Électrophorèse capillaire - ESIbadiaa/CHM3102_CE1a.pdf · Notions de base – électro-osmose La...

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Électrophorèse capillaire


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Vue d’ensemble

DDéétecteurtecteur

ÉÉlectrodelectrode


TamponTampon

TamponTamponÉÉchantillonchantillon

Séparation basée sur la migration différentielle des solutés sous l’influence d’un champ électrique. Séparation s’effectue dans des tubes de silicefondue de petit diamètre (25µm to 75 µm id)Haut voltages (10 to 30 kV) et haut champs électriques (100 to 500 V/cm) sont appliquesaux extremités du capillaire.Haute résistance du capillaire limite la generation de courant et l’effet Joule. Grande efficacité (N>105 to 106) et rapiditéd’analyse.Détection “en ligne” (pas de cellule externe).Petit volume d’injection (1 to 50 nL)Différents modes de séparation et application. Séparation en milieu aqueuxAutomatisation

AlimentationAlimentationéélectriquelectrique


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Support de séparation – silice

Matériel le plus utilisé pour les capillairesTubes résistants (polyimide) et de petit diamètreHaute constante diélectrique (isolant)Haute transmission UVFaible fluorescence

Gaine de polyimide(~15 µm)

Diamètreinterne(25-100 µm)

Diamètre externe(70-500 µm)


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L’instrumentationCartouche avec capillaireà °T contrôlée

Détecteur (DAD)

Compartimentà °T contrôlée

Carrouseld’échantillonet de tampons

Agilent HP 3D Capillary electrophoresis system


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Conversion des unités

1 Joule (J) = 1 kg.m2.s-2

1 centiPoise (cP) = 10-3 kg. m-1.s-1 = 10-3 Pa.s1 psi = 6.8948x103 Pa1 Coulomb (C) = 1 J.V-1 = 1 kg.m2.s-2.V-1


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Notions de base – velocité

Champ électrique:

Force électromotrice et frictionnelle



TamponTampon

TamponTampon



Ld

Lt

cathodeanodeVV

dx

dVE

-==

Lt

Charge

Champ électrique (V/cm) Coefficient de friction

Vélocité(m s-1)

q E = f vet f = 6 π η ri

où q est la charge électrique possédée par un ion i (C),

E est le champ électrique (V/m),

f est le coefficient de friction (cP m), pour un ion sphérique

η est la viscosité du milieu (cP),

v est la vitesse linéaire de la particule i (cm/s), dans un champ électrique

ri est le rayon hydrodynamique (ionique) de la particule i, (une forme sphérique) (m).

Analytes


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Notions de base – Mobilité ionique

Er

qfEq

vi

⋅=⋅

=πη6

On définit la mobilité électrophorètique de l’ion comme:

i

i

rqπη

µ6

ep. = en unités de m2V-1s-1

Caractéristique physico-chimique de l’ion d’intérêt

Donc: E v epep µ=

La mobilité électrophorètique, µep, et donc la vitesse électrophorètique, vep, dépend du milieu: pH et composition du tampon (force ionique, viscosité, etc.).


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Notions de base – séparation

Temps

Mélange équimolaire Asp, Gly, et Lystampon tris, pH 6.0

Assigner les différents pics observés et justifier leurspositions relatives.


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Notions de base – électro-osmose

La silice fondue (SiO2.H2O) possède des groupements silanols

ionisables lui confèrant des propriétés acides

La silice fondue en contacte avec le tampon formera une double couche électrique à la paroi du capillaire:

NaOAc + H2O Na+ + OAc - + H3O+ + OH-

Si

Si

Si

Si

O

O

O

O -

O -

O

pKa ~ 6 (pI ~ 1,5)

≡SiOH ≡SiO- + H+


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-------

++

++

+

Silice fondue avec cationsfortement adsorbés

Zone diffuse de la double coucheavec une prédominance de cations

Solution

+

-

Que se passe t’il suite àl’application du voltage ?

épaisseur de la double couche électrique

Distance à partir de la paroi du capillaire (nm)

Potentiel (mV)

couche diffuse

ζ

L’épaisseur de la couche diffuse estd’environ 10 nm pour une force ionique de 1 mM et 0.3 nm à 1 M.

