule cible" (Gutteridge et Mitchell, 1999 ;

Medina-Navarro et al., 2010).

17


Tableau : 07 Les antioxydants sont des systèmes enzymatiques ou non-enzymatiques.

Système enzymatique

réagit contre les produits toxiques de métabolisme cellulaire, et catalyse

la dismutation d’O2•- en H2O2 et en O2.

Supéroxyde Il existe plusieurs isoformes de SOD selon le métal utilisé par l’enzyme

dismutase Cytosolique (Cu, Zn-SOD), Mitochondriale (Mn- SOD) et

(SOD) extracellulaire (EC-SOD). (El- Demerdash et al. ; 2013 ).

La Catalase (CAT) est une enzyme qui catalyse la transformation d’

H2O2 peroxyde d’hydrogène en H2O et oxygène moléculaire

(Bonnefont-Rousselot et Collin, 2010), mais leur rôle est très important

Catalase surtout en présence d’ions ferreux (Lindau-Sehpard et Shaffer, 1993).

Elle est essentiellement présente dans les peroxysomes et dans les

érythrocytes (Delattre J et al., 2005).

Les glutathion peroxydases sont localisées dans le cytosol, le réticulum

Glutathion endoplasmique et dans la membrane interne des mitochondries. Elles

peroxydase permettent de réduire H202 en H2O en parallèle de l’oxydation du

glutathion. (Marfak, 2003)

Cette enzyme lutte contre les radicaux libres qui, s’ils sont en trop grand

nombre, vont attaquer et détruire l’ADN (Belkheiri, 2010).

18


Système non enzymatique

La vitamine C est un antioxydant hydrosoluble, qui se trouve dans le

cytosol et dans le fluide extracellulaire. C’est un piégeur très efficace

Vitamine C des ions superoxydes O2 -, du peroxyde d’hydrogène H2O2, des

radicaux hydroxyles HO•, et de l’oxygène singlet 1O2, et aussi de

régénérer la vitamine E (Powers and Jackson 2008).

La vitamine C protège ainsi les biomembranes et les lipoprotéines.

(Bouldjadj ,2009).

Vitamine E protège les cellules contre les dommages associés aux RL pour

empêcher la propagation des réactions de peroxydation lipidique

(Packer et al., 1997; Evans, 2006).

Les caroténoïdes permettent aussi de neutraliser les radicaux

hydroxyles, pyroxyles par conséquence, ils sont susceptibles d'inhiber

caroténoïdes la propagation des chaînes de peroxydation lipidiquel. (Edge,

1997).

C’est un tripeptide composé de cystéine, glutamine et glycine et joue

Glutathion un rôle dans la réduction des peroxydes cellulaires grâce à la réaction

catalysée par la glutathion peroxydase (GPX). Le GSH intervient

également dans le cycle de régénération de 2 vitamines antioxydantes :

la vitamine E et la vitamine C (Powers and Jackson. ; 2008).

Zn, Cu, Mg, Sn et Fe sont des cofacteurs indispensables pour des

Oligoéléments réactions métaboliques d’enzymes antioxydantes. (Guillouty ,2016)

Ces composes sont des antioxydants qui peuvent de piéger des

Polyphénoles espèces radicalaires et peuvent aussi d’être des chélateurs des métaux

Et flavonoides de transition comme le Fer et le Cuivre qui permettent de catalyser les

oxydations. En effet, les flavonoïdes sont des composes avec une

activité antioxydante prononcée .Ils ont la capacité de piéger

directement les radicaux libres comme le super oxyde, le radical

peroxyle, le radical alkoxyle et le OH• par transfert d’hydrogène

(McCord, 1995 ; Hodek et al., 2002 ; Stevenson, et Hurst, 2007).

19


L’activité antioxydante est l’habilité d’un composé (dit antioxydant) à inhiber la

dégradation oxydative d’un substrat telle que la peroxydation des lipides et des protéines

(Pellegrini et al., 2003 ; Roginsky et Lissi, 2005). Cet antioxydant a pour rôle d'empêcher les

RL d'atteindre leurs cibles biologiques, d'où leur fonction de protecteur chimique (Gardès-

Albert et al., 2003), ABTS, de l'oxyde nitrique et des radicaux hydroxyles.

In vitro l’extrait méthanolique, riche en composés phénoliques ainsi que des composés

d'acides gras présentent une capacité antioxydante plus élevée que l'huile volatile et TQ,

tandis que limonène avait même un piégeur de radicaux plus faible que l'huile Nigella sativa.

En accord avec ces résultats, l'enquête in vivo a révélé que les fractions et les composés testés,

particulièrement l'extrait méthanolique, efficacement protégés contre le stress oxydatif induit

des dommages cellulaires des tissus érythrocytaires et hépatiques, en empêchant la

peroxydation lipidique excessive (Ahmad et Beg, 2014).

1.3. Autres activités

Activitité anti inflamatoire (Lusi Putri et al. , 2019).

Activité anti diabétique (Benhaddou ,2009).

Effet anti-convulsif (Hosseinzadeh et Parvardeh ., 2004).

Activité anti-tumorale et anti-proliférative( El-Mahmoudy et al ., 2005).

Effet anti- allergique et anti-histaminique (El-Tahir et al ., 2003).

Effet hepato-protecteur (Daba et Abdel-Rahman, 1998; El-Mahmoudy et al ., 2005).

2. La toxicité de Nigelle Sativa

La plupart des études montrent clairement que la nigelle possède un index thérapeutique

élevé et une excellente innocuité à des doses inférieures à 4 g/kg/jour. (Mahfouz et al ., 1965 ;

Tenekoon et al.,1991) L’étude de Khader et ses collaborateurs (2009) montrent un effet cyto

génotoxique concentration-dépendant de la thymoquinone. En effet, la thymoquinone induit in

effet anti-prolifératif à une concentration de 20μM et à concentration plus élevée. La

thymoquinone peut être métabolisée en espèces réactives et augmente le stress oxydatif

(Khader et al., 2009).

20


De plus, le surdosage thérapeutique en graines de Nigella sativa peut provoquer des

avortements. Cette toxicité est due essentiellement à la présence de forte quantité de saponines

et d'alcaloïdes dans les graines de Nigelle (Benzine, 2014).

21

Matériels et Méthodes

1. Matériels et Méthodes

1.1. Matériel végétale

Les graines constituent la partie utilisée de cette plante dans cette étude. Les graines sont

nettoyées des débris végétaux pour être utiliser dans notre étude .

