Le gène suppresseur de métastases Growth Arrest … · iii Résumé Nous avons récemment...
Transcript of Le gène suppresseur de métastases Growth Arrest … · iii Résumé Nous avons récemment...
Le gène suppresseur de métastases Growth Arrest-
Specific 1 (Gas1) est réprimé épigénétiquement
chez le mélanome métastatique
Mémoire
Jimmy Savard-Lalancette
Maîtrise en Biologie Cellulaire et Moléculaire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Jimmy Savard-Lalancette, 2013
ii
iii
Résumé
Nous avons récemment découvert que le gène Gas1 agit comme un suppresseur de
métastases chez le mélanome. Ce gène pourrait être utilisé pour d’éventuelles thérapies
contre la métastase. Afin de découvrir le mécanisme réprimant l’expression de Gas1 chez
les cellules métastatiques, nous avons utilisé des ChIP, des inhibiteurs chimiques et des
petits ARN interférents contre des molécules susceptibles de réprimer Gas1. Chez le
mélanome métastatique murin B16-F10, nous avons observé plusieurs groupements
méthyles sur l’îlot CpG du promoteur de Gas1, ainsi que la marque de répression H3K9me3
et l’absence de la polymérase II. Chez les cellules humaines C8161 et Lox-IMVI, nous
avons découvert qu’il y avait une forte présence d’acétylation au niveau de l’histone 3 et de
polymérase II. Par ailleurs, nous avons prouvé que c-MYC et BRD4 étaient impliqués dans
la régulation de GAS1. Finalement, ces résultats pourront être utilisés pour développer
d’éventuelles thérapies contre la métastase.
iv
v
Table des matières Résumé .................................................................................................................................. iii
Table des matières .................................................................................................................. v
Liste des tableaux ................................................................................................................... ix
Liste des figures ..................................................................................................................... xi
Liste des abréviations .......................................................................................................... xiii
Remerciements ...................................................................................................................... xv
1. Introduction ...........................................................................................................1
1.1. Le cancer ...............................................................................................................1
1.2. Les métastases .......................................................................................................1
1.3. Les gènes suppresseurs de métastases ...................................................................2
1.4. Le gène Gas1 .........................................................................................................4
1.4.1. Gas1 et le cycle cellulaire ................................................................................. 4
1.4.2. Les caractéristiques de Gas1 ............................................................................. 5
1.4.3. Gas1 et les voies de signalisation GDNF et SHH ............................................ 7
1.4.4. Gas1 et l’apoptose ............................................................................................ 8
1.4.5. Gas1, un gène suppresseur de métastases ....................................................... 11
1.4.6. Gas1, un gène à plusieurs rôles ...................................................................... 12
1.4.7. La régulation de Gas1 ..................................................................................... 13
1.5. La régulation épigénétique ..................................................................................14
1.5.1. Le code des histones ....................................................................................... 15
1.5.1.1. Les marques activatrices .......................................................................15
1.5.1.2. Les marques répressives .......................................................................16
1.5.1.3. Les régulateurs épigénétiques ..................................................................... 17
1.5.2. La pause transcriptionnelle ............................................................................. 18
1.5.3. La poly(ADP-ribosyl)ation ............................................................................. 19
1.5.4. Les microARNs .............................................................................................. 20
1.6. L’oncogène c-Myc ..............................................................................................20
1.6.1. Le rôle de répresseur génique de c-Myc ......................................................... 21
1.7. Problématique et implications scientifiques de l’étude du gène Gas1 ................25
2. Méthodologie ................................................................................................................ 27
2.1. Culture cellulaire .................................................................................................27
2.2. Les vecteurs d’expression ...................................................................................27
2.3. Traitements chimiques cellulaires .......................................................................28
2.4. Extraction d’ARN ...............................................................................................28
2.5. Dosage d’ARN ....................................................................................................28
2.6. Réaction de transcription inverse ........................................................................28
2.7. Réaction en chaîne par polymérase quantitative .................................................29
2.8. Immunoprécipitation de la chromatine ...............................................................29
2.8.1. Fixation et récolte cellulaire ........................................................................... 29
2.8.2. Lyse cellulaire ................................................................................................. 30
2.8.3. Sonication ....................................................................................................... 30
2.8.4. Immunoprécipitation ....................................................................................... 30
2.8.5. Préparation de l’ADN ..................................................................................... 31
2.8.6. Isolation de l’ADN .......................................................................................... 31
2.8.7. Réaction en chaîne par polymérase quantitative ............................................. 31
vi
2.8.8. Vérification de la sonication .......................................................................... 32
2.9. Clonage moléculaire ........................................................................................... 32
2.9.1. Réaction en chaîne par polymérase ................................................................ 32
2.9.2. Gel d’agarose .................................................................................................. 33
2.9.3. Purification d’ADN ........................................................................................ 34
2.9.4. Digestion enzymatique ................................................................................... 34
2.9.5. Déphosphorylation de vecteurs ...................................................................... 34
2.9.6. Ligation .......................................................................................................... 34
2.9.7. Transformation bactérienne ............................................................................ 35
2.9.8. Extraction plasmidique de petites quantités (Miniprep) ................................ 35
2.9.9. Séquençage ..................................................................................................... 35
2.9.10. Extraction plasmidique de moyennes quantités (Midiprep) ....................... 35
2.10. Extraction d’ADN génomique ............................................................................ 36
2.11. Conversion d’ADN génomique au bisulfite de sodium ...................................... 36
2.12. Répression d’ARNm par petits ARN interférents .............................................. 37
2.12.1. Production des plasmides lentiviraux pLKO.1 ........................................... 37
2.12.2. Production des lentivirus pLKO.1 .............................................................. 37
2.12.3. Transduction des lentivirus pLKO.1 .......................................................... 37
2.13. Essai luciférase ................................................................................................... 37
3. Résultats ....................................................................................................................... 39
3.1. Le mélanome murin ............................................................................................ 39
3.1.1. Gas1 est réprimé chez les cellules de mélanome murin B16-F10 ................. 39
3.1.2. L'expression de Gas1 est modulable chimiquement par la TSA et le 5-Aza
chez le mélanome métastatique murin B16-F10 .......................................................... 41
3.1.3. Cbx1 est impliqué dans la répression épigénétique du gène Gas1 chez les
cellules de mélanome métastatique murin B16-F10 .................................................... 42
3.2. Le mélanome humain ......................................................................................... 43
3.2.1. L'expression de GAS1 est réprimé chez les cellules de mélanome métastatique
humain C8161 et Lox-IMVI ........................................................................................ 43
3.2.2. L'expression de GAS1 n'est pas modulable par la TSA et le 5-Aza chez les
cellules C8161 et Lox-IMVI ........................................................................................ 44
3.2.3. L’expression de GAS1 n'est pas contrôlée par microARNs ........................... 46
3.2.4. L’expression de GAS1 est contrôlée par les gènes BRD4 et c-MYC chez les
cellules de mélanome humain C81-61, C8161 et Lox-IMVI ....................................... 47
3.2.5. La répression de GAS1 n'implique pas les complexes c-MYC/MAX/MIZ1 ou
c-MYC/TFAP2C/KDM5B ........................................................................................... 50
3.2.6. La régulation de GAS1 implique d'autres protéines comme les PARPs ou
BMI-1 52
3.3. Le cancer du sein murin ...................................................................................... 53
3.3.1. Gas1 est réprimé chez les cellules de cancer du sein murin 4T1 ................... 53
4. Discussion .................................................................................................................... 55
4.1. Les lignées cellulaires murines ........................................................................... 55
4.1.1. Gas1 est réprimé chez les lignées cellulaires métastatiques murines B16-F10
55
4.1.2. L'expression de Gas1 est modulable chimiquement par la TSA et le 5-Aza
chez la lignée cellulaire métastatique murine B16-F10 ............................................... 56
vii
4.1.3. Cbx1 est impliqué dans la répression du gène Gas1 chez la lignée cellulaire
métastatique murine B16-F10 ....................................................................................... 59
4.1.4. Gas1 est réprimé chez les lignées cellulaires murines 4T1 ............................ 61
4.1.5. Conclusion ...................................................................................................... 62
4.2. Les lignées cellulaires humaines .........................................................................62
4.2.1. GAS1 est réprimé chez les cellules métastatiques de mélanome humain C8161
et Lox-IMVI .................................................................................................................. 62
4.2.2. GAS1 n'est pas régulé par les HDACs ou les DNMTS chez les cellules
métastatiques C8161 et Lox-IMVI ............................................................................... 63
4.2.3. L’expression du GAS1 est contrôlée par les gènes BRD4 et c-MYC chez les
cellules métastatiques de mélanome humain C8161 et Lox-IMVI ............................... 67
4.2.4. Conclusion ...................................................................................................... 70
5. Conclusion générale et perspectives ............................................................................. 73
6. Références ..................................................................................................................... 77
7. Annexes ........................................................................................................................ 97
7.1. Annexe un - Candidats criblés par petits ARN interférents ................................... 97
7.2. Annexe deux - Séquence des constructions 3'UTRhGAS1-A.1 et B.1 .................. 99
7.3. Annexe trois - Liste des produits, des anticorps et des amorces utilisés .............. 101
7.4. Annexe quatre - Vecteurs d'expression ................................................................ 107
viii
ix
Liste des tableaux
Tableau 1 : Liste des produits utilisés........................................................................101
Tableau 2 : Liste des anticorps..................................................................................104
Tableau 3 : Liste des amorces...................................................................................105
x
xi
Liste des figures
Figure 1 : Mécanisme d'apoptose induite par les récepteurs Gas1 et Ret....................9
Figure 2 : Métastases in vivo issues d'une injection de cellules B16-F10..................12
Figure 3 : Mécanisme de répression de la protéine Dnmt1 par PARylation..............20
Figure 4 : Différents mécanismes de répression employés par l'oncoprotéine c-
Myc..............................................................................................................................23
Figure 5 : Mécanisme de pause transcriptionnelle induite par c-Myc........................24
Figure 6 : Gas1 est réprimé chez les cellules B16-F10..............................................40
Figure 7 : Gas1 est modulable chimiquement chez les cellules B16-F10 par la TSA
et le 5-Aza....................................................................................................................42
Figure 8 : Le gène Cbx1 est impliqué dans la répression de Gas1.............................43
Figure 9 : GAS1 n'est pas modulable chimiquement par la TSA ou le 5-Aza chez les
lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI..................................................................44
Figure 10 : Le promoteur de GAS1 sont fortement acétylées au niveau des histones et
est caractérisé par la présence de polymérase.............................................................45
Figure 11 : GAS1 n’est pas contrôler par microARNs...............................................46
Figure 12 : BRD4 régule directement le gène GAS1 chez la lignée faiblement
métastatique C81-61....................................................................................................48
Figure 13 : c-MYC est impliqué dans la répression du gène GAS1 chez les cellules
métastatiques C8161 et Lox-IMVI..............................................................................49
Figure 14 : c-MYC réprime directement le gène GAS1 chez les lignées métastatiques
C8161 et Lox-IMVI.....................................................................................................50
Figure 15 : Le complexe c-MYC/MAX/MIZ1 n’est pas impliqué dans la répression
du gène GAS1 chez les C8161....................................................................................51
Figure 16 : La répression de GAS1 n’implique pas les facteurs de transcription
KDM5B, PARG ou NELF..........................................................................................52
Figure 17 : Gas1 est réprimé chez les cellules métastatiques murines du cancer du
sein 4T1.......................................................................................................................54
Figure 18 : Schéma récapitulatif des mécanismes de répression du gène GAS1.......74
Figure 19 : Candidats transduits par petits ARN interférents chez les cellules
C8161...........................................................................................................................97
Figure 20 : Clonage moléculaire de la région 3’UTR du gène GAS1........................99
Figure 21 : Vecteur pGEM-T Easy..........................................................................107
Figure 22 : Vecteur pLKO.1.....................................................................................108
Figure 23 : Vecteur pGL4.13 [luc2/SV40]...............................................................109
xii
xiii
Liste des abréviations
5-Aza 5-Aza-2'-deoxycytidine
Ac Acétyl
Acta2 Alpha-actin-2
ADN Acide Désoxyribonucléique
ADNc ADN complémentaire
ARN Acide Ribonucléique
ARNm ARN messager
BRD4 Bromodomain-containing Protein 4
C/EBP-delta CCAAT/Enhancer Binding Protein-delta
Cggbp1 CGG Triplet Repeat-binding Protein 1
CTCF CCCTC-binding Factor
Ctso Cathepsin O
DEPC Diethylpyrocarbonate
Dmp1 Dentin Matrix Acidic Phosphoprotein 1
Dnmt DNA methyltransferase
DSIF DRB Sensitivity Inducing Factor
ERK Extracellular Signal-regulated Kinases
FBS Fetal Bovine Serum
Gas1 Growth Arrest-Specific 1
GDNF Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor
GFR GDNF Family Receptor
Gly Glycine
GPI Glycophosphatidylinositol
H3K4 Histone 3 Lysine 4
H3K9 Histone 3 Lysine 9
H3K14 Histone 3 Lysine 14
H3K27 Histone 3 Lysine 27
H3K36 Histone 3 Lysine 36
H4K20 Histone 4 Lysine 20
HAT Histone acétyltransférase
Hdac Histone déacétylase
HP1 Heterochromatin Protein 1
HSP70 Heat Shock Protein 70
IgG Immunoglobulin G
kDa Kilo Dalton
KMT Histone Demethylase
LSD1 Lysine (K)-specific demethylase 1A
Me Méthyl
xiv
MKK4 Mitogen-activated Protein Kinase Kinase 4
NELF Negative Elongation Factor
NF-kb Nuclear Factor-Kappa B
NMDA N-methyl-D-Aspartic Acid
ORF Open Reading Frame
PARG Poly ADP Ribose Glycohydrolase
PARP Poly ADP Ribose Polymerase
PCR Polymerase Chain Reaction
PEI Polyethylenimine
PEITC Phenethylisothiocyanate
RET Rearranged During Transfection
PI3-K Phosphoinositide 3-Kinase
Pol II Polymérase II
PRC Polycomb Repressive Complex
Rkip Raf Kinase Inhibitor Protein
Ser Sérine
SHH Sonic Hedgehog
shRNA Small Hairpin RNA
SIRT Sirtuin
TGF-beta Transforming Growth Factor Beta
TSA Trichostatin A
ZBTB17 (Miz1) Zinc Finger and BTB Domain-containing Protein 17
xv
Remerciements
Je voudrais souhaiter tous mes remerciements à l’équipe du Dr. Stéphane Gobeil. Au
travers de deux années de maîtrise, vous avez tous su m’aider et apporter votre grain de sel
dans une excellente équipe de travail. Je vous en suis très reconnaissant.
Pour le Dr. Gobeil, je suis très heureux d’avoir été le premier étudiant à la maîtrise au sein
de votre laboratoire. Avec une belle complicité, nous avons réussi à développer une
méthodologie de travail très intéressante et stimulante. De plus, je voudrais vous remercier
pour toutes les connaissances et les techniques scientifiques que vous m’avez transmises.
Vous avez su tirer le meilleur de moi-même afin de toujours repousser mes limites et
atteindre mes objectifs. Merci beaucoup!
Pour tous les étudiants ou professionnels de recherche avec qui j’ai travaillé, vous êtes
parvenu à enrichir mes semaines au laboratoire. Louis-Jean a toujours été à disposition pour
m’enseigner les voies les plus rapides pour résoudre mes problèmes, en plus d’être un
excellent partenaire de laboratoire. Merci aussi à Yann, Rosette et Josie pour votre bonne
humeur quotidienne. Un gros merci à Coraline et Olivier pour votre aide dans mon projet
de maîtrise, mais aussi pour votre agréable compagnie.
Également un gros merci pour tous les stagiaires avec lesquels j’ai travaillé, ce fût un
plaisir. Finalement, j’aimerais souhaiter merci à ma conjointe qui a toujours été là pour
m’encourager et me soutenir, tout comme notre famille. J’ai été ravi de travail au sein de
l’équipe du Dr. Gobeil et je vous souhaite un très bel avenir!
1
1. Introduction
1.1. Le cancer
Le cancer est défini comme un désordre génétique causant une multiplication cellulaire
anarchique. Tout débute par quelques mutations au niveau de l’ADN. Ces dernières
peuvent être spontanées ou héréditaires. Dans la plupart des cas, les mutations spontanées
sont induites par des expositions aux composés mutagènes. Suite à l’accumulation de
mutations, la cellule peut perdre le contrôle de sa croissance et devenir tumorale197
.
Le cancer est donc défini par dix caractéristiques importantes pour sa progression, soit
l’immortalité, l’évitement du système immunitaire, l’évasion des suppresseurs de la
croissance, le maintient de signaux de survie, la dérégulation énergétique, la résistance à la
mort cellulaire, l’instabilité du génome, l’angiogénèse, la promotion inflammatoire et
l’activité métastatique110
. Le cancer touche donc plusieurs processus cellulaires et est
d’autant plus très complexe à étudier.
Malheureusement, le cancer est devenu la première cause de décès en Amérique du Nord,
dépassant les maladies cardiovasculaires202
. Il est donc vital d’accroître les connaissances
sur le cancer pour contribuer à la mise en place de nouvelles thérapies pour le vaincre.
1.2. Les métastases
Responsables de 90% des décès issus d’une tumeur primaire, les métastases sont l’étape
avancée du cancer69
. Fréquemment retrouvées aux os, au foie, aux poumons ou au cerveau,
les cellules métastatiques devront traverser une série d’étape pour y parvenir, appelée la
cascade métastatique69-201
. Par conséquent, les cellules doivent envahir l’environnement
autour de la tumeur primaire, procéder à l’intravasation dans le système de circulation, être
transportées jusqu’au site secondaire, effectuer l’extravasation dans le tissu et finalement
former la métastase201
. En d’autres mots, les cellules métastatiques devront accumulées des
modifications qui accroîtront leur pouvoir métastatique afin de parvenir à franchir toutes les
étapes de la cascade métastatique. Parmi ces modifications, la perte de gènes suppresseurs
de métastases a été démontrée comme très importante pour faciliter le passage vers les sites
secondaires. Par exemple, la répression de l’E-Cadherin permet de réduire l’attachement
2
aux cellules entourant la tumeur primaire pour augmenter l’invasion et la migration vers le
second site113
. Au final, étant donné la mortalité associée aux métastases, il apparait
impératif d’étudier en détail les mécanismes l’entourant afin de développer de nouveaux
outils thérapeutiques contre la métastase.
1.3. Les gènes suppresseurs de métastases
Les métastases sont la principale cause de décès chez les patients atteints du cancer. Par
exemple, chez le cancer du sein, ces tumeurs secondaires causeront la plupart des décès69
.
Les patients ayant été opérés pour la tumeur primaire devront être suivis jusqu’à dix ans
afin de déceler rapidement l’apparition de métastases. Cependant, plusieurs ne survivront
pas aux colonies secondaires111
, d’où l’importance d’amener de nouveaux outils contre les
métastases. C’est dans ce contexte que les gènes suppresseurs de métastases sont de plus en
plus étudiés.
Tout d’abord, il faut souligner le potentiel important pour combattre les colonies
secondaires grâce aux gènes suppresseurs de métastases. Par exemple, notre laboratoire a
démontré au cours d’essais in vitro et in vivo qu’il était possible de réduire le nombre de
métastases pulmonaires, causées par des cellules de mélanome64
. Il est important de
mentionner qu’afin d’obtenir le titre de gène suppresseur de métastases, le gène doit réduire
la capacité de formation de colonies secondaires in vivo, sans toutefois affecter la capacité
tumorigène de la cellule111-112
. Ceci démontre bien la possibilité d’utiliser ces gènes comme
outil thérapeutique contre la métastase.
Par ailleurs, plusieurs publications s’accordent à décrire les gènes suppresseurs de
métastases comme de bons biomarqueurs de la progression métastatique111
. En effet, des
études ont démontré l’utilité des gènes NM23207
et E-Cadherin208
dans le cadre d’un
diagnostique de la tumeur primaire. Ainsi, lorsque ces deux gènes y sont absents, le
diagnostique est plutôt mauvais111
. Il est donc intéressant d’accroître les connaissances à
propos de ces gènes suppresseurs de métastases, autant dans un contexte thérapeutique que
diagnostique.
Au final, bien que la liste des gènes suppresseurs de métastases reste restreinte, plusieurs
nouveaux gènes comme Gas1, Acta2 ou Ctso64
s’ajoutent aux premiers gènes découverts
3
comme NM23, KAI1, KISS1 ou MKK4111-112
. Il est maintenant possible de compter au
dessus d’une quarantaine de ces suppresseurs de métastases au sein de la littérature. Afin de
bien illustrer leur rôle important en oncologie, voici une description des principaux gènes
suppresseurs de métastases :
NM23 : Découvert en 1988, il est le premier gène suppresseur de métastases. Il a été
démontré que la perte de ce gène aide à promouvoir la survie, la mobilité et bien d’autres
processus cellulaires lors de la cascade métastatique111-112-113
.
