Florence Migot-Nabias

UR 10 « Santé de la mère et de l’enfant »IRD, Dakar, Sénégal

migot@ird.sn

Facteurs génétiques humains& paludisme à P. falciparum

Existence d’une régulation génétique des réponses immunitaires spécifiques du

paludisme

Différences individuelles, familiales ou ethniques des réponses immunitaires contre P. falciparum, dans des conditions d’exposition identiques

Concordance plus importante entre jumeaux monozygotes que dizygotes:

Pour le développement de fièvre lors d’un accès palustre: régulation génétique des cytokines pyrogènesPour la production d’anticorps dirigés contre différents antigènes plasmodiaux

Système HLA & paludisme

Souris:restriction génétique des réponses lymphocytaires à des épitopes de la CSP et de Pf155/RESA

Accès palustre grave: Protection contre le neuropaludisme (HLA-B53) et contre l’anémie sévère liée au paludisme (HLA-DRB1*1302-DQB1*0501)Plus grande susceptibilité au neuropaludisme chez les sujets homozygotes ou hétérozygotes pour l’allèle TNF-308AAllèle TNF-238A associé (+) à l’anémie sévère liée au paludisme ou (-) au neuropaludisme

Accès palustre simple:HLA I et II non associés à la résistance aux accès simples Présence ou non de relations entre allèles HLA I et II et réponse immunitaire à des antigènes des stades sanguins de P. falciparum

DN DO

Organisation génétique du système HLA

Centromère duchromosome 6

Classe II Classe III Classe I

D C4A, C4B, C221-OHase

B C A

TNF

α β

(α2)

(β2)

α1

β1

DQ

(α)(α2) α1

(β2) β1

DP

(β1)

DR

α

β1 β3 β4

Association peptide/HLA I et reconnaissance par les LyT cytotoxiques

In: « Immunologie », Revillard, 1994

CPAcytoplasme

protéine HLA classe Ipeptideprotéasome β2-microglobuline

Réticulum endoplasmiqu

e

Golgi

Vésicule de sécrétion

Ly T cytotoxique

CD8

TCRLyse de la cellule infectée

Association peptide/HLA II et reconnaissance par les LyT auxiliaires

In: « Immunologie », Revillard, 1994

CPA -cytoplasme-

Réticulum endoplasmique

+ + =

I α β αβ + I

Ly T auxiliaire

CD4

TCRProtéine exogène

récepteur

Endosome(protéases

)

Compartiment des molécules HLA classe II

Dissociation et dégradation de la chaîne I+

GolgiLysosome

peptides

•Production d’anticorps par les Ly B

•Relargage de cytokines induisant la lysedes micro-organismes intracellulaires par les macrophages

Facteurs non-HLA de régulation génétique

Contribution importante de gènes non liés à la région HLA dans la régulation génétique des réponses immunitaires dirigées contre P. falciparum

La région chromosomique 5q31-q33 (gènes de cytokines, gènes de régulation de la réponse immune) interviendrait dans le contrôle des niveaux d’infection par P. falciparum

Polymorphisme érythrocytaire & paludisme

Protection cliniqueTrait drépanocytaire, alpha-thalassémie, déficit en G6PD, ovalocytose, groupe sanguin ABO, groupe Duffy

Mécanismes proposésModification des antigènes érythrocytaires de surface favorisant la reconnaissance immunitaire (alpha-thal)Sensibilité accrue au stress oxydant favorisant la phagocytose des parasites (déficit G6PD)Ralentissement de la croissance parasitaire dans les hématies anormales (Hb S)Facilitation (groupe A) ou limitation (groupe O) de la formation de rosettes

Autres polymorphismes érythrocytaires moins directement liés à la protection

Hb C, Hb E, béta-thalassémie, récepteur du complément CR1

Pourquoi s’intéresser en 2004 au polymorphisme érythrocytaire en relation

avec le paludisme ?