Il a été acheté à partir d'une herbe bien connue dans la wilaya d'Oum El Bouaghi ils sont

broyés dans un mixeur, La poudre obtenue est stockée dans des petits sacs en papier, étiquetés

puis conservés à l'abri de la lumière jusqu'au l'utilisation ultérieur.

1.2. Analyse qualitative

1.2.1. Screening phytochimique

Le screening phytochimique est le moyen indispensable pour mettre en évidence la

présence des groupes de familles chimiques présentes dans une drogue donnée. Toutefois, ce

screening phytochimique ne renseigne point sur la nature des molécules chimiques. Bien

entendu, les tests de caractérisation phytochimiques présentent des imprécisions car ils sont

basés en partie sur l’analyse qualitative. Le principe est soit basé sur la formation de

complexes insolubles en utilisant les réactions de précipitation, soit la formation de complexe

colorés en utilisant des réactions de coloration.

1.2.1.1. Tests des métabolites secondaires

1.2.1.1.1. Test des alcaloïdes

Selon Bruneton, (1999), une quantité de 5 g de la poudre végétale est ajoutée à quelques

gouttes d’eau distillées avec l’acide sulfurique (H2SO4) à 0.5N. L’extrait obtenu après

filtration de la solution est reparti sur trois tubes correspondant respectivement à Wagner

(iodo-iodure de potassium) qui donne une précipité brun, Valser Mayer (tétraiodomercurate

de potassium) qui donne une précipité blanc jaunâtre et dragendorff (d'iodure de mercure

depotassium) qui donne une précipité orangé, et l’apparition de ces couleurs révèle la

présence des alcaloïde.

22


1.2.1.1.2. Test des saponosides

Les saponosides sont des substances très fréquentes chez les végétaux, ils sont caractérisés

parleur pouvoir moussant en solution aqueuse qui donne l’indice de mousse. Un décocté à 1%

est préparé avec 1g de poudre dans 100 ml d’eau bouillante et maintenir une ébullition légère

pendant15 minutes puis la suspension est filtrée. On introduit dans 10 tubes à essai

successivement 1 à 10 ml de filtrat en complétant le contenu de chaque tube à 10 ml avec de

l’eau. On agite le contenu de chaque tube pendant 15 secondes en raison de 2 agitations par

seconde. La hauteur de mousse est mesurée 15 minutes après. L’indice de mousse est calculé à partir du numéro de tube (N) dans lequel la hauteur de mousse est de 1cm. lm = 1000/N

(Diallo D et al., 2004).

1.2.1.1.3. Test des stérols et triterpènes

La présence des stérols et triterpènes est mis en évidence à l’aide de H2SO4 concentré.

Unextrait est tout d’abord réalisé à partir d’une macération pendant 24 heures de 1g de poudre

de la plante dans 20 ml d’éther. L’extrait obtenu servira en plus des stérols à la

caractérisationdes caroténoides et des coumarines. Les stérols et triterpènes sont mis en

évidence par ajoutde 1 ml de CHCl3 au résidu de 10 ml du macéré évaporé. La solution

obtenue est partagé dansdeux tubes à essais, puis 1 à 2 ml de H2SO4 concentré sont ajoutés

au fond de l’un des tubes,l’autre servira de témoin. La formation d’un anneau rouge brunâtre

ou violet à la zone decontact des deux liquides, révèle leur présence (Bruneton, 2009).

1.2.1.1.4. Test des tanins

La présence de tanins galliques et catéchiques a été mise en évidence à l’aide de

perchlorureferrique. Pour ce faire, un infusé à 5% est préparé en mettant 5g de poudre de

l’échantillondans 100 ml d’eau bouillante. Après 15 minutes, la suspension est filtrée et rincée

pour obtenir 100 ml d’infusé à 5%. Cet infusé servira également à caractériser les

flavonoïdes. Les tanins galliques, hydrolysables, sont mis en évidence par ajout de 15 ml de

réactif de Stiasny à 30 ml de l’infusé à 5%, après 15 minutes de chauffage au bain-marie à

90°C, le mélange estfiltré et saturé par 5 g d’acétate de sodium, ensuite il est additionné de

1ml de solution de FeCl3 à 1%. L’apparition d’une teinte bleue indique la présence de tanins

galliques. Les tanins catchiques, non hydrolysables, sont caractérisés par addition de 1 ml de

HCl concentré à 5 mld’infusé préalablement préparé, le mélange est porté à ébullition pendant

15 minutes. En présence de tanins catéchiques un précipité rouge insoluble dans l’alcool iso-

23

4 Matériels et Méthodes

amylique, se forme. Les tanins catéchiques sont aussi mis en évidence après l’addition du

réactif de Stiany par la formation de précipité (Bruneton, 2009).

1.2.1.1.5. Test des coumarines

Pour détecter les coumarines, 0,5 g de la poudre sont mis dans un tube à essai contenant du

méthanol, puis les tube à essai sont fermé avec du papier imbibé avec du NaOH (1N).

Lestubes sont, ensuite, placés dans un bain pendant quelques minutes, puis observés sous

lampe UV à 365 nm. L'apparition d'une fluorescence jaune indique leur présence (Trease et

Evans, 1989).

1.2.1.1.6. Test de phlobatannins

En dissolvant 0,5 g de poudre dans 10 ml de méthanol (50%) après filtration, on fait

bouillir le filtrat avec HCl à 1%. L'apparition d'un précipité rouge indique leur présence

(Sofowora, 1993).

1.2.1.1.7. Test des résines

Le test de précipitation implique de mettre 0,2 g de la poudre dans 15 ml d'éthanol à 96%,

l'extrait d'éthanol après filtration est traité avec 20 ml d'eau distillée. L'apparition d'un

précipité blanc indique leur présence (Evans, 2002).

1.2.1.1.8. Test de flavonoïdes

La recherche des flavonoïdes est réalisée par une macération de 10 g de la poudre dans 150

ml d’acide chlorhydrique (HCl 1%) pendant 24 h. Après filtration, une solution alcaline de

NH4OH est ajoute au 10 ml de filtrat. L’apparition de couleur jaune claire dans la partie

supérieure de tube indique la présence des flavonoïdes (Harborne, 1998).

1.2.1.1.9. Composés volatils

Les composés volatils ont été identifiés par la méthode d’hydrodistillation a l’aide d’un

extracteur de type Clevenger (Alitonou et al., 2012).

24


1.3. Analyse quantitative

1.3.1. Extraction des composés phénoliques totaux

Cette étape qui a pour but la désorption des molécules d’intérêt des sites actifs de la matrice

végétal, est primordiale car elle déterminera la quantité et la nature des substances extraites et

par conséquent le succès des étapes suivantes. L’extraction des flavonoïdes est réalisée selon

la méthode de Markham, (1982), avec modification inspirée selon la méthode de Bruneton,

(1993), Bekkara et al ., (1998).