Le potentiel Zeta correspond au potentiel associé àla couche diffuse

++

+

+

++

+

++

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

--

- -

--

-

La migration des cationssolvatés de la couche diffuse occasionne un déplacementvers la cathode, lequel estappellé électro-osmose

++


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où :µeo est la mobilité électro-osmotique (m2V-1s-1) ε est le constant diélectrique du milieu ζ est le potentiel Zeta (quelques mV) η est la viscosité du milieu (cP)

Le potentiel zeta associé à la couchediffuse est obtenue à partir de l’équation de Helmholtz

εµηπς eo 4

=

EEηπςεµ 4

v eoeo ==

Donc la mobilité électro-osmotique, µeo, et la vitesse électro-osmotique, vep sont obtenu par:


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Notions de base – les mesures de mobilité

Le mouvement d’un soluté chargé à travers le capillaire est la somme des deux phénomènes : électrophorèse et électro-osmose.

E

app

)(v

vvv

eoepapp

eoep

eoepapp

µµ

µµµ

+=

+=

+=

) 4

et r 6

où ( eoep ηπςεµ

ηπµ ==

q

On définit la vélocité apparente (vélocité totale) d’un soluté, vapp , et la mobilité apparente µapp comme:


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Notions de base – les mesures de mobilité


VLLL

t tdd

)(v donc

eoepappm µµ +

==

tm

d

LV

EtL

= et =vapp


TamponTampon

TamponTampon


Ld

LtAnalytes

E)(v eoepapp µµ +=



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Notions de base – Caractéristique du débitélectro-osmotique

pressure driven

parabolic flow

voltage driven

electroosmotic

flow

temps

A

temps

A

Le débit électro-osmotique issu de la couche diffuse est uniforme et a un profile étroit contrairement à celui associé aux systèmes utilisant une pression appliquéepour éluer les analytes (HPLC). Le débit électro-osmotique ne cause pas un élargissement significatif de la bande.


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Notions de base – l’ordre d’élution

eov

epv

++

+

-

-

appv

++

+

-

-

Mais aussi:+

+

+

+

Er

qv

i

⋅=πη6


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Notions de base – calculs de mobilité

veo

(307 s)

(353 s)Séparation effectuée à 20 kV dans un

capillaire de 60 cm (50 cm au détecteur)

(416 s)

Temps

Quelle est la mobilité electrophorétique de chaqueacide aminé (ordre est le meme queprécédemment?


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Notions de base – efficacité et plateau théorique

En chromatographie liquide

CuuB

AH ++=

Résistance au transfert de masse

Diffusion d’Eddy, chemin multiple

En electrophorèse capillaire

L’electro-osmose ne cause pas d’élargissement significatif mais affecte le temps auquel un ion prendra pour etre detecte. Seul la diffusion longitudinale a un impact important sur la diffusion des bandes.


18CHM 3102

Notions de base – efficacité et plateau théorique

et σ2 = 2Dm tm

VLL td

)( D 2

eoep

m2

µµσ

+=

VLLL

t tdd

)(v eoepappm µµ +

==

tLL

DN d

m•==

2V

HL app.d µ

et

coefficient de diffusion (m2s-1)

Aussi:

2

16 ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛×=

b

m

wt

N

VDL

LH

app

mt

d .

22

µσ

==

Dm (x10-11 m2s-1)

Glycine 106.0Insulin 8.2Hemoglobin 6.3Catalase 4.1Urease 3.5Tob. mos. virus 0.53


19CHM 3102

Notions de base – résolution

( )AB

mAmB

wwtt

R+−

=2

VLL

tapp

td

)( .m µ

=et

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

+∆

eoep

ep

4=R

µµµN

tLL

DN d

m•=

2Vapp.µ

et


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Facteurs affectant l’efficacité et sources de variance

σ2obs.= σdif.

2 + σinj.2 + σtemp.

2 + σads.2 + σdet.