Les particularités des érythrocytes « anormaux » peuvent être utilisées pour la conception d’un vaccin

Utilisation de la réponse anticorps anti-bande 3 (protéine exprimée à la surface des érythrocytes sénescents, ou infectés par Plasmodium, ou de sujets drépanocytaires, déficitaires en G6PD ou béta-thalassémiques)JR Kennedy, Int J Parasitol 2001 & Med Sci Monit 2002

Les modifications des réponses immunitaires spécifiques engendrées par les facteurs génétiques affectant l’érythrocyte restent méconnues

Nos programmes de recherche au Gabon (1995-2001) puis au Sénégal (2002-2005)

Structure de l’hémoglobine

Chromosome 11

Chromosome 16α2 α1α2 α1

Gγ Αγ δ β

Gγ Αγ δ β

naissance

αβ

δγ

Hb Fα2 γ2

Hb Aα2 β2

Hb A2α2 δ2

α

α

β β

hème

Trait drépanocytaire & Paludisme

Mutation ponctuelle au locus des β globines (hémoglobine S): Hb AS

Fréquence variant de >20% en Afrique équatoriale à <5% en Afrique du nord

Protection des jeunes enfants Hb AS contre les accès simples (60%) et graves (90%) (Hill 1992)

Mécanismes:Élimination plus rapide des GRP falciformes par la ratePersistance de Hb F qui retarde la croissance du parasite

HbS-F5’agtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatggtgcatctgactcc(93pb)/tgTggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccaccc(201pb)/ttAggctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctg(75pb)

HbS-R: 3’agacaggtgaggactacgac 5’

Séquence du fragment amplifié du variant HbS(chromosome 11, exon 6 du gène de la béta-globine, 369 pb)

Substitution nucléotidique A>T entraînant une modification d’acide aminé Glu>Val

Digestion par l’enzyme de restriction Dde I:La mutation abolit le site de coupure

294 pb201 pb

93 pb75 pb

Hé HéHo NPM

Détermination du variant HbS (PCR-RFLP)

Alpha-thalassémie & Paludisme

Délétion d’1 à 4 gènes de l’alpha globine

Afrique: -α3.7 thalassémie (5-40%)

La délétion α+ homozygote (-α/-α) favorise l’infestation précoce des enfants par P. vivax. Ceci permettrait le développement ultérieur d’une meilleure immunité vis-à-vis de P. falciparum et aussi envers d’autres agents infectieux (Williams 1996, Allen 1997)

Détermination des –α3.7 thalassémies par PCR

5’ 3’α2 α1

La délétion -α 3.7 de 3.7 kb entraîne la formationd’un gène hybride fonctionnel α2α1

α2α1

TS1 TS2 TS1 TS3

α0/α+

α+ homozygoteα+ hétérozygote

Appellation

1,9---/-α3.7

1,9--α3.7/-α3.7

1,9 + 2,11,9-α3.7/αα

2,1 kb1,9 kbαα/αα

TS1/TS3 (α1)TS1/TS2 (α2)Génotype

Déficit en G6PD & Paludisme

Etudes épidémiologiques

400 millions de personnes concernées dans le mondeVariant G6PD A- associé à 46% (58%) de réduction du risque d’infection sévère chez les filles hétérozygotes (garçons hémizygotes) – Ruwende 1995 -

Mécanismes en jeu

Le déficit en G6PD crée un stress oxydant qui altère la croissance du parasite dans le GRAprès 4 à 5 cycles de schizogonie, le parasite s’adapte en exprimant sa propre G6PD – Usanga & Luzzatto 1985 -

Déficit en G6PD / Physiologie

La Glucose-6-Phospho-Déshydrogénase (G6PD)

Enzyme cytoplasmique qui catalyse la première réaction de la voie des pentoses phosphates contribue à diminuer le stress oxydant subi par les cellules

Gène porté par le chromosome X

Phénomène de lyonisation de l’XNécessité de mener des analyses séparées en fonction du sexeA un génotype donné ne correspond pas un phénotype donné

