Les CULTURES in vitro VEGETALES
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BTSA 1 M55 Source net Mise en page Ph.A biotechnologies.education page 1 ²CHAPITRE 2 Les cultures in vitro végétales Dans les programmes classiques d'amélioration des plantes, pour créer une nouvelle variété il faut compter de 8 à 15 ans selon l'espèce. C'est très long, d'autant que les objectifs de sélection peuvent évoluer avec le temps: goût du consommateur, contraintes industrielles, etc. Les techniques de culture in vitro sont des outils qui peuvent aider l'obtenteur de plantes à différents niveaux de son programme d'amélioration, notamment pour réduire les délais de mise sur le marché des nouveaux cultivars, mais aussi pour assainir les variétés, les conserver et réduire les coûts de production. UNE DEFINITION :un peu longue !! Les cultures in vitro végétales sont des cultures d' explants de plantes, sur un milieu synthétique, dans des conditions stériles, dans un environnement contrôlé et dans un espace réduit. Les explants peuvent être des parties d'organes ou des organes entiers, (tige, feuille, racine, fleurs, etc.), des tissus, des pièces florales, des graines ou des embryons, des bourgeons ou des apex ou des méristèmes, des cellules somatiques ou sexuelles, des protoplastes. Le choix de l'explant sera fonction de la technique utilisée, de l'objectif et de l'espèce travaillée. Le milieu synthétique est adapté dans sa composition à la technique, l'explant, l'objectif et l'espèce, voire le cultivar. Il est en général composé d'eau, de macro et de micro-éléments, (sels minéraux), de substances de croissance: phytohormones et vitamines, de sucre et d'un agent gélifiant pour les milieux solides. Le pH est ajusté le plus souvent entre 5 et 6. On modifie le milieu au cours des différentes étapes de production, on doit utiliser un milieu neuf toutes les 3 ou 4 semaines en général. Les conditions stériles sont obtenues par une désinfection des explants, une stérilisation du milieu de culture et des flacons ou tubes de culture. Les différentes opérations de mise en culture sont réalisées dans un environnement stérile obtenu par une hotte à flux laminaire horizontal: de l'air stérile est propulsé vers le vitroculteur. Les conditions stériles sont primordiales à obtenir afin qu'aucun champignon ou bactérie ne vienne coloniser les milieux de culture, très favorables à leur prolifération, sous peine de nécrose de l'explant. L'environnement contrôlé concerne notamment deux paramètres: la température de culture, et l'éclairement: intensité et longueur du jour. Ils sont obtenus artificiellement. Leurs valeurs dépendent de l'espèce travaillée ainsi que de la technique utilisée. L'espace est réduit car les plantes sont miniaturisées, cultivées dans des récipients tenant sur des étagères éclairées, ce qui permet d'avoir la possibilité de replanter des hectares de terrain à partir de plants cultivés sur quelques mètres carrés. On peut également conserver d'innombrables variétés à l'abri des parasites et indéfiniment sur une petite surface au sol.
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sup2CHAPITRE 2
Les cultures in vitro veacutegeacutetales
Dans les programmes classiques dameacutelioration des plantes pour creacuteer une
nouvelle varieacuteteacute il faut compter de 8 agrave 15 ans selon lespegravece Cest tregraves long
dautant que les objectifs de seacutelection peuvent eacutevoluer avec le temps goucirct
du consommateur contraintes industrielles etc
Les techniques de culture in vitro sont des outils qui peuvent aider
lobtenteur de plantes agrave diffeacuterents niveaux de son programme
dameacutelioration notamment pour reacuteduire les deacutelais de mise sur le marcheacute des nouveaux cultivars
mais aussi pour assainir les varieacuteteacutes les conserver et reacuteduire les coucircts de production
UNE DEFINITION un peu longue
Les cultures in vitro veacutegeacutetales sont des cultures d explants de plantes sur un milieu syntheacutetique
dans des conditions steacuteriles dans un environnement controcircleacute et dans un espace reacuteduit
Les explants peuvent ecirctre des parties dorganes ou des organes entiers (tige feuille racine
fleurs etc) des tissus des piegraveces florales des graines ou des embryons des bourgeons ou des
apex ou des meacuteristegravemes des cellules somatiques ou sexuelles des protoplastes Le choix de
lexplant sera fonction de la technique utiliseacutee de lobjectif et de lespegravece travailleacutee
Le milieu syntheacutetique est adapteacute dans sa composition agrave la technique lexplant
lobjectif et lespegravece voire le cultivar Il est en geacuteneacuteral composeacute deau de macro et de
micro-eacuteleacutements (sels mineacuteraux) de substances de croissance phytohormones et
vitamines de sucre et dun agent geacutelifiant pour les milieux solides Le pH est ajusteacute le
plus souvent entre 5 et 6 On modifie le milieu au cours des diffeacuterentes eacutetapes de
production on doit utiliser un milieu neuf toutes les 3 ou 4 semaines en geacuteneacuteral
Les conditions steacuteriles sont obtenues par une deacutesinfection des explants une steacuterilisation du
milieu de culture et des flacons ou tubes de culture Les diffeacuterentes opeacuterations de mise en culture
sont reacutealiseacutees dans un environnement steacuterile obtenu par une hotte agrave flux laminaire horizontal de
lair steacuterile est propulseacute vers le vitroculteur Les conditions steacuteriles sont primordiales agrave obtenir
afin quaucun champignon ou bacteacuterie ne vienne coloniser les milieux de culture tregraves favorables
agrave leur prolifeacuteration sous peine de neacutecrose de lexplant
Lenvironnement controcircleacute concerne notamment deux
paramegravetres la tempeacuterature de culture et leacuteclairement
intensiteacute et longueur du jour Ils sont obtenus artificiellement
Leurs valeurs deacutependent de lespegravece travailleacutee ainsi que de la
technique utiliseacutee
Lespace est reacuteduit car les plantes sont miniaturiseacutees
cultiveacutees dans des reacutecipients tenant sur des eacutetagegraveres eacuteclaireacutees
ce qui permet davoir la possibiliteacute de replanter des hectares
de terrain agrave partir de plants cultiveacutes sur quelques megravetres
carreacutes On peut eacutegalement conserver dinnombrables varieacuteteacutes agrave labri des parasites et indeacutefiniment
sur une petite surface au sol
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DES PROPRIETES A savoir
Les techniques de culture in vitro veacutegeacutetales utilisent la proprieacuteteacute de totipotence des cellules
veacutegeacutetales mise en eacutevidence en 1902 par Haberlandt en theacuteorie il est possible de reacutegeacuteneacuterer une
plante entiegravere agrave partir de nimporte quelle cellule dune plante donneuse Cette proprieacuteteacute sexprime
dans la nature et est exploiteacutee depuis la nuit des temps dans les pheacutenomegravenes de bouturage
drageonnage marcottage etc
DESTECHNIQUES A connaicirctre
Les diffeacuterentes techniques de culture in vitro veacutegeacutetales que nous utilisons au laboratoire sont
La micro propagation
La culture de meacuteristegravemes
Lembryogenegravese somatique
Lhaplo-diploiumldisation par androgenegravese ou gynogenegravese
La creacuteation de variants le sauvetage dembryons immatures issus de croisements
interspeacutecifiques par exemple
Dautres techniques existent la culture de cellules et la production de meacutetabolites secondaires la
bio-encapsulation et la production de semences artificielles la cryo-conservation agrave -196degC la
culture de protoplastes et la fusion somatique la transformation geacuteneacutetique
En geacuteneacuteral il y a 4 eacutetapes de culture
- la mise en place des cultures (la plus deacutelicate et difficile) cf TP pluri M55
- la multiplication
- lenracinement
- le sevrage ou acclimatation
DES APPLICATIONS A ---
Aujourdhui de nombreuses espegraveces sont concerneacutees par lutilisation des cultures in vitro tant au
niveau de leacutelaboration de nouvelles varieacuteteacutes quau niveau de la production des plants et des
centaines de millions de plantes in vitro sont acclimateacutees annuellement dans le monde On estime
agrave plus de 300 espegraveces de plantes qui sont multiplieacutees in vitro de faccedilon industrielle
Certaines plantes vertes sont multiplieacutees uniquement par in vitro De nombreuses varieacuteteacutes de
plantes horticoles et maraicircchegraveres de grand inteacuterecirct anciennes ou nouvelles ont eacuteteacute sauveacutees de la
menace de disparition car viroseacutees par culture de meacuteristegravemes Aujourdhui la culture des
orchideacutees sest deacutemocratiseacutee gracircce agrave la culture in vitro on peut trouver dans le commerce des
plantes carnivores proteacutegeacutees car elles sont multiplieacutees in vitro
On a creacuteeacute des banques de conservation par culture in vitro des varieacuteteacutes anciennes et menaceacutees de
disparition Cest un moyen de sauvegarder la diversiteacute des espegraveces sauvages et les espegraveces rares
ou difficiles agrave multiplier naturellement (peu de graines ou de rejets)
Enfin les cultures in vitro permettent de mettre plus rapidement sur le marcheacute les plants certifieacutes
ou encore dassainir des collections
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I LA MICROPROPAGATION in vitro ou le CLONAGE veacutegeacutetal
Deacutefinition et technique
Les plantes se reproduisent par la voie sexueacutee via les graines mais elles utilisent pour certaines
aussi une autre voie celle de la multiplication veacutegeacutetative La particulariteacute de cette reproduction
est que les plantes filles qui en sont issues sont identiques geacuteneacutetiquement agrave la plante megravere cest le
clonage veacutegeacutetal ou multiplication conforme qui est exploiteacutee depuis des siegravecles par les
horticulteurs et jardiniers bouturage marcottage greffage etc
La micropropagation in vitro deacuterive de ce pheacutenomegravene naturel On cultive des explants veacutegeacutetaux
steacuterilement sur un milieu artificiel et dans un environnement controcircleacute Suite aux subcultures
successives on obtient alors des plantes identiques agrave la plante de deacutepart et que lon peut multiplier
agrave linfini On exploite ainsi la proprieacuteteacute de totipotence des cellules veacutegeacutetales
Objectif
Il sagit de produire en grande quantiteacute des cultivars dinteacuterecirct horticole sylvicole ou agronomique
qui viennent decirctre creacuteeacutes ou deacutecouverts ou qui ont toujours un inteacuterecirct Il peut sagir eacutegalement de
plantes difficiles agrave reproduire naturellement
Avantages
Les plantes obtenues sont geacuteneacutetiquement identiques agrave la plante ou varieacuteteacute de deacutepart
La puissance de multiplication du clonage in vitro permet une production dun grand nombre de
plantes geacuteneacutetiquement homogegravenes en un laps de temps court En 1 an on peut produire en theacuteorie
plus de 4 millions de plants dœillets agrave partir dun seul apex ou encore 50 000 plants de
framboisiers alors que traditionnellement on en obtient 50
Les plantes obtenues sont de qualiteacute car en tregraves bon eacutetat sanitaire avec un enracinement reacutegulier
des ramifications nombreuses donc une vigueur accrue
Le volume de plantes neacutecessaire agrave la mise sur le marcheacute des nouvelles varieacuteteacutes est plus
rapidement atteint
La production de plantes in vitro permet de saffranchir des saisons Les
cultures peuvent ecirctre ainsi programmeacutees afin dutiliser rationnellement
les surfaces de serres
La reacuteduction du nombre de pieds megraveres neacutecessaire agrave la production de
boutures permet un gain de place dans les serres dougrave une eacuteconomie
deacutenergie
Pour les espegraveces fruitiegraveres ou ornementales en multipliant in vitro il est
possible de saffranchir des portes-greffes Ainsi les arbres ou arbustes
obtenus ne preacutesenteront pas de problegraveme de rejet de sauvageon
Le microbouturage permet de multiplier des espegraveces difficiles agrave
reproduire naturellement telles les orchideacutees dougrave une diminution du coucirct de production En
faisant germer les graines dorchideacutees in vitro la preacutesence des champignons symbiotiques est
inutile
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La culture in vitro permet de multiplier des plantes steacuteriles
Il est possible de conserver des varieacuteteacutes anciennes agrave labri des parasites et pathogegravenes dans un
espace reacuteduit ducirc agrave la miniaturisation des vitroplants plus de 1 000 plantsm2
On peut reboiser tregraves rapidement des plantations qui pourraient ecirctre ravageacutees par des parasites ou
des catastrophes naturelles
Les vitroplants sont tregraves facilement transportables dun pays agrave lautre sans risques sanitaires
Inconveacutenients
Le coucirct du plant in vitro est plus eacuteleveacute que celui dune bouture obtenue classiquement il demande
une main-dœuvre speacutecialiseacutee qui repreacutesente environ 60 agrave 70 du prix de revient car
lautomatisation est limiteacutee
Applications
Des centaines de millions de plantes issues de microbouturage sont produites annuellement dans
le monde dans un nombre toujours grandissant despegraveces Plus de 300 espegraveces seraient
concerneacutees par la multiplication in vitro agrave leacutechelle industrielle
II LA CULTURE de MERISTEMES ou leacutelimination de virus
Deacutefinition
Les meacuteristegravemes sont des zones de cellules agrave divisions intenses situeacutes au cœur des bourgeons et
des extreacutemiteacutes de racines et agrave lorigine des tiges feuilleacutees ou du systegraveme racinaire
En 1950 les travaux de Limasset et Cornuet ont montreacute que les meacuteristegravemes eacutetaient indemnes de
virus
Technique
La culture de meacuteristegraveme est une culture aseptique sur milieu artificiel du docircme apical sans
eacutebauche foliaire Il mesure 02 agrave 03 mm de cocircteacute et la dissection se fait sous loupe binoculaire La
technique peut ecirctre associeacutee agrave de la thermotheacuterapie culture agrave tempeacuterature eacuteleveacutee pour favoriser
leacutelimination des virus
Remarque
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Remarque Les plantes se deacuteveloppent gracircce agrave des meacuteristegravemes soit des petits groupes de cellules
non diffeacuterencieacutees qui se divisent Dans le reste de la plantes les cellules se diffeacuterencient en
fonction de leur situation cellules de surface (eacutepiderme) cellules de remplissage (parenchyme)
cellules conductrices de la segraveve (Phloegraveme Xylegraveme) hellip et cessent de se diviser
Ces meacuteristegravemes se trouvent dans les bourgeons aux extreacutemiteacutes des racines et sur la longueur des
tiges et des racines (meacuteristegravemes lateacuteraux ils induisent la croissance en eacutepaisseur)
Les bourgeons axillaires ce sont les bourgeons situeacutes agrave la base des feuilles
Le bourgeon terminal il sagit de celui situeacute au sommet de la planteLes bourgeons adventifs des
cellules de la plante se deacutedifferencient et forment un nouveau meacuteristegraveme qui va deacutevelopper un
bourgeon ( bourgeon adventif) puis une tige ou une racine Ces tiges ou racines sont alors
appeleacutees tiges ou racines adventives
Objectif
Cest la seule faccedilon dobtenir des plantes saines indemnes de virus
Avantages
La culture de meacuteristegravemes permet le sauvetage des varieacuteteacutes menaceacutees de disparition car tregraves
viroseacutees Elle concerne essentiellement les plantes agrave reproduction par voie veacutegeacutetativebouturage
marcottage etc tels le Pelargonium le dahlia le chrysanthegraveme la pomme de terre lartichaut le
fraisier framboisier etc car cette voie favorise la transmission des
virus agrave la descendance
Les plantes produites sont saines sans virus champignons et bacteacuteries
et reacutepondent aux normes phytosanitaires deacutechanges internationaux de
plus en plus draconiennes
Les plantes assainies ont une vigueur accrue et des qualiteacutes de
floraison et de fructification restaureacutees
On obtient des varieacuteteacutes conformes agrave la varieacuteteacute dorigine et que lon peut
multiplier en grande quantiteacute la production est homogegravene
Limites
Les plantes obtenues sont indemnes de virus mais ne sont pas devenues reacutesistantes aux virus
Elles peuvent ecirctre recontamineacutees via des insectes si des mesures de prophylaxie ne sont pas
prises
Pour certaines varieacuteteacutes qui preacutesentent des chimegraveresplantes panacheacutees de Petunia ou de
Pelargonium par exemple par culture de meacuteristegravemes il est possible de ne pas retrouver agrave la
reacutegeacuteneacuteration ce caractegravere horticole
Applications
De nombreuses varieacuteteacutes de diverses espegraveces ont eacuteteacute sauvegardeacutees gracircce agrave cette technique pomme
de terre (Belle de Fontenay en 1954) dahlias fraisiers vigne iris framboisiers etc
Reacutecemment la Violette de Toulouse a eacuteteacute sauveacutee du deacuteclin gracircce agrave la culture de meacuteristegravemes qui a