KAI1 : Dans les premiers gènes identifiés, il a illustré sa capacité à supprimer la
formation métastatique chez le cancer de la prostate. Il a été associé à l’accroissement de la
capacité d’invasion autour de la tumeur primaire111-112
.
RKIP : Également capable d’empêcher la formation métastatique chez le cancer de
la prostate, le gène RKIP a été associé à des dérégulations signalétiques au sein des cellules,
menant à une augmentation de la croissance, de l’invasion et du pouvoir métastatique112-114
.
KISS1 : Découvert chez le mélanome, KISS1 a été démontré comme empêchant la
colonisation métastatique en y maintenant les cellules en dormance112
.
GAS1 : Découvert par notre laboratoire comme gène suppresseur de métastases, il a
été publié comme un frein du cycle cellulaire, en plus d’induire l’apoptose64
.
NDRG1 : Ce gène a été montré comme absent chez plusieurs lignées cellulaires
métastatiques du cancer du colon. De plus, il a été impliqué dans la capacité d’invasion
cellulaire113
.
E-Cadherin : L’absence d’expression de ce gène a été prouvée chez le cancer du
colon. Il a été démontré que la perte de ce récepteur permettait de diminuer les interactions
cellules-cellules afin d’accroitre le potentiel métastatique des cellules tumorales113
.
4
1.4. Le gène Gas1
1.4.1. Gas1 et le cycle cellulaire
Le cancer est défini comme une prolifération cellulaire anormale au sein d’un tissu. Au
cours des années, plusieurs scientifiques se sont donc penchés sur la question et ont étudié
le cycle cellulaire. Il était connu que plusieurs gènes promouvaient le cycle cellulaire.
Schneider (Schneider, 1988) avait ainsi émit l’hypothèse que d’autres gènes freinaient le
cycle cellulaire. C’est donc en 1988 qu’il découvrit six gènes ayant les capacités d’induire
l’arrêt du cycle cellulaire en G0. Il les appela les gènes Growth Arrest-Specific (Gas).60
Parmi ceux-ci, Gas1 a été démontré comme ayant le meilleur rôle de frein du cycle
cellulaire.
Poursuivant plus profondément ses études, Schneider (Schneider, 1988) a décrit Gas1
comme modulateur négatif du cycle cellulaire chez les cellules de fibroblastes murines NIH
3T3. Ainsi, il a illustré qu'en situation de sevrage nutritionnel, l'expression de Gas1
s'accroît après trois heures. Il a déterminé que les cellules sont ensuite maintenues en arrêt
lors de la phase G0, bloquant l'accès vers les phases G1/S. Par la suite, en stimulant les
fibroblastes avec du sérum nutritionnel, il a établi que les cellules redémarrent le cycle
cellulaire et que les niveaux d'expression de Gas1 s’amenuisent. Ensuite, d'autres
laboratoires ont confirmé le rôle de frein cellulaire de Gas1 chez les fibroblastes2-16-17-45
, les
cellules musculaires54
ou les adipocytes10
. Également, Evdokiou (Evdokiou, 1998) a utilisé
un vecteur inductible au dexamethasone pour obtenir des niveaux de Gas1 plus
physiologique chez les 3T3. Il a illustré qu'avec ces conditions de surexpression, la
croissance cellulaire était grandement ralentie et qu'il y avait un changement morphologie
des cellules. En outre, il a prouvé qu'il était possible de rétablir la croissance cellulaire par
un ARN anti-sense contre Gas116
. Fait intéressant, un autre scientifique a trouvé de
l'ARNm de Gas1 chez des cellules murines de foie en G0, mais également en G1/S, suite à
une hépatotectomie, signe qu’il est possible d’observer une hétérogénéité au sein d’une
population des niveaux d'expression de Gas156
. En plus, Schneider (Del Sal et Schneider,
1992) a montré que ce gène pouvait être impliqué également lors de l'inhibition de
5
croissance de contact entre les cellules1. En bref, ces expériences ont bien imagé
l'implication de Gas1 comme frein du cycle cellulaire chez les cellules de fibroblastes.
Afin de mieux comprendre le rôle de Gas1 au sein du cycle cellulaire, Schneider (Del Sal et
Schneider, 1992) a utilisé un vecteur exprimant Gas1 et l’a inséré par microinjection chez
les cellules de fibroblastes NIH 3T3. En accord avec son hypothèse, les cellules exprimant
le vecteur de Gas1 ont inhibé la croissance cellulaire, en plus de la synthèse d'ADN. Pour
valider ces recherches en oncologie, Schneider a introduit son vecteur de Gas1 chez des
cellules transformées par un oncogène, soit v-fos, v-myc, v-src, v-ras ou SV40. Ainsi, il a
montré que l'effet de Gas1 sur l’arrêt du cycle cellulaire était similaire chez toutes ces
cellules transformées, exception faite pour SV401-2
ou par un adénovirus9. Par contre, il a
été prouvé qu'une insertion d'un vecteur v-src diminue l'expression de Gas1 chez ces
cellules NIH 3T3 non transformées, permettant le passage des cellules de G0 vers la phase
S, impliquant donc potentiellement la voie de régulation Src pour ce gène18
. Par
conséquent, il est intéressant de noter que l’action du gène Gas1 n’est pas seulement visible
chez les cellules saines, mais également chez les cellules transformées et potentiellement
tumorigéniques.
Compte tenu de cet effet de frein du cycle cellulaire, Del Sal (Del Sal, 1995) a étudié plus
en profondeur les raisons derrières ce phénomène, pour finalement conclure que l'arrêt
cellulaire chez les 3T3 induite par Gas1 dépendait de p53, un gène inactif chez les cellules
transformées par SV40 ou par un adénovirus9. De plus, ce chercheur a démontré que le
domaine transactivateur de p53 n'était pas nécessaire pour observer l’effet de frein du cycle
cellulaire9, résultat appuyé par un autre groupe qui en plus a montré qu'il pouvait y avoir
compétition entre la signalisation de Gas1 et 53BP213
. Fait intéressant, un autre groupe a
démontré qu'il n'y avait pas d'expression de Gas1 chez les cellules NIH 3T3 transformées
par v-mos en situation de privation nutritionnelle. Selon eux, cet effet serait causé par un
arrêt des cellules en phase de G1 au lieu de G05. Ces travaux ont permis de démontrer plus
en détail le rôle de Gas1 lors du cycle cellulaire.
1.4.2. Les caractéristiques de Gas1
L’existence de Gas1 est connue depuis plusieurs années maintenant. Suite à de nombreux
travaux, il a été possible de comprendre plus en détail les caractéristiques entourant la
6
structure de cette protéine, souvent associée à la famille GDNF23-35
. Malgré cela, il reste
encore beaucoup de recherches à effectuer pour mieux comprendre les utilités des différents
domaines présents au cœur de la protéine Gas1.
Pour ce faire, Schneider (Del Sal et Schneider, 1992) a débuté l'étude de Gas1 au niveau de
l'ARNm lui-même. Par analyse d'extension d'amorces, il a démontré que l’ARNm de Gas1
murin commence à 14 nucléotides en amont d'un site de restriction BamHI. Son ARNm
comporte un 5’UTR de 425 nucléotides ayant trois ATG devant trois sites ORF
interrompus par trois codons d’arrêt. De plus, il a déterminé que le nucléotide 425 code
pour l’ATG de départ, terminant au nucléotide 1579, pour un total de 384 acides aminés.
Par ailleurs, Schneider a trouvé que le 3’UTR était de 1386 nucléotides de long. Or, il a
démontré que ce 3'UTR contient deux sites consensus AUUUA, impliqués dans la
déstabilisation d’ARNm. Pour sa part, ce scientifique a décrit que la protéine contient une
région membranaire entre les acides aminés 38-74. Ensuite, il a indiqué que la région entre
les acides aminés 75 et 384 semblait être une partie extracellulaire, car elle contient une
séquence semblable à des récepteurs à intégrine, deux sites N-glycosylation et des résidus
Ser-Gly, tous caractérisant de manière similaires les parties de domaines extracellulaires1.
En bref, Schneider a mis en lumière la similitude de Gas1 avec d’autres récepteurs
extramembranaires.
En complément, d'autres caractéristiques de Gas1 ont été publiées au fil des années. En
1993, un laboratoire a démontré que Gas1 était présent sur le chromosome 9 au niveau de
la région 9q21.3-q223-6
, une région absente chez le syndrome de Gorlin. De plus, d'autres
scientifiques ont analysé que le gène GAS1 humain comportait 85 % d'homologie avec le
gène murin4. Au niveau de la protéine, Gas1 a été démontré comme ayant un signal peptide
et s'illustrant comme étant un ancre-GPI, situé à la membrane22
, dans des radeaux
lipidiques35
, et codant une protéine d’un total de 45 kDa30
. En contrepartie, un autre
chercheur a prouvé que l'ancre-GPI de Gas1 n'était pas essentiel pour que ce gène soit
effecteur. En effet, avec l'aide d'une protéine de Gas1 soluble, l'effet de frein cellulaire de
Gas1 restait le même chez les cellules NIH 3T323
, mais également chez des cellules
mesangiales58
. En outre, il est justifié d’affirmer maintenant que le gène Gas1 code une
protéine similaire aux récepteurs de la famille GDNF, possédant eux-mêmes un ancre-
GPI209
.
7
1.4.3. Gas1 et les voies de signalisation GDNF et SHH
Découlant des faits que Gas1 pouvait freiner le cycle cellulaire et induire l’apoptose, des
chercheurs se sont penchés sur l’option d’utiliser ce gène comme cible thérapeutique pour
le traitement du cancer. Plusieurs laboratoires ont donc cherché à découvrir les partenaires
d’interaction de Gas1 pour comprendre les voies de signalisation derrière ces complexes,
avec pour objectif d’induire son expression. C’est ainsi que certains laboratoires ont illustré
l’implication de la famille GDNF avec le gène Gas1.
Par exemple, Ruaro (Ruaro, 2000) a émis l'hypothèse que Gas1 pouvait interagir au sein de
la signalisation GDNF grâce aux ligands GDNF, perséphine, artémine ou neurturine, au
récepteur Ret23-35
ou aux co-récepteurs GFR-α ou GFR-β23-27-30-34-37
. De même, un
chercheur a démontré que Gas1 pouvait réduire la phosphorylation de la tyrosine 1062 du
récepteur Ret et en diminuer sa signalisation43
. Dans un même ordre d'idée, il a été dévoilé
que la structure de Gas1 était similaire aux récepteurs GFR-α, en plus de pouvoir induire la
mort cellulaire lorsqu’il y avait une liaison à un ligand GDNF en condition de sevrage
nutritionnel35
. L'hypothèse que Gas1 pourrait freiner AKT et induire ERK a donc été
émise35
et prouvé pour AKT chez le neuroblastome SH-SY5Y43
. D'un autre côté, un
chercheur a montré l'association de Gas1 avec la voie de signalisation Sonic Hedgehog
(Shh) par une co-immunoprécipitation des deux protéines26-41-42-49
. Ce résultat coïncide
avec celui d'autres chercheurs qui ont démontré que la signalisation de la voie Shh était
fortement moins induite chez des souris comportant une ablation de Gas140
, en présence
d’un ARN anti-sens contre Gas155
ou chez un mutant N115K, limitant l'interaction avec
Gas1, à la surface de Shh46
. Également, il a été illustré que Gas1 agissait avec Patched1
pour faire la liaison avec Shh lors du développement murin38
, avec Cdo39
ou même Boc52
.
Bien évidemment, tous ces chercheurs ont réussi à prouver que Gas1 semble agir en
partenariat pour induire sa signalisation par les voies GDNF ou Shh. Plus précisément, il a
même été souligné que Gas1 pouvait joue un rôle au sein des voies de signalisation d’AKT
et de ERK, des joueurs importants en oncologie.
8
1.4.4. Gas1 et l’apoptose
Il est maintenant bien connu que Gas1 possède un rôle important lors du mécanisme
apoptotique. En effet, dès les années 90, les scientifiques avaient remarqué qu’une
surexpression de Gas1 entraînait une mort cellulaire67
. Plusieurs ont par la suite tenté de
déceler les mécanismes entourant l’apoptose enclenché par Gas1.
Le premier exemple impliquant Gas1 avec l’apoptose a été démontré chez une lignée
cellulaire de gliome. En surexprimant la protéine Gas1, les chercheurs ont constaté qu’il y
avait une augmentation de l’activité de la caspase-3, un joueur important de l’apoptose, in
vitro67
. Par la suite, ce même groupe a démontré qu’il était possible avec l’aide d’un
rétrovirus exprimant Gas1, d’induire in vivo l’apoptose66
. En plus, un autre groupe a publié
qu’une version soluble de Gas1 était également capable d’induire l’apoptose61
. Également,
il a été validé que ce gène cause l'apoptose chez les cellules mammaires11
. Il était
maintenant clair que Gas1 possédait un rôle lors de la mort cellulaire, lorsque ce dernier est
exprimé fortement à l’aide d’un vecteur.
Un autre joueur important impliqué lors de l’apoptose est la protéine p53. En effet, cette
molécule est une pierre angulaire de la mort cellulaire, à un point où les cellules tumorales
s’en débarrassent régulièrement pour survivre109
. Un groupe a donc mis au point un
système bicistronique d’expression de Gas1 et p53 grâce à un adénovirus. Ainsi, en
infectant des cellules de gliome, ils ont réussi à induire l’apoptose chez elles. Cependant, ils
ont constaté que Gas1 seul était suffisant pour obtenir la mort cellulaire65
. Ils ont donc
démontré que l’apoptose stimulée par Gas1 était indépendant de p53.
D’un autre point de vue, d’autres scientifiques ont démontré une implication de l’apoptose
causée par Gas1 via la voie de signalisation de Ret. En effet, ils ont constaté qu’une
expression de Gas1 menait à une diminution de l’autophosphorylation du récepteur Ret. En
plus, ils ont observé qu’il y avait une déphosphorylation par AKT de la protéine Bad,
impliqué dans la répression de l’apoptose via l’inhibition du relâchement du cytochrome C,
une molécule essentielle à l’apoptose. Ils ont d’ailleurs enregistré une augmentation du
niveau du cytochrome C lors de la surexpression de Gas1, en plus d’une augmentation de
9
l’activité de la caspase-9 et de la caspase-3. Par la suite, ils ont remarqué qu’il n’y avait pas
plus d’activité de la caspase-8 (Figure 1). Finalement, ils ont exposé qu’une privation
nutritionnelle entraîne une augmentation de Gas1 et cause l’apoptose, mais que s’il y a en
plus une inhibition par petits ARN interférents de Gas1, les cellules ne mourraient plus61
.
Aussi, ce même groupe avait également illustré l’implication des GDNF avec Gas1. En
effet, ils ont découvert que si Gas1 est présent, les GDNF ne peuvent plus activer le
récepteur Ret43
. Par ces expériences, il apparait maintenant plus clair le mécanisme par
lequel Gas1 induit l’apoptose chez les cellules gliales.
Par la suite, un autre laboratoire a affirmé l’implication de Gas1 au sein de l’apoptose, mais
chez le cancer gastrique. Ils ont illustré qu’une augmentation de Gas1 diminue l’activation
de Bad, augmente la phosphorylation de Bax et de la caspase-3 et induit ainsi l’apoptose.
Dans une autre expérience, ils ont inhibé l’expression de Gas1, diminuant alors l’activation
10
de la caspase-3 et augmentant la survie cellulaire57
. Ce groupe a une fois de plus confirmé
le rôle de Gas1 lors de l’apoptose, mais chez un nouveau type de cancer.
Par ailleurs, d’autres chercheurs ont vérifié la possibilité d’un mécanisme d’activation de
Gas1 via la voie de signalisation Sonic Hedgehog (Shh). Ils ont prouvé que chez des
cellules de glioblastomes et astrocytomes, la surexpression de Gas1 cause l’apoptose sans
toutefois passer par la voie de Shh63
. Finalement, notre laboratoire a également démontré
pour la première fois que Gas1 est impliqué dans l’apoptose par l’activation de la caspase-
3, mais chez le mélanome métastatique murin B16-F1064
.
En contrepartie, il est important de souligner que certaines études attribuent le titre de gène
suppresseur de tumeurs à Gas1, pour ses caractéristiques apoptotiques. En effet, un
chercheur a testé des injections de cellules d'adénocarcinomes du poumon A549 ou de
fibrosarcomes HT1080 comportant un vecteur inductible de Gas1 chez des souris. Il a
observé moins de tumeurs et de plus petit volume lorsque Gas1 est exprimé. Il a donc émis
l'hypothèse que Gas1 était un gène suppresseur de tumeurs, faute de tumeurs viables en
présence de Gas115
.
Au final, Gas1 a été identifié lors d'un criblage pour déceler les gènes impliqués durant la
mort neuronale induite par le NMDA. Pour valider ce résultat, le chercheur a exprimé Gas1
par un vecteur chez des cellules de neuroblastome BM69 et a observé une forte diminution
de la viabilité cellulaire. Par contre, ce phénomène pouvait être restreint si le vecteur de
Gas1 était exprimé en même temps qu'un codant pour la protéine Bcl-2 ou OpIAP2, sans
toutefois co-immunoprécipiter ensemble28
. Ces résultats impliquent potentiellement Gas1
durant une mort cellulaire différente des autres études publiées jusqu’à ce jour.
L’apoptose est un processus biologique contre le cancer très intéressant dans l’optique
qu’elle permet d’induire la mort des cellules, éliminant la tumeur. Il est donc très captivant
de poursuivre les recherches entre Gas1 et l’apoptose avec pour cible un traitement par
l’expression de ce gène. Les études présentées ci-haut illustrent bien le potentiel et l’utilité
de Gas1 pour réaliser cet objectif.
11
1.4.5. Gas1, un gène suppresseur de métastases
L’étude fondamentale entourant les mécanismes métastatiques du cancer prend de
l’ampleur chaque jour. Les puces à ADN et l’utilisation des petits ARN interférents sont
des exemples de nouvelles technologies utilisées pour l’étude des métastases. C’est en
utilisant un criblage pangénomique par petits ARN interférents que le Dr. Gobeil a décelé
un nouveau rôle de gène suppresseur de métastases de Gas1 chez le mélanome64
. Il s’agit
d’une découverte importante pour l’avancement de la recherche contre la métastase.
Pour atteindre un site secondaire, les cellules de la tumeur primaire devront parvenir à
franchir les étapes de la cascade métastatique69
. Pour ce faire, elles vont accumuler des
modifications qui vont augmenter leur potentiel métastatique. Ces modifications vont
amener l’activation de gènes pro-métastatiques et la perte d’expression de gènes dont le
rôle réduit directement ou indirectement la capacité métastatique des cellules68
. Dans ce
cas, il s’agit de gènes suppresseurs de métastases. Il est donc fréquent de ne pas retrouver
leur expression chez des cellules métastatiques. Ainsi, il a été démontré que l’expression de
Gas1 est diminuée ou absente chez certains mélanomes64
, cancers de la prostate21-31
,
cancers de la thyroïde33
, cancers colorectaux50
ou gastriques57
. Pour cette raison, il est
important de souligner que Gas1 peut servir de biomarqueur de la progression tumorale44
.
Par conséquent, il est possible de croire en l’importance de la perte de Gas1 chez plusieurs
types de cancer pour le développement des métastases.
Jusqu’à ce jour, le Dr. Gobeil a démontré que Gas1 agit comme gène suppresseur de
métastases chez le mélanome. Tout d’abord, il a illustré qu’il y avait moins de Gas1 chez
les cellules métastatiques de mélanome B16-F10 en comparaison avec les lignées primaires
B16-F0. De plus, il a démontré que la perte d’expression de Gas1 par petits ARN
interférents chez les B16-F0 augmente leur potentiel métastatique. Par la suite, le Dr.
Gobeil a surexprimé Gas1 chez le mélanome métastatique B16-F10, ce qui a provoqué une
diminution de la capacité de formation de métastases. Ces résultats ont également été
confirmés in vivo64
(Figure 2). Ces expériences ont bien démontré le rôle de Gas1 comme
gène suppresseur de métastases chez le mélanome. En outre, bien que l’étude de Gas1
12
comme gène suppresseur de métastases soit jeune, il n’y a aucun doute de son fort potentiel
contre ce stade avancé du cancer.
1.4.6. Gas1, un gène à plusieurs rôles
En dernier lieu, il faut souligner que le gène Gas1 est également étudié pour la résistance
aux agents thérapeutiques, en reproduction, mais aussi chez d’autres pathologies comme
l’Alzheimer.