Variants G6PD en Afrique sub-saharienne

3 variants alléliques principaux parmi les 400 identifiés

Génotypes et phénotypes

BA-, AA-, A-A-BB, BA, AAFemmeA-B, AHomme

DéficitaireNormal

G6PD B, 60 à 80%activité enzym. normale

G6PD A, 15 à 40%activité enzym. de 85%

mutation ponctuelle 376G

G6PD A-, 0 à 25%activité enzym. de 12%

mutation ponctuelle 202A additionnelle à 376Gautres mutations additionnelles: 542T (Santamaria), 680T et 968C

Détermination du variant G6PD A (PCR-RFLP)

G6PD-35’ctgcgttttctccgccaatcatagttgggtgtcatgattttggagagagagctttctccagtgtatttctcccaggtcaaaatatcctgaaatctggcctctgtcctaaggcacaggggtcccagcctggggcagtgtctgtgctgcctgctttggcctccctccctctGgatgtgcagagct(183pb)/gctaagatggggctgaacccagtgtgggacggggacactgacttctgagggcaccctccctggacctccagggaagaccctccactcccctggggcagaacacacacggactcaaagagaggggctgacatctgtctgtgtgtctgtctgtccgtgtctcccaggccaccccagaggagaagctcaagctggaggacttctttgcccgcaactcctatgtggctggccagtacgatgatgcagcctcctaccagcgcctcaacagccacatGgatgccctccacc(285pb)/tggggtcacaggccaaccgcctcttctacctggccttgcccccgaccgtctacgaggccgtcaccaagaacattcacgagtcctgcatgagccagatgtaaggcttgccgttgccct(117pb) 3’ G6PD-2:3’cattccgaacggcaacggga 5’

Séquence du fragment amplifié du variant G6PD A (chromosome X, exon 5, 585 pb)

117 pb

402 pb

285 pb

183 pbDigestion par l’enzyme de restriction Fok

I: la mutation crée le site de coupure

M = homo- ou hémi-zygoteH = hétérozygote

Substitution nucléotidique A>G en position 376de la partie codante, entraînant une modification

d’acide aminé Asn>Asp en position 126 de la protéine

Digestion par Nla III: la mutationcrée le site de coupure

Substitution nucléotidique G>Aen position 202 de la partie codante,

entraînant une modification d’aa Val>Methen position 68 de la protéine

Séquence du fragment amplifié du variant G6PD A- (chromosome X, exon 4, 109 pb)

G6PD-65’gtggctgttccgggatggccttctgcccgaaaacaccttcatcAtg(46pb)/ggctatgcccgttcccgcctcacagtggctgacatccgcaaacagagtgagcccttcttcaag(63pb)G6PD-7: 3’cgtttgtctcactcgggaagaagttc 5’

109 pb63 pb46 pb

Hét PM HomHém

PMN

Détermination du variant G6PD A- (PCR-RFLP)

Génotypage de la G6PD / Niakhar, Sénégal

403 enfants d’origine Sereer, sans lien de parenté direct

G6PD A: Filles G6PD BA = 38% et G6PD AA = 9%Garçons G6PD A = 30%

G6PD A-: seulement 1,2% (3 G6PD BA-, 1 G6PD AA-, 1 G6PD A-)

HypothèsesParticularité génétique de l’ethnie SereerAutre mutation additionnelle associée à un déficit enzymatique que la mutation 202A

Poursuite du génotypage (collaboration Hôp. Robert Debré, Paris)Enfants G6PD A: recherche des mutations 968C, 542T (Santamaria) et 680TEnfants G6PD B: recherche de la mutation 542T (Malaga)

Conclusion

Discordance des étudesAssociation possible de plusieurs anomalies génétiques

Modifications géniques importantes de l’hôte en réponse à la pression de sélection exercée par P. falciparum

Hématie: site direct d’action de l’infection palustreSystème immunitaire (MBP, répertoire TCR, cytokines …)Autres systèmes (HTA, surcharge en fer)

Polymorphisme antigénique du parasite

Complexité des interactions hôte-parasiteImplications vaccinales potentielles