permis de reacutegeacuteneacuterer des plantes sans virus
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Beaucoup de plantes horticoles de grande diffusion tels le Pelargonium le chrysanthegraveme etc sont
produites agrave partir de pieds megraveres qui ont eacuteteacute assainis par culture de meacuteristegravemes Il en est de mecircme
pour des espegraveces maraicircchegraveres tel lartichaut ou encore le fraisier
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III LEMBRYOGENESE SOMATIQUE
Deacutefinition
Lembryogenegravese somatique est une forme de multiplication veacutegeacutetative qui permet dobtenir une
multitude de plantules identiques geacuteneacutetiquement agrave la plante donneuse dexplants
Cest lobtention dembryons agrave partir de cellules somatiques cest agrave dire non sexuelles
Technique
De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoqueacutees agrave partir des tissus cultiveacutes gracircce
agrave lapport dune forte dose dauxine Un cal est alors obtenu cest agrave dire un amas de cellules
indiffeacuterencieacutees rejuveacuteniliseacutees et qui pourront donner naissance agrave des embryons bipolaires qui
vont se comporter comme des embryons zygotiques (issus de la feacutecondation entre une cellule
sexuelle femelle et une cellule sexuelle macircle)
Applications
Lembryogenegravese somatique est une technique qui sadapte bien agrave la production industrielle Les
embryons somatiques peuvent ecirctre initieacutes dans des bioreacuteacteurs afin soit de produire des
semences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif ou encore pour la synthegravese de
meacutetabolites secondaires utiliseacutes dans des meacutedicaments colorants etc Ce peut-ecirctre eacutegalement un
moyen de cloner des ligneux
Un litre de milieu de culture contenu dans un fermenteur peut produire des milliers voire des
millions dembryons somatiques
Cest une technique qui sapplique bien au fenouil au cafeacuteier au citronnier agrave la luzerne agrave la
carotte au peacutetunia agrave laubergine au cacaoyer agrave lheacuteveacutea au palmier agrave huile etc
Avantages
Cette technique de multiplication sadapte agrave lautomatisation ce qui permet de reacuteduire les coucircts de
production
Le rendement en plantes produites est tregraves eacuteleveacute
Les embryons obtenus sont dorigine unicellulaire il ny a donc pas de problegraveme de chimegraveres
Lembryogenegravese somatique permet la rejuveacutenation des tissus ainsi quun accegraves aux
transformations geacuteneacutetiques
Cest un bon moyen pour produire des clones dindividus eacutelites chez les ligneux
Par contre
Le passage par cal peut amener des risques de deacuterive geacuteneacutetique cest agrave dire dobtention de
variants qui seraient diffeacuterents de la plante de deacutepart
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IV LHAPLO-DIPLOIDISATION ou la creacuteation de ligneacutees pures
Les plantes haploiumldes sont issues dune cellule sexuelle macircle ou dune cellule sexuelle femelle
sans feacutecondation Les plantes obtenues nont quun seul lot de chromosomes au lieu de 2
normalement qui est doubleacute naturellement ou artificiellement afin quelles deviennent fertiles
Elles peuvent ecirctre obtenues par androgenegravese par gynogenegravese par feacutecondation avec du pollen
irradieacute ou par croisements interspeacutecifiques
Il existe dans la nature agrave des pourcentages tregraves faibles des plantes haploiumldes non issues de
feacutecondation normale
=gtL ANDROGENESE ou les plantes sans megravere
Technique
Cest la reacutegeacuteneacuteration de plantes entiegraveres agrave partir de culture de cellules sexuelles macircles des grains
de pollen immatures soit par culture de pollen isoleacute soit par culture danthegraveres
Objectif
Obtenir des plantes haploiumldes doubleacutees (apregraves doublement spontaneacute ou artificiel par colchicine )
Ainsi des ligneacutees pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 agrave 10 ans par technique
classique dautofeacutecondations
Lobtention de ligneacutees pures est une eacutetape presque toujours neacutecessaire des programmes
dameacutelioration des plantes
Applications
Cest une technique utiliseacutee chez le bleacute le riz la pomme de terre le tabac le maiumls lasperge le
piment etc et en routine chez le colza lorge et laubergine
Le bleacute Florin a eacuteteacute la premiegravere varieacuteteacute issue dandrogenegravese inscrite au catalogue franccedilais Ce fut
une premiegravere mondiale initieacutee par le laboratoire dAmeacutelioration des Plantes dOrsay Aujourdhui
de nombreux cultivars de diverses espegraveces et issus de ces techniques dhaplo-diploiumldisation sont
deacuteposeacutes chaque anneacutee
Avantages
Cette technique amegravene un important gain de temps ce qui permet de mettre plus rapidement sur
le marcheacute de nouvelles varieacuteteacutes preacutesentant des avantages pour lagriculteur lindustriel ou le
consommateur En effet une plante homozygote est directement obtenue ce qui eacutevite de faire
une dizaine de geacuteneacuterations dautofeacutecondations pour obtenir une ligneacutee pure eacutetat neacutecessaire aux
programmes de seacutelection veacutegeacutetale
Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes cela permet de deacutevoiler
des caractegraveres inteacuteressants par lexpression des allegraveles reacutecessifs habituellement cacheacutes Ces gegravenes
pouvant ecirctre exploiteacutes eacuteventuellement
Des recombinants inteacuteressants peuvent ainsi ecirctre deacutetecteacutes et exploiteacutes une reacutesistance agrave une
maladie par exemple
Limites
Le rendement (nombre de plantes viables100 anthegraveres cultiveacutees) est souvent deacutependant du
cultivar
Certaines varieacuteteacutes de ceacutereacuteales produisent un grand nombre de plantes albinos donc non viables
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V Preacutesentation en image de la micropropagation et rappels sur la
seacutequence faite en TP
1 Deacutefinitions
Les cultures in vitro veacutegeacutetales sont des cultures dexplants de plantes sur un milieu syntheacutetique dans
des conditions steacuteriles dans un environnement controcircleacute et dans un espace reacuteduit
Explants morceaux de la plante pouvant aller de lensemble de la partie aeacuterienne agrave des cellules isoleacutees
en passant par des morceaux de feuilles de racines des graines et des bourgeons
Milieu syntheacutetique il est en geacuteneacuteral composeacute des eacuteleacutements suivants eau sels mineacuteraux (macro et
micro-eacuteleacutements) hormones veacutegeacutetales vitamines sucre et pour les milieux solides un agent geacutelifiant le
plus souvent de lagar-agar Ce milieu doit ecirctre adapteacute en fonction de lespegravece et du but rechercheacute
(multiplication croissance production de racines etc)
Conditions steacuteriles le milieu de culture riche en sucre eacutetant tregraves propice au deacuteveloppement de bacteacuteries
et de champignons il est important de travailler avec du mateacuteriel steacuteriliseacute Mecircme les explants doivent
ecirctre deacutesinfecteacutes
Ils sont plongeacutes pendant quelques minutes agrave une demi heure en fonction des explants dans un meacutelange
deau et de javel Les manipulations se font sous une hotte agrave flux laminaire horizontal propulsant de lair
filtreacute vers le vitroculteur Ainsi lair contamineacute de la piegravece ne peacutenegravetre pas sous la hotte
Environnement controcircleacute ce controcircle concerne la tempeacuterature ainsi que lintensiteacute et la dureacutee de
leacuteclairement
Espace reacuteduit les plantes sont maintenues agrave une faible taille dans des bocaux Ceux-ci sont rangeacutes sur
des eacutetagegraveres dans des chambres de culture (= environnement controcircleacute)
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2 Lintroduction dexplants en culture in vitro
Les plantes ou leurs graines sont le support de bacteacuteries et de champignons divers
Il faut pour les cultiver dans un milieu steacuterile riche en sucre les deacutesinfecter en
surface
Des parties de la plante ou des graines sont plongeacutees dans un meacutelange deau de
javel et dune substance savonneuse pendant plusieurs dizaines de minutes
Ensuite on travaille steacuterilement sous hotte agrave flux laminaire Selon la plante on
deacutecoupe des morceaux de feuilles (reproduction veacutegeacutetative bourgeonnement
adventif) ou des bourgeons axillaires et on les place dans des pots individuels ou on
segraveme des graines
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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DES PROPRIETES A savoir
Les techniques de culture in vitro veacutegeacutetales utilisent la proprieacuteteacute de totipotence des cellules
veacutegeacutetales mise en eacutevidence en 1902 par Haberlandt en theacuteorie il est possible de reacutegeacuteneacuterer une
plante entiegravere agrave partir de nimporte quelle cellule dune plante donneuse Cette proprieacuteteacute sexprime
dans la nature et est exploiteacutee depuis la nuit des temps dans les pheacutenomegravenes de bouturage
drageonnage marcottage etc
DESTECHNIQUES A connaicirctre
Les diffeacuterentes techniques de culture in vitro veacutegeacutetales que nous utilisons au laboratoire sont
La micro propagation
La culture de meacuteristegravemes
Lembryogenegravese somatique
Lhaplo-diploiumldisation par androgenegravese ou gynogenegravese
La creacuteation de variants le sauvetage dembryons immatures issus de croisements
interspeacutecifiques par exemple
Dautres techniques existent la culture de cellules et la production de meacutetabolites secondaires la
bio-encapsulation et la production de semences artificielles la cryo-conservation agrave -196degC la
culture de protoplastes et la fusion somatique la transformation geacuteneacutetique
En geacuteneacuteral il y a 4 eacutetapes de culture
- la mise en place des cultures (la plus deacutelicate et difficile) cf TP pluri M55
- la multiplication
- lenracinement
- le sevrage ou acclimatation
DES APPLICATIONS A ---
Aujourdhui de nombreuses espegraveces sont concerneacutees par lutilisation des cultures in vitro tant au
niveau de leacutelaboration de nouvelles varieacuteteacutes quau niveau de la production des plants et des
centaines de millions de plantes in vitro sont acclimateacutees annuellement dans le monde On estime
agrave plus de 300 espegraveces de plantes qui sont multiplieacutees in vitro de faccedilon industrielle
Certaines plantes vertes sont multiplieacutees uniquement par in vitro De nombreuses varieacuteteacutes de
plantes horticoles et maraicircchegraveres de grand inteacuterecirct anciennes ou nouvelles ont eacuteteacute sauveacutees de la
menace de disparition car viroseacutees par culture de meacuteristegravemes Aujourdhui la culture des
orchideacutees sest deacutemocratiseacutee gracircce agrave la culture in vitro on peut trouver dans le commerce des
plantes carnivores proteacutegeacutees car elles sont multiplieacutees in vitro
On a creacuteeacute des banques de conservation par culture in vitro des varieacuteteacutes anciennes et menaceacutees de
disparition Cest un moyen de sauvegarder la diversiteacute des espegraveces sauvages et les espegraveces rares
ou difficiles agrave multiplier naturellement (peu de graines ou de rejets)
Enfin les cultures in vitro permettent de mettre plus rapidement sur le marcheacute les plants certifieacutes
ou encore dassainir des collections
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I LA MICROPROPAGATION in vitro ou le CLONAGE veacutegeacutetal
Deacutefinition et technique
Les plantes se reproduisent par la voie sexueacutee via les graines mais elles utilisent pour certaines
aussi une autre voie celle de la multiplication veacutegeacutetative La particulariteacute de cette reproduction
est que les plantes filles qui en sont issues sont identiques geacuteneacutetiquement agrave la plante megravere cest le
clonage veacutegeacutetal ou multiplication conforme qui est exploiteacutee depuis des siegravecles par les
horticulteurs et jardiniers bouturage marcottage greffage etc
La micropropagation in vitro deacuterive de ce pheacutenomegravene naturel On cultive des explants veacutegeacutetaux
steacuterilement sur un milieu artificiel et dans un environnement controcircleacute Suite aux subcultures
successives on obtient alors des plantes identiques agrave la plante de deacutepart et que lon peut multiplier
agrave linfini On exploite ainsi la proprieacuteteacute de totipotence des cellules veacutegeacutetales
Objectif
Il sagit de produire en grande quantiteacute des cultivars dinteacuterecirct horticole sylvicole ou agronomique
qui viennent decirctre creacuteeacutes ou deacutecouverts ou qui ont toujours un inteacuterecirct Il peut sagir eacutegalement de
plantes difficiles agrave reproduire naturellement
Avantages
Les plantes obtenues sont geacuteneacutetiquement identiques agrave la plante ou varieacuteteacute de deacutepart
La puissance de multiplication du clonage in vitro permet une production dun grand nombre de
plantes geacuteneacutetiquement homogegravenes en un laps de temps court En 1 an on peut produire en theacuteorie
plus de 4 millions de plants dœillets agrave partir dun seul apex ou encore 50 000 plants de
framboisiers alors que traditionnellement on en obtient 50
Les plantes obtenues sont de qualiteacute car en tregraves bon eacutetat sanitaire avec un enracinement reacutegulier
des ramifications nombreuses donc une vigueur accrue
Le volume de plantes neacutecessaire agrave la mise sur le marcheacute des nouvelles varieacuteteacutes est plus
rapidement atteint
La production de plantes in vitro permet de saffranchir des saisons Les
cultures peuvent ecirctre ainsi programmeacutees afin dutiliser rationnellement
les surfaces de serres
La reacuteduction du nombre de pieds megraveres neacutecessaire agrave la production de
boutures permet un gain de place dans les serres dougrave une eacuteconomie
deacutenergie
Pour les espegraveces fruitiegraveres ou ornementales en multipliant in vitro il est
possible de saffranchir des portes-greffes Ainsi les arbres ou arbustes
obtenus ne preacutesenteront pas de problegraveme de rejet de sauvageon
Le microbouturage permet de multiplier des espegraveces difficiles agrave
reproduire naturellement telles les orchideacutees dougrave une diminution du coucirct de production En
faisant germer les graines dorchideacutees in vitro la preacutesence des champignons symbiotiques est
inutile
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La culture in vitro permet de multiplier des plantes steacuteriles
Il est possible de conserver des varieacuteteacutes anciennes agrave labri des parasites et pathogegravenes dans un
espace reacuteduit ducirc agrave la miniaturisation des vitroplants plus de 1 000 plantsm2
On peut reboiser tregraves rapidement des plantations qui pourraient ecirctre ravageacutees par des parasites ou
des catastrophes naturelles
Les vitroplants sont tregraves facilement transportables dun pays agrave lautre sans risques sanitaires
Inconveacutenients
Le coucirct du plant in vitro est plus eacuteleveacute que celui dune bouture obtenue classiquement il demande
une main-dœuvre speacutecialiseacutee qui repreacutesente environ 60 agrave 70 du prix de revient car
lautomatisation est limiteacutee
Applications
Des centaines de millions de plantes issues de microbouturage sont produites annuellement dans
le monde dans un nombre toujours grandissant despegraveces Plus de 300 espegraveces seraient
concerneacutees par la multiplication in vitro agrave leacutechelle industrielle
II LA CULTURE de MERISTEMES ou leacutelimination de virus
Deacutefinition
Les meacuteristegravemes sont des zones de cellules agrave divisions intenses situeacutes au cœur des bourgeons et
des extreacutemiteacutes de racines et agrave lorigine des tiges feuilleacutees ou du systegraveme racinaire
En 1950 les travaux de Limasset et Cornuet ont montreacute que les meacuteristegravemes eacutetaient indemnes de
virus
Technique
La culture de meacuteristegraveme est une culture aseptique sur milieu artificiel du docircme apical sans
eacutebauche foliaire Il mesure 02 agrave 03 mm de cocircteacute et la dissection se fait sous loupe binoculaire La
technique peut ecirctre associeacutee agrave de la thermotheacuterapie culture agrave tempeacuterature eacuteleveacutee pour favoriser
leacutelimination des virus
Remarque
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Remarque Les plantes se deacuteveloppent gracircce agrave des meacuteristegravemes soit des petits groupes de cellules
non diffeacuterencieacutees qui se divisent Dans le reste de la plantes les cellules se diffeacuterencient en
fonction de leur situation cellules de surface (eacutepiderme) cellules de remplissage (parenchyme)
cellules conductrices de la segraveve (Phloegraveme Xylegraveme) hellip et cessent de se diviser
Ces meacuteristegravemes se trouvent dans les bourgeons aux extreacutemiteacutes des racines et sur la longueur des
tiges et des racines (meacuteristegravemes lateacuteraux ils induisent la croissance en eacutepaisseur)