Un groupe de chercheurs a souligné un effet de résistance au médicament epirubicine chez
le cancer gastrique lors d'une diminution de Gas1. Ils ont émis l'hypothèse que le gène
réduit l'apoptose en dérégulant le ratio des protéines Bcl-2 et Bax47
. Il s’agit d’une première
concernant un rôle de résistance accrue en l’absence de Gas1.
Une autre implication pour le gène de Gas1 concerne son rôle lors du développement. En
effet, ce gène a été associé à l'organogénèse chez les fœtus de rat lors des stages
préliminaires du développement20
. Ensuite, Gas1 a été démontré comme étant exprimé au
sein de plusieurs régions lors de l'embryogénèse murine24
, en fonction du temps25
. Plus
précisément, Gas1 a pleinement été impliqué lors de la mort cellulaire interdigitale pendant
le développement25
. Ces études ont permis d’accroître encore plus les connaissances
entourant le gène Gas1.
13
En plus d'être impliqué pleinement au sein des recherches portant sur l’oncologie, Gas1 fait
l'objet d'études chez la pathologie de l'Alzheimer. En effet, un chercheur a prouvé qu'il y
avait une augmentation du taux de production d'amyloïde-β lorsque Gas1 n'est pas
exprimé51
. Cette recherche illustre bien le rôle important que joue le gène Gas1 contre la
pathologie de l’Alzheimer.
En conclusion, il est crucial de souligner que les études effectuées permettent d’accroître le
savoir entourant le gène Gas1. Ainsi, les recherches ont contribué à connaître mieux le
mécanisme d’opération de Gas1 lors du cycle cellulaire, de l’apoptose et du
développement. Les futures publications pourront donc permettre de mieux comprendre les
procédés derrières la répression de Gas1 chez les cellules les plus agressives et d’obtenir de
meilleurs résultats pour les thérapies contre les métastases.
1.4.7. La régulation de Gas1
Au fil des ans, plusieurs scientifiques se sont intéressés au gène Gas1 et les mécanismes
entourant sa régulation. Parmi eux, c’est la répression de Gas1 par l’oncogène c-Myc qui a
été la mieux détaillée. Par contre, il est important d’ajouter que d’autres recherches ont
réussi à bien illustrer l’implication directe de protéines dans la régulation du gène Gas1
comme le facteur de transcription Cggbp1, par exemple53
.
Dans un premier temps, des chercheurs ont confirmé l'implication potentielle de certains
gènes comme Tgf-β ou c-Myc dans la régulation de Gas1. En effet, lorsque les niveaux
d'expression de c-Myc augmente, les niveaux d'expression de Gas1 diminue, et vice-versa1-
2-29. L'expérience a été réalisée également chez les cellules Rat-1, mais avec plus de
profondeur. En effet, ce groupe a inséré un vecteur luciférase de Gas1 et c-Myc, pour
illustrer la répression de Gas1 par c-Myc et aussi avec un vecteur MycER inductible. Dans
les deux cas, lorsque c-Myc est présent, l’expression de Gas1 est réduite14
. Plus
précisément, un autre laboratoire a montré avec l'aide d'un vecteur MycS, dont la protéine
est tronquée pour inactiver la fonction transactivatrice, qu'il était encore possible de
réprimer un vecteur exprimant Gas1, selon une expérience de luciférase19
. Il en va de même
pour Tgf- β. En sa présence, le niveau d’expression de Gas1 est diminué chez les 3T37. De
plus, d'autres protéines ont été associées à Gas1. Par exemple, un groupe a dévoilé qu'une
liaison de l'intégrine α5-β1 et de la fibronectine amenait une réduction du niveau
14
d'expression du gène Gas18. Finalement, un autre laboratoire a démontré chez des souris
ayant une ablation du gène Dmp1 qu'il y avait une augmentation de l'expression de Gas1,
indiquant un nouveau répresseur potentiel48
. Ces gènes pourraient donc être tous des
répresseurs directs ou indirects de Gas1.
Par la suite, d'autres se sont penchés sur les activateurs potentiels de Gas1. Ainsi, O'Rourke
(O’Rourke, 1997) a stipulé que C/ebpδ pourrait être un activateur direct de Gas1, puisqu'il
est exprimé lors de l'arrêt du cycle cellulaire chez les fibroblastes murins12
. D'autre part, la
protéine Cggbp1 a été confirmée dans la régulation de Gas1 chez la lignée de gliomes
humains U-2987 Mg. En effet, sa réduction par ARN interférent stimule l'expression de
Gas1 et p21, tout en diminuant les marques de répression H3K9me353
. Par ailleurs, un autre
groupe a démontré que Gas1 pourrait être réprimé par la protéine Menin chez les cellules
MEF59
. Des voies de signalisation ont également été scrutées pour induire l'expression de
Gas1. En effet, un laboratoire a prouvé que la VE-cadhérine pouvait induire l'expression de
Gas1 chez les cellules HEK293. En plus, avec l'aide d'une protéine VE-cadhérine tronquée,
il a observé l'implication de la protéine PI3-K pour induire Gas1. Au final, il a également
émis l'hypothèse que Gas1 pourrait être activé par NFkB32
. De surcroît, un groupe a montré
que l'expression de Gas1 peut être induite par un stress engendré par un sevrage en
méthionine, une méthode utilisée pour combattre les cancers de la peau36
.
Par conséquent, il est important de comprendre la portée de ces études pour accroître les
outils face aux pathologies comme le cancer. Ainsi, en démontrant que Gas1 peut être
modulé par des répresseurs comme l’oncogène c-MYC, il est possible de croire en
l’utilisation du gène Gas1 comme mécanisme de frein du cycle cellulaire et pour amener les
cellules tumorales en apoptose. Ces recherches des protéines responsables de la régulation
de Gas1 sont donc particulièrement intéressantes.
1.5. La régulation épigénétique
Bien que les mutations génétiques comme les délétions soient essentielles pour l’évolution
des espèces, la régulation épigénétique tient également un rôle vital au sein de la biologie
cellulaire. Avec l’afflux de signaux externes, une cellule du système immunitaire peut
s’adapter en permettant l’expression de gènes pour la mobilité pour se déplacer vers un site
15
d’une blessure, par exemple197
. Bref, l’épigénétique permet une réactivité cellulaire
importante pour répondre aux différents signaux environnementaux.
Au niveau du cancer, il a été montré que la régulation épigénétique était souvent
déstabilisée afin de permettre l’activation d’oncogènes comme c-MYC185
et d’empêcher la
transcription de gènes anti-tumoraux comme p21104
. Par conséquent, il a été publié
fréquemment des régulations aberrantes de protéines impliquées dans l’épigénétique
comme les HDACs ou les KMTs chez les cellules cancéreuses122
. En somme, la régulation
épigénétique est cruciale pour la survie des cellules tumorales.
1.5.1. Le code des histones
Initialement, les chercheurs attribuaient l’acétylation des histones à des gènes ouverts,
permettant leur expression, et les marques de méthylation à des gènes fermés115
.
Rapidement, ces derniers ont compris que l’épigénétique était beaucoup plus subtile et
complexe qu’à prime abord. En effet, il a été démontré au fil des ans que l’acétylation et la
méthylation dépendaient plutôt de la position de ces marques sur les histones. Par exemple,
la méthylation au niveau H3K4 ou H3K36 a été associée à l’activation115
. De plus, une
balance entre l’acétylation et la méthylation a été décrite régulièrement, impliquant la
présence des deux groupements au même promoteur. De ce fait, la transcription est active
ou non dépendamment de la proportion d’un groupement en comparaison à l’autre56
. Il
apparait évident que beaucoup de recherches reste à effectuer pour déceler toute la finesse
auquel le code des histones est soumis.
1.5.1.1. Les marques activatrices
Il existe plusieurs marques d’histones présentes au promoteur des gènes en transcription.
Cependant, H3K4 et H3K36 sont les deux marques les mieux connues et étudiées
présentement pour mieux comprendre les mécanismes entourant leur régulation chez les
cellules tumorales.
H3K4 : La marque H3K4 a été associée à l’activation de gènes lorsqu’elle était di- ou tri-
méthylée. Par conséquent, il a été démontré que les cellules tumorales pouvaient utiliser des
histones déméthylases comme LSD1 ou JARID1 pour éliminer des groupements méthyles
16
et restreindre l’activation du gène118
. Dans de telle situation, il a été montré qu’il est
fréquent de retrouver de la méthylation à l’ADN apporté par la famille DNMT afin d’y
maintenir le gène fermé196
. De plus, la marque d’activation H3K4me3 a été rapportée pour
être important pour la phase d’initiation de la transcription avec les marques H3K9ac et
H3K14ac198
. En outre, la marque H3K4 est l’une des principales menant à l’activation
génique afin d’entamer la transcription des gènes.
H3K36 : Autre marque d’importance, H3K36 a été associé avec l’élongation lors du processus
de transcription. Par conséquent, il est fréquent d’y retrouver un groupement tri-méthyle
lorsque le gène est activé et produit de l’ARNm198
. De plus, il a été démontré que des
histones méthylases comme KDM5B pouvaient éliminer des groupements méthyles sur
H3K36 afin d’induire la polymérase en pause transcriptionnelle107
. Par conséquent, il s’agit
d’une marque d’activation importante pour permettre l’élongation de la polymérase.
1.5.1.2. Les marques répressives
Dans le cadre de la biologie cellulaire, les marques de répression au niveau des histones
sont très importantes. En effet, elles permettent d’atténuer l’expression de gènes néfastes
pour la cellule comme ceux impliqués dans les voies apoptotiques, mais importants lorsque
survient une nécessité, ce qui ne serait plus possible en présence d’une délétion197
. Par
contre, la répression épigénétique permet aux cellules tumorales d’éteindre des gènes qui
seraient susceptibles de les restreindre. Or, ces études sont très importantes pour mieux
cerner les processus cellulaires comme la répression épigénétique dans l’optique d’apporter
de nouvelles thérapies anti-tumorales.
H3K9 : La marque de répression H3K9me3 a été associée à l’hétérochromatine, dévoilant
bien son rôle lors de la répression115-116-117
. La famille de protéine HP1 a également été
prouvée comme élément stabilisateur de cette marque de répression et de l’état
d’hétérochromatine115
. En effet, cette liaison a été montrée comme possible par le
chromodomaine de la protéine HP1 se liant à la marque H3K9me3115
. D’une part, les
protéines SETDB1, SUV39H1, SUV39H2, EHMT1 et EHMT2 ont été publiées comme des
actrices lors de la modification de l’histone 3 en H3K9me3116-117
.
17
H3K27me3 : Cette marque de répression a été prouvée comme étant ajoutée par le complexe
PRC2116-117
. Récemment, deux autres protéines, AEBP2 et JARID2, ont été illustrées
comme pouvant jouer un rôle lors de la modification de cette marque de répression116
.
Au final, il faut ajouter qu’il existe d’autres marques de répression permettant la régulation
épigénétique comme H4K20me3129
, une marque pouvant jouer des rôles d’activation, de
répression ou même de réparation de l’ADN selon les circonstances. Ces marques sont de
plus en plus étudiées pour apporter de nouvelles perspectives contre le cancer.
1.5.1.3. Les régulateurs épigénétiques
La régulation épigénétique est un processus biologique très complexe impliquant plusieurs
joueurs comme les facteurs de transcription ou des protéines modifiant la configuration de
la chromatine pour permettre la transcription ou non. Au fil du temps, les chercheurs ont su
démontrer toute l’importance des protéines responsables de la modulation de la chromatine,
soit les DNA méthyltransférases, les histones méthyltransférases, les histones déacétylases,
les histones acétylases ou les histones deméthylases118-122-130
. De plus, il a été prouvé que
ces acteurs pouvaient être dérégulés afin de transcrire des gènes favorables au cancer et
d’empêcher la transcription d’autres gènes nuisibles au développement des cellules
tumorales130
.
Tout d’abord, la famille HDAC a été illustrée pour enlever les groupements acétyle des
histones130
. Elle se divise en quatre classes composées des HDAC1 à HDAC11 et des SIRT1
à SIRT7203
. Par ailleurs, il a été publié fréquemment que les HDACs pouvaient être
dérégulés chez plusieurs types de cancer comme celui du colon ou du sein122
. Par exemple,
les gènes p15139
, p21140-141
et p27141
ont été dévoilés comme pouvant être réprimés par les
HDACs. Il existe donc des inhibiteurs chimiques contre les HDACs en essais cliniques afin
d’être utiliser pour les empêcher de réprimer des gènes anti-tumoraux132
. Cette famille est
donc pleinement impliquée dans la régulation de la transcription génique chez le cancer.
Ensuite, la famille HAT a été associée pour sa part avec l’acétylation des histones,
permettant par le fait même la transcription des gènes130
. Cependant, il a été montré que les
cellules tumorales pouvaient diminuer l’expression des HATs pour atténuer la transcription
de gènes anti-tumoraux ou d’en augmenter l’expression pour stimuler des gènes pro-
18
cancer204-205
. En d’autres termes, il a été prouvé que la hausse ou la réduction des HATs
pouvaient influencer la régulation de plusieurs gènes chez les cellules tumorales.
Par la suite, une autre famille a été dévoilée pour jouer un rôle important lors de la
régulation épigénétique, soit les KMTs. Ces protéines ont été démontrées comme
responsables de la déméthylation de lysine sur les histones118-119
. Cette famille a été
associée à plusieurs protéines, soit les gènes KDM1 à KDM6118
. Régulièrement, les KMTs
sont dérégulés chez les cellules tumorales. Par conséquent, les protéines KDM1, KDM2,
KDM4 et KDM5 ont été découvertes comme déméthylant les marques de transcription
H3K4 et H3K36 pour empêcher la transcription de gènes anti-tumoraux alors que KDM3,
KDM4 et KDM6 déméthylent les marques de répression H3K9 et H3K27 pour permettre la
transcription d’oncogènes206
. En outre, il est facile de comprendre l’implication cruciale des
KMTs au sein des cellules cancéreuses.
Au final, la famille DNA méthyltransférase a été publiée pour jouer un rôle lors de la
répression des gènes. En effet, cette famille comportant les gènes DNMT1, DNMT3A,
DNMT3B et DNMT3L a été prouvée comme responsable de la méthylation de l’ADN lors
de la fermeture de gènes au niveau d'îlots CpGs130
. Par ailleurs, les DNMTs ont été montrés
comme pouvant réprimer les gènes anti-tumoraux comme p14142
, p21 ou p16143
. En
somme, cette famille permet de maintenir fermés les gènes agissant contre les cellules
cancéreuses.
1.5.2. La pause transcriptionnelle
La pause transcriptionnelle est un mécanisme qui a été mis en lumière grâce à des études
sur les protéines Hsp70 au cours des années 90. Il a été démontré que la polymérase était
présente au promoteur du gène Hsp70 et parée pour la transcription. Pour ce faire, deux
protéines ont été illustrées comme rétentrices de la transcription, soit NELF et DSIF. En
présence d’un stimulus de choc thermique, le gène peut être rapidement activé pour
permettre aux cellules de résister à la chaleur199
. L’étude des Hsp a permis de mieux
comprendre le mécanisme entourant le maintient de la polymérase dans un état de pause
transcriptionnelle.
19
Dans un contexte oncologique, il arrive régulièrement que les cellules tumorales aient
recours à ce type de mécanisme pour restreindre la transcription de certains gènes pouvant
être utiles dans d’autres circonstances. C’est notamment le cas des gènes c-Myc et c-Fos200
.
Il a été prouvé qu’en premier lieu, les protéines NELF et DSIF étaient responsables d’un
maintient de la polymérase en pause transcriptionnelle en empêchant sa phosphorylation.
Pour sa part, P-TEFb était responsable de la phosphorylation du domaine c-terminal de la
polymérase, inhibant la répression de NELF et DSIF, et permettant la transcription167
. Ce
type de mécanisme est donc très important afin de moduler rapidement l’expression de
certains gènes en toute circonstance.
1.5.3. La poly(ADP-ribosyl)ation
Bien qu’ayant un rôle très important lors de la réparation de l’ADN, la poly (ADP-
ribosyl)ation est un mécanisme épigénétique également utilisé par les processus
biologiques pour l’activation et la répression génique178
. Par exemple, il a été illustré
qu’afin de résister au stress inflammatoire, la PARP-1 pouvait activer p65NF-κB lors de la
tumorigénèse179
. De plus, il a été démontré que certains facteurs de transcription comme
KDM5B pouvaient dépendre d’une PARylation par PARP-1 pour être inactivés, les
empêchant d’effectuer une répression180
. D’ailleurs, il a été publié que la combinaison
PARP-1/CTCF pouvait inhiber la protéine DNMT1 (Figure 3), permettant donc à la
chromatine de rester hypométhylée et donc de permettre la transcription181
. Par contre, il a
été montré que la PARP-2 pouvait agir comme répresseur en recrutant des HDACs183
, tout
comme les isolateurs CTCF avec la cohésine184
. D’un autre côté, le rôle inverse de la
PARG a été dévoilé comme une balance à la PARP. Ainsi, la PARG pouvait réduire la
PARylation de DNMT1 et permettre la méthylation de l’ADN et la répression génique182
.
En outre, il est facile de voir l’équilibre derrière les mécanismes épigénétiques impliquant
la poly(ADP-ribosyl)ation et le rôle important pour les PARPs, la PARG et les isolateurs
CTCF au sein du cancer.
20
1.5.4. Les microARNs
Au cours des dernières années, les scientifiques ont porté leur attention sur les mécanismes
entourant la régulation des gènes par les microARNs. Leur présence permet donc d’ajuster
finement les niveaux d’ARNm de gènes comme p21194
. Pour ce faire, certaines régions
génomiques contenant les microARNs sont transcrites, libérant des pri-microARNs. Ces
derniers sont catalysés en pré-microARNs par le complexe DGCR8/Drosha. Ensuite, les
pré-microARNs sont clivés en duplex microARN/microARN par un autre complexe
contenant la protéine DICER. Par la suite, le complexe RISC assemble l'ARNm, le
microARN et la protéine Ago, responsable de la dégradation de l'ARNm212
. Ainsi, par des
mécanismes de dérégulation génétique ou épigénétique, il a été démontré que les
microARNs sont régulièrement impliqués dans la répression génique chez les cellules
tumorales195
. Par conséquent, il est bien d’ajouter que les cellules cancéreuses peuvent
utiliser ce mécanisme pour réduire l’expression des gènes anti-tumoraux.
1.6. L’oncogène c-Myc
Les oncogènes peuvent mener au développement néoplasique, seuls ou en présence d’autres
facteurs185
. Ras, raf, src et myc sont des exemples de ces gènes186
. Fréquemment, les
21
oncogènes seront exprimés constitutivement. Ces gènes vont permettre la prolifération
cellulaire aberrante en dérégulant des voies de signalisation comme AKT ou ERK186
. Par
exemple, b-Raf est souvent activé constitutivement chez les mélanomes et les cancers
colorectaux, ovariens187
, thyroïdiens188-189
et pulmonaires190-191
. De tous ces oncogènes, c-
Myc est le plus étudié pour ces multiples rôles lors de la régulation cellulaire.
Parmi les facteurs nécessaires pour favoriser l’apparition tumorale, plusieurs types de
cancer possèdent une expression aberrante de proto-oncogènes185
. Le gène c-Myc fait partie
de cette catégorie. Chez de nombreuses tumeurs, c-Myc est surexprimé, causant un
dérèglement du cycle cellulaire. C-Myc est un facteur de transcription ciblant des gènes
impliqués dans la promotion du cycle cellulaire. De plus, il est connu pour réprimer
plusieurs candidats freinant le cycle cellulaire192
. Finalement, il possède également un rôle
de protection contre l’apoptose193
. Il est possible de concevoir la présence particulièrement
grande de c-Myc au sein des processus biologiques.
1.6.1. Le rôle de répresseur génique de c-Myc
Il n’y a plus de doute possible, le facteur de transcription c-Myc possède un rôle
d’activateur, mais également de répresseur génique. En effet, les évidences se sont
accumulées au cours des années, portant sur différents complexes répresseurs comme c-
Myc/Miz1/Max82-89
ou c-Myc/KDM5B/TFAP2C105
. Par conséquent, il est facile de
visualiser toute la finesse cellulaire derrière les mécanismes de répression impliquant c-
Myc et son importance pour mieux s’outiller face au cancer.