1.3.1.1. Extraction solide-liquide (ESL)

L’extraction des polyphénols est effectuée par macération à partir de la matière sèche finement

broyée dans le méthanol 80% (v/v), le volume de solvant doit d’être suffisant pour que la matrice

reste immergée pendant la totalité de l’extraction. Les ratios optimums solide liquide les plus

souvent trouvés dans la littérature sont 1/10 ou 1/50 (mg/ml) (Michel, 2011), dans la présente

étude que nous avons choisie 1/10. Après macération de 24 heures avec agitation, le macérât est

filtré sur Büchner sous pression réduite puis soumis à une évaporation à basse pression à 50°C par un Rota Vapor (Heidolph.4000 efficient). La phase aqueuse (le

filtrat) ainsi obtenue est conservée 48 heures à 40°C pour accélérer la diffusion des molécules

dans les solvants puis filtrée.

Fig.06 Les étapes d’extraction

25


1.3.1.2. Fractionnement de l’extrait hydrométhanolique par Extraction

liquide-liquide(ELL)

Dans le but de partager les molécules selon leurs propriétés physico-chimiques, un

fractionnement liquide-liquide est réalisé entre deux phases non miscibles. L’extrait

hydrométhanolique est débarrassé d’abords des cires, des lipides et de la chlorophylle partrois

lavages successifs avec l’éther de pétrole (v/v) pour donner une phase aqueuse.

Afin de séparer les flavonoïdes en fractions aglycones, monoglycosides et di et

triglycosides, la phase aqueuse est mélangée avec chloroforme (v/ v) pour obtenir une phase

organique contenant les flavonoïdes aglycones et les aglycones méthoxylés. La phase aqueuse

restante subit à son tour trois extractions avec l’acétate d’éthyle afin de récupérer dans la

phase organique certains flavonoïdes aglycones mais surtout les monoglycosides. La phase

aqueuse restante est mélangée avec le n-butanol pour récupérer notamment les flavonoïdes di

et triglycosides. La phase aqueuse finale contien tsurtout les flavonoïdes glycosylés plus

polaires. Les deux fractions récoltées acétate d’éthyle (ACT) et butanolique (BUT) qui font

l’objet de cette étude, sont concentrées par évaporation à basse pression à 45°C.

Phase organique

Phase aqueuse

Fig.07Extraction à l’acétate d’éthyle

26


Phase organique

Phase

aqueuse

Fig.08 l’extraction au n-butanol

1.3.2. Calcul du rendement

Chaque extrait est pesé pour calculer le rendement de l’extraction, exprimé en gramme de

lyophilisat par 100 g de matière sèche. Le rendement est calculé par la formule suivante :

R (%) = M x 100/M '

R: Rendement de chaque phase.

M: masse de l’extrait de chaque phase.

M’: masse de la matière sèche de la plante.

27


Les graines de Nigella Sativa100 g

Extraction solide-liquide Met OH (80%)

L’extrait hydrométhonolique

Extraction liquide-liquide

Extrait aqueux Fraction à l’étherde

pétrole

Partition Chloroforme

Fraction à

Chloroforme

Extrait aqueux

Partition Acétate d’éthyle

Fraction à l’acétate Extrait aqueux

D’éthyle (ACT)

Partition n-Butanol

Fraction Butanolique Extrait

aqueux (BUT)

Fig09. Schéma résumant les étapes de Fractionnement de l’extraction hydrométhanolique des graines

de NS par les solvants organiques.

28


1.3.3. Analyses quantitative des composés phénoliques

par spectrophotométrie (Visible)

Cette analyse permet d’avoir une estimation sur la teneur en phénols totaux de

l’échantillon. Le dosage des phénols totaux a été effectué par le réactif de Folin-Ciocalteu, et

les flavonoïdes ont été quantifiés par le dosage direct par le trichlorure d’aluminium. La

raison principale pour le choix de ces composés réside dans le fait que la majorité des

propriétés biologiquesdes plantes leurs sont attribuées.

1.3.3.1. Dosage des polyphénols totaux (PPT)

Le dosage des polyphénols totaux a été effectué avec le réactif colorimétrique Folin-

Ciocalteu selon la méthode cité par Wong et al., (2006).

1.3.3.1.1. Principe

La teneur phénolique totale (PPT) est habituellement déterminée colorimétriquement avec

le spectrophotomètre UV-Vis en utilisant l’essai de Folin-Denis ou généralement Folin

Ciocalteu. Ces essais sont basés principalement sur la réduction du réactif acide

phosphotungstiquephosphomolybdique (réactif de Folin) dans une solution alcaline

(Vuorela, 2005). Brièvement, 200 μl de chaque extrait (dissous dans le méthanol) ont

étéajoutés à 1ml de réactif de Folin-Ciocalteu (10 fois dilué). Les solutions ont été mélangées

et incubées pendant 4 minutes. Après l’incubation, 800μl de la solution de carbonate de

sodium Na2CO3 (75g/l) a été ajoutée. Le mélange final a été secoué et puis incubé pendant

2heures dans l'obscurité à température ambiante. L'absorbance de tous les extraitsa été

mesurée par un spectrophotomètre (SHIMADZU.UV1280) à 765 nm.

1.3.3.1.2. Expression des résultats

La concentration des polyphénols totaux est calculée à partir de l’équation derégression de

la gamme d’étalonnage.Les résultats sont exprimés en microgrammes d’équivalents d’acide

gallique par milligramme d’extrait (μg EAG/mg).

29


Fig.10 Spectrophotométrie

1.3.4.2. Dosage des flavonoïdes totaux (FT)

Pour le dosage des flavonoïdes totaux, la méthode utilisée est celle développée par Zhishen

et al., (1999) puis par Chen et Chen, (2011) avec quelques modifications de (Ghnimi, 2015).

1.3.4.2.1. Principe

Le principe de la méthode est basé sur l’oxydation des flavonoïdes par le

trichlorured’aluminium et de soude entrainant ainsi la formation d’un complexe détecté à 510

nm. La méthode consiste à placer dans des tubes à essais et d’une manière successive, 250 μl

de l’extrait étudié et 1 ml d’eau distillée. Au n temps initial (0 minute) on ajoute 75 μl d’une

solution de NaNO2 (5%), après 5 minutes 75 μl de AlCl3 (10%) sont ajoutés. 6 minutes après

500 μl de NaOH (1N) sont ajoutés ainsi que 2, 5 ml d’eau distillée. L’absorbance de chaque

mélange obtenu est directement mesurée au spectrophotomètre UV-visible à 510 nm.