Les bourgeons axillaires ce sont les bourgeons situeacutes agrave la base des feuilles
Le bourgeon terminal il sagit de celui situeacute au sommet de la planteLes bourgeons adventifs des
cellules de la plante se deacutedifferencient et forment un nouveau meacuteristegraveme qui va deacutevelopper un
bourgeon ( bourgeon adventif) puis une tige ou une racine Ces tiges ou racines sont alors
appeleacutees tiges ou racines adventives
Objectif
Cest la seule faccedilon dobtenir des plantes saines indemnes de virus
Avantages
La culture de meacuteristegravemes permet le sauvetage des varieacuteteacutes menaceacutees de disparition car tregraves
viroseacutees Elle concerne essentiellement les plantes agrave reproduction par voie veacutegeacutetativebouturage
marcottage etc tels le Pelargonium le dahlia le chrysanthegraveme la pomme de terre lartichaut le
fraisier framboisier etc car cette voie favorise la transmission des
virus agrave la descendance
Les plantes produites sont saines sans virus champignons et bacteacuteries
et reacutepondent aux normes phytosanitaires deacutechanges internationaux de
plus en plus draconiennes
Les plantes assainies ont une vigueur accrue et des qualiteacutes de
floraison et de fructification restaureacutees
On obtient des varieacuteteacutes conformes agrave la varieacuteteacute dorigine et que lon peut
multiplier en grande quantiteacute la production est homogegravene
Limites
Les plantes obtenues sont indemnes de virus mais ne sont pas devenues reacutesistantes aux virus
Elles peuvent ecirctre recontamineacutees via des insectes si des mesures de prophylaxie ne sont pas
prises
Pour certaines varieacuteteacutes qui preacutesentent des chimegraveresplantes panacheacutees de Petunia ou de
Pelargonium par exemple par culture de meacuteristegravemes il est possible de ne pas retrouver agrave la
reacutegeacuteneacuteration ce caractegravere horticole
Applications
De nombreuses varieacuteteacutes de diverses espegraveces ont eacuteteacute sauvegardeacutees gracircce agrave cette technique pomme
de terre (Belle de Fontenay en 1954) dahlias fraisiers vigne iris framboisiers etc
Reacutecemment la Violette de Toulouse a eacuteteacute sauveacutee du deacuteclin gracircce agrave la culture de meacuteristegravemes qui a
permis de reacutegeacuteneacuterer des plantes sans virus
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Beaucoup de plantes horticoles de grande diffusion tels le Pelargonium le chrysanthegraveme etc sont
produites agrave partir de pieds megraveres qui ont eacuteteacute assainis par culture de meacuteristegravemes Il en est de mecircme
pour des espegraveces maraicircchegraveres tel lartichaut ou encore le fraisier
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III LEMBRYOGENESE SOMATIQUE
Deacutefinition
Lembryogenegravese somatique est une forme de multiplication veacutegeacutetative qui permet dobtenir une
multitude de plantules identiques geacuteneacutetiquement agrave la plante donneuse dexplants
Cest lobtention dembryons agrave partir de cellules somatiques cest agrave dire non sexuelles
Technique
De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoqueacutees agrave partir des tissus cultiveacutes gracircce
agrave lapport dune forte dose dauxine Un cal est alors obtenu cest agrave dire un amas de cellules
indiffeacuterencieacutees rejuveacuteniliseacutees et qui pourront donner naissance agrave des embryons bipolaires qui
vont se comporter comme des embryons zygotiques (issus de la feacutecondation entre une cellule
sexuelle femelle et une cellule sexuelle macircle)
Applications
Lembryogenegravese somatique est une technique qui sadapte bien agrave la production industrielle Les
embryons somatiques peuvent ecirctre initieacutes dans des bioreacuteacteurs afin soit de produire des
semences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif ou encore pour la synthegravese de
meacutetabolites secondaires utiliseacutes dans des meacutedicaments colorants etc Ce peut-ecirctre eacutegalement un
moyen de cloner des ligneux
Un litre de milieu de culture contenu dans un fermenteur peut produire des milliers voire des
millions dembryons somatiques
Cest une technique qui sapplique bien au fenouil au cafeacuteier au citronnier agrave la luzerne agrave la
carotte au peacutetunia agrave laubergine au cacaoyer agrave lheacuteveacutea au palmier agrave huile etc
Avantages
Cette technique de multiplication sadapte agrave lautomatisation ce qui permet de reacuteduire les coucircts de
production
Le rendement en plantes produites est tregraves eacuteleveacute
Les embryons obtenus sont dorigine unicellulaire il ny a donc pas de problegraveme de chimegraveres
Lembryogenegravese somatique permet la rejuveacutenation des tissus ainsi quun accegraves aux
transformations geacuteneacutetiques
Cest un bon moyen pour produire des clones dindividus eacutelites chez les ligneux
Par contre
Le passage par cal peut amener des risques de deacuterive geacuteneacutetique cest agrave dire dobtention de
variants qui seraient diffeacuterents de la plante de deacutepart
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IV LHAPLO-DIPLOIDISATION ou la creacuteation de ligneacutees pures
Les plantes haploiumldes sont issues dune cellule sexuelle macircle ou dune cellule sexuelle femelle
sans feacutecondation Les plantes obtenues nont quun seul lot de chromosomes au lieu de 2
normalement qui est doubleacute naturellement ou artificiellement afin quelles deviennent fertiles
Elles peuvent ecirctre obtenues par androgenegravese par gynogenegravese par feacutecondation avec du pollen
irradieacute ou par croisements interspeacutecifiques
Il existe dans la nature agrave des pourcentages tregraves faibles des plantes haploiumldes non issues de
feacutecondation normale
=gtL ANDROGENESE ou les plantes sans megravere
Technique
Cest la reacutegeacuteneacuteration de plantes entiegraveres agrave partir de culture de cellules sexuelles macircles des grains
de pollen immatures soit par culture de pollen isoleacute soit par culture danthegraveres
Objectif
Obtenir des plantes haploiumldes doubleacutees (apregraves doublement spontaneacute ou artificiel par colchicine )
Ainsi des ligneacutees pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 agrave 10 ans par technique
classique dautofeacutecondations
Lobtention de ligneacutees pures est une eacutetape presque toujours neacutecessaire des programmes
dameacutelioration des plantes
Applications
Cest une technique utiliseacutee chez le bleacute le riz la pomme de terre le tabac le maiumls lasperge le
piment etc et en routine chez le colza lorge et laubergine
Le bleacute Florin a eacuteteacute la premiegravere varieacuteteacute issue dandrogenegravese inscrite au catalogue franccedilais Ce fut
une premiegravere mondiale initieacutee par le laboratoire dAmeacutelioration des Plantes dOrsay Aujourdhui
de nombreux cultivars de diverses espegraveces et issus de ces techniques dhaplo-diploiumldisation sont
deacuteposeacutes chaque anneacutee
Avantages
Cette technique amegravene un important gain de temps ce qui permet de mettre plus rapidement sur
le marcheacute de nouvelles varieacuteteacutes preacutesentant des avantages pour lagriculteur lindustriel ou le
consommateur En effet une plante homozygote est directement obtenue ce qui eacutevite de faire
une dizaine de geacuteneacuterations dautofeacutecondations pour obtenir une ligneacutee pure eacutetat neacutecessaire aux
programmes de seacutelection veacutegeacutetale
Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes cela permet de deacutevoiler
des caractegraveres inteacuteressants par lexpression des allegraveles reacutecessifs habituellement cacheacutes Ces gegravenes
pouvant ecirctre exploiteacutes eacuteventuellement
Des recombinants inteacuteressants peuvent ainsi ecirctre deacutetecteacutes et exploiteacutes une reacutesistance agrave une
maladie par exemple
Limites
Le rendement (nombre de plantes viables100 anthegraveres cultiveacutees) est souvent deacutependant du
cultivar
Certaines varieacuteteacutes de ceacutereacuteales produisent un grand nombre de plantes albinos donc non viables
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V Preacutesentation en image de la micropropagation et rappels sur la
seacutequence faite en TP
1 Deacutefinitions
Les cultures in vitro veacutegeacutetales sont des cultures dexplants de plantes sur un milieu syntheacutetique dans
des conditions steacuteriles dans un environnement controcircleacute et dans un espace reacuteduit
Explants morceaux de la plante pouvant aller de lensemble de la partie aeacuterienne agrave des cellules isoleacutees
en passant par des morceaux de feuilles de racines des graines et des bourgeons
Milieu syntheacutetique il est en geacuteneacuteral composeacute des eacuteleacutements suivants eau sels mineacuteraux (macro et
micro-eacuteleacutements) hormones veacutegeacutetales vitamines sucre et pour les milieux solides un agent geacutelifiant le
plus souvent de lagar-agar Ce milieu doit ecirctre adapteacute en fonction de lespegravece et du but rechercheacute
(multiplication croissance production de racines etc)
Conditions steacuteriles le milieu de culture riche en sucre eacutetant tregraves propice au deacuteveloppement de bacteacuteries
et de champignons il est important de travailler avec du mateacuteriel steacuteriliseacute Mecircme les explants doivent
ecirctre deacutesinfecteacutes
Ils sont plongeacutes pendant quelques minutes agrave une demi heure en fonction des explants dans un meacutelange
deau et de javel Les manipulations se font sous une hotte agrave flux laminaire horizontal propulsant de lair
filtreacute vers le vitroculteur Ainsi lair contamineacute de la piegravece ne peacutenegravetre pas sous la hotte
Environnement controcircleacute ce controcircle concerne la tempeacuterature ainsi que lintensiteacute et la dureacutee de
leacuteclairement
Espace reacuteduit les plantes sont maintenues agrave une faible taille dans des bocaux Ceux-ci sont rangeacutes sur
des eacutetagegraveres dans des chambres de culture (= environnement controcircleacute)
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2 Lintroduction dexplants en culture in vitro
Les plantes ou leurs graines sont le support de bacteacuteries et de champignons divers
Il faut pour les cultiver dans un milieu steacuterile riche en sucre les deacutesinfecter en
surface
Des parties de la plante ou des graines sont plongeacutees dans un meacutelange deau de
javel et dune substance savonneuse pendant plusieurs dizaines de minutes
Ensuite on travaille steacuterilement sous hotte agrave flux laminaire Selon la plante on
deacutecoupe des morceaux de feuilles (reproduction veacutegeacutetative bourgeonnement
adventif) ou des bourgeons axillaires et on les place dans des pots individuels ou on
segraveme des graines
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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I LA MICROPROPAGATION in vitro ou le CLONAGE veacutegeacutetal
Deacutefinition et technique
Les plantes se reproduisent par la voie sexueacutee via les graines mais elles utilisent pour certaines
aussi une autre voie celle de la multiplication veacutegeacutetative La particulariteacute de cette reproduction
est que les plantes filles qui en sont issues sont identiques geacuteneacutetiquement agrave la plante megravere cest le
clonage veacutegeacutetal ou multiplication conforme qui est exploiteacutee depuis des siegravecles par les
horticulteurs et jardiniers bouturage marcottage greffage etc
La micropropagation in vitro deacuterive de ce pheacutenomegravene naturel On cultive des explants veacutegeacutetaux
steacuterilement sur un milieu artificiel et dans un environnement controcircleacute Suite aux subcultures
successives on obtient alors des plantes identiques agrave la plante de deacutepart et que lon peut multiplier
agrave linfini On exploite ainsi la proprieacuteteacute de totipotence des cellules veacutegeacutetales
Objectif
Il sagit de produire en grande quantiteacute des cultivars dinteacuterecirct horticole sylvicole ou agronomique
qui viennent decirctre creacuteeacutes ou deacutecouverts ou qui ont toujours un inteacuterecirct Il peut sagir eacutegalement de
plantes difficiles agrave reproduire naturellement
Avantages
Les plantes obtenues sont geacuteneacutetiquement identiques agrave la plante ou varieacuteteacute de deacutepart
La puissance de multiplication du clonage in vitro permet une production dun grand nombre de
plantes geacuteneacutetiquement homogegravenes en un laps de temps court En 1 an on peut produire en theacuteorie
plus de 4 millions de plants dœillets agrave partir dun seul apex ou encore 50 000 plants de
framboisiers alors que traditionnellement on en obtient 50
Les plantes obtenues sont de qualiteacute car en tregraves bon eacutetat sanitaire avec un enracinement reacutegulier
des ramifications nombreuses donc une vigueur accrue
Le volume de plantes neacutecessaire agrave la mise sur le marcheacute des nouvelles varieacuteteacutes est plus
rapidement atteint
La production de plantes in vitro permet de saffranchir des saisons Les
cultures peuvent ecirctre ainsi programmeacutees afin dutiliser rationnellement
les surfaces de serres
La reacuteduction du nombre de pieds megraveres neacutecessaire agrave la production de
boutures permet un gain de place dans les serres dougrave une eacuteconomie
deacutenergie
Pour les espegraveces fruitiegraveres ou ornementales en multipliant in vitro il est
possible de saffranchir des portes-greffes Ainsi les arbres ou arbustes
obtenus ne preacutesenteront pas de problegraveme de rejet de sauvageon
Le microbouturage permet de multiplier des espegraveces difficiles agrave
reproduire naturellement telles les orchideacutees dougrave une diminution du coucirct de production En
faisant germer les graines dorchideacutees in vitro la preacutesence des champignons symbiotiques est
inutile
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La culture in vitro permet de multiplier des plantes steacuteriles
Il est possible de conserver des varieacuteteacutes anciennes agrave labri des parasites et pathogegravenes dans un
espace reacuteduit ducirc agrave la miniaturisation des vitroplants plus de 1 000 plantsm2
On peut reboiser tregraves rapidement des plantations qui pourraient ecirctre ravageacutees par des parasites ou
des catastrophes naturelles
Les vitroplants sont tregraves facilement transportables dun pays agrave lautre sans risques sanitaires
Inconveacutenients
Le coucirct du plant in vitro est plus eacuteleveacute que celui dune bouture obtenue classiquement il demande
une main-dœuvre speacutecialiseacutee qui repreacutesente environ 60 agrave 70 du prix de revient car
lautomatisation est limiteacutee
Applications
Des centaines de millions de plantes issues de microbouturage sont produites annuellement dans
le monde dans un nombre toujours grandissant despegraveces Plus de 300 espegraveces seraient
concerneacutees par la multiplication in vitro agrave leacutechelle industrielle
II LA CULTURE de MERISTEMES ou leacutelimination de virus
Deacutefinition
Les meacuteristegravemes sont des zones de cellules agrave divisions intenses situeacutes au cœur des bourgeons et
des extreacutemiteacutes de racines et agrave lorigine des tiges feuilleacutees ou du systegraveme racinaire
En 1950 les travaux de Limasset et Cornuet ont montreacute que les meacuteristegravemes eacutetaient indemnes de
virus
Technique
La culture de meacuteristegraveme est une culture aseptique sur milieu artificiel du docircme apical sans
eacutebauche foliaire Il mesure 02 agrave 03 mm de cocircteacute et la dissection se fait sous loupe binoculaire La
technique peut ecirctre associeacutee agrave de la thermotheacuterapie culture agrave tempeacuterature eacuteleveacutee pour favoriser
leacutelimination des virus
Remarque
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Remarque Les plantes se deacuteveloppent gracircce agrave des meacuteristegravemes soit des petits groupes de cellules
non diffeacuterencieacutees qui se divisent Dans le reste de la plantes les cellules se diffeacuterencient en
fonction de leur situation cellules de surface (eacutepiderme) cellules de remplissage (parenchyme)
cellules conductrices de la segraveve (Phloegraveme Xylegraveme) hellip et cessent de se diviser
Ces meacuteristegravemes se trouvent dans les bourgeons aux extreacutemiteacutes des racines et sur la longueur des
tiges et des racines (meacuteristegravemes lateacuteraux ils induisent la croissance en eacutepaisseur)
Les bourgeons axillaires ce sont les bourgeons situeacutes agrave la base des feuilles
Le bourgeon terminal il sagit de celui situeacute au sommet de la planteLes bourgeons adventifs des
cellules de la plante se deacutedifferencient et forment un nouveau meacuteristegraveme qui va deacutevelopper un
bourgeon ( bourgeon adventif) puis une tige ou une racine Ces tiges ou racines sont alors
appeleacutees tiges ou racines adventives
Objectif
Cest la seule faccedilon dobtenir des plantes saines indemnes de virus
Avantages
La culture de meacuteristegravemes permet le sauvetage des varieacuteteacutes menaceacutees de disparition car tregraves
viroseacutees Elle concerne essentiellement les plantes agrave reproduction par voie veacutegeacutetativebouturage
