PATHOGENÈSE DES LÉSIONS

HÉPATIQUES DU VHC :

Mécanismes moléculaires

Dr. Hervé LERAT, PhD.

INSERM U955 Département de Virologie Moléculaire et Immunologie

Physiopathologie et Thérapeutique des Hépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)

Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.

Viral

Proteins

Host & Environmental factors

Steatosis Diabetes

Liver Tumor

Chronic viral infection

Cirrhosis

Fibrosis

Pathogenèse associée au VHC

Infection VHC

Réponse immunitaire de l’hôte Protéines virales

Hépatocarcinomes viro-induits :

rôle direct et/ou indirect des protéines virales?

Lésions

hépatiques

Cirrhose CANCER

?

Nécessité de développement de

modèles animaux

Contexte d’un organe entier

dans un animal vivant.

Pathologies viro-induites:

contribution du virus?

Modèles animaux pour l’étude des

pathologies induites par le VHC

Primates non-humains

Chimpanzé

Ouistiti

Modèles d’infection

Problème de disponibilité et de coût.

Modèle in vivo de souris transgéniques pour le VHC (FL-N/35)

Lerat et al., Gastroenterology 2002

ARN VHC +

FOIE

micro-injections

C57Bl6J x C3H/HeJ

X C57BL6J ou C3H

ADN HCV +

FL-N E1 E2 core

NS

4a

NS3 NS4b NS5a NS5b NS2 p7

Promoteur Albumine SV40 PolyA

Génotype 1b

FL-N/35

Lerat et al., Gastroenterology 2002

ARN VHC +

FOIE

micro-injections

C57Bl6J x C3H/HeJ

X C57BL6J ou C3H

ADN HCV +

FL-N E1 E2 core

NS

4a

NS3 NS4b NS5a NS5b NS2 p7

Promoteur Albumine SV40 PolyA

Génotype 1b

Stéatose

CHC

fibrogenèse

+CCl4

Modèle in vivo de souris transgéniques pour le VHC (FL-N/35)

CHC induit par le VHC:

Mécanismes Moléculaires?

Rôle direct des protéines virales?

Hepatocellular Carcinomas

A

Lerat et al., Gastroenterology 2002.

1 cm

1 cm FL-N/35-170UNC

FL-N/35-171UNC

1 cm FL-N/35-102CERFE

APOPTOSE

caspase 3 caspase 9

cytochrome C

caspase 8

Fas

FasL

Bid

Membrane cellulaire

mitochondrie

VHC

(NS2)

CIDE-B

fragmentation ADN

VHC (NS5A)

calpaïne

Etape vers le

cancer

Inhibition de la voie apoptotique FAS dans le foie des souris VHC

GADD45g GADD45b GADD45a GADD153 GADD34

Senseurs de stress

Q

M

G1 G2

S

G0

CyclinB1

Cdc2

Arrêt du cycle

cellulaire (G2/M)

GADD45β Lésions de

l’ADN

Lésions de l’ADN – La famille GADD

P

P

P

Histone H3

Histone H1

Lamine

Les protéines du VHC induisent la méthylation du promoteur de GADD45β:

inhibition de sa transcription : évasion du point de contrôle.

VHC

Effects of c-Myc over-expression

c-Myc

M

G1 G2

S

G0

Normal Cancer

Genomic instability DNA damage

SSB DSB

ROS production (reactive oxygen species)

Abnormal

G1-S progression

VHC c-Myc

c-Myc c-Myc

Signalling events activating Akt – Downstream effects

Huh7 Huh7

+ SGR

Rela

tive A

kt activity

(%)

0

50

100

150

200

250

300 p = 0.01

Human

hepatoma cells

Hepatic lysates Primary cells

Rela

tive A

kt acitvity (

%)

0

wt

FL-N/35

p=0.02

p=0.02

50

100

150

200

250

300

Mice

0

100

200

300

400

EtOH HBV + HCV +

Non-tumoral tissueP

-AK

T/tota

l A

KT

(E

tOH

= 1

00%

)

p = 0,006

p = 0.003

Human liver

AKT is activated in the context of HCV infection and HCV protein expression.

Higgs et al. Oncogene, 2013

DNA damage

Bid

Diminished

apoptosis Genomic instability

HCV infection

NS5A

Viral protein

expression

Metabolic syndrome

(IR,steatosis)

Non structural proteins

Pi3K/P-AKT

GADD45b promoter

Abnormal

cell-cycle checkpoints

Defective

DNA repair

CH3 CH3

Gadd45b

Mitochondrial dysfunction

c-Myc

promoter

b-catenin b-catenin

c-Myc

c-Myc c-Myc c-Myc

Oxidative

Stress

Stem cell

recruitment

Cell cycle

Blockade

Gastro 2002, 2004, 2006, 2008

JBC 2003

JBC 2009

Hepato 2009

Cancer Res 2010

J Hepatol 2012

Oncogene 2013

Evènements pro-carcinogènes

Stéatose induite par le VHC:

Mécanismes Moléculaires?