1.3.4.2.2. Expression des résultats

La concentration des flavonoïdestotaux est calculée à partir de l’équation de régression de la

gamme d’étalonnage. Les résultats sont exprimés en microgrammes d’équivalent

dequercétine par milligramme d’extrait (μg EQ/mg).

30

Chapitre : 4 Matériels et Méthodes

1.4. Activité antioxydante

1.4.1. Test de l’activité antioxydante

De nombreuses méthodes sont utilisées pour l’évaluation de l’activité antioxydante des

composés phénoliques purs ou des extrais. Dans notre étude nous avons utilisé l’effet

scavanger sur le radical 2,2diphényl1-1-picrylhydrazyl (DPPH).

1.4.1.1. Piégeage du radical libre par DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhdrazil)

Pour dépister l'activité antioxydante des graines de Nigella sativa, le test au DPPH a été

utilisé selon le protocole décrit par YuCaoet et al., (2009), Naznine et al., (2009). Le DPPH,

est un radical libre de couleur violette, est ré duit en un composé de couleur jaune en présence

de composés antiradicalaires (Molyneux, 2004).

Fig. 11 Mécanisme d’action de DPPH.

Dans ce test, les antioxydants réduisent le diphényle picryl hydrazyl ayant une couleur

violette en un composé jaune, le diphényle picryl hydrazyl, dont l’intensité de la couleur est

inversement proportionnelle à la capacité des antioxydants présents dans le milieu à donner

des protons. Dans des tubes à essais, 0.1 ml de chaque fraction (ACT, BUT) est introduite

avec 3 ml de la solution méthanolique de DPPH (0.04%). Un tube standard est préparé avec la

quercétine, après agitation, les tubes sont placés à l’obscurité à température ambiante

pendant30 minutes. La lecture a été effectuée par la mesure de l’absorbance à 517 nm.

31


Les résultats sont exprimés en tant qu’activité anti-radicalaire ou l’inhibition des

radicauxlibres en pourcentages (I %) en utilisant la formule suivante :

% = [(Abs contrôle – Abs échantillon) / Abs contrôle] x 100

Dont:

I%: Pourcentage de l’activité anti-radicalaire (AAR%).

Abs Échantillon : Absorbance de l'échantillon.

Abs contrôle : Absorbance du Contrôle négatif.

En modifiant les concentrations des fractions et en calculant les pourcentages d’inhibition,

il est nécessaire d’établir une courbe de régression linéaire qui relie les

différentesconcentrations et les pourcentages d’inhibition.

A partir de cet abaque, on détermine l’IC50 qui correspond à la concentration de

l’échantillon qui entraine 50% d’inhibition. Notons que l’activité antioxydante est

inversement proportionnelle à la valeur de l’IC50. Ainsi, l’échantillon qui présente l’IC50 la

plus faible est celui qui présente l’activité anti-radicalaire la plus importante.

Tous les tests ont été effectués sur trois répétitions.

1.4.1.2. Réduction du fer : FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)

1.4.1.2.1. Principe

La méthode FRAP est basée sur la réaction de réduction de fer ferrique (Fe3+) présent dans

le complexe K3Fe(CN) 6 en fer ferreux (Fe2+) par un antioxydant, la réaction est révélée par

le virement de la couleur jaune du fer ferrique (Fe3+) à la couleur bleue - vert du fer ferreux

(Fe2+). L’intensité de cette coloration est mesurée par spectrophotométrie à 700 nm.

1.4.1.2.2. La technique

Pour le test de FRAP, nous avons suivi la technique de Yildirim et al., (2001) qui consiste à

prélever 0,5 ml de l’extrait brut butanolique et acétate à différentes Concentrations et les

mélanger avec 1.25 ml d’une solution tampon phosphate à 0,2 M (pH= 6,6) et 1,25 ml d’une

32


solution de ferricyanure de potassium K3Fe(CN)6 à 1%. Le tout est incubé à 50°C pendant 20

min, puis refroidi à la température ambiante. 2,5 ml d’acide trichloracétique à 10% sont

ajoutés pour stopper la réaction, puis les tubes sont centrifugés à 3000 tr/min pendant 10min.

1,25 ml du surnageant sont ajoutés à 1,25 ml d’eau distillée et 250 μl d’une solution de

chlorure de fer (FeCl3, 6H2O) à 0,1%. La lecture des absorbances se fait par

spectrophotométrie à une longueur d’onde de 700nm. Des témoins de contrôle utilisant

l’acideascorbique sont inclus dans l’expérimentation.

33

Résultats et discussion

1. Analyse qualitative

1.1. Screening phytochimique

Des tests phytochimique ont été appliqués sur les différents extraits aqueux et hydro

alcoolique par différentes méthodes (décoction, infusion et macération).

Un test phytochimique permet l’identification des différentes familles de métabolites

secondaires existants dans la partie étudiée de la plante(les alcaloïdes, les flavonoïdes,…etc.)

Par des réactions de précipitation ou de coloration par des réactifs spécifiques à chaque

famille ainsi que de l’examen en lumière Ultraviolette.

Tableau 08 : Les résultats de screening phytochimique effectués sur les graines de Nigella Sativa sont

mentionnés dans le tableau suivant.

Métabolites

secondaires Réactifs ou méthodes Extrait Extrait aqueuses

alcoolique

Flavonoïdes NaOH +++ /

Mayer _ /

Alcaloïdes

Wagner +++ /

Dragendorff +++ /

Saponines Indice de mousse / +

Coumarines UV à 365 ++ /

Stérols Réaction de Liebermann _ /

Tannins FeCl3 / +++

Résines Précipitation _ /

Phlobatannins HCL + /

Composés volatils Hydrodistilation / ++

+++Fortement positive ; ++Moyennement positive ; + Faiblement positive ; - Absent ; / ne

pas tester.

34


phytochimiques de Nigella sativa révèle une présence très remarquable des métabolites

secondaires à savoir, les flavonoïdes, les alcaloïdes, les tannins et une moyenne présence des

coumarines ainsi que les huiles essentielles et une faible présence de phlobatannins et

saponines et absence des stérols et des résines(tableaux 08 et figure 09 ). Ces résultats suggèrent

que les grains de cet espèce est une source de molécules biologiquement actives tel que

alcaloïdes, les phénols et les tannins… Fig.12 Résultats de screening phytochimiques

Photo : 1 Test des flavonoïdes Photo : 2 Tests des alcaloïdes

Photo : 3 Test des saponines Photo : 4 Test de Coumarines

35


Photo : 5 tests de résine Photo : 6 Test de Tannin

Photo : 7 Test de phlobatannins

2. Analyse quantitative

2.1. Extraction des flavonoïdes et détermination du rendement de

l’extraction

L’extraction des flavonoïdes et détermination du rendement de l’extraction à partir de

l’extrait brut (hydrométhanolique) des graines de Nigella sativa a été effectuée par les

solvants organiques à partir d’une poudre végétale.