marcottage etc tels le Pelargonium le dahlia le chrysanthegraveme la pomme de terre lartichaut le
fraisier framboisier etc car cette voie favorise la transmission des
virus agrave la descendance
Les plantes produites sont saines sans virus champignons et bacteacuteries
et reacutepondent aux normes phytosanitaires deacutechanges internationaux de
plus en plus draconiennes
Les plantes assainies ont une vigueur accrue et des qualiteacutes de
floraison et de fructification restaureacutees
On obtient des varieacuteteacutes conformes agrave la varieacuteteacute dorigine et que lon peut
multiplier en grande quantiteacute la production est homogegravene
Limites
Les plantes obtenues sont indemnes de virus mais ne sont pas devenues reacutesistantes aux virus
Elles peuvent ecirctre recontamineacutees via des insectes si des mesures de prophylaxie ne sont pas
prises
Pour certaines varieacuteteacutes qui preacutesentent des chimegraveresplantes panacheacutees de Petunia ou de
Pelargonium par exemple par culture de meacuteristegravemes il est possible de ne pas retrouver agrave la
reacutegeacuteneacuteration ce caractegravere horticole
Applications
De nombreuses varieacuteteacutes de diverses espegraveces ont eacuteteacute sauvegardeacutees gracircce agrave cette technique pomme
de terre (Belle de Fontenay en 1954) dahlias fraisiers vigne iris framboisiers etc
Reacutecemment la Violette de Toulouse a eacuteteacute sauveacutee du deacuteclin gracircce agrave la culture de meacuteristegravemes qui a
permis de reacutegeacuteneacuterer des plantes sans virus
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Beaucoup de plantes horticoles de grande diffusion tels le Pelargonium le chrysanthegraveme etc sont
produites agrave partir de pieds megraveres qui ont eacuteteacute assainis par culture de meacuteristegravemes Il en est de mecircme
pour des espegraveces maraicircchegraveres tel lartichaut ou encore le fraisier
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III LEMBRYOGENESE SOMATIQUE
Deacutefinition
Lembryogenegravese somatique est une forme de multiplication veacutegeacutetative qui permet dobtenir une
multitude de plantules identiques geacuteneacutetiquement agrave la plante donneuse dexplants
Cest lobtention dembryons agrave partir de cellules somatiques cest agrave dire non sexuelles
Technique
De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoqueacutees agrave partir des tissus cultiveacutes gracircce
agrave lapport dune forte dose dauxine Un cal est alors obtenu cest agrave dire un amas de cellules
indiffeacuterencieacutees rejuveacuteniliseacutees et qui pourront donner naissance agrave des embryons bipolaires qui
vont se comporter comme des embryons zygotiques (issus de la feacutecondation entre une cellule
sexuelle femelle et une cellule sexuelle macircle)
Applications
Lembryogenegravese somatique est une technique qui sadapte bien agrave la production industrielle Les
embryons somatiques peuvent ecirctre initieacutes dans des bioreacuteacteurs afin soit de produire des
semences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif ou encore pour la synthegravese de
meacutetabolites secondaires utiliseacutes dans des meacutedicaments colorants etc Ce peut-ecirctre eacutegalement un
moyen de cloner des ligneux
Un litre de milieu de culture contenu dans un fermenteur peut produire des milliers voire des
millions dembryons somatiques
Cest une technique qui sapplique bien au fenouil au cafeacuteier au citronnier agrave la luzerne agrave la
carotte au peacutetunia agrave laubergine au cacaoyer agrave lheacuteveacutea au palmier agrave huile etc
Avantages
Cette technique de multiplication sadapte agrave lautomatisation ce qui permet de reacuteduire les coucircts de
production
Le rendement en plantes produites est tregraves eacuteleveacute
Les embryons obtenus sont dorigine unicellulaire il ny a donc pas de problegraveme de chimegraveres
Lembryogenegravese somatique permet la rejuveacutenation des tissus ainsi quun accegraves aux
transformations geacuteneacutetiques
Cest un bon moyen pour produire des clones dindividus eacutelites chez les ligneux
Par contre
Le passage par cal peut amener des risques de deacuterive geacuteneacutetique cest agrave dire dobtention de
variants qui seraient diffeacuterents de la plante de deacutepart
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IV LHAPLO-DIPLOIDISATION ou la creacuteation de ligneacutees pures
Les plantes haploiumldes sont issues dune cellule sexuelle macircle ou dune cellule sexuelle femelle
sans feacutecondation Les plantes obtenues nont quun seul lot de chromosomes au lieu de 2
normalement qui est doubleacute naturellement ou artificiellement afin quelles deviennent fertiles
Elles peuvent ecirctre obtenues par androgenegravese par gynogenegravese par feacutecondation avec du pollen
irradieacute ou par croisements interspeacutecifiques
Il existe dans la nature agrave des pourcentages tregraves faibles des plantes haploiumldes non issues de
feacutecondation normale
=gtL ANDROGENESE ou les plantes sans megravere
Technique
Cest la reacutegeacuteneacuteration de plantes entiegraveres agrave partir de culture de cellules sexuelles macircles des grains
de pollen immatures soit par culture de pollen isoleacute soit par culture danthegraveres
Objectif
Obtenir des plantes haploiumldes doubleacutees (apregraves doublement spontaneacute ou artificiel par colchicine )
Ainsi des ligneacutees pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 agrave 10 ans par technique
classique dautofeacutecondations
Lobtention de ligneacutees pures est une eacutetape presque toujours neacutecessaire des programmes
dameacutelioration des plantes
Applications
Cest une technique utiliseacutee chez le bleacute le riz la pomme de terre le tabac le maiumls lasperge le
piment etc et en routine chez le colza lorge et laubergine
Le bleacute Florin a eacuteteacute la premiegravere varieacuteteacute issue dandrogenegravese inscrite au catalogue franccedilais Ce fut
une premiegravere mondiale initieacutee par le laboratoire dAmeacutelioration des Plantes dOrsay Aujourdhui
de nombreux cultivars de diverses espegraveces et issus de ces techniques dhaplo-diploiumldisation sont
deacuteposeacutes chaque anneacutee
Avantages
Cette technique amegravene un important gain de temps ce qui permet de mettre plus rapidement sur
le marcheacute de nouvelles varieacuteteacutes preacutesentant des avantages pour lagriculteur lindustriel ou le
consommateur En effet une plante homozygote est directement obtenue ce qui eacutevite de faire
une dizaine de geacuteneacuterations dautofeacutecondations pour obtenir une ligneacutee pure eacutetat neacutecessaire aux
programmes de seacutelection veacutegeacutetale
Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes cela permet de deacutevoiler
des caractegraveres inteacuteressants par lexpression des allegraveles reacutecessifs habituellement cacheacutes Ces gegravenes
pouvant ecirctre exploiteacutes eacuteventuellement
Des recombinants inteacuteressants peuvent ainsi ecirctre deacutetecteacutes et exploiteacutes une reacutesistance agrave une
maladie par exemple
Limites
Le rendement (nombre de plantes viables100 anthegraveres cultiveacutees) est souvent deacutependant du
cultivar
Certaines varieacuteteacutes de ceacutereacuteales produisent un grand nombre de plantes albinos donc non viables
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V Preacutesentation en image de la micropropagation et rappels sur la
seacutequence faite en TP
1 Deacutefinitions
Les cultures in vitro veacutegeacutetales sont des cultures dexplants de plantes sur un milieu syntheacutetique dans
des conditions steacuteriles dans un environnement controcircleacute et dans un espace reacuteduit
Explants morceaux de la plante pouvant aller de lensemble de la partie aeacuterienne agrave des cellules isoleacutees
en passant par des morceaux de feuilles de racines des graines et des bourgeons
Milieu syntheacutetique il est en geacuteneacuteral composeacute des eacuteleacutements suivants eau sels mineacuteraux (macro et
micro-eacuteleacutements) hormones veacutegeacutetales vitamines sucre et pour les milieux solides un agent geacutelifiant le
plus souvent de lagar-agar Ce milieu doit ecirctre adapteacute en fonction de lespegravece et du but rechercheacute
(multiplication croissance production de racines etc)
Conditions steacuteriles le milieu de culture riche en sucre eacutetant tregraves propice au deacuteveloppement de bacteacuteries
et de champignons il est important de travailler avec du mateacuteriel steacuteriliseacute Mecircme les explants doivent
ecirctre deacutesinfecteacutes
Ils sont plongeacutes pendant quelques minutes agrave une demi heure en fonction des explants dans un meacutelange
deau et de javel Les manipulations se font sous une hotte agrave flux laminaire horizontal propulsant de lair
filtreacute vers le vitroculteur Ainsi lair contamineacute de la piegravece ne peacutenegravetre pas sous la hotte
Environnement controcircleacute ce controcircle concerne la tempeacuterature ainsi que lintensiteacute et la dureacutee de
leacuteclairement
Espace reacuteduit les plantes sont maintenues agrave une faible taille dans des bocaux Ceux-ci sont rangeacutes sur
des eacutetagegraveres dans des chambres de culture (= environnement controcircleacute)
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2 Lintroduction dexplants en culture in vitro
Les plantes ou leurs graines sont le support de bacteacuteries et de champignons divers
Il faut pour les cultiver dans un milieu steacuterile riche en sucre les deacutesinfecter en
surface
Des parties de la plante ou des graines sont plongeacutees dans un meacutelange deau de
javel et dune substance savonneuse pendant plusieurs dizaines de minutes
Ensuite on travaille steacuterilement sous hotte agrave flux laminaire Selon la plante on
deacutecoupe des morceaux de feuilles (reproduction veacutegeacutetative bourgeonnement
adventif) ou des bourgeons axillaires et on les place dans des pots individuels ou on
segraveme des graines
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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La culture in vitro permet de multiplier des plantes steacuteriles
Il est possible de conserver des varieacuteteacutes anciennes agrave labri des parasites et pathogegravenes dans un
espace reacuteduit ducirc agrave la miniaturisation des vitroplants plus de 1 000 plantsm2
On peut reboiser tregraves rapidement des plantations qui pourraient ecirctre ravageacutees par des parasites ou
des catastrophes naturelles
Les vitroplants sont tregraves facilement transportables dun pays agrave lautre sans risques sanitaires
Inconveacutenients
Le coucirct du plant in vitro est plus eacuteleveacute que celui dune bouture obtenue classiquement il demande
une main-dœuvre speacutecialiseacutee qui repreacutesente environ 60 agrave 70 du prix de revient car
lautomatisation est limiteacutee
Applications
Des centaines de millions de plantes issues de microbouturage sont produites annuellement dans
le monde dans un nombre toujours grandissant despegraveces Plus de 300 espegraveces seraient
concerneacutees par la multiplication in vitro agrave leacutechelle industrielle
II LA CULTURE de MERISTEMES ou leacutelimination de virus
Deacutefinition
Les meacuteristegravemes sont des zones de cellules agrave divisions intenses situeacutes au cœur des bourgeons et
des extreacutemiteacutes de racines et agrave lorigine des tiges feuilleacutees ou du systegraveme racinaire
En 1950 les travaux de Limasset et Cornuet ont montreacute que les meacuteristegravemes eacutetaient indemnes de
virus
Technique
La culture de meacuteristegraveme est une culture aseptique sur milieu artificiel du docircme apical sans
eacutebauche foliaire Il mesure 02 agrave 03 mm de cocircteacute et la dissection se fait sous loupe binoculaire La
technique peut ecirctre associeacutee agrave de la thermotheacuterapie culture agrave tempeacuterature eacuteleveacutee pour favoriser
leacutelimination des virus
Remarque
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Remarque Les plantes se deacuteveloppent gracircce agrave des meacuteristegravemes soit des petits groupes de cellules
non diffeacuterencieacutees qui se divisent Dans le reste de la plantes les cellules se diffeacuterencient en
fonction de leur situation cellules de surface (eacutepiderme) cellules de remplissage (parenchyme)
cellules conductrices de la segraveve (Phloegraveme Xylegraveme) hellip et cessent de se diviser
Ces meacuteristegravemes se trouvent dans les bourgeons aux extreacutemiteacutes des racines et sur la longueur des
tiges et des racines (meacuteristegravemes lateacuteraux ils induisent la croissance en eacutepaisseur)
Les bourgeons axillaires ce sont les bourgeons situeacutes agrave la base des feuilles
Le bourgeon terminal il sagit de celui situeacute au sommet de la planteLes bourgeons adventifs des
cellules de la plante se deacutedifferencient et forment un nouveau meacuteristegraveme qui va deacutevelopper un
bourgeon ( bourgeon adventif) puis une tige ou une racine Ces tiges ou racines sont alors
appeleacutees tiges ou racines adventives
Objectif
Cest la seule faccedilon dobtenir des plantes saines indemnes de virus
Avantages
La culture de meacuteristegravemes permet le sauvetage des varieacuteteacutes menaceacutees de disparition car tregraves
viroseacutees Elle concerne essentiellement les plantes agrave reproduction par voie veacutegeacutetativebouturage
marcottage etc tels le Pelargonium le dahlia le chrysanthegraveme la pomme de terre lartichaut le
fraisier framboisier etc car cette voie favorise la transmission des
virus agrave la descendance
Les plantes produites sont saines sans virus champignons et bacteacuteries
et reacutepondent aux normes phytosanitaires deacutechanges internationaux de
plus en plus draconiennes
Les plantes assainies ont une vigueur accrue et des qualiteacutes de
floraison et de fructification restaureacutees
On obtient des varieacuteteacutes conformes agrave la varieacuteteacute dorigine et que lon peut
multiplier en grande quantiteacute la production est homogegravene
Limites
Les plantes obtenues sont indemnes de virus mais ne sont pas devenues reacutesistantes aux virus
Elles peuvent ecirctre recontamineacutees via des insectes si des mesures de prophylaxie ne sont pas
prises
Pour certaines varieacuteteacutes qui preacutesentent des chimegraveresplantes panacheacutees de Petunia ou de
Pelargonium par exemple par culture de meacuteristegravemes il est possible de ne pas retrouver agrave la
reacutegeacuteneacuteration ce caractegravere horticole
Applications
De nombreuses varieacuteteacutes de diverses espegraveces ont eacuteteacute sauvegardeacutees gracircce agrave cette technique pomme
de terre (Belle de Fontenay en 1954) dahlias fraisiers vigne iris framboisiers etc
Reacutecemment la Violette de Toulouse a eacuteteacute sauveacutee du deacuteclin gracircce agrave la culture de meacuteristegravemes qui a
permis de reacutegeacuteneacuterer des plantes sans virus
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Beaucoup de plantes horticoles de grande diffusion tels le Pelargonium le chrysanthegraveme etc sont
produites agrave partir de pieds megraveres qui ont eacuteteacute assainis par culture de meacuteristegravemes Il en est de mecircme
pour des espegraveces maraicircchegraveres tel lartichaut ou encore le fraisier
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III LEMBRYOGENESE SOMATIQUE
Deacutefinition
Lembryogenegravese somatique est une forme de multiplication veacutegeacutetative qui permet dobtenir une
multitude de plantules identiques geacuteneacutetiquement agrave la plante donneuse dexplants
Cest lobtention dembryons agrave partir de cellules somatiques cest agrave dire non sexuelles
Technique
De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoqueacutees agrave partir des tissus cultiveacutes gracircce
agrave lapport dune forte dose dauxine Un cal est alors obtenu cest agrave dire un amas de cellules
indiffeacuterencieacutees rejuveacuteniliseacutees et qui pourront donner naissance agrave des embryons bipolaires qui
vont se comporter comme des embryons zygotiques (issus de la feacutecondation entre une cellule
sexuelle femelle et une cellule sexuelle macircle)
Applications
Lembryogenegravese somatique est une technique qui sadapte bien agrave la production industrielle Les
embryons somatiques peuvent ecirctre initieacutes dans des bioreacuteacteurs afin soit de produire des
semences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif ou encore pour la synthegravese de
meacutetabolites secondaires utiliseacutes dans des meacutedicaments colorants etc Ce peut-ecirctre eacutegalement un
moyen de cloner des ligneux
Un litre de milieu de culture contenu dans un fermenteur peut produire des milliers voire des
millions dembryons somatiques
Cest une technique qui sapplique bien au fenouil au cafeacuteier au citronnier agrave la luzerne agrave la
carotte au peacutetunia agrave laubergine au cacaoyer agrave lheacuteveacutea au palmier agrave huile etc
Avantages
Cette technique de multiplication sadapte agrave lautomatisation ce qui permet de reacuteduire les coucircts de
