Les différentes méthodes d'etude cellulaire

Khalfaoui Youness Gr E2 année universitaire 2009/2010

Les différentes méthodes d'étude de la cellule

I. Concept des tissus et des cellules :

l'histoire de la médecine et de la biologie :

concepte des tissus et celui de la cellule(dissection anatomique à l'oeil nu)

1838(schwan) utilisation du microscope, mettre en évidence la notion de cellule de l'organisme est fait de cellule

définition :

organisme : rassembler les tissus différents/nature des cellules et de leur substance élaborait formant la MEC.

Tissus : groupe des cellules à fonctions spécialisées, reliés par des systèmes de communication.

Cellules : petite compartiment limité par des membranes rompit d'une solution aqueuse, concentré d'une substance chimique.

La cellule possède : noyau : double hélice, double membrane nucléaire

cytoplasme : plusieurs réactions métaboliques de la cellule présente de nombreuses organites.

Les différents méthodes d'étude des cellules et des tissus :

les cellules sont petites 10 à 20 µm et complexe : - voir leur structure, lors composition

- comprendre le fonctionnement de leurs constituants.

Au début du 19éme siècle>> microscope photonique, lancé en descriptive des cellules, nation du regroupement des cellules = tissus

fin du 19éme siècle>> utilisation des colorants>>> visibilité des cellules et des tissus c(ontraste)

au cours du 20éme siècle>> microscopie électronique>>> détails de la cellule et du tissu>>> actuellement la biologie et mycologie moléculaire>>> étude des molécules constitutives des cellules et des tissus.

Les microscopes :

sont classés selon la nature de la source utilisée, microscope optique(lumière) grossissement×100

microscope électronique(électrons) grossissement ×30 000 à 40 000.

Microscope photonique>>> la description de la cellule= pouvoir séparateur en micromètres noyés au cytoplasme.

Microscope électronique>> les détails de la cellule== pouvoir séparateur en nanomètres de angström (ultrastructure).


Microscope optique :

(propriétés de diffraction)

observation des cellules vivantes>>>> utilisation des photons

-à contraste de phase -à interférence - à font sombre

observation des cellules mortes utilisation des rires qui veut spécifique>> fixation à des composantes cellulaires ADN et ARN.

Microscopie électronique :

systèmes analogues aux microscopies antiques. Remplacement des photons avec des électrons>>> l'étude ultrastructure de la cellule.

Microscope électronique en transmission : un rangement des organiques, membrane protéines.

Microscope électronique à balayage : contourne la surface cellulaire.

La microscopie électronique en transmission=MET

la microscopie en transmission : l'observation de l'échantillon en transparence, c'est une technique basée sur le principe de diffraction des électrons et pouvant atteindre un grandissement de 1000000 la limite de résolution dépend de la longueur d’onde des électrons, (tensions d'accélération) qui est de l'ordre de quelques en angström : structure fine de la cellule.

La microscopie électronique à balayage :MEB le faisceau électronique est refléchi par la surface de l'échantillon au lieu de la traversée comme dans la MET

l'échantillon est balayé par un faisceau convergent électrons qui est émis ensuite, détecté et converti en images sur un écran.

Son application principale et dans l'observation des structures dont les tailles varient entre celles des cellules isolées essaient de petits organismes.

Les méthodes d'étude standard en histologie :

repose sur une démarche de particulières, nécessite le passage par trois étapes :

observation (utilisation des techniques) mise en images(microscope) interprétation du résultat observé

observation :préparer des échantillons pourrait regarder en microscope optique ou électronique :fixation, inclusion, coupe, coloration, montage.Avant fixation des tissus on peut faire des appositions sur les lames permettant une étude cytopathologique des prélèvements pour des techniques particulières : congélation culture cellulaire, cytogénétique ou biologiques moléculaires.Fixation :