La séparation est basée sur le degré de solubilité des polyphénols dans les solvants

organiques d’extraction (l’éther de pétrole, chloroforme, l’acétate d’éthyle, n-butanol) et donc

selon leur degré de glycosylation (flavonoïdes aglycones, mono, di et tri-glycosylés).

36


Les deux fractions récoltées acétate d’éthyle (ACT) et butanolique (BUT) qui font l’objet

de cette études.

La couleur, l’aspect ainsi que le rendement de chaque fractionsont représentés dans le

tableau et figure ci-dessous.

Tableau 09: Aspects, couleurs et rendements des fractions des graines de Nigella sativa

Fraction Aspect Couleur rendement℅

ACT Pâteux Marron foncé 1,6316

BUT Pâteux Marron foncé 0,47733

2

1,5

1

Rendement% 0,5

0

ACT BUT

Fractions

Fig. 13 le rendement d’extraction des fractions des graines de Nigella sativa.

Les résultats obtenus montrent que parmi les différentes fractions de l’extrait brut, la

fraction ACT représente le rendement le plus élevé avec un taux de 1 .631% ainsi que la

fraction BUT a été représenté par un taux de 0.477%.

Nos résultats d'extraction, montre que le taux de rendement est proche à celle obtenus par

(Meziti, 2009), dont le rendement d'extraction de la fraction ACT était de 2,88%.

La composition chimique d’une espèce varie selon les espèces et au sein de même espèce,

elle dépend de plusieurs facteurs tel que : les conditions de culture (qualité du sol, climat,

irrigation, traitements phytosanitaires), de la période de récolte (précoce ou tardive) et la

37


méthode d’extraction et même le type des solvantsselon la méthode de Markham, (1982),

avec modification inspirée selon la méthode de Bruneton, (1999), Bekkara et al.,(1998).

A notre connaissance, les informations relatives au taux de rendement de la fraction BUT de

NS ne sont pas disponibles, par conséquent, il est difficile de comparer les résultats avec des

travaux antérieurs.

2.2. Quantification des composés phénoliques

2.2.1. Résultats de dosage des composés phénoliques totaux

Les teneurs en polyphénols totaux dans l’extrait des graines de Nigella sativa a été

déterminé à partir des courbes d’étalonnages réalisées avec l’acide gallique (figure 15).

1,2

1 R² = 0,9887

nm

0,8

à 7

65

Ab

sorb

ance

0,6

0,4

0,2

0 0 20 40 60 80 100 120

Concentration (µg/ml)

Fig. 14 Droite d'étalonnage de l’acide gallique.

Nos résultats montrent que la fraction ACT de Nigella sativa contient une quantité de

polyphénols avec une teneur de 9 ,30 ±0,00057 µg EAG/mg d’extrait, tandis que la fraction

BUT contient une quantité de polyphénols estimée de 0,058 ± 0,00057 μg EAG/mg.

Ces résultats sont différent à ceux publiés par Meziti, 2009 dont ses résultats a montré que

l‘extrait d’acétate d’éthyle contient 72,43 ± 2,94 µg EAG/mg d’extrait.

Les résultats de dosage des polyphénols totaux dans les échantillons de Nigella sativa

analysés sont rapportés dans le tableau11.

38


Tableau:10 Dosage des polyphénols totaux dans les fractions des graines de Nigella sativa.

Fraction Teneur en acide gallique μg EAG/mg PS des fractions

ACT 9.30±0,00057

BUT 0.058±0,00057

2.2.2. Résultats de dosage des flavonoïdes

Le dosage des flavonoïdes est réalisé par la méthode colorimétrique au chlorure

d’aluminium (AlCl3) décrite par Zhishen et al., (1999) puis par Chen et Chen, (2011) avec

quelques modifications de (Ghnimi, 2015) la courbe d’étalonnage a été déterminée par la

quercétine.

Fig.15 Droite d'étalonnage de la quercétine.

Les résultats (sont représentés dans le tableau12) de la détermination quantitative des

flavonoïdes pour la fraction ACT, et la fraction BUT sont respectivement de 1.425±0,0015 μg

EQ/mg PS ,1.080±0,0011 μg EQ/mg PS.

Tableau 11 : Dosage des flavonoïdes dans les fractions des graines de Nigella sativa.

Fraction Teneur en quercétine μg EQ/mg PS des fractions

ACT 1.425±0,0015

BUT 1.080± 0,0011

39


Les travaux de Meziti, (2009) portés sur la fraction ACT des grains de NS, ont montré une

teneur en flavonoïdes supérieur à celle trouvé dans notre étude, dont le taux a été estimé à

4,19 ± 0,089 µg EQ/mg d’extrait.

En effet, plusieurs facteurs peuvent avoir un impact sur la répartition qualitative et

quantitative des composés phénoliques dans les fractions tel que les propriétés génétiques des

graines ainsi qu’à l’origine géographique, les conditions et la durée de stockage, de la récolte

et également les méthodes d’extraction appliquées.

Bien qu'il existe des rapports antérieurs sur le dosage des flavonoïdes et polyphénols de

différents extraits de NS, il faut noter qu’aucune études n’a était réalisée concernant la

fraction BUT de NS, ce qui rend difficile la discussion les résultats de cette fraction.

2.3. L’activité antioxydante

2.3.1. Piégeage du radical libre DPPH

L’activité antioxydante a été évaluée par la méthode du radical (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazil).Cette méthode est basé sur la réduction de la solution de DPPH en présence

d’un antioxydant pu se traduit par la transformation de la couleur violet en couleur jaune.

Fig.16 Résultats d’activité antioxydante DPPH (ACT, BUT)

40


80 y = 4,7666x + 43,038

80

70 R² = 0,859 70

60 60

% d

'ihin

ibit

ion

d'h

ini

bit

ion

xe

y = 14,9ln(x) + 45,346

50

50

R² = 0,9172

40 40

30 30

20

%

20

10 10

0 0

0 2 4 6 8

0 2 4 6 8

Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml)

Fig.17 Pourcentage d’inhibition de DPPH par la fraction ACT de Nigella sativa.