2 + σ∆k2 ...

dif.: Diffusion longitudinale, limite fondamentale déterminée par le coefficient de diffusion

inj.: Longueur de la bande d’injection doit être moindre que la longueur associée àla diffusion. Contrainte de sensibilite nécessite bien souvent un compromis.

temp.: Effet Joule et gradient de °T avec augmentation de V

ads.: Interaction de l’analyte avec la paroi du capillaire

det.: Détecteur être relativement petit p/r à la largeur de pic.

∆k: Différence de conductivité entre l’analyte et le tampon


21CHM 3102

Température

Les effets d’échauffement peuvent causer un gradient de température non-uniforme, un changement local de viscosité, et une diffusion de l’analyte. L’augmentation de V peutavoir des effets néfaste lorsque l’effet Joule (augmentation de °T suite au passage de courant électrique celle-ci dépendant de la puissance = V.I).

0 25375 25 375390390

PolyimideSilice

Tampon

Environnementextérieur

r (µm) °T (paroi) ∆°T

25 299.0 0.5350 301.2 1.3975 304.2 3.14100 307.7 5.58125 311.6 8.72

°T

HPCE – An introductionD. Heiger

d (µm)


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Volume d’injection

Variance associée a l’injection : σinj.2 = (∆tm)2/12

σ2dif. = 2Dm tm

Largeur de la banded’injection; doit être < à la déviation std associée à la diffusion

vD

H2

=

∆tmax: Largeur max. acceptable de la bandeeh: Accroissement acceptable de Hobs.

comparativement a Hmin (dif. seul.)mteDt hm24max =∆

E.Grushka, R. McCormick, J. Chrom., 471, 421 (1989)


23CHM 3102

Volume d’injection

10000

100000

1000000

10000000

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025

W/L

N

Glycine

insulin

Le nombre de plateau variesignificativement avec le volume d’injection. La variance associée à la diffusion représente la limiteminimale d’élargissement et Nmax. Celle-ci varieegalement avec Dm. De façon pratique on limite la longueur de la banded’injection à ~ 1% de L.

~5000000

~385000 L: 0.7 mtm: 600 s


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Adsorption

La variance associée due l’adsorption à la surface ducapillaire est exprimée par:

( ) ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

+=

dmd

deo

ads KDkr

kL

Lvk 24

'

'

' 2

22σ où: k’: Facteur de capacité

veo: vélocité électro-osmotiqueDm: Coeff. diffusionKd: Const. de dissociationr: Rayon du capillaire

HPCE – An introductionD. Heiger

On voit que qu’une augmentation significative de σ2

ads survient lorsque k’ (tm-teo/teo) augmente et ce même avec k’<1. La séparation de protéinesavec CE peut devenir problématique a cause de l’adsorption à la surface. Afin de limiter cettesource d’élargissement de pic on peut diminuerles charge effective à la surface en augmentant la force ionique, en diminuant le pH ou en modifiantla surface du capillaire.


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Electrodispersion et différence de conductivité

La différence de conductivite, ∆k entre la zone de l’analyte et celle dutampon avoisinant est donnée par:

( )( )µµµµµ

−−=∆ CBCF

k où: C: Concentration de l’analyteF: Constante de Faradayµ: Mobilité de l’analyteµB: Mobilité de l’ion de même charge

que l’analyteµC: Mobilite de l’ion de charge

opposé à l’analyteke: Conductivité du tampon 22

2

16)(

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ ∆=∆

e

e

k kkEtµσ

Hjerten, S. Electrophoresis, 11, 665 (1990)


26CHM 3102

Electrodispersion et différence de conductivité

++++

+++

+

+

+

Échantillon de faibleconductivité κ < κe

Échantillon de grandeconductivité κ > κe

Échantillon de conductivitécomparable κ ~ κe

++++

+++

+

+

+

++++

+++

+

+

+

+

+

+

+ ++- - -

Tampon

µPour un échantillon de faibleconductivité, l’analyte entrera dans la region du tampon moins rapidementcar le champ électrique est plus faible.

Pour un échantillon de grandeconductivité, l’analyte entrera dans la region du tampon plus rapidement car le champ électrique est plus grand.

Pour minimiser les effects de diffusion associes aux differences de conductiviteon ajuste le tampon pour avoir ∆ke/ke

<0.5%.

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