Conservation morphologique des structures cellulaires et tissulaires>> immobilisation des tissus, dureté des tissus.Les fixateurs utilisées sont : le formol, liquides de Bouin= formol+acide acétique +acide pyrique, paraformaldehyde.- la fixation doit être précoce- le volume du fixateur doit être suffisant (10 fois)- le temps de fixation est important selon la taille de l'échantillonInclusion :passage par plusieurs étapes : enrobage du tissu : - lavage à l’eau ou au tampon - passage à l'alcool(50,75, 97,100)>>> déshydratation- imprégnation du tissu à la paraffine>>> inclusionl'inclusion à la paraffine : 54° 56°Cinclusion à la celloidine : 25° microscope optique

inclusion à la gélatine : 37°

À la résine 60°>>> microscope électronique.L'orientation du fragment dans le sens de la coupe est indispensablecoupe en microscope :découpe de trois à 5 µm d'épaisseurrayons lumineux traversant le prélèvement ,superposition cellulaire à éviterla coupe est déposée et colé sur une lametissus frais/cryostat (examen préparatoire)découpe de 0,5 µm d'épaisseur : tissus inclus en résine(microscope électronique)colorationmettre en évidence les différents structures tissulaires et cellulaires-introduire des contrastes dans les cellules incolores(coloration topographique)-coloration standard(trichronique)

Hématoxyline :noyauHES Eosine :cytoplasme

safran :tissu conjonctif

Coloration spéciale : pour mettre en évidence d'autres structures

rouge sinus= les fibres de collagène

PAS :(acides périodiques sciff) = les membranes basales

rouge Congo= les structures amyloïdes

coloration perls= le fer

bleu alcian=les mucines

noir Soudan= les lipides(tissus frait, refroidi et occupé aux cryostat)


mise en images :

microscope optique(photonique) : les cellules sont incolores, translucides et minuscules 10 à 20 µm>> colorants= contraste microscope= visibilité

microscope électronique le bombardement électronique>> objet non vivant épaisseur inférieure à 100 nm

être traversé au balayé par les électrons

NB : préparation de l'échantillon observé.

Fixation : agents chimiques>> -aldéhydes(protéines) - oxydes métalliques(acide osmique, lipides)

Déshydratation :- alcool(concentration croissante)

- oxydes de propylène(missiles à la résine)

inclusion : aux résines hepoxy(polymérisation)

coupe : épaisseur de 50 à 100 nm montés sur des grils.

Contraste : imprégner/métaux lourds

Citrate plomb>>>membrane

Acetyl uranil>>> noyau nucléole et ribosomes

Interprétation :

donner un sens aux images observées, écarté les artefacts dans un tissu, une cellule ou des organiques particulières.

Passer d'un monde à deux dimensions à un monde réel trois dimensions

différencier entre dysplasie, hyperplasie et métaplasie

différencier entre un tissu et des artefacts

différencier entre un tissu normale et infecté

autre méthode d'étude :

c'est la détermination de la composition chimique des organiques présentant dans la cellule. L’homogenation cellulaire obtenu après balayage et analysé par les méthodes adaptées :

traditionnellement cellulaire :

consiste à séparer les constituants par lyse cellulaire rupture de la membrane cytoplasmique avec respect des structures internes et leur membrane.

Application des méthodes mécaniques, ultrasons, choc osmotique(milieu hypotonique)


centrifugation différentielle :

application de plusieurs centrifugations avec des accélérations croissantes.