60 90 y = 30,383x + 10,269

80

50

R² = 0,9935

dh

inib

itio

nxe

70 y = 19,377ln(x) + 50,604

40

%

d'h

inib

it

ion

60

R² = 0,9668

30 50

40

20

30

%

20 10

10

0 0 0 0,5 1 1,5 2 0 2 4 6 8


Fig.18 Pourcentage d’inhibition de DPPH par la fraction BUT de Nigella sativa.

41


Les valeurs d’IC50 obtenus dans ce test montrent que les fractions ACT et BUT des graines

de Nigella Sativa possèdent de très faible capacités réductrices avec des IC50 de 1,460mg/ml,

et1, 307mg/ml pour les deux fractions respectivement, ainsi que une valeur de 0,00324 mg/ml

marqué pour quercétine (figure16).

1,5

1

IC50mg/ml

0,5

0

ACT BUT Quercétine

Fig.19 les valeurs d’IC50 des fractions ACT et BUT de Nigella sativa.

Cette activité est plus inférieur par rapport les résultats trouvé par Meziti (2009) qui montre

que la fraction ACT possède un pouvoir réducteur présumée avec une IC50= 121 ,62 ± 2,60

μg /ml.

L’activité anti-radicalaire des extraits est donc relativement dépendante de la teneur en

polyphénols totaux et en flavonoïdes, qui réduisent et décolorent le DPPH en raison de leur

capacité à céder l’hydrogène (Pooter, 1986), qui est directement liée à la richesse de l’extrait

en hydroxyles phénoliques.

Selon Kadri et al., (2011)Une valeur plus faible de l’IC50 (la concentration du substrat qui

cause une inhibition de 50 % de l’activité de DPPH) indique une activité antioxydante plus

élevée. À travers cela, nous concluons que la quercétine a une activité antiradicalaire très

forte par apport les deux fractions ACT et BUT qui ont montré presque le même pouvoir

antioxydant modéré vis-à-vis du radical DPPH.

Notre résultat pour la fraction ACT presque le même obtenu par (Mariod et al., 2009) avec

une valeur d’IC50 égale 1,89 ±0,12 mg/ml. Une autre étude par El-Agbar et al (2008) et Mariod et al (2009) montrent que l’extrait

méthanolique possède un effet antiradicalaire de l’ordre d’IC50= 168,8 ± 2,1et 2260 μg/ml

respectivement.

D’autre part Zaher et al (2008) ont rapporté que l’extrait aqueux des graines de Nigella

sativa possède une activité antioxydante très importante avec une CI50 = 3 μg/ml.

42


Les polyphénols contenus dans les extraits et huiles des graines de Nigella sont

probablement responsables de l’activité antioxydante des extraits (Talbi et al., 2015).

Cette différence dans l’IC50 peut être devient la cause de la concentration de DPPH utilisée

dans le test part et d’autre part à l’influence des autres facteurs qui peuvent affecter la

composition chimique(les polyphénols totaux, flavonoïdes) et par conséquence la capacité

antioxydante de l’échantillon, en outre, la variété des graines, les conditions des croissances

de la plante, les conditions de stockages des graines et les méthodes d’extractions pratiques.

Sont des facteurs importants en influents dans la capacité de l’antioxydante des molécules

bioactives.

De même, aucune étude n’a été réalisée sur l’activité antioxydante de la fraction BUT de

graines de Nigella Sativa pour cela, il est difficile, voire impossible de comparer nos résultats

avec les autres travaux.

43


Propriété réductrice

Le test de FRAP est un essai simple, rapide et reproductible. Il est universel peut être

appliqué aussi bien chez les plantes que les plasmas et dans les extraits organiques et aqueux

(Li H-B et al., 2008).

Les résultats obtenus sont illustrés dans les figures 21 et 22 :

0,6

0,5 R² = 0,960

nm

0,4

à 7

00

0,3

Ab

sorb

an

ce 0,2

0,1

0 0 0,5 1 1,5 2

Fig. 20courbe de réduction de fer par la fraction ACT de Nigella Sativa.

0,6

nm

0,5 R² = 0,942

à 7

00

0,4

Ab

sorb

an

ce

0,3

0,2

0,1

0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Concentration mg/ml

Fig. 21courbe de réduction de fer par la fraction BUT de Nigella Sativa

44


D’après les graphes de la figure 21 et 22, nous remarquons que l’augmentation de la

réduction du fer est proportionnelle à l’augmentation de la concentration des extraits ACT

et BUT.

Les deux extraits montrent une activité intéressent, autrement dit, à une concentration de

0,375mg/mL, ces extraits ont des densités optiques (DO) égales à 0,462et0, 465 mg/ml

respectivement. Alors qu’en augmentant la concentration à 0,75mg/ml, l’absorbance est de

0,521et 0,541mg/ml respectivement.

Nous pouvons noter que l’extrait ACT a présenté le plus d'activité le fer par rapport à

l’extrait BUT, dont l’extraits acétate a un EC50 de 1,26±0,06mg/ml supérieur à celle de

l’extrait butanolique qui donne une valeur de 0,586±0,189mg/ml.

1,4

1,2

1

0,8

0,6

EC50 0,4

0,2

0 ACT

BUT

Fraction

Fig .22 les valeurs d’EC50 des fractions ACT et BUT de Nigella Sativa.

A noter qu’aucune étude n’as été exploité ces deux fractions avec le test de FRAP, ceci qui

rend difficile de comparer nos résultats avec ceux de la bibliographie.

Les études élaborés par Benbouriche et Boudiab(2012) ont montrent que l’extrait

méthanolique possède un pouvoir réducteur exprimé par EC50 égale à 0, 175 mg/ml.

Dans une autre étude de Rouba, (2012), les valeurs des EC50 des deux extraits

polyphénoliques délipidé (ED) et non délipidé (EnD) des graines de Nigella Sativa sont

3,35µg/ml et 5 1333µg/ml respectivement.

Les résultats obtenus par Mosbah, (2016) montrent que l’huile totale présente la meilleure

capacité avec une EC50de 85.93 mg/ml suivi par la fraction neutre avec 141.15 mg/ml.

45

: Résultats et discussion

Les résultats obtenus par (Lamaoui, 2014) montrent que les huiles essentielles

commerciales et Algérienne possèdent un fort pouvoir réducteur(les’EC50sontde l’ordre

de132, 56±1,75et133, 37±1,227….), qui est plus important par rapport à nos extraits.