Rôle direct des protéines virales?

Microvesicular steatosis

Non TG HCV TG

HCV TG HCV TG

Lerat et al., Gastroenterology 2002.

Stéatose micro-vésiculaire

coloration Oil Red O

analyse in silico

HCV TG

NON TGM

F

M

0

5

10

15

20

25

12.5 ± 0.4

13 ± 0.8 14.4 ± 0.8

14.1 ± 0.3

n=12

n=12 n=10

n=7

p<0.001

% d

e l’a

ire

to

tal

PERK ATF6

IRE-1

Stress RE RE

Epissage ARNm XBP1 P-eiF2α

Arrêt traduction Dégradation protéique

Résumé

SREBP1c Domaine de transactivation

(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lip

ogenèse

ACC

FAS

SCD1

VLDL MTP Exportation TG

ApoB

Accumulation TG intracellulaires STEATOSE

HEPATIQUE

=

=

Potential mechanisms of HCV-induced steatosis

Lerat et al., Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 5(3):341-52, (2011)

Fibrose induite par le VHC:

Mécanismes Moléculaires?

Rôle direct des protéines virales?

Fibrosis is enhanced in CCl4-treated FL-N/35 mice

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

FL-N/35 WT

+ CCl4 - CCl4

WT

p<0.005*

Are

a o

f fi

bers

(%

)

n 5 5 13 17

FL-N/35

*Mann-Whitney test Scale bars : 100µm.

WT FL-N/35

- CCl4

+ CCl4

HPC

Altération de

la prolifération

hépatocytaire Fibrogenèse

périportale

Réaction

Ductulaire

Lésion hépatique chronique

Chouteau et al. J Hepatol. (2012)

Fibrogenèse

The hepatocyte cell cycle is deregulated in HCV mice during liver repair.

HCV, liver fibrosis and regeneration:

0

50

100

150

200

250

0h 24h 40h 48h 60h

Brd

U +

hep

ato

cyte

s /

µm

2

wt

FL-N35

- CCl4 + CCl4

p<0.0001

p<0.0001

n= 4/4 4/4 8/8 4/4 4/4

wt FL-N/35

40h

48h

60h

24h

0h

+ C

Cl 4

CCl4 injection (IP, 795mg/kg)

24h 40h 48h 60h 72h 120h

Quiescent liver / Liver damage / Hepatocyte proliferation / Liver repair

0h

Sacrifice, liver sections, BrdU staining

FL-N/35 WT

Higgs et al. Cancer Research, 2010

Chouteau et al. J Hepatol 2012

Higgs et al. Oncogene, 2013

HCV infection

HCV protein

expression

DNA

damage

Hepatocyte

cell cycle

perturbation ?

HCV, liver fibrosis and regeneration:

The modulation of the oxidative stress-DNA damage-cell cycle axis by HCV protein expression results in a

delayed G1/S phase.

cdc25a Ub

E2F

Rb

Rb

P

E2F

S phase genes

(Cyclin A)

Cdk2

Cyclin E

ATM

Chk 2 p53

p53 p21

P

Degradation

cdc25a

Delayed

Ub Ub

Chk 2 P

Chk 1 P

ATR

HCV, liver fibrosis and regeneration:

ROS HCV

Chk 1

Modèle reproduisant les principales pathologies induites par le VHC

Niveau d’expression similaire à l’infection chronique chez l’homme

Absence de réponse immunitaire (pas d’inflammation ni de cirrhose)

La cirrhose n’est pas un pré requis au développement de CHC : en accord avec données cliniques (méta-analyse, Maisonneuve 2009)

Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines virales en absence de cirrhose.

Inhibition de l’apoptose (voie FAS)

Inhibition de l’expression du suppresseur de tumeur GADD45β

Stimulation de l’expression de l’oncogène c-myc

Activation de la kinase AKT

Inhibition de la sécretion des VLDL (MTP)

Stimulation de la lipogenèse

Fibrogenèse associée à une réaction ductulaire due à une inhibition de la prolifération hépatocytaire (ROS, lésion de l’ADN)

Conclusions

• Main objective: To induce liver inflammation in HCV mice. HCC incidence?

PERSPECTIVES:

Co-morbidity (non-viral) factors in virally-induced HCC

MCD or DIO FLN/35 or HLE mice

FLN/35 or HLE mice Mdr2 KO

HCC incidence

and mechanisms