Centrifugation : obtention d'un culot (constituants qui sédimente) +surnagement(constituants qui restent en suspension)les constituants sont séparés selon leur taille et leur poids : le plus gros en premier et le plus fin en dernier culot 1 : microsomes (liposomes lysosomes appareil de Golgi peroxysomes)culot 4 : ribosomesle culot obtenu n'est jamais pur il faut associer d'autres techniquesélectrophorèse : séparation en fonction de la charge sous l'influence d'un champ électrique. Méthode utilisée pour séparer les acides aminés protéines et les nucléotides migration électrophorètique des molécules ironisé sur membrane de cellulose ou sur le gel d’agaroses ou d'acide acrylamide .Culture cellulaire :culture des lymphocytesse fait dans un milieu nutritif assurant un enrichissement cellulaire >>intérêt de la cellule : chercher des anomalies chromosomiques (caryotype) ou application de la FISH.Culture des cellules tumoralesfaire des tests pharmacologiques des traitements thérapeutiques, chercher les gènes responsables de certaines pathologies(carcinome au autre)la culture des cellules résulte de la reproduction des cellules. Ce type de reproduction met en jeu la réplication de l’ADN en passant par différentes phases :phase S : synthèse de l'ADN, phase M : mitose, puis l y a les phasesG0 et G1 (gap) situé entre M et S et la phase G2 situé entre S et M.l'ensemble de ces phases forme le cycle cellulaire qui est contrôlé, cela et dont le but d'éviter les erreurs d'ADN (mutations, d'élections etc.) entraînement des pathologies graves comme la prolifération incontrôlée d'un gène= tumeur génétique(di george)la technologie de la culture cellulaire est également utilisée pour étudier le phénomène de la mort cellulairemort cellulaire :nécroseon distingue deux types de mort cellulaire nécroses et apoptose se produit quand les conditions de livres deviennent incompatibles été favorables ,la nécrose c'est une mort cellulaire qui s'associe à une inflammationmort cellulaire apoptoseil s'agit d'une élimination programmée des cellules inutiles et dangereuses pour l'organismeimmunocytochimie identification d'un antigène cellulaire tissulaireimmunohystochimie direct :AC I+AC2 couplé au fluorochrome AC I+AC2 conjugé


Intérêt de l’immunohistochimie :diagnostique : identification et classification des tumeursthérapeutique : caractére homono sensibles de tumeurs malignes.Cytomérie de flux (CMF) :rapide très sensible reproductif et qualitativeréalisé sur des cellules isolées au sur des tissus après dissociation mécaniqueanalyse un grand nombre de cellulesanalyse cellules par cellulesmesures simultanées de plusieurs paramètres (multiparamètrique)expression d'un antigène membranaire au intracellulaireviabilité et cycle cellulaireprincipe :méthodes de mesures physiques >>cellules en suspension+ molécules fluo(FITC)cellule en supensuion traverse un rayon laser qui stimule la fluorescence>> mesure effectuée à V=50-300000 cellules /seconde mesure des différents caractéristiques de la cellulehétérogénéité, taille, structures, intensité relative de fluorescence, pourcentage cellulaireintérêt de la CMF(clitométrie de fluorescence) :diagnostique, pronostique et thérapeutique


prolifération cellulaire(ploïde des tumeurs) apoptose imminophenotypage de VIH

histologie nucléaire :hybridation in situ, biologie moléculairehybridation in situ :sonde nucléotidique fluorescente>> marqué l'ARN ou l’ADN chercher les anomalies génétiques>>> intérêt pronostique et diagnostique :-Lymphomes leucémie- cancer de l'estomac-virus HPV ou EBV-cancer du seindifférents sentent utilisé :sonde CEP (chromosome énumération probe) s'hybride sur les centromères des chromosomes.Sonde LSI (locus specific identificatier) s’ybride sur des loci specifiques génes zones suceptible d'être détecté d'amplifier.Sonde telvysion : s'hybride sur les régions tellomériques centromérique= dénombrements chromosomiques.Peintures chromosomiques= translocationlocus spécifique= translocationpolymérisation chaîne réaction(PCR)synthèse d'un fragment d'adeptes une encadrée par deux amorces sur fragment est synthétisé un grand nombre de fois un obtenir une quantité importante d'ADN>>> intérêt diagnostique et thérapeutique :leucémie de l'enfant, lymphomes, cancer du sein la réaction PCR :


Présentation extraite dehttp://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

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