production
Le rendement en plantes produites est tregraves eacuteleveacute
Les embryons obtenus sont dorigine unicellulaire il ny a donc pas de problegraveme de chimegraveres
Lembryogenegravese somatique permet la rejuveacutenation des tissus ainsi quun accegraves aux
transformations geacuteneacutetiques
Cest un bon moyen pour produire des clones dindividus eacutelites chez les ligneux
Par contre
Le passage par cal peut amener des risques de deacuterive geacuteneacutetique cest agrave dire dobtention de
variants qui seraient diffeacuterents de la plante de deacutepart
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IV LHAPLO-DIPLOIDISATION ou la creacuteation de ligneacutees pures
Les plantes haploiumldes sont issues dune cellule sexuelle macircle ou dune cellule sexuelle femelle
sans feacutecondation Les plantes obtenues nont quun seul lot de chromosomes au lieu de 2
normalement qui est doubleacute naturellement ou artificiellement afin quelles deviennent fertiles
Elles peuvent ecirctre obtenues par androgenegravese par gynogenegravese par feacutecondation avec du pollen
irradieacute ou par croisements interspeacutecifiques
Il existe dans la nature agrave des pourcentages tregraves faibles des plantes haploiumldes non issues de
feacutecondation normale
=gtL ANDROGENESE ou les plantes sans megravere
Technique
Cest la reacutegeacuteneacuteration de plantes entiegraveres agrave partir de culture de cellules sexuelles macircles des grains
de pollen immatures soit par culture de pollen isoleacute soit par culture danthegraveres
Objectif
Obtenir des plantes haploiumldes doubleacutees (apregraves doublement spontaneacute ou artificiel par colchicine )
Ainsi des ligneacutees pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 agrave 10 ans par technique
classique dautofeacutecondations
Lobtention de ligneacutees pures est une eacutetape presque toujours neacutecessaire des programmes
dameacutelioration des plantes
Applications
Cest une technique utiliseacutee chez le bleacute le riz la pomme de terre le tabac le maiumls lasperge le
piment etc et en routine chez le colza lorge et laubergine
Le bleacute Florin a eacuteteacute la premiegravere varieacuteteacute issue dandrogenegravese inscrite au catalogue franccedilais Ce fut
une premiegravere mondiale initieacutee par le laboratoire dAmeacutelioration des Plantes dOrsay Aujourdhui
de nombreux cultivars de diverses espegraveces et issus de ces techniques dhaplo-diploiumldisation sont
deacuteposeacutes chaque anneacutee
Avantages
Cette technique amegravene un important gain de temps ce qui permet de mettre plus rapidement sur
le marcheacute de nouvelles varieacuteteacutes preacutesentant des avantages pour lagriculteur lindustriel ou le
consommateur En effet une plante homozygote est directement obtenue ce qui eacutevite de faire
une dizaine de geacuteneacuterations dautofeacutecondations pour obtenir une ligneacutee pure eacutetat neacutecessaire aux
programmes de seacutelection veacutegeacutetale
Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes cela permet de deacutevoiler
des caractegraveres inteacuteressants par lexpression des allegraveles reacutecessifs habituellement cacheacutes Ces gegravenes
pouvant ecirctre exploiteacutes eacuteventuellement
Des recombinants inteacuteressants peuvent ainsi ecirctre deacutetecteacutes et exploiteacutes une reacutesistance agrave une
maladie par exemple
Limites
Le rendement (nombre de plantes viables100 anthegraveres cultiveacutees) est souvent deacutependant du
cultivar
Certaines varieacuteteacutes de ceacutereacuteales produisent un grand nombre de plantes albinos donc non viables
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V Preacutesentation en image de la micropropagation et rappels sur la
seacutequence faite en TP
1 Deacutefinitions
Les cultures in vitro veacutegeacutetales sont des cultures dexplants de plantes sur un milieu syntheacutetique dans
des conditions steacuteriles dans un environnement controcircleacute et dans un espace reacuteduit
Explants morceaux de la plante pouvant aller de lensemble de la partie aeacuterienne agrave des cellules isoleacutees
en passant par des morceaux de feuilles de racines des graines et des bourgeons
Milieu syntheacutetique il est en geacuteneacuteral composeacute des eacuteleacutements suivants eau sels mineacuteraux (macro et
micro-eacuteleacutements) hormones veacutegeacutetales vitamines sucre et pour les milieux solides un agent geacutelifiant le
plus souvent de lagar-agar Ce milieu doit ecirctre adapteacute en fonction de lespegravece et du but rechercheacute
(multiplication croissance production de racines etc)
Conditions steacuteriles le milieu de culture riche en sucre eacutetant tregraves propice au deacuteveloppement de bacteacuteries
et de champignons il est important de travailler avec du mateacuteriel steacuteriliseacute Mecircme les explants doivent
ecirctre deacutesinfecteacutes
Ils sont plongeacutes pendant quelques minutes agrave une demi heure en fonction des explants dans un meacutelange
deau et de javel Les manipulations se font sous une hotte agrave flux laminaire horizontal propulsant de lair
filtreacute vers le vitroculteur Ainsi lair contamineacute de la piegravece ne peacutenegravetre pas sous la hotte
Environnement controcircleacute ce controcircle concerne la tempeacuterature ainsi que lintensiteacute et la dureacutee de
leacuteclairement
Espace reacuteduit les plantes sont maintenues agrave une faible taille dans des bocaux Ceux-ci sont rangeacutes sur
des eacutetagegraveres dans des chambres de culture (= environnement controcircleacute)
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2 Lintroduction dexplants en culture in vitro
Les plantes ou leurs graines sont le support de bacteacuteries et de champignons divers
Il faut pour les cultiver dans un milieu steacuterile riche en sucre les deacutesinfecter en
surface
Des parties de la plante ou des graines sont plongeacutees dans un meacutelange deau de
javel et dune substance savonneuse pendant plusieurs dizaines de minutes
Ensuite on travaille steacuterilement sous hotte agrave flux laminaire Selon la plante on
deacutecoupe des morceaux de feuilles (reproduction veacutegeacutetative bourgeonnement
adventif) ou des bourgeons axillaires et on les place dans des pots individuels ou on
segraveme des graines
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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Remarque Les plantes se deacuteveloppent gracircce agrave des meacuteristegravemes soit des petits groupes de cellules
non diffeacuterencieacutees qui se divisent Dans le reste de la plantes les cellules se diffeacuterencient en
fonction de leur situation cellules de surface (eacutepiderme) cellules de remplissage (parenchyme)
cellules conductrices de la segraveve (Phloegraveme Xylegraveme) hellip et cessent de se diviser
Ces meacuteristegravemes se trouvent dans les bourgeons aux extreacutemiteacutes des racines et sur la longueur des
tiges et des racines (meacuteristegravemes lateacuteraux ils induisent la croissance en eacutepaisseur)
Les bourgeons axillaires ce sont les bourgeons situeacutes agrave la base des feuilles
Le bourgeon terminal il sagit de celui situeacute au sommet de la planteLes bourgeons adventifs des
cellules de la plante se deacutedifferencient et forment un nouveau meacuteristegraveme qui va deacutevelopper un
bourgeon ( bourgeon adventif) puis une tige ou une racine Ces tiges ou racines sont alors
appeleacutees tiges ou racines adventives
Objectif
Cest la seule faccedilon dobtenir des plantes saines indemnes de virus
Avantages
La culture de meacuteristegravemes permet le sauvetage des varieacuteteacutes menaceacutees de disparition car tregraves
viroseacutees Elle concerne essentiellement les plantes agrave reproduction par voie veacutegeacutetativebouturage
marcottage etc tels le Pelargonium le dahlia le chrysanthegraveme la pomme de terre lartichaut le
fraisier framboisier etc car cette voie favorise la transmission des
virus agrave la descendance
Les plantes produites sont saines sans virus champignons et bacteacuteries
et reacutepondent aux normes phytosanitaires deacutechanges internationaux de
plus en plus draconiennes
Les plantes assainies ont une vigueur accrue et des qualiteacutes de
floraison et de fructification restaureacutees
On obtient des varieacuteteacutes conformes agrave la varieacuteteacute dorigine et que lon peut
multiplier en grande quantiteacute la production est homogegravene
Limites
Les plantes obtenues sont indemnes de virus mais ne sont pas devenues reacutesistantes aux virus
Elles peuvent ecirctre recontamineacutees via des insectes si des mesures de prophylaxie ne sont pas
prises
Pour certaines varieacuteteacutes qui preacutesentent des chimegraveresplantes panacheacutees de Petunia ou de
Pelargonium par exemple par culture de meacuteristegravemes il est possible de ne pas retrouver agrave la
reacutegeacuteneacuteration ce caractegravere horticole
Applications
De nombreuses varieacuteteacutes de diverses espegraveces ont eacuteteacute sauvegardeacutees gracircce agrave cette technique pomme
de terre (Belle de Fontenay en 1954) dahlias fraisiers vigne iris framboisiers etc
Reacutecemment la Violette de Toulouse a eacuteteacute sauveacutee du deacuteclin gracircce agrave la culture de meacuteristegravemes qui a
permis de reacutegeacuteneacuterer des plantes sans virus
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Beaucoup de plantes horticoles de grande diffusion tels le Pelargonium le chrysanthegraveme etc sont
produites agrave partir de pieds megraveres qui ont eacuteteacute assainis par culture de meacuteristegravemes Il en est de mecircme
pour des espegraveces maraicircchegraveres tel lartichaut ou encore le fraisier
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III LEMBRYOGENESE SOMATIQUE
Deacutefinition
Lembryogenegravese somatique est une forme de multiplication veacutegeacutetative qui permet dobtenir une
multitude de plantules identiques geacuteneacutetiquement agrave la plante donneuse dexplants
Cest lobtention dembryons agrave partir de cellules somatiques cest agrave dire non sexuelles
Technique
De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoqueacutees agrave partir des tissus cultiveacutes gracircce
agrave lapport dune forte dose dauxine Un cal est alors obtenu cest agrave dire un amas de cellules
indiffeacuterencieacutees rejuveacuteniliseacutees et qui pourront donner naissance agrave des embryons bipolaires qui
vont se comporter comme des embryons zygotiques (issus de la feacutecondation entre une cellule
sexuelle femelle et une cellule sexuelle macircle)
Applications
Lembryogenegravese somatique est une technique qui sadapte bien agrave la production industrielle Les
embryons somatiques peuvent ecirctre initieacutes dans des bioreacuteacteurs afin soit de produire des
semences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif ou encore pour la synthegravese de
meacutetabolites secondaires utiliseacutes dans des meacutedicaments colorants etc Ce peut-ecirctre eacutegalement un
moyen de cloner des ligneux
Un litre de milieu de culture contenu dans un fermenteur peut produire des milliers voire des
millions dembryons somatiques
Cest une technique qui sapplique bien au fenouil au cafeacuteier au citronnier agrave la luzerne agrave la
carotte au peacutetunia agrave laubergine au cacaoyer agrave lheacuteveacutea au palmier agrave huile etc
Avantages
Cette technique de multiplication sadapte agrave lautomatisation ce qui permet de reacuteduire les coucircts de
production
Le rendement en plantes produites est tregraves eacuteleveacute
Les embryons obtenus sont dorigine unicellulaire il ny a donc pas de problegraveme de chimegraveres
Lembryogenegravese somatique permet la rejuveacutenation des tissus ainsi quun accegraves aux
transformations geacuteneacutetiques
Cest un bon moyen pour produire des clones dindividus eacutelites chez les ligneux
Par contre
Le passage par cal peut amener des risques de deacuterive geacuteneacutetique cest agrave dire dobtention de
variants qui seraient diffeacuterents de la plante de deacutepart
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IV LHAPLO-DIPLOIDISATION ou la creacuteation de ligneacutees pures
Les plantes haploiumldes sont issues dune cellule sexuelle macircle ou dune cellule sexuelle femelle
sans feacutecondation Les plantes obtenues nont quun seul lot de chromosomes au lieu de 2
normalement qui est doubleacute naturellement ou artificiellement afin quelles deviennent fertiles
Elles peuvent ecirctre obtenues par androgenegravese par gynogenegravese par feacutecondation avec du pollen
irradieacute ou par croisements interspeacutecifiques
Il existe dans la nature agrave des pourcentages tregraves faibles des plantes haploiumldes non issues de
feacutecondation normale
=gtL ANDROGENESE ou les plantes sans megravere
Technique
Cest la reacutegeacuteneacuteration de plantes entiegraveres agrave partir de culture de cellules sexuelles macircles des grains
de pollen immatures soit par culture de pollen isoleacute soit par culture danthegraveres
Objectif
Obtenir des plantes haploiumldes doubleacutees (apregraves doublement spontaneacute ou artificiel par colchicine )
Ainsi des ligneacutees pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 agrave 10 ans par technique
classique dautofeacutecondations
Lobtention de ligneacutees pures est une eacutetape presque toujours neacutecessaire des programmes
dameacutelioration des plantes
Applications
Cest une technique utiliseacutee chez le bleacute le riz la pomme de terre le tabac le maiumls lasperge le
piment etc et en routine chez le colza lorge et laubergine
Le bleacute Florin a eacuteteacute la premiegravere varieacuteteacute issue dandrogenegravese inscrite au catalogue franccedilais Ce fut
une premiegravere mondiale initieacutee par le laboratoire dAmeacutelioration des Plantes dOrsay Aujourdhui
de nombreux cultivars de diverses espegraveces et issus de ces techniques dhaplo-diploiumldisation sont
deacuteposeacutes chaque anneacutee
Avantages
Cette technique amegravene un important gain de temps ce qui permet de mettre plus rapidement sur
le marcheacute de nouvelles varieacuteteacutes preacutesentant des avantages pour lagriculteur lindustriel ou le
consommateur En effet une plante homozygote est directement obtenue ce qui eacutevite de faire
une dizaine de geacuteneacuterations dautofeacutecondations pour obtenir une ligneacutee pure eacutetat neacutecessaire aux
programmes de seacutelection veacutegeacutetale
Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes cela permet de deacutevoiler
des caractegraveres inteacuteressants par lexpression des allegraveles reacutecessifs habituellement cacheacutes Ces gegravenes
pouvant ecirctre exploiteacutes eacuteventuellement
Des recombinants inteacuteressants peuvent ainsi ecirctre deacutetecteacutes et exploiteacutes une reacutesistance agrave une
maladie par exemple
Limites
Le rendement (nombre de plantes viables100 anthegraveres cultiveacutees) est souvent deacutependant du
cultivar
Certaines varieacuteteacutes de ceacutereacuteales produisent un grand nombre de plantes albinos donc non viables
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V Preacutesentation en image de la micropropagation et rappels sur la
seacutequence faite en TP
1 Deacutefinitions
Les cultures in vitro veacutegeacutetales sont des cultures dexplants de plantes sur un milieu syntheacutetique dans
des conditions steacuteriles dans un environnement controcircleacute et dans un espace reacuteduit
Explants morceaux de la plante pouvant aller de lensemble de la partie aeacuterienne agrave des cellules isoleacutees
en passant par des morceaux de feuilles de racines des graines et des bourgeons
Milieu syntheacutetique il est en geacuteneacuteral composeacute des eacuteleacutements suivants eau sels mineacuteraux (macro et
micro-eacuteleacutements) hormones veacutegeacutetales vitamines sucre et pour les milieux solides un agent geacutelifiant le
plus souvent de lagar-agar Ce milieu doit ecirctre adapteacute en fonction de lespegravece et du but rechercheacute
(multiplication croissance production de racines etc)
Conditions steacuteriles le milieu de culture riche en sucre eacutetant tregraves propice au deacuteveloppement de bacteacuteries
et de champignons il est important de travailler avec du mateacuteriel steacuteriliseacute Mecircme les explants doivent
ecirctre deacutesinfecteacutes
Ils sont plongeacutes pendant quelques minutes agrave une demi heure en fonction des explants dans un meacutelange
deau et de javel Les manipulations se font sous une hotte agrave flux laminaire horizontal propulsant de lair
filtreacute vers le vitroculteur Ainsi lair contamineacute de la piegravece ne peacutenegravetre pas sous la hotte
Environnement controcircleacute ce controcircle concerne la tempeacuterature ainsi que lintensiteacute et la dureacutee de
leacuteclairement
Espace reacuteduit les plantes sont maintenues agrave une faible taille dans des bocaux Ceux-ci sont rangeacutes sur
des eacutetagegraveres dans des chambres de culture (= environnement controcircleacute)