En premier lieu, il incombe de porter l’attention sur l’un des premiers complexes répressifs
publiés au fil des ans, soit l’interaction c-Myc/Miz1/Max82-89-92-97
(Figure 4A). En effet,
plusieurs chercheurs ont démontré l’étendu d’un tel partenariat pour la répression génique
au sein des cellules tumorales. Par exemple, des chercheurs ont prouvé que ce complexe
était présent au promoteur du gène C/EBPδ et le réprimait, chez des cellules épithéliales
mammaires en prolifération82-89
. De plus, ce complexe a été découvert au promoteur du
gène GADD153, par immunoprécipitation de la chromatine chez les cellules Rat-192
. Le
complexe c-Myc/Max/Miz1 s’ait aussi révélé être répresseur du gène p15 chez des cellules
MEFs97
. Dans le même sens, un autre laboratoire a utilisé un criblage pour découvrir 67
gènes inhibés par le complexe c-Myc/Miz1. En utilisant un mutant (MycV394D)
22
empêchant le lien entre c-Myc et Miz1, il a trouvé qu’il y avait une forte diminution de
l’expression de ces 67 gènes seulement avec un vecteur exprimant c-Myc en comparaison
au vecteur mutant88
. Par la suite, il a été démontré que Miz1 et c-Myc répriment plusieurs
gènes de la famille Hox100
, p21104
, des membres DNRG102-103
ou un membre de la voie de
signalisation Wnt, WIF-1101
. Il est intéressant d’ajouter que le complexe de répression
entourant c-Myc peut varier. En effet, il a été confirmé que c-Myc/Miz1/Gfi-1 pouvait
réprimer le gène p2190
, mais également le gène p1591
. Ces expériences ont donc permis
d’approfondir les connaissances entourant le dynamisme derrière la répression par c-Myc,
passant par le partenaire Miz1.
Ensuite, bien que certaines études aient stipulé une répression de c-Myc/Miz1/Max,
d’autres laboratoires ont illustré différents mécanismes de répression entre c-Myc et Max
indépendant de Miz1. Une étude a même mis en lumière lors d’un criblage la dépendance
de c-Myc à Max pour réprimer plusieurs gènes93
. De plus, en 2004, c-Myc/Max ont été
directement trouvés au promoteur des gènes GADD45a et GADD153 chez les cellules Rat-
192
. Également, ces deux protéines ont été associées à la répression du gène p2796
. Il est
facile de deviner toute la complexité en arrière des processus de répression par c-Myc et
l’étendu des recherches qu’il reste à faire pour mieux les comprendre.
Il est à souligner également que plusieurs publications ont établi qu’il y a un équilibre entre
les complexes de facteurs de transcription, c-Myc/Max, Max/Max et Max/Mad, pour
réguler les gènes cibles95-99
comme ODC94
ou hTERT98
. Cet équilibre est particulièrement
pratique pour établir des ajustements fins lors des processus biologiques chez les cellules
saines, mais également très complexe à étudier lors de pathologies comme le cancer.
23
Par la suite, il faut mentionner qu’un autre complexe a été impliqué lors de la répression de
plusieurs gènes. Il s’agit du complexe c-Myc/Sp1 (Figure 4B). En fait, Gartel (Gartel,
2001) a illustré le rôle de ce complexe pour la répression du gène p21 chez les cellules
d’adénocarcinome du colon Caco-278-81
. Également, un autre scientifique a montré qu’un
complexe Sp1/Smad2-3/c-Myc pouvait interagir ensemble pour causer une répression du
gène p15Ink4B
chez la lignée cellulaire HaCaT79-81
(Figure 4C). Lors de l’utilisation d’un
nouvel inhibiteur d’histones déacétylases, le Phenethylisothiocyanate (PEITC), Wang
(Wang, 2008) a démontré une nouvelle fois l’action du complexe répressif c-Myc/Sp1 sur
le gène p21, mais chez le cancer de la prostate. Ainsi, suite au traitement avec le PEITC, le
promoteur du gène p21 avait perdu la protéine c-Myc, en plus de devenir hypométhylé et
actif84
. De surcroît, la présence d’un complexe répresseur c-Myc/Sp1/Max au promoteur du
gène BRD7 a également été publiée, bien que seul c-Myc semblait le réguler
négativement85
. Une expérience similaire a montré que Sp1/c-Myc pouvait réprimer le gène
BAG2 chez les cellules TRE29387
. Par ailleurs, le complexe c-Myc/Sp1 a même été publié
chez des cellules T du système immunitaire de patients infectés par le HIV en latence. En
fait, la présence des trois protéines c-Myc/Sp1/Hdac1 a été remarquée au niveau du
promoteur HIV latent83
. Ces résultats dévoilent une nouvelle fois la variabilité entre les
différents mécanismes de répression cellulaire engendrés par la protéine c-Myc.
24
Au cours des dernières années, plusieurs laboratoires ont découvert d’autres partenaires ou
processus permettant une répression par c-Myc. Par exemple, il a bien été illustré qu’une
interaction entre c-Myc/KDM5B/TFAP2C (Figure 5) menait à la répression du gène p21
chez les cellules MCF-7105
, confirmant l’implication potentiel de membres de la famille
d’histone 3 lysine 4 demethylases JARID1 avec c-Myc106
. De plus, il a été prouvé que la
répression par c-Myc pouvait impliquer des histones déacétylases comme HDAC183
et
HDAC3108
ou des DNA methyltransférases comme DNMT3a et DNMT3b109
, chez
plusieurs gènes. Cependant, c-Myc a été démontré comme pouvant réprimer non
seulement des gènes, mais aussi des microARNs. Ainsi, il a été publié que c-Myc était
responsable de la répression du miR-26a, un microARN ayant des vertus d’atténuation de
la prolifération cellulaire, chez des cellules d’un lymphome murin107
.
En conclusion, il apparait évident que c-Myc joue un rôle majeur lors de la répression de
plusieurs gènes engagés dans une grande variété d’activité cellulaire comme p2178-81
ou
Gas129
. Avec les années, beaucoup études ont démontré l’implication de plusieurs
partenaires potentiels pour exercer le rôle de répresseur attribué à c-Myc. Bien que Sp1 ou
Miz1 semble faire partie de ce complexe empêchant la transcription de gènes, certains
scientifiques se posent la question à savoir si ces deux partenaires sont bien nécessaires
pour que c-Myc parvienne à exécuter sa répression86
. D’autres publications futures pourront
permettre de mieux cerner les différents rôles intermoléculaires joués par cet ensemble très
complexe de facteurs de transcription.
25
1.7. Problématique et implications scientifiques de l’étude du gène
Gas1
L’étude des gènes suppresseurs de métastases comme Gas1 est très important pour la
recherche contre le cancer. En effet, cette pathologie est devenue la première cause de
décès en Amérique du Nord. De surcroît, les métastases sont responsables d’un très grand
nombre de cette mortalité. L’acquisition de connaissances entourant les mécanismes
biologiques menant à la formation de colonies secondaires est donc cruciale dans cette lutte
contre le cancer. Nous nous sommes donc penché à découvrir comment le gène Gas1 est
régulé chez les lignées métastatiques étudiées. À la lumière de la littérature illustrant
l’implication de c-Myc lors du processus de répression du gène Gas1, nous avons émis
l’hypothèse que cet oncogène était responsable de l’arrêt de la transcription de Gas1 par le
recrutement de complexes répresseurs.
Pour en découvrir la véracité, nous avons d’abord fixé comme objectifs de trouver un
modèle cellulaire de lignées primaires et métastatiques pour en vérifier les niveaux
d’expression du gène Gas1. Par la suite, nous voulions déterminer la composition
moléculaire au niveau du promoteur de ce gène, soit en étudiant les groupements
d’acétylation et de méthylation sur l’ADN et les histones. En plus, nous voulions démontrer
l’implication de complexes par l’utilisation d’inhibiteurs chimiques empêchant la
répression de Gas1. Ensuite, nous désirions établir les facteurs de transcription
responsables d’empêcher la transcription de ce gène par des immunoprécipitations de la
chromatine et l’utilisation de petits ARN interférents. Finalement, notre objectif principal
était de détourner la répression du gène Gas1 dans l’optique d’une utilisation thérapeutique
contre la métastase.
26
27
2. Méthodologie
Par souci d'allègement, les références des produits utilisés sont en annexe 1.
2.1. Culture cellulaire
Les lignées de mélanomes murins faiblement métastatique B16-F0 (ATCC #CRL-6322) et
fortement métastatique B16-F10 (ATCC #CRL-6475) sont cultivées dans le milieu de
culture DMEMA1
contenant du FBSA2
[10%]. Les lignées de mélanomes humains
faiblement métastatiques C81-61 (Don du Dre. MJ Hendrix) et fortement métastatiques
C8161 (Don du Dre. MJ Hendrix) sont cultivées dans le milieu F10-HAMA3
contenant du
FBSA2
[15%] et du Mito+ extension de sérumA4
[1x] et dans le milieu RPMI 1640A5
contenant du FBSA2
[10%] et de l'hepesA6
[20mM] respectivement. La lignée de mélanome
métastatique Lox-IMVI (Don Dr. MR Green) a été cultivée dans le milieu RPMI 1640A5
contenant du FBSA2
[10%]. Par la suite, les lignées du cancer du sein murin faiblement
métastatiques 67NR (Don du Dr. MR Green) et fortement métastatiques 4T1 (ATCC
#CRL-2539) sont cultivées dans le milieu DMEMA1
contenant du FBSA2
[10%] et
DMEMA1
contenant du FBSA2
[5%], du MEM [5%] et du NCSA8
[5%] respectivement.
Finalement, les cellules embryonnaires humaines de rein HEK 293T (Don Dr. MR Green)
et HEK 293T G/P (Don du Dr. MR Green) sont cultivées dans le milieu de culture
DMEMA1
contenant du FBSA2
[10%]. Il est à noter que tous les milieux de culture sont
complétés avec de la L-glutamineA9
[2mM] et les antibiotiques pénicilline/streptomycineA10
[1x].
2.2. Les vecteurs d’expression
Tous les clonages moléculaires passent par un vecteur de transport, pGEM-T Easy, pour
conserver un vecteur facilement transférable vers une autre destination. Les shRNA pour la
répression d'ARNm sont tous dans le vecteur lentiviral pLKO.1. Les surexpressions
géniques sont dans le vecteur QCXI-P. Finalement, les séquences 3'UTR de Gas1 pour les
essais de luciférase sont dans le vecteur pGL4.13. Cartographie des vecteurs en annexe
trois.
28
2.3. Traitements chimiques cellulaires
Les cellules sont traitées avec un inhibiteur d'histone déacétylases, la TSAB1
, [0,3µM et 1
µM] pendant 24 à 48 heures. Les cellules sont traitées également avec un inhibiteur de
DNA méthyltransférases, le 5-AzaB2
, [1µM, 3µM et 10µM] pendant 48 à 72 heures.
Finalement, les cellules sont traitées avec un inhibiteur de c-MycB3
[50µM et 100µM] et un
inhibiteur de bromodomaine, JQ1B4
, [500nM] pendant 4 à 24 heures.
2.4. Extraction d’ARN
De 2-8 millions de cellules sont incubées dans un pétri de 100 mmC1
pour chaque extraction
d’ARN. Le milieu de culture est aspiré et les cellules sont lavées au PBS [1x] deux fois. Par
la suite, les cellules sont grattées et lysées directement dans le pétri avec la solution de
lyseC2
. Les échantillons sont filtrés sur une colonneC3
pour enlever les débris cellulaires. De
l'éthanol-H2O DEPC [70%] est ajouté aux échantillons filtrés pour permettre l'adhésion à la
colonneC3
. Ensuite, le mélange est passé sur une colonne d’attachement d’ARNC4
pour
conserver l’ARN des cellules. Les colonnes sont lavées une première fois avec la solution
de lavage IC5
. Les traces d’ADN sont dégradées avec l’ajout de DNAseC6
[1x] sur colonne
pendant 20 minutes à température pièce. L’ARN est lavé une deuxième fois avec la
solution de lavage IC5.
Par la suite, l’échantillon est lavé deux fois avec la solution de
lavage IIC7
. Finalement, l’ARN est récupéré avec la solution d’élutionC8
.
2.5. Dosage d’ARN
Tous les échantillons d’ARN sont dosés au spectrophotomètre. Le blanc de référence est la
solution d’élutionC8
. L’ARN est dosé aux longueurs d’ondes 260/280. La pureté de l’ARN
peut être vérifiée par bioanalyseur.
2.6. Réaction de transcription inverse
Une quantité de 2 µg d’ARN total est combiné avec un mélange d’amorces d’hexamères et
d’oligo(dT) ancréesD1
[60 µM] et complété à 16 µl avec de l’H2O DEPC. Les échantillons
sont incubés à 70°C pendant 5 minutes et rapidement déposés sur glace. Ensuite, l’enzyme
de transcriptase inverseD2
[200U/µl] avec son tamponD3
[10x] et l’inhibiteur de RNasesD4
29
[40U/µl] sont ajoutés à l’échantillon pour effectuer la réaction de transcription inverse.
Finalement, le tout est incubé à 25°C pendant 5 minutes pour l'appariement des amorces,
42°C pendant 1 heure pour la synthèse de l'ADNc et 80°C pendant 5 minutes pour
l'inactiver l'enzyme. Les échantillons sont complétés à 200 µl avec de l’H2O Milli-Q.
2.7. Réaction en chaîne par polymérase quantitative
L’expression des gènes est quantifiée en temps réel avec une PCR quantitative210
. De 500
ng à 1000 ng de la réaction de transcription inverse est mélangée avec de l’H2O Milli-Q,
des amorces de gauche et de droite [5 µM] et un mélange de l’agent fluorescent, de tampon
et de polyméraseE1
[2x] dans une plaque 96 puitsE2
. La plaque est scellée avec un film
collantE3
. Le protocole est le suivant : activation de l'enzyme à 95°C pendant 10 minutes,
dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 15 secondes, liaison des amorces avec l’ADNc et
élongation à 60°C pendant 1 minute. Les deux dernières étapes sont répétées 40 cycles. La
qualité des amorces est vérifiée par une courbe de dissociation allant de 65°C à 95°C par
0.5°C pendant 0.05 seconde. Liste des amorces utilisées en annexe.
2.8. Immunoprécipitation de la chromatine
Protocole par le Dr. Nelson211
.
2.8.1. Fixation et récolte cellulaire
Toutes les étapes sont effectuées sur glace pour protéger les protéines de la dégradation. Un
nombre de 10 millions de cellules par immunoprécipitation de la chromatine sont incubées
dans des pétris 150 mmF1
. Les cellules sont fixées avec de la formaldéhydeF2
[37%] à une
concentration finale de 1.42% pendant 10 minutes. Le formaldéhyde est inhibé avec de la
glycineF3
[1M] à une concentration finale de [141 mM] pendant 5 minutes. Les cellules
sont lavées deux fois au PBS [1x] froid et elles sont grattées et transférées dans un tube de
1.5 mlF4
. Les cellules sont centrifugées à 2000g pendant 5 minutes et le surnageant est
aspiré.
30
2.8.2. Lyse cellulaire
Le culot cellulaire est lysé avec du tampon d’immunoprécipitation froid (NaClF5
[150mM],
TrisF6
-HCLF7
[50mM] pH 7.8, EDTAF8
[5mM], NP-40F9
[0.5% vol/vol] et Triton X-100F10
[1% vol/vol]) contenant des inhibiteurs de protéases (PMSFF11
[0.1M] et leupeptineF12
[10
µg/ml]). L’échantillon est centrifugé à 12 000g pendant 5 minutes et le surnageant est
aspiré. Le culot nucléaire est lysé à nouveau avec du tampon d’immunoprécipitation froid
contenant des inhibiteurs de protéases. L’échantillon est centrifugé à nouveau et le
surnageant est aspiré. Le culot nucléaire est lysé une dernière fois avec du tampon
d’immunoprécipitation froid contenant des inhibiteurs de protéases. L’échantillon est
séparé en deux parties pour augmenter l’efficacité de la sonication.
2.8.3. Sonication
Chaque échantillon est soniqué par ultrason avec un sonicateurF13
possédant une sondeF14
1/8 pour permettre le déchirement de l’ADN en longueur de 1 à 5 nucléosomes. Les
conditions de sonication sont les suivantes : 10 répétitions de 15 secondes à la puissance 10
sur 20 sur glace. Par la suite, les échantillons sont centrifugés 12 000g pendant 10 minutes
et le surnageant de tous les échantillons est transféré dans un même tube de 15 mlF15
. Le
tout est mélangé par inversion douce.
2.8.4. Immunoprécipitation
Ensuite, le mélange est séparé en un aliquote servant de référence, congelé à -80°C, un
aliquote pour vérifier la sonication de l’échantillon, congelé à -80°C, un volume pour servir
de bruit de fond et un volume par anticorps. Les aliquotes sont de 1x105 cellules et les
volumes d’immunoprécipitation sont de 1x107 cellules. Les anticorps pour
l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt sont ajoutés. La quantité d’anticorps varie
entre 2 µg et 8 µg (Liste en annexe). Un anticorps normal de lapin de type IgG est utilisé
pour l’échantillon de bruit de fond. Il permet en effet de réduire l’ADN non spécifique en
diminuant son interaction avec les billes. Les échantillons avec les anticorps sont incubés à
4°C toute la nuit sur un rotatoire. Le lendemain, les échantillons sont centrifugés à 12 000g
pendant 10 minutes. Pendant ce temps, les billes d’agarose AF16
ou GF17
, selon les types
31
d’anticorps, sont lavées 3 fois avec du tampon d’immunoprécipitation pour enlever
l’éthanol des billes. Un lavage consiste à ajouter du tampon, centrifuger à 2000g pendant 1
minute et aspirer le surnageant avec précaution. Ensuite, les billes sont pré-nettoyées avec
de la BSA [5%] pendant 30 minutes sur rotatoire. Une fois la centrifugation des
échantillons de 10 minutes terminée, 90% du surnageant est transféré dans les billes
d’agarose. Les échantillons sont incubés pendant 45 minutes à 4°C sur le rotatoire. Après
l’immunoprécipitation, les billes d’agarose sont lavées 5 à 6 fois. Un lavage consiste à
centrifuger les billes à 2000g pendant 1 minute à 4°C et aspirer le surnageant. Le tampon
d’immunoprécipitation froid est ajouté pour laver les billes. Une fois les lavages terminés,
il faut aspirer complètement le tampon des billes d’agarose.
2.8.5. Préparation de l’ADN
Pendant l’immunoprécipitation, la référence et l’échantillon sont décongelés pour vérifier la
qualité de la sonication. L’ADN est précipité avec de l'éthanol [100%] et incubé à
température pièce 10 minutes. Le tout est centrifugé à 12 000g pendant 3 minutes à 4°C et
le surnageant est aspiré. Ensuite, le culot d’ADN est lavé avec de l’éthanol [75%],
centrifugé à 12 000g pendant 1 minute à 4°C et le surnageant est aspiré. L’ADN est séché
pendant 15 minutes à température pièce. Une fois terminée, du chelex-100F18
[10%] est
ajouté aux échantillons.
2.8.6. Isolation de l’ADN
Du chelex-100F18
[10%] est ajouté aux billes d’agarose des échantillons et de la protéinase
KF19
[20 µg/ µl]. Les échantillons sont incubés à 55°C pendant 30 minutes. Ensuite, ils sont
bouillis pendant 10 minutes. Ces deux étapes permettent de dégrader les protéines pour ne
conserver que l’ADN. Le tout est centrifugé à 12 000g pendant 1 minute à 4°C et le
surnageant est transféré dans un nouveau tube de 1.5 mlF4.
De l’eau Milli-Q est ajoutée pour
laver les billes et le chelex-100F18
. Les échantillons sont centrifugés à nouveau et le
surnageant est transféré avec l’autre surnageant.
2.8.7. Réaction en chaîne par polymérase quantitative
L’expression des gènes d’intérêt est quantifiée en temps réel avec une PCR quantitative.
L'ADN immunoprécipité est mélangé avec de l'H2O Milli-Q, des amorces de gauche et de
32
droite [5 µM] et du Sybr GreenE1
[2x] dans une plaque 96 puitsE2.
La plaque est scellée
avec un film collantE3.
Le protocole est le suivant : activation de l'enzyme à 95°C pendant
10 minutes, dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 15 secondes, liaison des amorces à
l’ADNc et élongation de l'ADN à 60°C pendant 1 minute. Les deux dernières étapes sont
répétées 40 cycles. La qualité des amorces est vérifié une courbe de dissociation allant de
65°C à 95°C par 0.5°C pendant 0.05 seconde. Les résultats sont comparés à
l’enrichissement au dessus du bruit de fond. En d’autres mots, lorsque la protéine est
présente au promoteur du gène d’intérêt, l’immunoprécipitation a enrichi la quantité
d’ADN disponible, contrairement au contrôle négatif. Par conséquent, plus
l’enrichissement est élevé par rapport au contrôle négatif, plus la protéine est présente au
promoteur du gène. Liste des amorces en annexe.