Le pouvoir réducteur des graines de NG probablement dû à la présence de groupement

hydroxyle dans les composés phénoliques qui peuvent servir comme donneur d’électron. Par

conséquent, les antioxydants peuvent être considérés comme des réductants et inactivateurs

des oxydants (Siddhuraju et Becker, 2007).

Des études antérieures ont également montré que le pouvoir réducteur d'un composé peut

servir comme indicateur significatif de son activité antioxydante potentielle (Jeong et al.,).

L’aptitude d’un échantillon de donner un électron reflète leur pouvoir antioxydant, et la

réduction de Fe3+ est un indicateur de la capacité de l’échantillon de donner un électron

(Gholivand et al., 2010). Par conséquent, Fe2+ peut être évalué en mesurant et en surveillant

l’augmentation de la densité de la couleur bleu dans le milieu réactionnel à 700nm

(Kumaranet al., 2007).

Dans notre étude, le test de l'activité antioxydante qui a réalisé par la méthode de FRAP

pour des fractions ACT et BUT de Nigella sativa représente un meilleur effet (pouvoir

réducteur) par rapport la méthode DPPH qui donne une activité antioxydante très faible.

46

Conclusion

Conclusion

La Nigelle est une plante herbacée, aromatique et médicinale connue pour leurs propriétés

biologiques intéressantes sont utilisées dans divers domaines en médecine, pharmacie,

cosmétologie et en agriculture.

Les analyses qualitatives ont mise en évidence la présence des métabolites secondaires tels

que : des flavonoïdes, des tannins, les flavonoïdes, les alcaloïdes, les tannins , les coumarines

ainsi que les huiles essentielles.

La détermination du rendement d’extraction des polyphénols de Nigella Sativa par

fractionnement de l’extrait méthanolique a révèle que les rendements de l’Acétate d’éthyle,

butanol est de l’ordre de 1,887%, 1,432% respectivement.

Les résultats quantitatives a été déterminé par le dosage des polyphénols a révélé une

teneur de 9.30±0,00057μg EAG/mg d’extrait ACT et une teneur de0.058 ±0,00057μg

EAG/mg d’extrait BUT, tandis que le dosage des flavonoïdes contenus dans l’extrait acétate

et butanol a été déterminé par les teneurs de 1,425±0,0015 et 1,080±0 ,0011μg EAG/mg

respectivement.

L’activité antioxydant de l’extraits des graines de la nigelle a été évaluer par la méthode de

réduction de radical libre DPPH qui a montré que l’extrait ACT a un IC50 égale à

1,460mg/ml, Suivi par l’extrait BUT1, 307mg/ml Alors que et le test de pouvoir réducteur FRAP indique que les deux fractions ACT, BUT

possèdent une activité1, 26 mg/ml avec un taux égales à 0,58 mg/ml respectivement.

En conclusion, les graines de Nigella Sativa possèdent une gamme extraordinaire de

molécule bioactive qui lui confère plusieurs propriétés biologiques telles que l’activité

antioxydante.

Ces résultats restent préliminaires et il serait intéressant d’utiliser des méthodes plus

performantes pour isoler les molécules bioactives et tester leurs activités.

47

Résumé

Résumé

La Nigelle ou Nigella sativa, plante herbacée de la famille des Renonculacées, est utilisée

depuis des siècles au médicine traditionnelle. L’objectif de cette étude est l’évaluation des

pouvoirs antioxydant des fractions obtenues à partir de graines de la nigelle commerciale.

L’évaluation préliminaire de la composition des graines de Nigella sativa a révélé la présence

de de molécules biologiquement actives telles qu’alcaloïdes, les phénols, les tannins,

alcaloïdes, et saponosides…

Le rendement de l’extraction par l’acétate d’éthyle ACT (1,6316%) est supérieur à celui de

l’extraction butanolique BUT (0,47733%). La teneur en polyphénols de Nigelle est 9 ,30±

0,00057735 μg EAG/mg de fraction acétate et 0,058 ±0,00057735 μg EAG/mg de fraction

butanol ainsi, la teneur en flavonoïde de fraction acétate 1.425± 0,001527525 μg EQ/mg PS

est importante par rapport à la teneur en flavonoïdes de fraction butanol BUT (1 .080±

0,001154701 μg EQ/mg PS).

Par ailleurs les fractions acétate ACT et butanol BUT ont montré presque le même pouvoir

antioxydant modéré vis-à-vis du radical DPPH avec des IC50 de l’ordre de 1,460 et 1,307

mg/ml respectivement. Tandis que les fractions acétate et butanol de notre plante présentent

un pouvoir réducteur pour le FRAP avec une CE50 égale à / ml, respectivement.

Le pouvoir réducteur des deux extraits a montré que l’extrait acétate est plus actif que l’extrait

butanolique.

Les mots clé : Nigella sativa, pouvoir antioxydant, polyphénols, flavonoïde, DPPH, FRAP.

Résumé

Abstract

The Nigella or Nigella sativa, herbaceous plant of the family Rennunculaceae, has been used

for centuries on traditional medicine. The objective of this study is the evaluation of the

antioxidant powers of the fractions obtained from the seeds of commercial nigelle.

The preliminary evaluation of the composition of Nigella sativa seeds revealed the presence

of biologically active molecules such as alkaloids, phenols, tannins, alkaloids, and

saponosides... The yield of extraction by ethyl acetate( ACT) (1.6316%) is greater than that of butanolic

(BUT) extraction (0.47733%).The polyphenol also showed values estimated at 9, 30 ±

0.000577 for and0.058 ± 0.000577μg EQ / mg PS for BUT. Whereas, those of the flavonoid

content of acetate fraction 1.425 ± 0.00152 μg EQ / mg PS is important compared to the

flavonoid content of butanol fraction (1.080 ± 0.001154701 μg EQ / mg PS). Moreover, the acetate and butanol fractions showed almost the same moderate antioxidant

power for DPPH radical with IC50 of the order of 1.460 and 1.307 mg / ml respectively.

While the acetate and butanol fractions of our plant have a reducing power for the FRAP with

an EC50 equal to / ml, respectively. The reducing power of the two extracts showed that the acetate extract is more active than the

extract butanol. Key words: Nigella sativa, l’activité antioxydant power, polyphénols, flavonoïd, DPPH,

FRAP.

Résumé

ملخص

Nigelle أوNigella sativa ،)للعائلة الحوذانية ينتمي عشبي نبات )الحبة السوداء أو سنوج

Renonculacées ، الدراسة هذه من الهدف إن حيث الطب التقليدي ، في قرون منذ استخدامه تم فقد

وذلك من خلال ( الايثيل , بيتانول اسيتات للمستخلصين) سدةللأك المضادة القدرة تقدير في يتمثل

الحصول عليهما من بذور الحبة السوداء التجارية.