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2 Lintroduction dexplants en culture in vitro
Les plantes ou leurs graines sont le support de bacteacuteries et de champignons divers
Il faut pour les cultiver dans un milieu steacuterile riche en sucre les deacutesinfecter en
surface
Des parties de la plante ou des graines sont plongeacutees dans un meacutelange deau de
javel et dune substance savonneuse pendant plusieurs dizaines de minutes
Ensuite on travaille steacuterilement sous hotte agrave flux laminaire Selon la plante on
deacutecoupe des morceaux de feuilles (reproduction veacutegeacutetative bourgeonnement
adventif) ou des bourgeons axillaires et on les place dans des pots individuels ou on
segraveme des graines
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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Beaucoup de plantes horticoles de grande diffusion tels le Pelargonium le chrysanthegraveme etc sont
produites agrave partir de pieds megraveres qui ont eacuteteacute assainis par culture de meacuteristegravemes Il en est de mecircme
pour des espegraveces maraicircchegraveres tel lartichaut ou encore le fraisier
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III LEMBRYOGENESE SOMATIQUE
Deacutefinition
Lembryogenegravese somatique est une forme de multiplication veacutegeacutetative qui permet dobtenir une
multitude de plantules identiques geacuteneacutetiquement agrave la plante donneuse dexplants
Cest lobtention dembryons agrave partir de cellules somatiques cest agrave dire non sexuelles
Technique
De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoqueacutees agrave partir des tissus cultiveacutes gracircce
agrave lapport dune forte dose dauxine Un cal est alors obtenu cest agrave dire un amas de cellules
indiffeacuterencieacutees rejuveacuteniliseacutees et qui pourront donner naissance agrave des embryons bipolaires qui
vont se comporter comme des embryons zygotiques (issus de la feacutecondation entre une cellule
sexuelle femelle et une cellule sexuelle macircle)
Applications
Lembryogenegravese somatique est une technique qui sadapte bien agrave la production industrielle Les
embryons somatiques peuvent ecirctre initieacutes dans des bioreacuteacteurs afin soit de produire des
semences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif ou encore pour la synthegravese de
meacutetabolites secondaires utiliseacutes dans des meacutedicaments colorants etc Ce peut-ecirctre eacutegalement un
moyen de cloner des ligneux
Un litre de milieu de culture contenu dans un fermenteur peut produire des milliers voire des
millions dembryons somatiques
Cest une technique qui sapplique bien au fenouil au cafeacuteier au citronnier agrave la luzerne agrave la
carotte au peacutetunia agrave laubergine au cacaoyer agrave lheacuteveacutea au palmier agrave huile etc
Avantages
Cette technique de multiplication sadapte agrave lautomatisation ce qui permet de reacuteduire les coucircts de
production
Le rendement en plantes produites est tregraves eacuteleveacute
Les embryons obtenus sont dorigine unicellulaire il ny a donc pas de problegraveme de chimegraveres
Lembryogenegravese somatique permet la rejuveacutenation des tissus ainsi quun accegraves aux
transformations geacuteneacutetiques
Cest un bon moyen pour produire des clones dindividus eacutelites chez les ligneux
Par contre
Le passage par cal peut amener des risques de deacuterive geacuteneacutetique cest agrave dire dobtention de
variants qui seraient diffeacuterents de la plante de deacutepart
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IV LHAPLO-DIPLOIDISATION ou la creacuteation de ligneacutees pures
Les plantes haploiumldes sont issues dune cellule sexuelle macircle ou dune cellule sexuelle femelle
sans feacutecondation Les plantes obtenues nont quun seul lot de chromosomes au lieu de 2
normalement qui est doubleacute naturellement ou artificiellement afin quelles deviennent fertiles
Elles peuvent ecirctre obtenues par androgenegravese par gynogenegravese par feacutecondation avec du pollen
irradieacute ou par croisements interspeacutecifiques
Il existe dans la nature agrave des pourcentages tregraves faibles des plantes haploiumldes non issues de
feacutecondation normale
=gtL ANDROGENESE ou les plantes sans megravere
Technique
Cest la reacutegeacuteneacuteration de plantes entiegraveres agrave partir de culture de cellules sexuelles macircles des grains
de pollen immatures soit par culture de pollen isoleacute soit par culture danthegraveres
Objectif
Obtenir des plantes haploiumldes doubleacutees (apregraves doublement spontaneacute ou artificiel par colchicine )
Ainsi des ligneacutees pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 agrave 10 ans par technique
classique dautofeacutecondations
Lobtention de ligneacutees pures est une eacutetape presque toujours neacutecessaire des programmes
dameacutelioration des plantes
Applications
Cest une technique utiliseacutee chez le bleacute le riz la pomme de terre le tabac le maiumls lasperge le
piment etc et en routine chez le colza lorge et laubergine
Le bleacute Florin a eacuteteacute la premiegravere varieacuteteacute issue dandrogenegravese inscrite au catalogue franccedilais Ce fut
une premiegravere mondiale initieacutee par le laboratoire dAmeacutelioration des Plantes dOrsay Aujourdhui
de nombreux cultivars de diverses espegraveces et issus de ces techniques dhaplo-diploiumldisation sont
deacuteposeacutes chaque anneacutee
Avantages
Cette technique amegravene un important gain de temps ce qui permet de mettre plus rapidement sur
le marcheacute de nouvelles varieacuteteacutes preacutesentant des avantages pour lagriculteur lindustriel ou le
consommateur En effet une plante homozygote est directement obtenue ce qui eacutevite de faire
une dizaine de geacuteneacuterations dautofeacutecondations pour obtenir une ligneacutee pure eacutetat neacutecessaire aux
programmes de seacutelection veacutegeacutetale
Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes cela permet de deacutevoiler
des caractegraveres inteacuteressants par lexpression des allegraveles reacutecessifs habituellement cacheacutes Ces gegravenes
pouvant ecirctre exploiteacutes eacuteventuellement
Des recombinants inteacuteressants peuvent ainsi ecirctre deacutetecteacutes et exploiteacutes une reacutesistance agrave une
maladie par exemple
Limites
Le rendement (nombre de plantes viables100 anthegraveres cultiveacutees) est souvent deacutependant du
cultivar
Certaines varieacuteteacutes de ceacutereacuteales produisent un grand nombre de plantes albinos donc non viables
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V Preacutesentation en image de la micropropagation et rappels sur la
seacutequence faite en TP
1 Deacutefinitions
Les cultures in vitro veacutegeacutetales sont des cultures dexplants de plantes sur un milieu syntheacutetique dans
des conditions steacuteriles dans un environnement controcircleacute et dans un espace reacuteduit
Explants morceaux de la plante pouvant aller de lensemble de la partie aeacuterienne agrave des cellules isoleacutees
en passant par des morceaux de feuilles de racines des graines et des bourgeons
Milieu syntheacutetique il est en geacuteneacuteral composeacute des eacuteleacutements suivants eau sels mineacuteraux (macro et
micro-eacuteleacutements) hormones veacutegeacutetales vitamines sucre et pour les milieux solides un agent geacutelifiant le
plus souvent de lagar-agar Ce milieu doit ecirctre adapteacute en fonction de lespegravece et du but rechercheacute
(multiplication croissance production de racines etc)
Conditions steacuteriles le milieu de culture riche en sucre eacutetant tregraves propice au deacuteveloppement de bacteacuteries
et de champignons il est important de travailler avec du mateacuteriel steacuteriliseacute Mecircme les explants doivent
ecirctre deacutesinfecteacutes
Ils sont plongeacutes pendant quelques minutes agrave une demi heure en fonction des explants dans un meacutelange
deau et de javel Les manipulations se font sous une hotte agrave flux laminaire horizontal propulsant de lair
filtreacute vers le vitroculteur Ainsi lair contamineacute de la piegravece ne peacutenegravetre pas sous la hotte
Environnement controcircleacute ce controcircle concerne la tempeacuterature ainsi que lintensiteacute et la dureacutee de
leacuteclairement
Espace reacuteduit les plantes sont maintenues agrave une faible taille dans des bocaux Ceux-ci sont rangeacutes sur
des eacutetagegraveres dans des chambres de culture (= environnement controcircleacute)
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2 Lintroduction dexplants en culture in vitro
Les plantes ou leurs graines sont le support de bacteacuteries et de champignons divers
Il faut pour les cultiver dans un milieu steacuterile riche en sucre les deacutesinfecter en
surface
Des parties de la plante ou des graines sont plongeacutees dans un meacutelange deau de
javel et dune substance savonneuse pendant plusieurs dizaines de minutes
Ensuite on travaille steacuterilement sous hotte agrave flux laminaire Selon la plante on
deacutecoupe des morceaux de feuilles (reproduction veacutegeacutetative bourgeonnement
adventif) ou des bourgeons axillaires et on les place dans des pots individuels ou on
segraveme des graines
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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III LEMBRYOGENESE SOMATIQUE
Deacutefinition
Lembryogenegravese somatique est une forme de multiplication veacutegeacutetative qui permet dobtenir une
multitude de plantules identiques geacuteneacutetiquement agrave la plante donneuse dexplants
Cest lobtention dembryons agrave partir de cellules somatiques cest agrave dire non sexuelles
Technique
De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoqueacutees agrave partir des tissus cultiveacutes gracircce
agrave lapport dune forte dose dauxine Un cal est alors obtenu cest agrave dire un amas de cellules
indiffeacuterencieacutees rejuveacuteniliseacutees et qui pourront donner naissance agrave des embryons bipolaires qui
vont se comporter comme des embryons zygotiques (issus de la feacutecondation entre une cellule
sexuelle femelle et une cellule sexuelle macircle)
Applications
Lembryogenegravese somatique est une technique qui sadapte bien agrave la production industrielle Les
embryons somatiques peuvent ecirctre initieacutes dans des bioreacuteacteurs afin soit de produire des
semences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif ou encore pour la synthegravese de
meacutetabolites secondaires utiliseacutes dans des meacutedicaments colorants etc Ce peut-ecirctre eacutegalement un
moyen de cloner des ligneux
Un litre de milieu de culture contenu dans un fermenteur peut produire des milliers voire des
millions dembryons somatiques
Cest une technique qui sapplique bien au fenouil au cafeacuteier au citronnier agrave la luzerne agrave la
carotte au peacutetunia agrave laubergine au cacaoyer agrave lheacuteveacutea au palmier agrave huile etc
Avantages
Cette technique de multiplication sadapte agrave lautomatisation ce qui permet de reacuteduire les coucircts de
production
Le rendement en plantes produites est tregraves eacuteleveacute
Les embryons obtenus sont dorigine unicellulaire il ny a donc pas de problegraveme de chimegraveres
Lembryogenegravese somatique permet la rejuveacutenation des tissus ainsi quun accegraves aux
transformations geacuteneacutetiques
Cest un bon moyen pour produire des clones dindividus eacutelites chez les ligneux
Par contre
Le passage par cal peut amener des risques de deacuterive geacuteneacutetique cest agrave dire dobtention de
variants qui seraient diffeacuterents de la plante de deacutepart
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IV LHAPLO-DIPLOIDISATION ou la creacuteation de ligneacutees pures
Les plantes haploiumldes sont issues dune cellule sexuelle macircle ou dune cellule sexuelle femelle
sans feacutecondation Les plantes obtenues nont quun seul lot de chromosomes au lieu de 2
normalement qui est doubleacute naturellement ou artificiellement afin quelles deviennent fertiles
Elles peuvent ecirctre obtenues par androgenegravese par gynogenegravese par feacutecondation avec du pollen
irradieacute ou par croisements interspeacutecifiques
Il existe dans la nature agrave des pourcentages tregraves faibles des plantes haploiumldes non issues de
feacutecondation normale
=gtL ANDROGENESE ou les plantes sans megravere
Technique
Cest la reacutegeacuteneacuteration de plantes entiegraveres agrave partir de culture de cellules sexuelles macircles des grains
de pollen immatures soit par culture de pollen isoleacute soit par culture danthegraveres
Objectif
Obtenir des plantes haploiumldes doubleacutees (apregraves doublement spontaneacute ou artificiel par colchicine )
Ainsi des ligneacutees pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 agrave 10 ans par technique
classique dautofeacutecondations
Lobtention de ligneacutees pures est une eacutetape presque toujours neacutecessaire des programmes
dameacutelioration des plantes
Applications
Cest une technique utiliseacutee chez le bleacute le riz la pomme de terre le tabac le maiumls lasperge le
piment etc et en routine chez le colza lorge et laubergine
Le bleacute Florin a eacuteteacute la premiegravere varieacuteteacute issue dandrogenegravese inscrite au catalogue franccedilais Ce fut
une premiegravere mondiale initieacutee par le laboratoire dAmeacutelioration des Plantes dOrsay Aujourdhui
de nombreux cultivars de diverses espegraveces et issus de ces techniques dhaplo-diploiumldisation sont
deacuteposeacutes chaque anneacutee
Avantages
Cette technique amegravene un important gain de temps ce qui permet de mettre plus rapidement sur
le marcheacute de nouvelles varieacuteteacutes preacutesentant des avantages pour lagriculteur lindustriel ou le
consommateur En effet une plante homozygote est directement obtenue ce qui eacutevite de faire
une dizaine de geacuteneacuterations dautofeacutecondations pour obtenir une ligneacutee pure eacutetat neacutecessaire aux
programmes de seacutelection veacutegeacutetale
Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes cela permet de deacutevoiler
des caractegraveres inteacuteressants par lexpression des allegraveles reacutecessifs habituellement cacheacutes Ces gegravenes
pouvant ecirctre exploiteacutes eacuteventuellement
Des recombinants inteacuteressants peuvent ainsi ecirctre deacutetecteacutes et exploiteacutes une reacutesistance agrave une
maladie par exemple
Limites
Le rendement (nombre de plantes viables100 anthegraveres cultiveacutees) est souvent deacutependant du
cultivar
Certaines varieacuteteacutes de ceacutereacuteales produisent un grand nombre de plantes albinos donc non viables
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V Preacutesentation en image de la micropropagation et rappels sur la
seacutequence faite en TP
1 Deacutefinitions
Les cultures in vitro veacutegeacutetales sont des cultures dexplants de plantes sur un milieu syntheacutetique dans
des conditions steacuteriles dans un environnement controcircleacute et dans un espace reacuteduit
Explants morceaux de la plante pouvant aller de lensemble de la partie aeacuterienne agrave des cellules isoleacutees
en passant par des morceaux de feuilles de racines des graines et des bourgeons
Milieu syntheacutetique il est en geacuteneacuteral composeacute des eacuteleacutements suivants eau sels mineacuteraux (macro et
micro-eacuteleacutements) hormones veacutegeacutetales vitamines sucre et pour les milieux solides un agent geacutelifiant le
plus souvent de lagar-agar Ce milieu doit ecirctre adapteacute en fonction de lespegravece et du but rechercheacute
(multiplication croissance production de racines etc)
Conditions steacuteriles le milieu de culture riche en sucre eacutetant tregraves propice au deacuteveloppement de bacteacuteries
et de champignons il est important de travailler avec du mateacuteriel steacuteriliseacute Mecircme les explants doivent
ecirctre deacutesinfecteacutes
Ils sont plongeacutes pendant quelques minutes agrave une demi heure en fonction des explants dans un meacutelange
deau et de javel Les manipulations se font sous une hotte agrave flux laminaire horizontal propulsant de lair
filtreacute vers le vitroculteur Ainsi lair contamineacute de la piegravece ne peacutenegravetre pas sous la hotte
Environnement controcircleacute ce controcircle concerne la tempeacuterature ainsi que lintensiteacute et la dureacutee de
leacuteclairement
Espace reacuteduit les plantes sont maintenues agrave une faible taille dans des bocaux Ceux-ci sont rangeacutes sur
des eacutetagegraveres dans des chambres de culture (= environnement controcircleacute)
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2 Lintroduction dexplants en culture in vitro
Les plantes ou leurs graines sont le support de bacteacuteries et de champignons divers
Il faut pour les cultiver dans un milieu steacuterile riche en sucre les deacutesinfecter en
surface
Des parties de la plante ou des graines sont plongeacutees dans un meacutelange deau de
javel et dune substance savonneuse pendant plusieurs dizaines de minutes