2.8.8. Vérification de la sonication
Les résultats de la sonication sont vérifiés sur un gel d'agarose [1%]. Le gel est obtenu en
mélangeant 1% d'agarose avec un tampon de TAE [1x] (TrisF6
[40mM], acide acétique
glacialF20
[20mM] et EDTAF8
[1 mM] pH 8.0). Le mélange est chauffé aux micro-ondes
pour dissoudre l'agarose. Une fois refroidit à 60°C, du bromure d'éthidium [10 mg/ml] est
ajouté au mélange pour permettre la visualisation de l'ADN aux rayons ultraviolets. Les
échantillons sont ajoutés aux puits et migrés à 100 volts pendant 1 heure. Les résultats sont
observés aux rayons ultraviolets et comparés à une échelle de 100 paires de basesF21
[500µg/ml].
2.9. Clonage moléculaire
2.9.1. Réaction en chaîne par polymérase
Les échantillons sont amplifiés à partir d'une librairie d'ADN complémentaire obtenue suite
à l'extraction d'ARN et d'une réaction de transcription inverse. Les amplifications ont été
effectuées avec deux types d'enzymes selon les besoins, soit la Pfu ADN polymérase et la
Taq polymérase.
Pfu ADN polymérase Phire IIG1
:
33
Les éléments suivants sont utilisés pour effectuer l'amplification désiré : du tampon de
Phire IIG2
[5x], des dNTPsG3
[10mM], des amorces de droite et de gauche [5 µM], de
l'ADNc, du DMSOG4
[100%], du CES [5x] (un amplificateur permettant une meilleure
amplification des régions riches en GC), de la Phire IIG1
et le tout est complété avec de
l'H2O Milli-Q. La réaction est exécutée selon le protocole suivant : activation de l'enzyme à
98°C pendant 30 secondes, dénaturation de l'ADN à 98°C pendant 10 secondes,
appariement des amorces - température variable selon les amorces - pendant 30 secondes et
élongation de l'ADN à 72°C pendant 1 minute. Les trois dernières étapes sont répétées 25 à
40 cycles selon les besoins. Finalement, l'élongation est complétée par une étape de 72°C
pendant 10 minutes. Étant donné les bouts francs laissés par la Pfu ADN polymérase, de la
Taq polyméraseG5
est ajouté aux échantillons avec une incubation additionnelle à 95°C
pendant 5 minutes pour activer la Taq polymérase et 72°C pendant 15 minutes pour ajouter
une queue de poly-A. Liste des amorces en annexe.
Taq polyméraseG5
:
Les éléments suivants sont utilisés pour effectuer l'amplification désiré : du tampon de Taq
polyméraseG6
[10x], des dNTPsG3
[10mM], des amorces de droite et de gauche [5 µM], de
l'ADNc, du MgCl2G7
[25mM], du CES [5x], de la Taq polyméraseG5
et le tout est complété
avec de l'H2O Milli-Q. La réaction est exécutée selon le protocole suivant : activation de
l'enzyme à 95°C pendant 5 minutes, dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 30 secondes,
appariement des amorces - température variable selon les amorces - pendant 30 secondes et
élongation de l'ADN à 72°C pendant 1 minute. Les trois dernières étapes sont répétées 25 à
40 cycles selon les besoins. Finalement, l'élongation est complétée par une étape de 72°C
pendant 10 minutes. Liste des amorces en annexe.
2.9.2. Gel d’agarose
Tous les produits obtenus par PCR sont vérifiés sur gel d'agarose [0.8%]. Le gel est obtenu
en mélangeant 0,8% d'agarose avec un tampon de TAE [1x] (TrisF6
[40mM], acide acétique
glacialF20
[20mM] et EDTAF8
[1 mM] pH 8.0). Le mélange est chauffé au four à micro-
ondes pour dissoudre l'agarose. Une fois refroidit à 60°C, du bromure d'éthidium [10
mg/ml] est ajouté au mélange pour permettre la visualisation de l'ADN aux rayons
ultraviolets. Les échantillons sont ajoutés aux puits et migrés à 100 volts pendant 1 heure.
34
Les résultats sont observés aux rayons ultraviolets et comparés à une échelle de 1000 paires
de basesG9
[500µg/ml].
2.9.3. Purification d’ADN
Les bandes sélectionnées sur le gel d'agarose sont coupées avec l'aide d'un scalpel et
déposées dans un tube 1.5 mlF4
. Trois volumes de tampon QX1G9
sont ajoutés par 100 mg
de bandes d'agarose extraites pour permettre la dégradation de l'agarose. La solution
QX2G10
est ajoutée au mélange pour lier l'ADN resuspendu. Le tout est incubé à 50°C
pendant 10 minutes pour entamer la dégradation de l'agarose. Ensuite, l'échantillon est
centrifugé à 13000 rpm pendant 30 secondes. Le culot est lavé avec la solution QX1G9
pour
enlever les traces d'agarose restantes. Le tout est centrifugé à nouveau à 13000 rpm pendant
30 secondes. Le culot est ensuite nettoyé deux fois avec la solution tampon PEG11
pour
éliminer les sels. Le culot est séché pendant 10 à 15 minutes à l'air pour finalement être
élué dans de l'H2O Milli-Q.
2.9.4. Digestion enzymatique
Les échantillons d'ADN purifié sont mélangés avec les enzymes de restriction (Liste en
annexe) et leur tampon respectifG12-G13-G14-G15
. De plus, pour certaines enzymes, de la
BSAG16
est ajoutée. Toutes les digestions sont incubées à 37°C pendant 1 heure et vérifiées
sur un gel d'agarose [0.8%].
2.9.5. Déphosphorylation de vecteurs
Une fois digérée, les vecteurs sont déphosphorylés pour empêcher qu'ils ne se referment sur
eux-mêmes en mélangeant : le tampon de phosphatase alcalineG17
[2x], le vecteur et la
phosphatase alcalineG18
[10000U/ml]. Le mélange est incubé à 37°C pendant 30 minutes.
La phosphatase est ensuite inactivée en incubant à 65°C pendant 10 minutes.
2.9.6. Ligation
Les ligations sont effectuées en mélangeant l'ADN à insérer avec un vecteur, le tampon de
ligation [2x], la ligase T4G19
[400000U/ml] et en complétant avec de l' H2O Milli-Q. Les
échantillons sont par la suite incubés à 16°C toute la nuit.
35
2.9.7. Transformation bactérienne
Une partie du produit de ligation est mélangée avec des bactéries TOP10F' chimio-
compétentes et incubée sur glace pendant 30 minutes. Par la suite, un choc thermique est
effectué en déposant l'échantillon dans un bain à 42°C pendant 45 secondes, suivi d'un
retour sur glace pour permettre l'entrée du plasmide dans les bactéries. Du milieu de culture
LB est ajouté pour la croissance des bactéries et elles sont déposées à 37°C avec agitation
de 200 rpm pour 1 heure. Le mélange est finalement déposé sur pétri LB contenant
l’antibiotique approprié selon la résistance du plasmide.
2.9.8. Extraction plasmidique de petites quantités (Miniprep)
Au premier jour, plusieurs colonies sont repiquées dans un milieu LBG20
contenant
l'antibiotique approprié et incubées à 37°C avec agitation de 200 rpm toute une nuit. Le
lendemain, une partie des bactéries sont conservées pour un stock de glycérolG21
[50%]. Le
reste des bactéries sont centrifugées à 13 000 rpm pendant 30 secondes et resuspendues
avec la solution IG22
. Les bactéries sont ensuite lysées avec la solution IIG23
pendant 1
minute à température pièce. La lyse est arrêtée avec la solution IIIG24
en incubant 1 minute
à température pièce. Les débris cellulaires sont éliminés en centrifugeant 12 000 rpm
pendant 5 minutes et le surnageant est transféré sur colonneG25
. La colonne est centrifugée à
10 000 rpm pendant 2 minutes, laissant adhérer les plasmides à la matrice de la colonne. La
colonneG25
est lavée deux fois avec la solution de lavage pour éliminer les restes d'ADN
bactérien. La colonne est centrifugée une autre fois pour enlever les traces de la solution de
lavage et les plasmides sont élués dans la solution de tampon d'élution.
2.9.9. Séquençage
Toutes les constructions plasmiques sont séquencées par la plate-forme de séquençage pour
vérifier que les plasmides sont exacts.
2.9.10. Extraction plasmidique de moyennes quantités (Midiprep)
Au premier jour, plusieurs colonies sont repiquées dans un milieu LBG20
contenant
l'antibiotique approprié et incubées à 37°C avec agitation de 200 rpm toute une nuit. Le
lendemain, une partie des bactéries sont conservées pour un stock de glycérolG21 [50%].
36
Le reste des bactéries sont centrifugées à 5 000g pendant 10 minutes et resuspendues avec
la solution de resuspensionG26
. Les bactéries sont ensuite lysées avec la solution de lyseG27
pendant 4 minutes à température pièce. La lyse est arrêtée avec la solution de
neutralisationG28.
Une solution d'attachementG29
est ajoutée pour permettre une meilleure
adhésion des plasmides à la colonne. Les débris cellulaires sont éliminés en passant sur
seringueG30
l'homogénat et le tout est transféré sur colonneG31
. La colonne est centrifugée à
3 000g pendant 2 minutes, laissant adhérer les plasmides à la matrice de la colonne. La
colonne est lavée deux fois avec la solution de lavage IG32
et la solution de lavage IIG33
pour
éliminer les restes d'ADN bactérien. La colonne est centrifugée une autre fois pour enlever
les traces de la solution de lavage et les plasmides sont élués dans la solution de tampon
d'élutionG34
.
2.10. Extraction d’ADN génomique
Une quantité variant de 2-8 millions de cellules est incubée dans un pétri de 100 mmC1
pour
chaque extraction d’ADN génomique. Le milieu de culture est aspiré complètement.
Ensuite, la solution de lyseH1
est ajouté sur le pétri pour lyser les cellules. L'homogénat est
transféré dans un tube de 1.5 mlF4.
De l'éthanol [100%] est ajouté pour isoler l'ADN
génomique formant une boule qui est transférée dans un nouveau tube de 1.5 mlF4.
L'ADN
génomique est ensuite lavé avec de l'éthanol [75%] deux fois. Finalement, l'ADN
génomique est resuspendu dans du NaOHH2
[8 mM].
2.11. Conversion d’ADN génomique au bisulfite de sodium
L'ADN génomique est mélangé avec le tampon de dilutionI1
et complété avec de l'H2O
Milli-Q. Le tout est incubé à 37°C pendant 15 minutes. Ensuite, le bisulfite de sodiumI2
est
ajouté pour convertir les cytosines non méthylées en cytosine sulphonate et l'échantillon est
incubé à 50°C toute la nuit dans le noir. Le lendemain, l'échantillon est déposé sur glace
pendant 10 minutes et transféré sur colonneI3
pour y faire adhérer l'ADN. La colonne est
lavée une fois avec la solution de lavageI4
. Par la suite, le tampon de désulphonationI5
est
ajouté pour convertir les cytosines sulphonates en uracile et incubé à température pièce
pendant 20 minutes. La colonne est lavée deux autres fois avec la solution de lavageI6
et
l'ADN génomique est élué avec le tampon d'élutionI7
.
37
2.12. Répression d’ARNm par petits ARN interférents
2.12.1. Production des plasmides lentiviraux pLKO.1
Idem à la section 2.9.8.
2.12.2. Production des lentivirus pLKO.1
Quatre millions de cellules HEK 293T sont laissées adhérer dans un pétri 100 mmC1
dans
leur milieu de culture standard ne contenant que de la pénicilline-StreptomycineA10
[0.1x].
Huit heures plus tard, les cellules sont transfectées avec les éléments suivants : 1.5 µg de
vecteur psPAX2 – la particule virale d’empaquetage – 0.167 µg de vecteur pMD2.G –
l'enveloppe virale – et 1.6 µg de vecteur pLKO.1 shRNA, le tout dans du tampon LBS
(NaClF5
[150mM], acétate de sodiumJ1
[20mM] pH 4.0). La combinaison est mélangée avec
l'agent transfectant, soit le PEIJ2
[5 mg/ml], et est incubée à température pièce pendant 20
minutes. Le mélange est ajouté au milieu de culture des cellules. Le lendemain, les cellules
sont rafraîchies avec leur milieu de culture normal contenant 5.5 g de BSA pour aider la
préservation des lentivirus. Deux jours plus tard, les lentivirus sont récoltés dans des tubes
de 15 mlF15
.
2.12.3. Transduction des lentivirus pLKO.1
Les cellules à infecter sont laissées adhérer dans un pétri 100 mmC1
. Le milieu de culture
est retiré et les lentivirus sont déposés sur les cellules. Du polybrène [10µg/ml] est ajouté
par la suite pour favoriser les interactions ioniques pour l'entrée du lentivirus. Le
lendemain, les cellules sont rafraîchies avec du milieu de culture et de la puromycineJ3
(les
quantités varient d’une lignée cellulaire à l’autre. Elles sont déterminées selon une courbe
de mort cellulaire) est ajouté pour sélectionner les cellules transduites.
2.13. Essai luciférase
Quatre millions de cellules à transfecter sont laissées adhérer dans un pétri 100 mmC1
dans
leur milieu de culture standard. 8 heures plus tard, les cellules sont transfectées avec les
éléments suivants : 18 µg d'ADN du plasmide pGL4.13 – contenant le gène d’intérêt, et
180 ng de pRL-CMV – codant pour la rénilla pour normaliser les échantillons – le tout dans
38
du tampon LBS. La combinaison est mélangée avec l'agent transfectant, soit le PEI [5
mg/ml], et est incubée à température pièce pendant 20 minutes. Le mélange est ajouté au
milieu de culture des cellules. Le lendemain, le milieu de culture est aspiré et les cellules
sont rincées deux fois au PBS [1x]. Le tampon de lyseL1
est ajouté aux cellules et les pétris
sont incubés 45 minutes sur une plaque rotatoire. Les cellules sont par la suite grattées et
transférées dans des tubes 1.5 mlF4
. Les échantillons sont congelés dans la glace sèche et
décongelés dans un bain chauffant à 37°C deux fois pour briser les cellules. Dans une
plaque 96 puits blancheK4
, les échantillons sont ajoutés en triplicata et ensuite analysés au
bioluminomètre suite à l'ajout des solutions de substrats pour luciférase et de renillaL2
.
39
3. Résultats
Avec pour objectif d’étudier la régulation du gène Gas1, plusieurs expériences ont été
effectuées pour en démontrer les mécanismes. Ainsi, les variations d’ARNm ont été
analysées par PCR quantitative afin de voir les effets des inhibiteurs chimiques ou des
petits ARN interférents utilisés. De plus, pour l’étude du promoteur de Gas1, des
expériences de bisulfite de sodium et d’immunoprécipitation de la chromatine ont permis
de révéler des résultats nouveaux, notamment aux niveaux des protéines pouvant être
responsables de la régulation du gène Gas1. Finalement, il est important de souligner que
diverses lignées cellulaires, murines ou humaines, ont été utilisées pour valider l’étendue
des résultats observés.
3.1. Le mélanome murin
3.1.1. Gas1 est réprimé chez les cellules de mélanome murin B16-F10
Pour confirmer des résultats déjà obtenus par le Dr. Gobeil, le niveau d'expression d'ARNm
de gas1 a été mesuré par PCR quantitative entre les lignées cellulaires de mélanome
faiblement métastatique B16-F0 et fortement métastatique B16-F10. La figure 6A démontre
qu'il y a environ 22 fois plus d'ARNm chez les cellules B16-F0 que chez celles
métastatiques B16-F10. Ces résultats illustrent bien la faible expression du gène Gas1 chez
la lignée de mélanome métastatique murin B16-F10.
Pour poursuivre l'investigation de cette répression du gène Gas1, l'ADN génomique des
cellules B16-F10 a été extrait, traité au bisulfite de sodium, amplifié par PCR et cloné dans
le vecteur d'expression pGEM-T Easy. En effet, le séquençage d'ADN traité au bisulfite de
sodium permet de vérifier le niveau de méthylation d'îlots CpGs au promoteur des gènes.
Suite au séquençage, l'analyse entre la lignée métastatique B16-F10 sauvage et celle ayant
subie le traitement permet de démontrer que l’îlot CpGs du promoteur de Gas1 est
fortement méthylé (en noir), tel qu'illustré à la figure 6B. Concrètement, une forte présence
de méthylation indique un gène réprimé et implique donc des DNA méthyltransférases. Ce
40
résultat est classique des gènes réprimés, tout comme pour Gas1 chez la lignée
métastatique B16-F10.
Finalement, pour continuer l'étude du gène Gas1 chez les cellules métastatiques B16-F10,
une immunoprécipitation de la chromatine a été effectuée avec les anticorps contre la
marque d'acétylation AcH3, la marque de méthylation H3K9me3 et la polymérase II totale.
Illustré à la figure 6C, ces résultats montrent une forte présence de la marque de répression
H3K9me3 comparativement à la marque d'acétylation AcH3 ou à la polymérase II.
L’enrichissement est comparé au contrôle négatif contenant un anticorps normal IgG de
souris. Ce résultat accroît les évidences d'une répression du gène Gas1 chez le mélanome
métastatique B16-F10.
41
3.1.2. L'expression de Gas1 est modulable chimiquement par la TSA et le 5-
Aza chez le mélanome métastatique murin B16-F10
Pour vérifier que la répression de Gas1 n'était pas génétique, par exemple par délétion du
gène, la lignée métastatique B16-F10 a été traitée avec un inhibiteur d’histones
déacétylases et un inhibiteur de DNA méthyltransférases, soit la TSA et le 5-Aza
respectivement, pouvant affecter plusieurs gènes réprimés. Dans un premier temps, les
cellules ont été traitées avec de la TSA [1μM] pendant 48 heures, illustré à la figure 7A. Par
la suite, elles ont été incubées en présence de 5-Aza [3μM] pendant 72 heures, présenté à la
figure 7A, également. Dans les deux cas, les résultats démontrent une augmentation de 10
et 8 fois respectivement du niveau d'ARNm, mesuré par PCR quantitative. L'expression de
Gas1 est donc modulable chimiquement chez la lignée métastatique B16-F10 et implique
les familles Hdac et Dnmt dans le processus de répression.
Pour déterminer précisément les candidats responsables de cette répression épigénétique de
Gas1, la dégradation par petits ARN interférents a été effectuée pour les gènes ciblés. En
premier lieu, trois histones déacétylases potentielles ont été sélectionnées, soit hdac1,
hdac2 et hdac7. En effet, ces gènes font parties de la famille ciblée par l'inhibiteur TSA.
L'ARNm de ces gènes a été dégradé par petits ARN interférents et par la suite, l'effet
encouru sur le gène Gas1 a été analysé par PCR quantitative, tel que visualisé à la figure
7B. En deuxième lieu, les trois principaux types de DNA méthyltransférases ont été choisis,
soit dnmt1, dnmt3a et dnmt3b. L'ARNm de ces gènes a été dégradé par petits ARN
interférents et ensuite, l'effet encouru sur le gène Gas1 a été rapporté par PCR quantitative,
tel qu'illustré à la figure 7C. Également, il est possible de voir les niveaux d’ARNm des
gènes ciblés. Dans tous les cas, l'effet de modulation du gène Gas1 n'a pas été au niveau
escompté, soit une hausse au même niveau qu'avec les inhibiteurs chimiques.
42
3.1.3. Cbx1 est impliqué dans la répression épigénétique du gène Gas1 chez les
cellules de mélanome métastatique murin B16-F10
Dans l'optique d'identifier les candidats impliqués dans la répression du gène gas1 chez les
cellules métastatiques B16-F10, plusieurs gènes potentiels ont été criblés par petits ARN
interférents. Ces gènes ont été choisis pour leur implication lors de la méthylation d'îlots
CpGs et d'histones de type H3K9me3. Ainsi, les gènes setdb1, cggbp1, cbx1, cbx3, cbx5,
suv39h1 et suv39h2 ont été réprimés par petits ARN interférents. Par la suite, l'effet de leur
répression sur le niveau d'expression du gène Gas1 a été mesuré par PCR quantitative,
visualisé à la figure 8. Il est donc possible d'apercevoir une augmentation moyenne de
l’ARNm de Gas1 de 5 fois lors de l'inhibition de l’ARNm de cbx1, illustré à la figure 8A.
La figure 8B montre le résultat des autres gènes ciblés, ayant un effet moindre sur
l’expression du gène Gas1. Il est maintenant démontré que cbx1 est impliqué dans la
répression du gène Gas1 chez les cellules métastatiques B16-F10, bien que d'autres joueurs
comme cbx5 pourraient y être mêlés.