وهو نسبة اكبر (٪66.6..) الإيثيل يتمثل في أسيتات لمستخلص إن المردود الذي تم الحصول علبه

(.٪66..0.4) من الذي تم الحصول عليها من المستخلص البيتانولي

أما ,(EAG μg / mg) ..0.0000 ±9.60الإيثيل هو مادة اليفينولات لمستخلص أسيتات محتوى

بينما كان محتوى ,(EAG μg / mg) ..0.0000 ± 0.008مستخلص البيتانول فهو يحتوي على

.,0.00.0±4,0,.الايثيل و البيتانول هو لمستخلص اسيتات الفلافونويدات

.,080±0.00..04.0. (EQ μg / PS mg. )

للأكسدة وذلك عند تقييم القدرة المضادة و مستخلص البيتانول تقريبا نفس الأسيتات لقد أظهر مستخلص

.التوالي على ، مل/ ملغم .60.. و 460..هي IC50حيث أن قيم DPPH النشاطية المضادة لجذر

.على التواليالقدرة الارجاعية لمستخلص الأسيتات البيتانول هي كما أن

DPPH ، النشاط مضاد للأكسدة ، البوليفينول ، الفلافونويد، Nigella sativa : الكلمات المفتاحية

، .FRAP

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http://bibliotheque-islamique-coran-sunna.over-blog.com/%201%20Les%20bienfaits%20de%20la%20graine%20de%20nigelle



Annexe

Annexes :

Annexe 1 : matériels et solvants utilisés.

Equipements : Verreries et Solvants et réactifs :

autres matériels :

-Rota vapeur (de Type -Bécher. Solvants : -Erlenmeyer. -Méthanol

Heidolph). -Fioles. -Chloroforme,

-Spectrophotomètre -Micropipette. -hexane,

-Agitateur magnétique - Tubes. Acides :

(de type Heidolph). -Papier filtre. -Chlorure d’hydrogène

-Clevenger -Papier film et papier HCl

-Vortex aluminium. -Acide tricoloacétique

-Bain marie -Boite de pétri. (TCA).

- Lampe UV. -Les écouvillons. -Chlorure d’aluminium

-Centrifugeuse. -Eprouvette graduées. AlCl3

-Balance. -Ampoule à décante. -AC.Sulfurique,

-Plaque chauffante (de -Spatule. -acide acétique.

type Heidolph). -Verre à montre. Réactifs :

-Balance de précision (de -Entonnoir en verre. -Eau physiologique

type OHAUS -Flacons. -Folin-Ciocalteu

ADVENTURER°). -Ballons. -dragondorff

-1diphenyl-2-

picrylhydrazyl(DPPH)

-Carbonate de sodium

Na2CO3

-Chlorure d’aluminium

AlCl3

-Ammoniaque,

-Pouvoir antioxydant

réducteur du fer : FRAP

Annexe 2 : Réactifs utilisés dans le screening phytochimique des Tannins.

1. Réactif de Stiasny

La préparation de ce premier s’effectue comme suit :

Ajouter 25ml de formol à 40% et 25ml d’acide chlorhydrique.

Annexe

Annexe 3 : Résultats d'extraction.

Les deux fractions Fraction ACT Fraction BUT

Fig. Résultats d'extraction.

Annexe 4 : Dosage

1. Dosage des polyphénols totaux des fractions.

FACT FBUT

Fig. Résultats de dosage des polyphénols totaux des fractions.

Annexe

2. Dosage des Flavonoïdes pour les fractions.

FACT FBUT

Fig. Résultats de dosage des flavonoïdes des fractions.

Annexe 5 : Activité antioxydante.

1) DPPH

Figure : Courbe d’activités antiradicalaires de la quercétine.

Annexe

FACT FBUT

Fig. Résultats d’activité antioxydante DPPH

80 y = 4,7666x + 43,038

60

y = 30,383x + 10,269

70 R² = 0,859

50 R² = 0,9935

60

D h i n i b i t i o n x e

50 40

40 30

30

%

20

20

10 10

0 0 0 2 4 6 8 0 0,5 1 1,5 2


Fig. Pourcentage d’inhibition de DPPH par la fraction ACT et BUT de Nigella sativa.

Date de soutenance Zerzi Fatima 15 Septembre 2019

Bechegaoui Leila

Contribution à l’étude des substances bioactives et

de l’activité antioxydante des deux extraits des

graines de Nigella sativa

Résumé

La Nigelle ou Nigella sativa, plante herbacée de la famille des Renonculacées, est utilisée depuis des siècles au médicine traditionnelle. L’objectif de cette étude est l’évaluation des pouvoirs antioxydant des fractions obtenues à partir de graines de la nigelle commerciale. L’évaluation préliminaire de la composition des graines de Nigella sativa a révélé la

présence de de molécules biologiquement actives telles qu’alcaloïdes, les phénols, les tannins, alcaloïdes, et saponosides… Le rendement de l’extraction par l’acétate d’éthyle ACT (1,6316%) est supérieur à celui de

l’extraction butanolique BUT (0,47733%). La teneur en polyphénols de Nigelle est 9 ,30±

0,00057735 μg EAG/mg de fraction acétate et 0,058 ±0,00057735 μg EAG/mg de fraction

butanol ainsi, la teneur en flavonoïde de fraction acétate 1.425± 0,001527525 μg EQ/mg PS

est importante par rapport à la teneur en flavonoïdes de fraction butanol BUT (1 .080±

0,001154701 μg EQ/mg PS). Par ailleurs les fractions acétate ACT et butanol BUT ont montré presque le même pouvoir antioxydant modéré vis-à-vis du radical DPPH avec des IC50 de l’ordre de 1,460 et 1,307

mg/ml respectivement. Tandis que les fractions acétate et butanol de notre plante présentent un pouvoir réducteur pour le FRAP avec une CE50 égale à 1,26 et 0,58 mg / ml,

respectivement. Le pouvoir réducteur des deux extraits a montré que l’extrait acétate est plus actif que l’extrait butanolique. Les mots clé : Nigella sativa, pouvoir antioxydant, polyphénols, flavonoïde, DPPH, FRAP

Président : Dr.Hamadouche Nadira

MCA. Université d’Oum El Bouaghi

Rapporteur : Dr. Mosbah Camélia

MCB à l’université d’Oum El Bouaghi

Examinatrice : Dr. Bouhbila Aziz

M.C.B à l’université d’Oum El Bouaghi

Année universitaire : 2018-2019

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