Ensuite on travaille steacuterilement sous hotte agrave flux laminaire Selon la plante on
deacutecoupe des morceaux de feuilles (reproduction veacutegeacutetative bourgeonnement
adventif) ou des bourgeons axillaires et on les place dans des pots individuels ou on
segraveme des graines
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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IV LHAPLO-DIPLOIDISATION ou la creacuteation de ligneacutees pures
Les plantes haploiumldes sont issues dune cellule sexuelle macircle ou dune cellule sexuelle femelle
sans feacutecondation Les plantes obtenues nont quun seul lot de chromosomes au lieu de 2
normalement qui est doubleacute naturellement ou artificiellement afin quelles deviennent fertiles
Elles peuvent ecirctre obtenues par androgenegravese par gynogenegravese par feacutecondation avec du pollen
irradieacute ou par croisements interspeacutecifiques
Il existe dans la nature agrave des pourcentages tregraves faibles des plantes haploiumldes non issues de
feacutecondation normale
=gtL ANDROGENESE ou les plantes sans megravere
Technique
Cest la reacutegeacuteneacuteration de plantes entiegraveres agrave partir de culture de cellules sexuelles macircles des grains
de pollen immatures soit par culture de pollen isoleacute soit par culture danthegraveres
Objectif
Obtenir des plantes haploiumldes doubleacutees (apregraves doublement spontaneacute ou artificiel par colchicine )
Ainsi des ligneacutees pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 agrave 10 ans par technique
classique dautofeacutecondations
Lobtention de ligneacutees pures est une eacutetape presque toujours neacutecessaire des programmes
dameacutelioration des plantes
Applications
Cest une technique utiliseacutee chez le bleacute le riz la pomme de terre le tabac le maiumls lasperge le
piment etc et en routine chez le colza lorge et laubergine
Le bleacute Florin a eacuteteacute la premiegravere varieacuteteacute issue dandrogenegravese inscrite au catalogue franccedilais Ce fut
une premiegravere mondiale initieacutee par le laboratoire dAmeacutelioration des Plantes dOrsay Aujourdhui
de nombreux cultivars de diverses espegraveces et issus de ces techniques dhaplo-diploiumldisation sont
deacuteposeacutes chaque anneacutee
Avantages
Cette technique amegravene un important gain de temps ce qui permet de mettre plus rapidement sur
le marcheacute de nouvelles varieacuteteacutes preacutesentant des avantages pour lagriculteur lindustriel ou le
consommateur En effet une plante homozygote est directement obtenue ce qui eacutevite de faire
une dizaine de geacuteneacuterations dautofeacutecondations pour obtenir une ligneacutee pure eacutetat neacutecessaire aux
programmes de seacutelection veacutegeacutetale
Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes cela permet de deacutevoiler
des caractegraveres inteacuteressants par lexpression des allegraveles reacutecessifs habituellement cacheacutes Ces gegravenes
pouvant ecirctre exploiteacutes eacuteventuellement
Des recombinants inteacuteressants peuvent ainsi ecirctre deacutetecteacutes et exploiteacutes une reacutesistance agrave une
maladie par exemple
Limites
Le rendement (nombre de plantes viables100 anthegraveres cultiveacutees) est souvent deacutependant du
cultivar
Certaines varieacuteteacutes de ceacutereacuteales produisent un grand nombre de plantes albinos donc non viables
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V Preacutesentation en image de la micropropagation et rappels sur la
seacutequence faite en TP
1 Deacutefinitions
Les cultures in vitro veacutegeacutetales sont des cultures dexplants de plantes sur un milieu syntheacutetique dans
des conditions steacuteriles dans un environnement controcircleacute et dans un espace reacuteduit
Explants morceaux de la plante pouvant aller de lensemble de la partie aeacuterienne agrave des cellules isoleacutees
en passant par des morceaux de feuilles de racines des graines et des bourgeons
Milieu syntheacutetique il est en geacuteneacuteral composeacute des eacuteleacutements suivants eau sels mineacuteraux (macro et
micro-eacuteleacutements) hormones veacutegeacutetales vitamines sucre et pour les milieux solides un agent geacutelifiant le
plus souvent de lagar-agar Ce milieu doit ecirctre adapteacute en fonction de lespegravece et du but rechercheacute
(multiplication croissance production de racines etc)
Conditions steacuteriles le milieu de culture riche en sucre eacutetant tregraves propice au deacuteveloppement de bacteacuteries
et de champignons il est important de travailler avec du mateacuteriel steacuteriliseacute Mecircme les explants doivent
ecirctre deacutesinfecteacutes
Ils sont plongeacutes pendant quelques minutes agrave une demi heure en fonction des explants dans un meacutelange
deau et de javel Les manipulations se font sous une hotte agrave flux laminaire horizontal propulsant de lair
filtreacute vers le vitroculteur Ainsi lair contamineacute de la piegravece ne peacutenegravetre pas sous la hotte
Environnement controcircleacute ce controcircle concerne la tempeacuterature ainsi que lintensiteacute et la dureacutee de
leacuteclairement
Espace reacuteduit les plantes sont maintenues agrave une faible taille dans des bocaux Ceux-ci sont rangeacutes sur
des eacutetagegraveres dans des chambres de culture (= environnement controcircleacute)
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2 Lintroduction dexplants en culture in vitro
Les plantes ou leurs graines sont le support de bacteacuteries et de champignons divers
Il faut pour les cultiver dans un milieu steacuterile riche en sucre les deacutesinfecter en
surface
Des parties de la plante ou des graines sont plongeacutees dans un meacutelange deau de
javel et dune substance savonneuse pendant plusieurs dizaines de minutes
Ensuite on travaille steacuterilement sous hotte agrave flux laminaire Selon la plante on
deacutecoupe des morceaux de feuilles (reproduction veacutegeacutetative bourgeonnement
adventif) ou des bourgeons axillaires et on les place dans des pots individuels ou on
segraveme des graines
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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V Preacutesentation en image de la micropropagation et rappels sur la
seacutequence faite en TP
1 Deacutefinitions
Les cultures in vitro veacutegeacutetales sont des cultures dexplants de plantes sur un milieu syntheacutetique dans
des conditions steacuteriles dans un environnement controcircleacute et dans un espace reacuteduit
Explants morceaux de la plante pouvant aller de lensemble de la partie aeacuterienne agrave des cellules isoleacutees
en passant par des morceaux de feuilles de racines des graines et des bourgeons
Milieu syntheacutetique il est en geacuteneacuteral composeacute des eacuteleacutements suivants eau sels mineacuteraux (macro et
micro-eacuteleacutements) hormones veacutegeacutetales vitamines sucre et pour les milieux solides un agent geacutelifiant le
plus souvent de lagar-agar Ce milieu doit ecirctre adapteacute en fonction de lespegravece et du but rechercheacute
(multiplication croissance production de racines etc)
Conditions steacuteriles le milieu de culture riche en sucre eacutetant tregraves propice au deacuteveloppement de bacteacuteries
et de champignons il est important de travailler avec du mateacuteriel steacuteriliseacute Mecircme les explants doivent
ecirctre deacutesinfecteacutes
Ils sont plongeacutes pendant quelques minutes agrave une demi heure en fonction des explants dans un meacutelange
deau et de javel Les manipulations se font sous une hotte agrave flux laminaire horizontal propulsant de lair
filtreacute vers le vitroculteur Ainsi lair contamineacute de la piegravece ne peacutenegravetre pas sous la hotte
Environnement controcircleacute ce controcircle concerne la tempeacuterature ainsi que lintensiteacute et la dureacutee de
leacuteclairement
Espace reacuteduit les plantes sont maintenues agrave une faible taille dans des bocaux Ceux-ci sont rangeacutes sur
des eacutetagegraveres dans des chambres de culture (= environnement controcircleacute)
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2 Lintroduction dexplants en culture in vitro
Les plantes ou leurs graines sont le support de bacteacuteries et de champignons divers
Il faut pour les cultiver dans un milieu steacuterile riche en sucre les deacutesinfecter en
surface
Des parties de la plante ou des graines sont plongeacutees dans un meacutelange deau de
javel et dune substance savonneuse pendant plusieurs dizaines de minutes
Ensuite on travaille steacuterilement sous hotte agrave flux laminaire Selon la plante on
deacutecoupe des morceaux de feuilles (reproduction veacutegeacutetative bourgeonnement
adventif) ou des bourgeons axillaires et on les place dans des pots individuels ou on
segraveme des graines
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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2 Lintroduction dexplants en culture in vitro
Les plantes ou leurs graines sont le support de bacteacuteries et de champignons divers
Il faut pour les cultiver dans un milieu steacuterile riche en sucre les deacutesinfecter en
surface
Des parties de la plante ou des graines sont plongeacutees dans un meacutelange deau de
javel et dune substance savonneuse pendant plusieurs dizaines de minutes
Ensuite on travaille steacuterilement sous hotte agrave flux laminaire Selon la plante on
deacutecoupe des morceaux de feuilles (reproduction veacutegeacutetative bourgeonnement
adventif) ou des bourgeons axillaires et on les place dans des pots individuels ou on
segraveme des graines
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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La multiplication
En culture in vitro on multiplie les plantes par clonage delles-mecircme On peut ainsi obtenir un grand
nombre dindividus identiques entre eux et agrave lindividu de deacutepart On utilise pour ce faire la capaciteacute
de reproduction veacutegeacutetative des plantes Et pour controcircler cette multiplication veacutegeacutetative on utilise les
hormones veacutegeacutetales particuliegraverement les cytokinines
Multiplication par bourgeonnement axillaire
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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Multiplication par bourgeonnement adventif
4 La reacuteintroduction des plantes en milieu naturel
Lenracinement
En culture in vitro on multiplie des tiges feuilleacutees Pour obtenir des plantes complegravetes il faut que
ces tiges deacuteveloppent des racines Cela sobtient en transfeacuterant les tiges sur un milieu frais enrichi
en auxines (hormones veacutegeacutetales)
Lacclimatation
Lorsque les tiges sont enracineacutees on peut acclimater les plantes c agrave d les reacutehabituer agrave la vie agrave
lair libre
On deacutebarrasse les racines de la geacutelose dans laquelle elles ont pousseacute et on repique les plantes dans
le substrat
adeacutequat (tourbe terreau) Les plantes sont placeacutees dans un milieu toujours confineacute afin quelles
sadaptent
progressivement agrave de lair plus sec agrave des variations de luminositeacute et de tempeacuterature
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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VI Les Avantages de la culture in vitro
Lassainissement des veacutegeacutetaux
La culture in vitro permet leacutelimination des virus et des bacteacuteries
Exemple le virus de la pomme de terre
La multiplication de masse
Gracircce agrave cette technique on peut obtenir rapidement et indeacutependamment des conditions
climatiques un grand nombre de plantes qui sont stockeacutees dans un espace reacuteduit
Laccroissement de la diversiteacute
Des plantes rares en voie de disparition peuvent ecirctre conserveacutees et multiplieacutees en culture
in vitro De mecircme des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles agrave bouturer
etou agrave greffer beacuteneacuteficient aussi de cette technique On peut ainsi obtenir des rosiers ou
des vignes sur leurs propres racines
La multiplication de nouvelles espegravecesvarieacuteteacutes ou de plantes steacuteriles
- plantes reacutesultant de croisement (hybrides) qui sont souvent steacuteriles
- plantes transgeacuteniques
- plantes agrave fruits sans peacutepin
- plante preacutesentant une caracteacuteristique inteacuteressante comme par exemple la couleur
particuliegravere de ses fleurs ---gt nouveau cultivar
La multiplication de plantes seacutelectionneacutees
- Pour leur reacutesistance aux maladies
- Pour leur production plus importante
- Pour leur toleacuterance agrave divers facteurs (seacutecheresse excegraves deau trop ou trop peu
de sels froidchaud herbicide)
- Pour leur vigueur
La seacutelection de plantes reacutesistantes
On peut exercer une pression de seacutelection en cultivant les plantes sur des milieux
contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides Les plus reacutesistantes
sont repiqueacutees sur du milieu de plus en plus concentreacute
On peut par la mecircme technique seacutelectionner des plantes capables de vivre sur des
milieux pauvres ou des plantes reacutesistantes agrave certains pathogegravenes
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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VII Les phytohormones
Les hormones veacutegeacutetales ou phytohormones sont impliqueacutees agrave tous les stades de la vie dune
plante depuis la pollinisation provoquant la feacutecondation et le deacuteveloppement de lembryon
zygotique tout au long du deacuteveloppement de celui-ci en plante adulte jusquau controcircle de la
floraison de la fructification et de la seacutenescence Les mecircmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de deacuteveloppement elles sont pour cela obligatoirement
impliqueacutees dans des meacutecanismes speacutecifiques de division deacutelongation et de diffeacuterenciation
cellulaire mais aussi neacutecessairement dans les meacutetabolismes primaire et secondaire
Les phytohormones sont dune importance capitale dans le controcircle des cultures in vitro de
cellules tissus organes ou plantes entiegraveres cest-agrave-dire dans lorientation quon veut leur donner
maintien en vie croissance initiation dune organogenegravese speacutecifique (production dorganes tels
que pousses feuilleacutees racines embryons somatiques) multiplication dorganes ou de plantules
etchellip Elles sont eacutegalement largement utiliseacutees pour le controcircle de la production de meacutetabolites
secondaires dinteacuterecircts divers
Ici nous parlerons essentiellement de plantes entiegraveres ou presque
non issus du deacuteveloppement dune graine
Quelques expeacuteriences simples expliquant le rocircle des hormones veacutegeacutetales dans la
plante
1 les auxines
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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- Premiegravere expeacuterience
- Cette hormone favorise le deacuteveloppement racinaire
On coupe la base racinaire de la
plantule que lon place dans un
milieu contenant ou non de
lauxine
En labsence dauxine des
racines adventives peuvent se
deacutevelopper
Cest le principe du bouturage
Cependant en preacutesence
dauxine le deacuteveloppement de
racines est beaucoup plus
important
Exemple
- Deuxiegraveme expeacuterience autre effet de lauxine
- Lorsquon coupe le bourgeon
terminal dune plantule on
constate le deacuteveloppement des
bourgeons axillaires en
rameaux lateacuteraux
- Si on remplace le bourgeon
terminal par de louate imbibeacutee
avec de lauxine on ne constate
plus de deacuteveloppement des
bourgeons axillaires
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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- Lauxine remplace donc le bourgeon terminal
- On peut en deacuteduire que celle-ci est produite dans la partie terminale de la plante
On parle de dominance apicale la partie apicale (terminale) de la plante empecircche le
deacuteveloppement des bourgeons axillaires au profit de son deacuteveloppement propre
2 Les cytokinines
- Les cytokinines favorisent le bourgeonnement adventif
Si on prend une feuille de
geacuteranium et quon place celle-ci
sur de la terre ou du milieu sans
hormone quelques bourgeons
adventifs apparaissent
Si on ajoute des cytokinines
dans le milieu on observe
beaucoup plus de bourgeons
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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3 Auxines et cytokinines
- en haut on a donc supprimeacute la dominance apical en supprimant le bourgeon terminal
- au centre on a coupeacute le bourgeon terminal et la base ou coiffe racinaire On observe plus de
deacuteveloppement des bourgeons axillaires sur lexplant
Les racines sont donc neacutecessaires au deacutebourrement (deacuteveloppement des bourgeons)
- par contre (en bas) si un explant identique est placeacute dans un milieu contenant des
cytokinines le deacuteveloppement des bourgeons se produit
Les cytokinines remplacent donc les racines et on peut en deacuteduire quelles sont produites dans
les racines
On constate aussi quil ny a pas de deacuteveloppement racinaire en preacutesence de cytokinines
4 Reacutecapitulatif
Les auxines - Elles sont produites dans la partie terminale de la plante