43
3.2. Le mélanome humain
3.2.1. L'expression de GAS1 est réprimé chez les cellules de mélanome
métastatique humain C8161 et Lox-IMVI
Le niveau d'expression d'ARNm de GAS1 a été mesuré par PCR quantitative entre trois
lignées cellulaires de mélanome humain, soit les cellules faiblement métastatiques C81-61
et les deux lignées fortement métastatiques C8161 et Lox-IMVI. La figure 9A démontre
qu'il y a 275 fois plus d'ARNm chez les cellules C81-61 que chez celles métastatiques. Ces
résultats illustrent bien la faible expression du gène GAS1 chez les lignées de mélanome
métastatique humain C8161 et Lox-IMVI.
44
3.2.2. L'expression de GAS1 n'est pas modulable par la TSA et le 5-Aza chez
les cellules C8161 et Lox-IMVI
Pour vérifier le mécanisme de répression du gène GAS1, les lignées métastatiques C8161 et
Lox-IMVI ont été traitées avec un inhibiteur d’histones déacétylases et un inhibiteur de
DNA méthyltransférases, soit la TSA et le 5-Aza respectivement, pouvant affecter plusieurs
gènes réprimés. Dans un premier temps, les cellules ont été traitées avec de la TSA [0,1μM]
pendant 48 heures, illustré à la figure 9B. Par la suite, elles ont été incubées en présence de
5-Aza [3μM] pendant 72 heures, présenté à la figure 9C. Dans les deux cas, les résultats ne
démontrent aucun changement majeur du niveau d'ARNm, mesuré par PCR quantitative.
L'expression de GAS1 n'est donc pas modulable chimiquement par la TSA ou le 5-Aza chez
les lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI.
Pour poursuivre l'investigation de cette répression du gène GAS1, l'ADN génomique des
cellules C81-61, C8161 et Lox-IMVI a été extrait, traité au bisulfite de sodium et cloné
dans le vecteur d'expression pGEM-T Easy. Suite au séquençage, l'analyse entre la lignée
45
sauvage et celle ayant subie le traitement permet de démontrer que l’îlot CpG du promoteur
de GAS1 est faiblement méthylé chez les trois lignées cellulaires, tel qu'illustré à la figure
10A. Ce résultat est classique des gènes actifs malgré l'absence de GAS1 chez les cellules
métastatiques C8161 et Lox-IMVI, amenant des indices d'une répression différente des
cellules murines B16-F10.
Finalement, pour continuer l'étude du gène GAS1 chez les cellules métastatiques C81-61 et
C8161, une immunoprécipitation de la chromatine a été effectuée avec les anticorps contre
la marque d'acétylation AcH3, la marque de méthylation H3K9me3 et la polymérase II
totale. Illustrés au graphique 10 B) et C), ces résultats montrent une forte présence de la
marque d’activation AcH3, ainsi qu'une présence moindre de la polymérases II et de la
marque de répression H3K9me3 chez les deux lignées cellulaires. L’enrichissement est
comparé au contrôle négatif contenant un anticorps normal IgG de souris. Ce résultat
accroît les évidences d'un mécanisme de répression du gène GAS1 très différent des cellules
murines B16-F10.
46
3.2.3. L’expression de GAS1 n'est pas contrôlée par microARNs
Par conséquent, l'option d'une régulation par microARN du gène GAS1 a été émise. En
effet, la région 3'UTR de GAS1 contient quatre sites du miR-495, un microARN présent en
abondance chez la lignée métastatique C8161, comparativement à celle faiblement
métastatique C81-61. Afin de vérifier cette possibilité suite aux résultats obtenus jusqu'à
présent, la région 3'UTR du gène GAS1 a été clonée en deux parties (Figure 20 - en
annexe). La partie 3'UTRhGAS1-A.1 s'accapare les nucléotides 1 à 797 de la région 3'UTR,
tandis que la partie 3'UTRhGAS1-B.1 comporte les nucléotides 798 à 1378. C'est la région
B.1 qui contient les quatre sites du miR-495. Le processus est le suivant : le vecteur
pGL4.13 est transcrit en ARNm et traduit en protéine de luciférase. Avec l'ajout d'un
substrat, la luciférase le transforme, ce qui cause une luminosité détectable au
bioluminomètre. Dans cet expérience, la région 3'UTR de la luciférase a été remplacé par la
région A.1 ou B.1, et si GAS1 est régulé par microARNs, l'ARNm de la luciférase diminue,
réduisant la quantité de lumière produite lors de l'ajout du substrat. Ainsi, les cellules
métastatiques C8161 ont été transfectées avec les constructions A.1 et B.1 et la quantité de
luciférase dosée par bioluminomètre. À la figure 11, il est montré que les parties A.1 et B.1
expriment autant de luminosité que le contrôle positif, normalisé par la renilla. Ce fait
illustre l'inaction des microARNs contre l'ARNm du gène GAS1 chez les cellules
métastatiques C8161.
47
3.2.4. L’expression de GAS1 est contrôlée par les gènes BRD4 et c-MYC chez
les cellules de mélanome humain C81-61, C8161 et Lox-IMVI
Pour étudier le rôle de régulateur des protéines c-MYC et BRD4 sur le gène GAS1 chez les
cellules de mélanome humain, les cellules faiblement métastatiques C81-61 ont été traitées
avec un inhibiteur de bromodomaine, JQ1, dont fait partie le gène BRD4. En effet, dans la
littérature, c-MYC est considéré comme un répresseur de GAS1, tandis que BRD4 est
impliqué dans la transcription de c-MYC. À la figure 12A, il est possible de voir une
diminution de 80% de l'expression du gène GAS1 suite au traitement avec l'inhibiteur JQ1
[500nM] pendant 24 heures. De plus, les cellules C81-61 ont été infectées par un lentivirus
codant pour des petits ARN interférents contre l'ARNm du gène BRD4. Ainsi, suite à cette
transduction, l'expression de GAS1 est diminuée pour deux des trois petits ARN
interférents, illustré à la figure 12B. Il est également possible d’observer une diminution de
l’expression du gène c-MYC, une autre cible de BRD4. Finalement, une
immunoprécipitation de la chromatine avec un anticorps contre BRD4 a été exécutée pour
en vérifier la présence au promoteur de GAS1. Cette expérience a démontré l'implication
directe de BRD4 sur la transcription de GAS1 par son enrichissement de 5 fois au dessus du
contrôle négatif IgG, tel que visualisé à la figure 12C. Ces expériences permettent de
déceler un rôle pour BRD4 dans l’activation du gène GAS1 chez la lignée de mélanome
C81-61.
48
Par la suite, l'implication directe du proto-oncogène c-MYC dans la répression de GAS1 a
été démontrée chez les lignées cellulaires métastatiques C8161 et Lox-IMVI. En effet, les
cellules ont été infectées avec des petits ARN interférents ciblant c-MYC et l'augmentation
de l'expression du gène GAS1 a été analysé par PCR quantitative. La figure 13A révèle une
augmentation moyenne de l’expression en ARNm du gène GAS1 de 13 fois et 9 fois chez
les C8161 et Lox-IMVI respectivement et ce par rapport aux cellules contrôles. De plus, les
cellules C8161 et Lox-IMVI infectées avec les petits ARN interférents contre l'ARNm du
gène c-MYC ont été traitées avec l'inhibiteur de bromodomaine JQ1 [500nM] pendant 24
heures. La figure 13B et 13C dévoile que l'augmentation de l’expression du gène GAS1 est
réduite lorsque les cellules métastatiques sont traitées avec l'inhibiteur JQ1. Le même
résultat a été observé pour l’expression d’ARNm du gène contrôle c-MYC. Finalement, des
immunoprécipitations de la chromatine avec des anticorps contre c-MYC et BRD4 ont été
effectuée pour valider leur présence au promoteur du gène GAS1. Tel que démontré à la
figure 14, la protéine c-MYC est présente au promoteur de GAS1, grâce à un
enrichissement supérieur au contrôle négatif IgG, montrant ainsi une répression directe de
49
GAS1 par c-MYC chez les C8161 (A) et les Lox-IMVI (B). Le gène GAPDH est utilisé
comme contrôle positif, tandis que le gène RHAG comme contrôle négatif. De plus,
l’immunoprécipitation de la chromatine avec un anticorps de BRD4 chez les cellules
métastatiques C8161 dévoile sa présence au promoteur de GAS1, montré à la figure 14C,
par un enrichissement d’au moins deux fois au dessus du contrôle négatif IgG. Par ces
résultats, il est possible d’affirmer que c-MYC joue un rôle de régulateur du gène GAS1, en
plus de la protéine BRD4.
50
3.2.5. La répression de GAS1 n'implique pas les complexes c-
MYC/MAX/MIZ1 ou c-MYC/TFAP2C/KDM5B
Par ailleurs, l'hypothèse d'une répression par un complexe c-MYC/MIZ1/MAX a été
envisagée, suite aux résultats précédents. Pour en vérifier la véracité, les cellules C8161 ont
été traitées avec un inhibiteur chimique de l'interaction c-MYC/MAX, le 10058-F4, aux
doses de [50μM], [100μM] et [200μM], pendant 48 heures, les empêchant d'accomplir leur
mécanisme de répression. Tel qu'illustré à la figure 15A, l'utilisation de cet inhibiteur n'a
pas augmenté l'expression du gène GAS1, malgré l’augmentation de l’expression du
contrôle p21 par plus de deux fois aux doses de [100μM] et [200μM]. De surcroît, l'ARNm
des gènes MAX et MIZ1 ont été dégradé par petits ARN interférents chez les cellules
métastatiques humaines C8161 sans aucune augmentation du niveau d'expression de GAS1,
visualisé à la figure 15B et 15C. Par contre, il est possible de voir à la figure 15B qu’un
seul petit ARN interférent contre l’ARNm de MAX semble efficace à augmenter
l’expression des gènes contrôles p21 ou C/EBPδ. Également, à la figure 15C, deux petits
ARN interférents sur trois augmente l’expression du gène contrôle p21, mais pas celle du
gène C/EBPδ. Il est envisageable d'affirmer que la répression du gène GAS1 n'est pas
causée par un complexe c-MYC/MAX/MIZ1.
51
En plus, un autre complexe de répression, c-MYC/TFAP2C/KDM5B a été considéré pour
la régulation négative de l'expression du gène GAS1. Ainsi, les gènes TFAP2C et KDM5B
ont été réprimés par petits ARN interférents pour vérifier leur rôle dans la régulation de
GAS1. Démontré à la figure 16A, la dégradation de leurs ARNm n'a pas apporté
d'augmentation comparable à l'expérience avec c-MYC du gène GAS1. Ce complexe ne
semble donc pas avoir d'incidence sur la régulation de GAS1.
52
3.2.6. La régulation de GAS1 implique d'autres protéines comme les PARPs
ou BMI-1
Afin d'élucider le rôle potentiel de la PARP-1 et de la PARP-2 dans le contrôle positif de
GAS1, les cellules faiblement métastatiques C81-61 ont été traitées avec un inhibiteur de
PARP-1 et PARP-2, l'ABT-888 [10μM] pendant 48 heures. En effet, les PARPs peuvent
permettre la transcription de certains gènes par la poly ADP-ribosylation de répresseurs. À
la figure 16B, il est possible de voir qu'il y a une diminution de 60% de l'expression du
gène GAS1, établissant une implication de la PARP-1 ou la PARP-2 dans sa régulation. Par
la suite, le rôle de la PARG, une protéine antagonisme de la poly (ADP-ribosyl)ation des
PARPs, a été vérifié pour la répression de l’expression de GAS1 chez les cellules
métastatiques C8161. En fait, en éliminant les poly ADP-ribosyl, les répresseurs peuvent
exercer leur fonction. Les cellules C8161 ont donc été transduites avec un lentivirus codant
pour des petits ARN interférents contre le gène PARG. Démontré à la figure 16C, sa
dégradation n'a pas amené d'augmentation de l'expression du gène GAS1, mais plutôt le
contraire.
53
Dans un autre ordre d'idée, pour percevoir la possibilité d'un mécanisme de pause
transcriptionnelle, le gène WHSC2, une composante vitale du complexe NELF impliqué
dans un tel mécanisme, a été dégradé par petits ARN interférents. En effet, il existe un lien
potentiel entre le maintient en pause transcriptionnelle par c-MYC et le complexe NELF
dans la littérature. Toutefois, présenté à la figure 16D, cette expérience n'a pas eu d'impact
sur l'expression du gène GAS1, excluant ce type de répression.
3.3. Le cancer du sein murin
3.3.1. Gas1 est réprimé chez les cellules de cancer du sein murin 4T1
Pour étudier le gène Gas1 chez le cancer du sein, le niveau d'expression d'ARNm de Gas1
a été mesuré par PCR quantitative entre les lignées cellulaires faiblement métastatiques
67NR et fortement métastatiques 4T1. La figure 17A présente qu'il y a 45 fois plus
d'ARNm chez les cellules 67NR que chez celles métastatiques. Ces résultats illustrent bien
la faible expression du gène Gas1 chez la lignée de cancer du sein métastatique murin 4T1.
Pour poursuivre l'investigation de cette répression du gène Gas1, l'ADN génomique des
cellules 4T1 a été extrait, traité au bisulfite de sodium et cloné dans le vecteur d'expression
pGEM-T Easy. Suite au séquençage, l'analyse entre la lignée métastatique sauvage et celle
ayant subie le traitement permet de démontrer que l’îlot de CpGs du promoteur de Gas1 est
fortement méthylés (en noir), tel qu'illustré à la figure 17B. Ce résultat est classique des
gènes réprimés, tout comme pour Gas1 chez la lignée métastatique B16-F10.
Pour vérifier que la répression de Gas1 n'était pas génétique, la lignée métastatique 4T1 a
été traitée avec un inhibiteur d’histones déacétylases, soit la TSA, pouvant affecter
plusieurs gènes réprimés. En effet, les cellules ont été traitées avec de la TSA [0,3μM]
pendant 48 heures, illustré à la figure 17C. Les résultats démontrent une augmentation de
18 fois du niveau d'ARNm, mesurée par PCR quantitative. L'expression de Gas1 est donc
modulable chimiquement chez la lignée métastatique 4T1.
54
Pour conclure cette section, il est important d’appuyer que les résultats obtenus entre les
lignées métastatiques murines et humaines indiquent des mécanismes de régulation du gène
Gas1 différents. Dans un premier temps, chez les cellules B16-F10, le gène Gas1 est
modulable par les inhibiteurs TSA et 5-Aza, contrairement aux cellules C8161 ou Lox-
IMVI. Ensuite, le promoteur de Gas1 est complètement différent : chez les B16-F10, l'îlots
CpG est fortement méthylé et la marque de répression H3K9me3 très présente, tandis qu’il
en est tout le contraire chez les C8161 et les Lox-IMVI. À la lumière de ces résultats, il est
possible d’affirmer que les mécanismes de régulation du gène Gas1 sont différents entre les
lignées investiguées et également très complexes.
55
4. Discussion
4.1. Les lignées cellulaires murines
Le développement de la biotechnologie permet de fournir aux chercheurs des outils
puissants pour étudier la science. Dans l’optique de créer un tel outil pour étudier la
métastase, le Dr. Fidler a développé une nouvelle lignée cellulaire, les cellules fortement
métastatiques murines de mélanome B16-F10. Pour y parvenir, il a injecté la lignée
faiblement métastatique murine de mélanome B16-F0 chez la souris. Fidler a ensuite
récolté la tumeur, isolé les cellules et répété l’expérience dix fois. Par le fait même, il a
sélectionné une partie de la population des B16-F0 de plus en plus agressives et
métastatiques. Les cellules B16-F10 sont nées123
. En outre, Fidler a développé un bon
modèle cellulaire pour étudier les variations géniques selon les différentes capacités
métastatiques cellulaires.
Découlant du fait qu’il s’agit d’un bon modèle pour l’étude de la métastase, le Dr. Gobeil a
choisi les cellules B16-F0 et B16-F10 pour vérifier les différences géniques entre elles par
un criblage pangénomique par petits ARN interférents. Il a donc découvert 22 gènes que
lorsque leur expression est réduite par petits ARN interférents, il y a une hausse de la
capacité métastatique des cellules faiblement métastatiques B16-F0, sans affecter la
croissance de la tumeur primaire64
. Au final, nous avons décidé d’étudier plus en
profondeur en premier le gène Gas1, car il est le gène le plus réprimé entre les lignées
cellulaires B16-F0 et B16-F10.
4.1.1. Gas1 est réprimé chez les lignées cellulaires métastatiques murines B16-
F10
En premier lieu, afin de confirmer les résultats obtenus précédemment64
, nous avons
comparé les niveaux d’expression du gène Gas1 entre les lignées cellulaires B16-F0 et
B16-F10 par PCR quantitative. Tel qu’escompté, la figure 6A montre que l’expression de
Gas1 est 22 fois plus forte chez la lignée faiblement métastatique B16-F0 que celle
56
fortement métastatique B16-F10. Ce résultat coïncide avec d’autres études démontrant
l’absence de Gas1 chez les cellules les plus agressives ou métastatiques au sein du cancer
de la prostate21-31
, du cancer de la thyroïde33
, du cancer colorectal50
et du cancer gastrique57
.
En effet, ces études ont toutes mises en valeur la répression de Gas1 chez les lignées
tumorales démontrant une plus grande capacité à franchir la cascade métastatique.
Par conséquent, la démonstration in vivo que Gas1 puisse supprimer la formation de
métastases64
conjuguée à l’ensemble des données montrant la diminution de Gas1 chez les
cellules agressives permet d’affirmer que certaines cellules métastatiques tendent à
réprimer Gas1 pour parvenir à former les colonies secondaires. En outre, cette information
est importante parce qu’elle permet d’envisager l’utilisation de Gas1 comme moyen
thérapeutique contre la métastase qui cause la majeure partie des décès issus de tumeurs
solides64
. De plus, les publications dévoilant que Gas1 permet l’arrêt du cycle cellulaire2-10-
16-17-45-54-60 et peut induire l’apoptose
11-61-64-66-67, supportent l’idée d’utiliser Gas1 comme
outil thérapeutique. Également, Gas1 a été utilisé comme biomarqueur de la progression
tumorale33-64
. En somme, il est important de poursuivre l’investigation des mécanismes
répresseurs de Gas1, car comprendre la répression de ce gène pourrait permettre de mettre
en place des stratégies visant sa réactivation avec pour but de réduire le pouvoir
métastatique cellulaire.
4.1.2. L'expression de Gas1 est modulable chimiquement par la TSA et le 5-
Aza chez la lignée cellulaire métastatique murine B16-F10
Nous avons décidé de débuter l’analyse du mécanisme réprimant Gas1 par une étude de
l’épigénétique. Il existe plusieurs mécanismes de répression d’un gène. Il n’y a qu’à penser
aux modifications des marques d’histones, à la dégradation protéomique, aux délétions et
aux mutations de l’ADN ou encore aux microARNs. Par conséquent, pour nous éclairer sur
la direction à prendre, nous avons vérifié l’aspect du promoteur de Gas1 par séquençage et
par immunoprécipitation de la chromatine chez les cellules métastatiques B16-F10. À la
figure 6B, suite au traitement au bisulfite de sodium, nous avons pu visualiser la
méthylation du promoteur de Gas1 dans la région entre les nucléotides -288 et +59 du site
de départ de la transcription. En effet, le traitement de l'ADN au bisulfite de sodium permet
de vérifier le niveau de méthylation d'îlots CpGs au promoteur des gènes213
. Nous avons
57
donc décelé que cette région était fortement méthylée chez tous nos clones analysés. Tel
que démontré par plusieurs publications214-215
, la méthylation des groupements CpGs des
promoteurs est utilisée pour maintenir l’ADN dans un état d’hétérochromatine. C’est
seulement au moment de la transcription que la région codante du gène devient en état
d’euchromatine et que les groupements CpGs seront déméthylés pour permettre
l’élongation de la polymérase124-125
. Par cette expérience, nous avons commencé à mettre
les premières pièces du casse-tête entourant le mécanisme réprimant le gène Gas1.
Par la suite, nous avons poursuivi l’étude épigénétique en vérifiant les marques
d’acétylation et de méthylation des histones pour en apprendre d’avantage sur le gène
Gas1. Nous avons donc analysé plusieurs marques de répression et d’activation par
immunoprécipitation de la chromatine chez les cellules B16-F10. Parmi celles-ci, il n’y a
pas eu d’enrichissement significatif des marques H3K27me3 et H4K20me3 (résultats non
dévoilés), ni de AcH3 et de la polymérase II totale (Figure 6C). Cependant, nous avons une
forte présence de la marque de répression H3K9me3 (Figure 6C). Ce résultat corrobore avec
la littérature scientifique. En effet, bien qu’il existe plusieurs mécanismes de répression
génique, l’arrêt de la transcription par la marque H3K9me3 est fréquent lorsque le gène est
maintenu en hétérochromatine116-126-128
. Pour sa part, Nestorov (Nestorov 2013) croit que
les deux mécanismes de répression H3K9me3 et H3K27me3 sont mutuellement exclusifs127
.
Dans cette optique, il apparait tout à fait logique que nous n’ayons pas trouvé la marque
H3K27me3 au promoteur du gène Gas1. Bien que rien n’indique que la marque de
répression H4K20me3 ne pourrait pas être présente en plus de celle H3K9me3129
, nous
n’avons décelé que très peu sa présence chez Gas1. D’autre part, il est également normal de
retrouver faiblement les marques d’acétylation sur l’histone trois d’un gène à l’état
d’hétérochromatine115-117-122
, tout comme la présence de la polymérase II128
. À la lumière
de ces résultats, il est maintenant possible d’affirmer que le gène Gas1 est réprimé chez les
cellules B16-F10 par des groupements méthyles au niveau de l’ADN, mais également au
niveau de l’histone 3 à la lysine 9.
Le remodelage de la chromatine est un processus biologique très important. En effet, par
l’intervention d’acteurs clés comme les HATs, les HDACs, les DNA methyltransférases ou
les HMTs, les modifications épigénétiques peuvent être préservées entre les générations
cellulaires118-122-130
. Chez les cellules tumorales, l’expression aberrante de HDACs est très
58
fréquente130
. Par conséquent, plusieurs inhibiteurs de HDACs ont été créés pour faire face
au cancer comme la TSA, le SAHA ou le Depsipeptide132
. Partant de ces faits et pour
obtenir une réponse plus précise du mécanisme réprimant le gène Gas1, nous avons traité
les cellules B16-F10 avec l’inhibiteur TSA (figure 7A). Le résultat démontre qu’il y a une
augmentation de l’expression de Gas1 de 10 fois par rapport aux cellules non-traitées. Cette
expérience illustre bien l’implication des histones déacétylases pour empêcher la
transcription de Gas1. Cependant, il est important de souligner que la TSA est un inhibiteur
de HDACs de classes I et II seulement133
. L'expérience ne démontre donc pas l'implication
d'HDACs des classes III et IV. D’ailleurs, il a été publié que la TSA pouvait inhiber la
répression des gènes p15139
, p21140-141
ou p27141
, des gènes impliqués dans le contrôle du
cycle cellulaire comme Gas1. Plus précisément, nous avons utilisé des petits ARN
interférents contre certains HDACs de la classe I et II, soit HDAC1, HDAC2 et HDAC7. Il
est possible de voir à la figure 7B qu’il n’y a pas de variation par rapport au contrôle, sauf
quand le cas de hdac1. Par contre, l’élévation de l’expression de Gas1 n’est pas aussi
prononcée qu’avec l’inhibiteur TSA. La diminution de l’expression de hdac1 par le shRNA
utilisé n’est peut-être pas suffisante pour produire un effet plus concluant sur l’expression
de Gas1. Ce résultat pourrait être significatif, l’expérience pourra être essayée à nouveau,
mais également avec plus d’un petit ARN interférent pour en valider sa pertinence. En
somme, ce résultat semble classique, puisque le lien entre la TSA et Hdac1 a déjà été établi
chez plusieurs cancers humains134
. Il est donc possible de croire que les histones
déacétylases jouent un rôle dans la répression du gène Gas1 chez les cellules B16-F10, au
sein d’un complexe moléculaire beaucoup plus grand.
D’ailleurs, des publications ont déjà démontré la dynamique entre les HDACs et les DNA
méthyltransférases135
, en plus de leur association avec la marque de répression H3K9me3124
.
Or, il existe également des inhibiteurs de DNA méthyltransférases comme le 5-Aza ou le
Zebularine ayant été testés in vivo ou même en phase clinique136-137
. Pour le 5-Aza, il a été
publié qu’il pouvait induire l’expression des gènes p14142
, p21 ou p16143
, impliqué dans le
contrôle du cycle cellulaire. Ainsi, afin d'étudier l’épigénétique du promoteur de Gas1,
nous avons traité les cellules B16-F10 avec du 5-Aza (figure 7A). Il est possible
d’apercevoir une hausse de l’expression du gène Gas1 de 7,5 fois par rapport au contrôle,
illustrant l’implication de DNA méthyltransférases dans sa répression. Pour persévérer dans
59
cette direction, nous avons réduit l’expression des trois principaux dnmts, soit Dnmt1,
Dnmt3a et Dnmt3b par petits ARN interférents. Illustré à la figure 7C, l’expérience
démontre qu’il n’y a que très peu de changement de l’expression du gène Gas1, malgré une
efficacité de réduction de l’expression des Dnmts d’au moins 50%. Ce résultat n’est pas
surprenant, puisqu’il a été publié que les Dnmts peuvent avoir des rôles redondants138
. Dans
les prochaines expériences, il faudra donc utilisé un vecteur permettant de supprimer deux
Dnmts à la fois pour vérifier lesquels sont réellement impliqués. Bien que les familles
HDAC et DNMT soient impliquées dans la répression de GAS1, le complexe répresseur
comporte assurément d’autres joueurs importants.
4.1.3. Cbx1 est impliqué dans la répression du gène Gas1 chez la lignée
cellulaire métastatique murine B16-F10
Ayant découvert des marques de répression H3K9me3 chez le gène Gas1, nous avons
formulé l’hypothèse que la famille de protéines HP1 pouvait jouer un rôle important dans le
maintient de l’ADN en hétérochromatine via la stabilisation des marques de répression
H3K9me3. En effet, il a été démontré que les trois isoformes du gène HP1, soit Cbx1, Cbx3
et Cbx5, pouvaient se lier à la marque de répression H3K9me3 par leur chromodomaine127-
144 et participer à la répression génique
127-145. De plus, il a été publié que ces trois isoformes
pouvaient avoir un rôle redondant144
. Nous avons donc réduit l’expression de Cbx1 (Figure
8A), Cbx3 et Cbx5 (Figure 8B) par petits ARN interférents et vérifier l’effet sur
l’expression du gène Gas1 chez la lignée métastatique B16-F10. Nous avons démontré
qu’il y avait une hausse moyenne de l’expression de Gas1 de 5,5 fois par rapport au
contrôle entre les deux petits ARN interférents testés contre Cbx1. Par ailleurs, il y a une
augmentation moyenne de 2,25 fois de l’expression de Gas1 suite à la transduction contre
Cbx5. Cependant, il faudra refaire l’expérience pour s’assurer de l’exactitude du résultat.
Par contre, il n’y a pas eu de changement par la transduction de petits ARN interférents
contre Cbx3. En somme, nous pouvons maintenant dire que Cbx1 est impliqué dans la
répression du gène Gas1 chez les cellules B16-F10. Il faudra donc utiliser une
immunoprécipitation de la chromatine pour confirmer son rôle direct dans la régulation de
Gas1.
60
Dans la même lancée, nous avons cherché à découvrir d’autres joueurs impliqués dans la
répression du gène Gas1. Nous avons donc vérifié la participation d’histones
méthyltransférases, soit Setdb1, Ehmt2, Suv39h1 et Suv39h2. Ces quatre membres de la
famille KMT ont été démontrés comme des acteurs importants du mécanisme de répression
H3K9me3/HP1127-150
. L’interaction entre Suv39h1, Hp1, dnmt3a et dnmt3b a déjà été
illustré146
, ainsi que celui entre Suv39h1 et hdac1147
ou Suv39h1, Hp1, Ehmt2 et dmnt3a148
.
Suv39h1 a même été associé à la répression de l’E-cadherin, un autre gène suppresseur de
métastases, chez le cancer du sein149
. Pour sa part, l’étude de Suv39h2 est très récente.
Malgré tout, il a été dévoilé qu’une ablation de Suv39h1, Suv39h2 ou les deux n’était pas
létale chez la souris, mais il y avait tout de même des problèmes de taille et des troubles
chromosomiques151
. Pour Setdb1, il a été publié que cette histone méthyltransférase pouvait
interagir avec dnmt3a et dnmt3b pour la méthylation de l’ADN de novo152
, mais également
avec Akt153
ou b-raf154
. Finalement, Ehmt2 a été démontré comme partenaire avec
Hdac1155
, avec Jarid1a156
ou Glp156-157
.
Ainsi, par petits ARN interférents, nous avons réduit l’expression des gènes Setdb1,
Suv39h1, Suv39h2 et Ehmt2 chez les cellules métastatiques B16-F10. Il est donc possible
de visualiser à la figure 8B les effets des petits ARN interférents sur le gène Gas1 pour
Setdb1, Suv39h1 et Suv39h2, mais pas pour Ehmt2. En effet, la réduction par petits ARN
interférents des trois premiers gènes a causé beaucoup de morts cellulaires suite à la
sélection, alors qu’avec Ehmt2, toutes les cellules sont mortes. De plus, il n’y a eu aucune
hausse notable de l’expression du gène Gas1, tel qu’attendue, avec toute cette mort
cellulaire. Dans les prochaines expériences, il faudra impérativement utiliser un vecteur
d’expression inductible afin de moduler plus finement l’expression des petits ARN
interférents contre ces quatre gènes. Il pourrait d'ailleurs être intéressant de vérifier si la
mort cellulaire est causée par l'apoptose engendré par Gas1. En somme, il sera obligatoire
de bien démontrer leurs implications, par petits ARN interférents et par
immunoprécipitation de la chromatine, parce qu’il apparait clair que l’une ou plusieurs de
ces protéines peuvent jouer un rôle important dans la répression du gène Gas1 chez les
cellules B16-F10.
D’autre part, nous avons voulu analyser l’implication du gène Cggbp1 et c-Myc dans la
répression de Gas1. En effet, Cggbp1 a été trouvé au promoteur de Gas1 chez les cellules
61
de gliomes humaines U-2987 Mg53
, tandis que c-Myc a été démontré comme régulateur
indirect de Gas1 chez les fibroblastes NIH 3T314
. Pour notre part, nous n’avons trouvé
aucun indice chez les cellules métastatiques B16-F10 du rôle répresseur de Cggbp1 par
petits ARN interférents (Figure 8B), ni pour c-Myc par petits ARN interférents ou même
par immunoprécipitation de la chromatine (Résultats non illustrés). Bien que ces
expériences soient préliminaires, il n’y a aucune indication de leurs implications lors de la
répression du gène Gas1 chez les cellules métastatiques B16-F10.
4.1.4. Gas1 est réprimé chez les lignées cellulaires murines 4T1
Parallèlement, nous avons choisi de valider nos résultats chez un autre type de cancer, celui
du sein. En effet, il a été publié que certains gènes suppresseurs de métastases comme l’E-
Cadherin pouvaient être régulés épigénétiquement chez le cancer du sein149
. Nos avons
donc sélectionné les cellules 67NR faiblement métastatiques et les cellules 4T1 fortement
métastatiques pour faire nos expériences. Pour vérifier notre modèle, nous avons analysé
par PCR quantitative les niveaux d’expression du gène Gas1 entre les deux lignées
murines. À la figure 17A, il est possible d’apercevoir qu’il y a 43 fois plus d’ARNm de
Gas1 chez la lignée 67NR que celle 4T1. Une fois encore, ce résultat semble indiqué que
les cellules métastatiques du cancer du sein répriment Gas1 pour accroître leur potentiel
métastatique.
Pour continuer l’investigation, nous avons effectué le séquençage de l’îlot CpGs du
promoteur de Gas1 chez la lignée métastatique 4T1. Par conséquent, la figure 17B dévoile
que les groupements CpGs sont pratiquement tous méthylés, impliquant donc le rôle
potentiel des dnmts136-137
. De plus, nous avons utilisé l’inhibiteur TSA pour vérifier
l’implication des histones déacétylases dans la répression de Gas1. Tel qu’illustré à la
figure 17C, le traitement des cellules 4T1 augmente l’expression du gène Gas1. Bien que
ces expériences nous indiquent l’implication potentielle des dnmts et des hdacs dans la
répression de Gas1, il faudra effectuer des essais avec des petits ARN interférents et des
immunoprécipitation de la chromatine pour en confirmer le rôle direct. En somme, il est
tout de même plausible de croire que la répression de Gas1 chez la lignée du cancer du sein
4T1 est similaire à celle obtenue chez la lignée de mélanome B16-F10.
62
4.1.5. Conclusion
Pour conclure, nous avons démontré que le gène suppresseur de métastases Gas1 était
réprimé épigénétiquement chez le mélanome métastatique B16-F10. Nous avons également
montré qu’il était possible d’induire l’expression de Gas1 à l’aide de deux inhibiteurs
chimiques, soit la TSA et le 5-Aza. En plus, nous avons prouvé l’implication de la protéine
Cbx1 au sein du mécanisme répresseur. Bien que nous n’ayons toujours pas trouvé les
HDACs, DNMTs ou les KMTs responsables de la répression de Gas1, nous avons tout de
même illustré qu’ils sont forcément impliqués. En outre, nous avons montré que le
mécanisme réprimant Gas1 semble être similaire chez le cancer du sein murin, offrant de
nouvelles voies d’exploration.
4.2. Les lignées cellulaires humaines
Le plus diagnostiqué en Amérique du Nord, le cancer de la peau possède une forme moins
fréquente, mais très agressive, soit le mélanome. En effet, les métastases issues de la
tumeur primaire causeront plus de 80% de décès chez le patient diagnostiqué158-159
. Offertes
par la Dre. MJ Hendrix160-161
, nous avons choisi les cellules faiblement métastatiques C81-
61 et fortement métastatiques C8161 comme modèle d’étude pour découvrir les
mécanismes entourant la répression du gène Gas1 chez le mélanome humain. Ces cellules
sont très intéressantes, puisqu’elles proviennent d’un même patient. De plus, nous avons
utilisé une deuxième lignée de mélanome humain métastatique, les Lox-IMVI, n’exprimant
pas Gas164
, afin de valider certains résultats. Ainsi, avec l’aide de ces outils, nous avons
décidé de poursuivre l’investigation du gène GAS1 chez le mélanome humain, ayant un
impact clinique plus significatif.
4.2.1. GAS1 est réprimé chez les cellules métastatiques de mélanome humain
C8161 et Lox-IMVI
Dans un premier temps, nous avons émis l’hypothèse que le gène GAS1 était régulé
épigénétiquement selon la même approche qu’avec la lignée métastatique B16-F10 chez les
lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI. Tout d’abord, nous avons vérifié les niveaux
d’expression du gène GAS1 par PCR quantitative chez nos trois lignées de mélanome
63
humain, les C81-61, les C8161 et les Lox-IMVI. À la figure 9A, il est possible de voir qu’il
y a environ 250 fois plus d’ARNm chez la lignée faiblement métastatique C81-61, en
comparaison avec les deux lignées fortement métastatiques. Ce résultat permet de croire
que les lignées cellulaires doivent empêcher l’expression de GAS1 pour accroître leur
pouvoir métastatique, tel que démontré également chez le cancer de la prostate21-31
, le
cancer colorectal50
, le cancer de la thyroïde33
ou le cancer gastrique57
. En somme, étant
donné le rôle de frein du cycle cellulaire2-10-16-17-45-54-60
et d’induction de l’apoptose11-61-64-66-
67 du gène Gas1, l’étude de ce gène pour une utilisation thérapeutique est donc très
intéressante.
4.2.2. GAS1 n'est pas régulé par les HDACs ou les DNMTS chez les cellules
métastatiques C8161 et Lox-IMVI
Par la suite, nous avons voulu analyser l’implication des HDACs et des DNMTs lors de la
répression du gène GAS1 chez les lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI. Par
conséquent, nous avons traité ces deux lignées avec l’inhibiteur d’histones déacétylases
(TSA) et l’inhibiteur de DNA méthyltransférases (5-Aza). Étonnamment, il est possible de
constater à la figure 9A (TSA) et 9B (5-Aza) qu’il n’y a aucun effet significatif de ces deux
inhibiteurs sur les lignées C8161 et Lox-IMVI, contrairement aux cellules métastatiques
B16-F10, observées précédemment. Du fait de l’inaction de ces inhibiteurs, il est possible
de croire qu’il n’y a pas d’HDACs des classes I et II et de DNMTs régulant GAS1124-132-136-
137. À la lumière de ces évidences, nous avons conclue que la répression du gène GAS1
procédait par un mécanisme différent chez les lignées C8161 et Lox-IMVI.
Dans l’optique d’approfondir le mécanisme entourant la répression de GAS1 chez les
lignées métastatiques de mélanome humain, nous avons effectué des études épigénétiques
pour vérifier l’acétylation et la méthylation de ce gène. Pour ce faire, nous avons séquencé
le promoteur du gène GAS1 suite au traitement avec le bisulfite de sodium. En comparaison
avec la séquence sauvage, il est donc possible d’affirmer que l’îlot CpGs du gène GAS1 est
faiblement méthylé chez les lignées cellulaires C81-61, C8161 et Lox-IMVI (Figure 10A).
Impliqué lors de la méthylation de l’ADN et de la répression H3K9me3124-135
, nous
pouvons donc conclure que la répression du gène GAS1 utilise un autre mécanisme pour
64
empêcher sa transcription que les DNMTs ou les HDACs. Bref, un autre complexe
moléculaire répresseur semble à l’œuvre chez ces lignées cellulaires.
D’ailleurs, pour nous indiquer une direction pour chercher le mécanisme de répression du
gène GAS1, nous avons choisi d’effectuer une immunoprécipitation de la chromatine chez
les cellules C81-61 et C8161 pour vérifier la différence entre les marques épigénétiques de
gène GAS1. Curieusement, à la figure 10B (C81-61) et 10C (C8161), il est possible de
discerner une forte présence de la marque d’acétylation au niveau de l’histone 3, une plus
faible présence de la marque de répression H3K9me3, mais aussi un enrichissement de la
polymérase II totale. Également, nous avons immunoprécipité les marques de répression
H3K9me2, H4K20me3 et H3K27me3, et la marque d’activation H3K36me3 au promoteur de
GAS1, bien qu’en très faible quantité (Résultats non montrés). Cette expérience est
importante, puisqu’elle présente des résultats très différents de ceux obtenus avec la lignée
métastatique B16-F10 et ils nous ont poussé à chercher de nouveaux mécanismes
responsables de la répression du gène GAS1 chez la lignée métastatique C8161. Par
ailleurs, nous avons pu tirer plusieurs conclusions de cette expérience. Tout d’abord, la
faible présence de la marque de répression H3K27me3 nous indique que la répression du
gène GAS1 chez la lignée cellulaire C8161 ne procède pas par le complexe répresseur
PRC2. En effet, ce complexe comprenant notamment les protéines EZH2, SUZ12 et
JARID2, est responsable de la mise en place des groupements méthyles au niveau de la
lysine 27 de l’histone 3126-162
. De plus, nous avons effectué une immunoprécipitation de la
chromatine contre SUZ12 chez les C8161, où il n’y a pas eu d’enrichissement, signe de
l’absence de cette protéine au promoteur de GAS1 (Résultat non illustré). Il est intéressant
de noter que nous avons également vérifié l’implication du complexe répresseur PRC1,
notamment par une immunoprécipitation de la chromatine contre RING1B (Résultat non
montré) et par l’utilisation de petits ARN interférents contre BMI1 (Figure 19A - en
Annexe). Bien que l’immunoprécipitation de RING1B n’ait pas donnée de résultat positif,
la dégradation de l’ARNm de BMI1 par petits ARN interférents a causé une hausse de
l’expression du gène GAS1 chez les cellules C8161. En fait, les deux protéines sont
utilisées dans le complexe PRC1 pour la répression par monoubiquitination H2AK199 et
recrutées par PRC2126
. En outre, il est possible de croire que PRC2 et la marque de
répression H3K27me3 ne jouent aucun rôle dans la répression de GAS1 chez la lignée
65
métastatique C8161, alors que BMI1 pourra y en avoir un par un autre mécanisme.
D’autres expériences devront donc être envisagées pour connaître son implication.
Ensuite, nous avons examiné l’implication des marques H3K9me2 (Résultat non dévoilé) et
H3K9me3 (Figure 10C) lors de la répression de GAS1. Marques de répression catalysées par
les KMTs, elles sont généralement présentes au niveau de gènes non transcrits127-128
.
Malgré tout, il a été démontré qu’il pouvait exister un équilibre entre les marques
d’activation et de répression au promoteur de Gas1 chez des cellules hépatiques lors des
différents cycles cellulaires et que la transcription du gène dépendait des proportions entre
les marques activatrices et répressives56
. Par conséquent, il apparait probable qu’un tel
équilibre existe entre les marques d’acétylation et de méthylation au niveau du promoteur
de GAS1 chez les cellules C8161, d’autant plus qu’il y a présence d’une forte acétylation
sur l’histone 3 (Figure 10C). Bien qu’il y ait moins de marque H3K9me3 et très peu de
H3K9me2 par rapport à celle d'AcH3, nous avons tout de même cherché à trouver le
responsable de cette méthylation. Pour l’instant, nous avons réduit l’expression du gène
SETDB1, une KMT, par petits ARN interférent (Figure 19A - en annexe), sans observer
d’effet sur le gène GAS1. En somme, bien que les marques H3K9me3 et H3K9me2 sont
présentes en faible proportion au promoteur de GAS1, la forte présence d’acétylation et la
présence de la polymérase nous signale un autre type de mécanisme impliqué dans sa
répression.