- Elles sopposent au deacuteveloppement des bourgeons axillaires
- Elles favorisent la rhizogenegravese (deacuteveloppement des racines)
Les cytokinines - Elles sont produites au niveau des racines
- Elles sopposent au deacuteveloppement des racines
- Elles favorisent le deacuteveloppement des bourgeons axillaires
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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Utilisation des hormones en culture in vitro
- De fortes concentrations en
cytokinines allieacutees agrave de faibles
concentrations en auxines nous
permettent dobtenir le
deacuteveloppement des bourgeons
axillaires ou adventifs et ainsi de
multiplier les plantes
- De fortes concentrations en
auxines allieacutees ou non agrave de faibles
concentrations en cytokinines nous
permettent dobtenir
lenracinement des tiges feuilleacutees
- Si on eacutequilibre les
concentrations de ces deux
hormones on obtient un cal Le cal
est le reacutesultat de la prolifeacuteration
anarchique de cellules plus ou
moins diffeacuterencieacutees mais qui
narrivent plus agrave sorganiser en tissus
et organes distincts
Si la connaissance du contenu en hormones introduites (ou quelques fois seacutecreacuteteacutees par le
mateacuteriel veacutegeacutetal) dans les milieux de culture est souvent dune grande utiliteacute cest surtout la
nature et la quantiteacute des phytohormones (et les rapports entre elles) naturellement meacutetaboliseacutees
par les veacutegeacutetaux qui sont importantes pour une approche fondamentale des pheacutenomegravenes ce qui
permettra ensuite de les controcircler et dorienter leur contenu endogegravene
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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Lexique
ADN Acide deacutesoxyribonucleacuteique se preacutesentant sous forme de deux chaicircnes polynucleacuteotidiques
apparieacutees lune agrave lautre par des liaisons hydrogegravene enrouleacutees en spirale agrave laspect dune double heacutelice et renfermant dans sa seacutequence linformation geacuteneacutetique Cest une macromoleacutecule lineacuteaire dont la sous-
uniteacute de base un deacutesoxyribonucleacuteotide contient le sucre deacutesoxyribose Les bases azoteacutees sont la thymine qui se lie agrave ladeacutenine et la guanine qui se lie agrave la cytosine
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Bacteacuteries du sol qui permettent dintroduire des gegravenes eacutetrangers dans les veacutegeacutetaux par lintermeacutediaire de leurs plasmides On reacutegeacutenegravere ainsi des plantes transgeacuteniques
ALBINOS Plantes blanches car deacutepourvues de pigments chlorophylliens donc ne pouvant assurer la photosynthegravese donc condamneacutees agrave la neacutecrose ou au parasitisme
ALLELE Un des deux gegravenes dune mecircme paire de chromosomes homologues et pouvant ecirctre diffeacuterents ou identiques Lun est dorigine paternelle lautre maternelle Leur expression concerne le mecircme
caractegravere pheacutenotypique Cest lallegravele dominant qui sexprime Lallegravele reacutecessif ne sexprime pas mais peut ecirctre transmis agrave la descendance
ANDROGENESE Reacutegeacuteneacuteration de plantes par culture de cellules sexuelles macircles grains de pollen isoleacutes ou anthegraveres non matures Les individus obtenus haploiumldes expriment directement leur
geacutenome apregraves doublement spontaneacute de leur stock de chromosomes ou provoqueacute par de la colchicine Les plantes obtenues sont parfaitement homozygotes ce sont des ligneacutees pures
ANTHERE Partie de leacutetamine surmontant le filet et qui renferme les grains de pollen
APEX Sommet du bourgeon agrave lorigine des organes constitueacute du meacuteristegraveme entoureacute deacutebauches foliaires
AUXINE Reacutegulateur de croissance syntheacutetiseacute essentiellement dans les bourgeons des plantes supeacuterieures Les auxines ont un rocircle dans la croissance lorganogenegravese la diffeacuterenciation cellulaire la
rhizogenegravese Lacide 3-indole aceacutetique (AIA) est une auxine naturelle LANA ( acide naphtalegravene aceacutetique) est une auxine de synthegravese plus stable agrave la chaleur
CAL Amas de cellules veacutegeacutetales indiffeacuterencieacutees en divisions totipotentes obtenues par culture in vitro ou naturellement suite agrave une blessure des tissus ou une infection Des plantes entiegraveres peuvent ecirctre reacutegeacuteneacutereacutees agrave partir des cals Les cals peuvent ecirctre eacutegalement agrave lorigine de suspensions cellulaires
CHIMERE Ensemble de deux lots cellulaires nayant pas le mecircme patrimoine geacuteneacutetique Les plantes panacheacutees sont des plantes chimeacuteriques
CHROMOSOME Forme condenseacutee de la moleacutecule d ADN associeacutee agrave des proteacuteines (histones) contenu
dans le noyau cellulaire et support de lheacutereacutediteacute Les chromosomes sont visibles lors de la division cellulaire (mitose)
COLCHICINE Alcaloiumlde antimitotique Au moment de la division cellulaire les chromosomes
dupliqueacutes restent dans le mecircme noyau au lieu de migrer dougrave le doublement du stock chromosomique La colchicine est extraite de la colchique
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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CROWN-GALL Tumeur des plantes au niveau du collet ou des tiges provoqueacutee par Agrobacterium tumefaciens
CULTIVAR Varieacuteteacute cultiveacutee proteacutegeacutee et reacutepertorieacutee dans des catalogues officiels
CYTOKININES Substances de croissance veacutegeacutetales eacutelaboreacutees essentiellement par les racines et les
embryons Elles peuvent induire des divisions cellulaires la neacuteoformation de bourgeons ainsi que des diffeacuterenciations La kineacutetine est une cytokinine naturelle
DOMINANT Se dit de lun des deux allegraveles qui sexprime dans le pheacutenotype et qui masque lexpression de lallegravele reacutecessif
EMBRYONS SOMATIQUES Embryons bipolaires non zygotiques cest agrave dire non issus de la fusion de gamegravetes macircle et femelle mais issus dune cellule somatique non germinale ou non sexuelle
ETAMINE Piegravece florale macircle productrice du pollen composeacutee de lanthegravere et du filet
EXPLANT Fragment de plante mis en culture cellule meacuteristegraveme apex tissu embryon piegraveces florales organes etc
FUSION de PROTOPLASTES Fusion ou hybridation de cellules deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique
GENOME Ensemble du patrimoine geacuteneacutetique contenu dans chaque cellule de chaque organisme vivant
GENOTYPE Ensemble de linformation geacuteneacutetique contenu dans les chromosomes
HAPLOIDE Les cellules non sexuelles sont diploiumldes ou 2n Elles ont 2 lots de chromosomes qui peuvent
sapparier lun issu de la megravere lautre venant du pegravere Une cellule haploiumlde ne contient quun seul lot de chromosomes n Un organisme haploiumlde est constitueacute de cellules haploiumldes il est steacuterile et doit ecirctre
doubleacute pour ecirctre fertile Son pheacutenotype exprime son geacutenotype cest pourquoi il est inteacuteressant car des caractegraveres habituellement cacheacutes car reacutecessifs peuvent alors sexprimer et ecirctre exploiteacutes
HOMOZYGOTE Organisme qui a des allegraveles identiques aux deux locis homologues dun lot de chromosomes diploiumldes Des plantes homozygotes pour tous leurs gegravenes sont des ligneacutees pures
HYBRIDATION SOMATIQUE Fusion provoqueacutee de deux cellules somatiques (non sexuelles) et deacutebarrasseacutees de leur paroi pecto-cellulosique (protoplastes) Cette technique permet les croisements interspeacutecifiques voire intergeacuteneacuteriques
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
KANAMYCINE Antibiotique dont le gegravene de reacutesistance peut servir de marqueur des cellules transformeacutees
LOCUS Localisation dun gegravene donneacute sur un chromosome
MERISTEME Amas de cellules indiffeacuterencieacutees qui se divisent activement situeacutees agrave lextreacutemiteacute des
bourgeons ou des racines agrave lorigine des organes Les meacuteristegravemes sont indemnes de virus
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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PARTHENOGENESE Deacuteveloppement dun fruit sans feacutecondation donc sans formation de peacutepins ou de graines La banane est un fruit partheacutenocarpique
PHENOTYPE Ensemble de lexpression des gegravenes dominants formant lapparence dun individu Cest le reacutesultat de linteraction entre lexpression des gegravenes et lenvironnement
PROTOPLASTE Cellule veacutegeacutetale non sexuelle deacutebarrasseacutee de sa paroi pecto-cellulosique elle prend alors une forme spheacuterique La fusion de protoplastes permettant la creacuteation dhybrides somatiques
PHYTOHORMONES Substances de croissances produites par certaines cellules veacutegeacutetales le plus souvent transporteacutees en dehors du lieu de synthegravese Elles agissent agrave des doses infiniteacutesimales et reacutegulent
certains processus physiologiques Les principales hormones eacutetant les auxines les cytokinines les gibbeacuterellines lacide abscissique et leacutethylegravene
RECESSIF Se dit de lun des deux allegraveles qui ne sexprime pas dans le pheacutenotype car lexpression est masqueacutee par celle de lallegravele dominant
REJUVENATION Pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation cellulaire qui entraicircne globalement lexpression de caractegraveres juveacuteniles
RHIZOGENESE Formation de racines
TOTIPOTENCE Proprieacuteteacute quont les cellules veacutegeacutetales de pouvoir se deacutediffeacuterencier cest agrave dire de reacutegeacuteneacuterer une plante entiegravere si elles sont cultiveacutees sur un milieu approprieacute
TRANSGENIQUE Plante ameacutelioreacutee et issue dune cellule agrave laquelle a eacuteteacute ajouteacute un segment d ADN eacutetranger par diverses techniques
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
HELLEBORE PETUNIA ANTHURIUM ROSIER - rose tree PELARGONIUM
PHANALEOPSIS PHAIumlUS CORDYLINE CENTAUREA jacea ANUBIA
DAHLIA CROTON MICROSORUM CHRYSANTHEME BANANIER
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ESPECES SAUVAGES
FOUGERE- fern ORME CENTAUREE
germination de spores
ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
tree CAFEIER ORME - elm
embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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ESPECES de GRANDE CULTURE
BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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ESPECES FLORALES et ORNEMENTALES
LIS GLAIEUL - gladiolus ST PAULIA CACTUS COLEUS
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ESPECES LIGNEUSES
LAGERSTROEMIA RHODODENDRON POMMIER -
apple tree FUSAIN - spindle
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embryon
somatique callogenegravese
ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
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1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
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1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
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apple tree FUSAIN - spindle
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embryon
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ESPECES POTAGERES
CAROTTE POIREAU - leek
embryogenegravese somatique
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1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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BLE - wheat BETTERAVE -beet POMME de TERRE - potato
androgenegravese microtubeacuterisation
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HISTORIQUE des CULTURES in vitro
1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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1902 GHABERLANDT un autrichien eacutenonce le concept de la totipotence cellulaire veacutegeacutetale Il reacuteussit agrave faire survivre in vitro quelques mois mais sans multiplication de petits amas cellulaires
1922 Aux Etats-Unis WJ ROBBINS et en Allemagne W KOTTE obtiennent la croissance de pointes de racines pendant
quelques mois seulement
1926 E KUROSAWA (Formose) deacutecouvre laction de la gibbeacuterelline sur la croissance cest la premiegravere fois quune substance hormonale est extraite dune plante
1934 PR WHITE (USA) reacuteussit une culture de racines de tomates
1935 Le Professeur RJ GAUTHERET en France cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu
1936 OORSOS en Hongrie induit des cals et des organes agrave partir de tissus de tubercule de chou-navet FG GUSTAFSON obtient avec un grand succegraves les premiers fruits partheacutenocarpiques (tomate raisin figue) par application dauxine sur des ovaires non feacutecondeacutes
1939 RJ GAUTHERET reacuteussit des cultures indeacutefinies de tissus veacutegeacutetaux normaux de carotte Aujourdhui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent agrave prolifeacuterer Les cultures de PR WHITE sur le tabac eacutetaient quant agrave elles des tumeurs veacutegeacutetales et ne neacutecessitaient pas dadjonction de phytohormones Il faut citer eacutegalement les travaux contemporains du franccedilais P
NOBECOURT quatriegraveme pionnier des cultures in vitro veacutegeacutetales sur la carotte
1941 AC BRAUN en eacutetudiant les tumeurs veacutegeacutetales ou crown-gall a amorceacute les travaux qui ont conduit aux premiegraveres manipulations geacuteneacutetiques veacutegeacutetales
1944 R BUVAT par les techniques de culture de tissus met en eacutevidence le pheacutenomegravene de deacutediffeacuterenciation la
rejuveacutenation
1946 E BALL aux Etats-Unis obtient la reacutegeacuteneacuteration de plants de lupin et de capucine agrave partir dapex de grande taille
1949 P LIMASSET et P CORNUET notent labsence de virus dans les meacuteristegravemes de tabacs viroseacutes
1952 Mettant agrave profit ces travaux G MOREL et C MARTIN agrave lINRA de Versailles reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres saines de dahlia varieacuteteacute le Recircve indemnes de virus agrave partir de culture de meacuteristegravemes de plants infecteacutes par trois virus diffeacuterents De la
mecircme maniegravere ils sauveront la varieacuteteacute de pomme de terre la Belle de Fontenay en 1954
culture cellulaire
1954 WH MUIR et col obtiennent les premiegraveres cultures de cellules isoleacutees agrave partir de cals friables cultiveacutes en milieu liquide
agiteacute
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
environnement
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1955 CO MILLER et col deacutecouvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires dans des cultures de tissus de tabac
1957 F SKOOG et C MULLER reacutegeacutenegraverent des racines et des tiges agrave partir de cals sous influence dauxine et de cytokinine
1958 FC STEWART et J REINERT obtiennent des embryons somatiques de carottes agrave partir de culture de racines et mettent ainsi en eacutevidence le principe de totipotence cellulaire eacutenonceacute par Haberlandt en 1902
1962 T MURASHIGE et F SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture MS utiliseacute largement en culture in vitro Il sagit dun milieu contenant des eacuteleacutements mineacuteraux des vitamines du groupe B du sucre auxine et cytokinine
1964 S GUHA et SC MAHESHWARI en Inde obtiennent des plantes haploiumldes de Datura innoxia Mill agrave partir de culture
danthegraveres
protoplastes
1971 Au Japon I TAKEBE et col reacutegeacutenegraverent des plantes entiegraveres de Nicotiana tabacum agrave partir de protoplastes
1972 PS CARLSON obtient le premier hybride somatique interspeacutecifique par fusion de protoplastes entre diffeacuterentes espegraveces
de tabac
WR SHARP obtient des plantes haploiumldes de tomates par culture de pollen isoleacute
1975 KKPANDEY utilise du pollen irradieacute de tabac pour reacutealiser des croisements interspeacutecifiques
1976 LH SAN NOEUM dans leacutequipe du Pr DEMARLY agrave Orsay reacuteussit la premiegravere culture dovaires dorge non feacutecondeacutes Cette mecircme anneacutee SEIBERT reacuteussit agrave initier des pousses dœillets agrave partir dapex conserveacutes agrave -196degC cest le deacutebut de la cryoconservation pouvant ecirctre utiliseacutee pour la constitution de banques de gegravenes
1983 M Van MONTAIGU et col creacuteent en Belgique les premiegraveres plantes transgeacuteniques transformeacutees par Agrobacterium tumefaciens Il sagit dun plan de tabac reacutesistant agrave la kanamycine
Depuis le deacutebut du XXegraveme siegravecle avec les travaux dHaberlandt de nombreux chercheurs ont œuvreacute et continuent agrave travailler au cœur de leurs laboratoires afin dameacuteliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les
diffeacuterentes techniques de cultures in vitro Lobjectif eacutetant dutiliser ces outils sur le plus grand nombre despegraveces possibles et avec le meilleur rendement ceci agrave des fins dameacutelioration des plantes au service de lhomme et de son
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