Par la suite, la faible présence de la marque H3K36me3 pose de nouvelles interrogations. En
effet, la marque d’H3K36me3 a été régulièrement associée à l’élongation de la
polymérase126
. De plus, il a été démontré que son absence pouvait empêcher la transcription
du gène p21, en induisant une pause transcriptionnelle à l’aide du complexe NELF163
. Étant
donné qu’il y a présence de la polymérase II et qu’il n’y avait pas de marque H3K36me3 au
sein du gène GAS1, nous avons émis l’hypothèse qu’il pourrait s’agir d’une répression par
pause transcriptionnelle. Par conséquent, nous avons dégradé par petits ARN interférents
l’ARNm du gène WHSC2, codant pour une protéine essentielle au complexe NELF, soit
NELF-A, chez la lignée métastatique C8161. À la figure 16D, il est possible de constater
que bien que la répression de l’ARNm de WHSC2 soit supérieure à 50% pour trois petits
ARN interférents testés, il n’y a aucun effet sur l’expression de GAS1. Par ailleurs, il a été
publiée que le complexe NELF requière tous ces composantes pour être fonctionnel164-166
.
66
Nous pourrions donc exclure ce type de mécanisme. Par contre, une autre publication a
illustré par une étude d’ablation des composantes NELF qu’il y avait des gènes pouvant
être augmentés ou diminués en fonction du type de NELF, en plus d’une variation de
l’intensité165
. Nous pouvons donc croire que la dégradation de l’ARNm d’un autre
composant du complexe NELF pourrait avoir un effet sur GAS1. Il apparait d’ailleurs pour
certain que l’un ou l’autre entre NELF et DSIF, un autre complexe responsable de
l’inhibition de l’élongation, pourrait avoir un rôle plus important pour certains gènes ou
tissus167
. À la lumière de ces évidences, il est clair que le mécanisme de répression du gène
GAS1 pourrait dépendre d’une pause transcriptionnelle chez les cellules métastatiques
C8161, induite par les complexes NELF et DSIF. D’autres expériences pourront démontrer
la pertinence de cette hypothèse.
Également, nous avons trouvé très peu de marque H4K20me3, une marque de répression qui
a été associée aux régions d’hétérochromatine129
. Son absence illustre bien l’implication
d’un mécanisme différent pour réprimer le gène GAS1 chez les cellules métastatiques
C8161.
Au final, la forte présence d’acétylation sur l’histone 3 nous dévoile que les lysines 9 et 27
de l’histone 3 sont potentiellement acétylées. De plus, conjugué avec la présence de la
polymérase, il apparait évident que le mécanisme de répression du gène GAS1 implique une
dynamique épigénétique pour empêcher la transcription de son ARNm. Malheureusement,
nous n’avons pas encore vérifié d’autres mécanismes possibles de répression comme
l’absence de phosphorylation sur certain activateur génique, l’acétylation de la marque
H3K4 ou la glycosylation d’histones115
.
Parallèlement, nous avons construit deux vecteurs luciférases exprimant la région 3’UTR
du gène GAS1 (Figure 20 - en annexe). En effet, il a été démontré plusieurs fois que les
microARNs peuvent jouer un rôle majeur dans la régulation des gènes. Par exemple, le
microARN 144 a été illustré comme un promoteur du pouvoir métastatique chez le
carcinome du nasopharynx en réprimant le gène PTEN176
. Nous avons décidé d'étudier cette
possibilité, car il a été démontré qu'il y avait une forte présence du miR-495 chez les
cellules métastatiques C8161, en comparaison avec les cellules faiblement métastatiques
C81-61217
. De plus, avec un outil de détection des sites de microARNs, MiRanda218
, nous
67
avons trouvé qu'il y avait quatre sites possibles pour le miR-495 présents dans la région
3'UTR de GAS1. Nous avons donc effectué un essai luciférase avec les deux constructions,
soit la partie A.1 et la partie B.1 de la région 3’UTR de GAS1 chez la lignée métastatique
C8161. Or, il n’y a pas eu de dégradation d’aucune des deux parties en comparaison avec le
contrôle positif (Figure 11). Nous pourrions donc croire qu’il n’y a pas d’implication des
microARNs chez les cellules C8161, mais d’autres expériences devront être effectué pour
en être certain. Par exemple, il faudra exprimer le microARNs miR-495 en même temps
que les vecteurs exprimant la région 3’UTR de GAS1 afin de bien valider leur implication
chez la lignée C8161.
4.2.3. L’expression du GAS1 est contrôlée par les gènes BRD4 et c-MYC chez
les cellules métastatiques de mélanome humain C8161 et Lox-IMVI
Très abondant chez plusieurs types de cancers, l’oncogène c-MYC est une protéine aux
multiples rôles. Tant activateur que répresseur, il a été démontré qu’elle possédait un
champ d’action grandiose, contrôlant autant la prolifération, l’apoptose et bien d’autres
processus biologiques. Plusieurs publications portaient à croire que c-MYC était impliqué
dans la répression de GAS1, mais sans le démontrer directement. Nous avons donc émis
l’hypothèse que GAS1 pouvait être réprimé épigénétiquement par un complexe moléculaire
comprenant c-MYC chez le mélanome métastatique.
Dans un premier temps, pour valider notre hypothèse, nous avons dégradé l’ARNm du gène
c-MYC chez les lignées cellulaires métastatiques C8161 et Lox-IMVI. À la figure 13A, il
est possible de voir que chez les deux lignées observées et transduites par petits ARN
interférents contre c-MYC, l’expression du gène GAS1 est augmentée en moyenne de 10
fois par rapport au contrôle. De plus, la figure 14B (C8161) et 14C (Lox-IMVI) illustre
l’enrichissement au dessus du contrôle négatif de 4 fois (C8161) et de 2,5 fois (Lox-IMVI)
d’une immunoprécipitation de la chromatine avec un anticorps contre c-MYC au promoteur
du gène GAS1. Pris ensembles, ces résultats prouvent bien la présence et la répression
directe induite par la protéine c-MYC du gène GAS1 chez les mélanomes métastatiques
C8161 et Lox-IMVI. Par ailleurs, ces expériences abondent dans le même sens que la
littérature scientifique, où c-MYC a été régulièrement retrouvé répresseur de gènes
impliqués dans la régulation du cycle cellulaire comme p21104
, p1597
ou GADD15392
. De
68
plus, d’autres évidences démontraient son rôle dans la répression de GAS1, mais
indirectement et chez d’autres lignées cellulaires comme les fibroblastes 3T31-2-14-29
. En
somme, ces résultats démontrent bien le rôle répresseur de c-Myc au gène GAS1.
D’ailleurs, nous avons poursuivi l’investigation en vérifiant la capacité à empêcher la
répression de GAS1 par c-MYC en utilisant l’inhibiteur chimique JQ1. Ce produit est un
composé inhibant le domaine BET de la protéine BRD4, impliqué dans l’activation du gène
c-MYC177
. Par conséquent, la répression de c-MYC devait augmenter les niveaux
d’expression du gène GAS1 chez les lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI. De plus, en
parallèle, nous avons effectué une dégradation de l’ARNm de c-MYC par petits ARN
interférent pour vérifier le potentiel synergique des deux combinaisons. La figure 13B
(C8161) et 13C (Lox-IMVI) nous dévoile qu’il y a belle et bien synergie de l’inhibiteur
JQ1 avec les petits ARN interférent pour la répression de c-MYC, mais curieusement, la
combinaison n’augmente pas plus l’expression de GAS1 en comparaison avec les petits
ARN interférent contre c-MYC seul. Or, la synergie avec JQ1 provoque au contraire une
légère diminution de l’expression de GAS1. Il nous a donc fallu envisager la possibilité du
rôle activateur de BRD4 au promoteur de GAS1. En effet, plusieurs publications dénotent la
présence de BRD4 comme régulation de la transcription chez les gènes Aurora B168
ou NF-
κB169
. De plus, d’autres articles stipulent la capacité de BRD4 à phosphoryler la sérine 2 de
la polymérase II pour démarrer la transcription170-171
. Bref, il s’avèrerait plausible que
l’expression de GAS1 soit contrôlée par c-MYC et par BRD4.
Dans l’optique de valider cette nouvelle hypothèse, nous avons utilisé l’inhibiteur JQ1 pour
empêcher la liaison de BRD4 au promoteur de GAS1 chez la lignée faiblement métastatique
C81-61. Or, la figure 12A divulgue qu’il y a bien une diminution de l’expression de GAS1
de plus de 80% chez les cellules C81-61 traitées avec l’inhibiteur JQ1. Nous avons donc
poursuivi en diminuant la présence de BRD4 par petits ARN interférent. Concordant avec
la première expérience, l’expression de GAS1 est bien réduite avec deux des trois petits
ARN interférents testés (Figure 12B). Pour finaliser le tout, nous avons effectué une
immunoprécipitation de la chromatine contre la protéine BRD4 au promoteur de GAS1
chez la lignée faiblement métastatique C81-61 et démontré sa présence (Figure 12C), mais
également chez la lignée métastatique C8161 (Figure 14C), prouvant son implication direct
69
dans l’activation du gène GAS1. Ces expériences nous ont bien illustré le rôle de BRD4
dans la promotion de la transcription de GAS1.
D’une part, nous avons voulu établir le complexe répresseur entourant l’oncogène c-MYC
lors de la régulation de GAS1. Il a été régulièrement démontré dans la littérature que MIZ1
et MAX pouvaient être des partenaires de c-MYC lors de la répression92-97
. Dans ce
contexte, nous avons utilisé l’inhibiteur 10058-F4, un composant empêchant la liaison entre
MAX et c-MYC, pouvant réduire leur potentiel répressif. En effet, ce produit a déjà été
publié pour empêcher la répression des gènes p21 et p27172
. À la figure 15A, il est possible
de voir que le gène p21 est effectivement plus exprimé en présence de l’inhibiteur de c-
MYC/MAX, mais ce n’est pas le cas de GAS1 chez la lignée métastatique C8161. Pour être
certain, nous avons tout de même réprimé par petits ARN interférents le gène MAX (Figure
15B). Une fois encore, l’expression de p21 est augmentée pour l’un des petits ARN
interférents, mais pas les deux autres. Par contre, il n’y a toujours aucun changement pour
notre gène d’intérêt, GAS1. Fait intéressant, il y a également une hausse de l’expression du
gène C/EBPδ, indiquant potentiellement une répression MAX/MAD, plutôt que c-
MYC/MAX/MIZ195-99
pour celui-ci. Pour clore l’investigation, nous avons dégradé
l’ARNm du gène MIZ1, impliqué dans le complexe de répression avec c-MYC et MAX104
.
Bien que l’expression du contrôle p21 soit augmentée, ce n’est pas le cas pour GAS1
(Figure 15C). À la lumière de ces évidences, il est donc possible d’affirmer que le gène
GAS1 est réprimé épigénétiquement par c-MYC chez la lignée cellulaire métastatique
C8161, mais sans la participation des facteurs de transcription MAX ou MIZ1.
Dernièrement, un article avait publié pour la première fois un nouveau complexe répressif
avec c-MYC, impliquant les protéines KDM5B et TFAP2C105
. Pour valider cette
possibilité, nous avons donc réduit le niveau d’ARNm de ces deux gènes chez la lignée
métastatique de mélanome C8161 par petits ARN interférents. Or, à la figure 16A, il est
possible de constater que la diminution de l’expression de ces deux gènes ne provoque pas
ou peu d’augmentation du niveau d’ARNm de GAS1. Nous avons donc exclue ce type de
mécanisme de répression chez la lignée C8161 pour le gène GAS1.
Dans un autre ordre d’idée, plusieurs publications ont démontré la voie TGF-β comme
stimulateur de la progression tumorale173-174
. Nous avons donc émis l’hypothèse que la
70
répression de GAS1 pouvait être issue de cette voie de signalisation. Pour le vérifier, nous
avons donc dégradé par petits ARN interférents divers acteurs de cette voie, soit SMAD2,
SMAD3, SMAD4 et TGFβRII (Figure 19B - en annexe). Malheureusement, aucune des
expériences n’a eu d’incidence sur l’expression du gène GAS1 chez la lignée cellulaire
C8161. La répression de GAS1 passe donc par une autre voie de signalisation chez cette
lignée de mélanome.
Pour finir, nous avons voulu examiner la possibilité d’un contrôle du gène GAS1 chez la
lignée cellulaire C8161 par un mécanisme employant les isolateurs CTCF. En effet, le
mécanisme utilisant les PARPs, la PARG et les isolateurs CTCF peut réguler les gènes en
activant ou réprimant ceux-ci comme illustré pour le gène RARRES1175
. Ainsi, les
isolateurs CTCF se lient aux régions hypométhylées, empêchent la prolifération
d'hétérochromatine et facilitent la transcription génique216
. Dans certains cas, les PARPs
peut favoriser cette transcription par PARylation de répresseurs comme DNMT1,
empêchant la méthylation de ces promoteurs actifs216
. Par conséquent, nous avons utilisé un
inhibiteur de PARP-1 et de PARP-2, l’ABT-888. Ces PARPs pouvaient être responsables
de l’activation génique avec les isolateurs CTCF en inhibant DNMT1178
, chez la lignée
faiblement métastatique C81-61. À la figure 16B, il est possible d’observer que l’utilisation
de ce composé réduit l’expression du gène GAS1 de 60%. Il est donc envisageable de croire
en l’implication de ce type de mécanisme comme répression de GAS1 chez la lignée C81-
61. Cependant, la dégradation par petits ARN interférents du gène de la PARG chez la
lignée fortement métastatique C8161 n’induit pas d’expression de GAS1 (Figure 16C), mais
réduit plutôt son expression. En effet, la PARG élimine les poly (ADP-ribose) mis en place
par les PARPs, permettant la prolifération d'hétérochromatine par des protéines comme les
DNMTs182
. Il pourrait donc être possible que la dégradation de l'ARNm de la PARG permet
la prolifération de l'hétérochromatine, réduisant encore plus l'expression de GAS1 chez la
lignée métastatique C8161. En somme, nous avons conclue que le mécanisme de répression
du gène GAS1 chez les cellules C8161 utilisait un autre procédé que la PARG.
4.2.4. Conclusion
En conclusion, bien que la dynamique entre l’activation et la répression génique reste très
complexe, il est possible d’affirmer que chez notre modèle cellulaire C81-61 et C8161, la
71
répression du gène GAS1 est très différente de celle retourné chez les cellules B16-F0 et
B16-F10. Dans un premier temps, le promoteur de la lignée C8161 est dans un état ouvert
avec une forte présence d’acétylation et une plus faible présence de la polymérase II. En
plus, nous avons démontré l’implication lors de la répression de GAS1 de l’oncogène c-
MYC, sans toutefois identifier ses partenaires. Par conséquent, un mécanisme de pause
transcriptionnelle pourrait être une possibilité intéressante, dans l’optique où c-MYC
pourrait empêcher le recrutement de facteurs de transcription responsables de la
méthylation de marques d’élongation comme H3K36me3. En somme, il serait intéressant
lors des prochaines expériences d’analyser l’implication de gènes de la famille HMTs pour
élucider ces perspectives.
72
73
5. Conclusion générale et perspectives
Depuis quelques années, le cancer est devenu la première cause de décès en Amérique du
Nord. Dans 90% de ces décès, ce sont les métastases issues d’une tumeur primaire solide
qui en seront responsables. Il est donc impératif d’accroître les outils thérapeutiques pour
combattre cette pathologie.
Pour notre part, nous avons choisi d’étudier la régulation transcriptionnelle du gène
suppresseur de métastases Gas1 dans l’optique de freiner la capacité métastatique des
cellules tumorales. Dans un premier temps, nous avons démontré que Gas1 n’était pas
exprimé chez les cellules métastatiques, autant chez les cellules murines B16-F10 que chez
les cellules humaines C8161 et Lox-IMVI. De plus, nous avons illustré que le mécanisme
de répression de Gas1 chez les B16-F10 utilisait la méthylation d’histones et d’ADN grâce
aux Hdacs et Ddnmts. De plus, nous avons prouvé l’implication de la marque de la
répression H3K9me3 et des protéines associées HP1.
Dans un deuxième temps, nous avons montré que le mécanisme de répression du gène
GAS1 chez les cellules métastatiques humaines C8161 et Lox-IMVI utilisait un processus
différent des cellules B16-F10. En effet, nous avons dévoilé qu’il y avait très peu de
marque de répression, mais plutôt une forte présence des marques d’activation et même la
présence de la polymérase II. Également, nous avons démontré l’implication de l’oncogène
c-MYC et du facteur de transcription BRD4 pour la régulation de GAS1 chez les C8161.
Nous avons finalement émis l’hypothèse que sa répression pourrait être basée sur une pause
transcriptionnelle induite par la déméthylation d’histones impliquées dans l’élongation. Un
schéma récapitule ces découvertes à la figure 18. Finalement, nous avons découvert que le
gène Gas1 n’est pas présent chez les cellules métastatiques 4T1, ouvrant une nouvelle voie
vers le cancer du sein.
74
En perspective, il serait intéressant de poursuivre les découvertes entourant la régulation du
gène Gas1 chez la lignée métastatique B16-F10. Par exemple, l'utilisation de petits ARN
interférents contre les Dnmts ou du 5-Aza, suivi d'un séquençage d'ADN traité au bisulfite
de sodium pourrait démontrer directement leur implication. Pour palier leur rôle redondant,
il serait également intéressant d'effectuer des dégradations de plus d'un Dnmt à la fois. En
plus, l'utilisation d'un vecteur inductible pour vérifier l'implication des KMTs serait efficace
pour réduire la mort cellulaire afin d'observer l'effet sur le gène Gas1 chez la lignée B16-
F10.
Pour les lignées métastatiques humaines, il serait stimulant de poursuivre l'implication des
facteurs de transcription c-MYC et BRD4 par des dégradations par petits ARN interférents
en même temps que des immunoprécipitations de la chromatine. L'étude plus en profondeur
des membres de la famille HMTs serait une future avenue pour découvrir les mécanismes
de régulation du gène GAS1 chez les lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI. En effet, la
marque d'élongation H3K36me3 est absente du gène GAS1 chez ces cellules.
Avec ces nouvelles évidences, il est maintenant possible de mieux comprendre les
mécanismes entourant la répression de Gas1 chez les cellules métastatiques. Chez ces
75
cellules, Gas1 semble réprimer tout comme d'autres gènes impliqués dans la régulation du
cycle cellulaire, tel que p21 ou p15. Au niveau protéique, Gas1 a été démontré comme un
récepteur pouvant induire l'arrêt de la croissance cellulaire, mais également l'apoptose via
des partenaires comme Ret et les GFRs. Bien que d’autres expériences devront être
effectuées pour augmenter les connaissances de Gas1, il est dès maintenant envisageable
d’utiliser ce gène comme outil thérapeutique contre la métastase. Par exemple, Gas1 a déjà
été utilisé pour induire l'apoptose chez des cellules d'un gliome65
. Il pourrait également être
intéressant d'induire l'expression de Gas1 chez des cellules métastatiques afin de réduire
leur expansion ou même les éliminer par apoptose.
76
77
6. Références
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suppression, Cell 1992, 70 : 595-607.
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sensitive method for monitoring changes in higher order chromatin structure
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suppressing human homologue of the murine gas1 gene, PNAS 1994, 91(5): 1848-
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5- Rhodes, N. et al. : v-mos-transformed cells fail to enter quiescence but growth
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7. Annexes
7.1. Annexe un - Candidats criblés par petits ARN interférents
98
99
7.2. Annexe deux - Séquence des constructions 3'UTRhGAS1-A.1 et
B.1
100
101
7.3. Annexe trois - Liste des produits, des anticorps et des amorces
utilisés
Tableau 1 : Liste des produits utilisés Numéro Produit Compagnie Catalogue
A1 DMEM Sigma-aldrich D5648
A2 FBS Sigma-aldrich F6178
A3 F10-HAM Sigma-aldrich N6635
A4 Mito+ BD Biosciences 355006
A5 RPMI 1640 Gibco 11875119
A6 Hepes Sigma-aldrich H4034
A7 MEM Sigma-aldrich M7145
A8 NCS Sigma-aldrich N4639
A9 L-glutamine Sigma-aldrich G3126
A10 Pénicilline/Streptomycine Sigma-aldrich P4333
Numéro Produit Compagnie Catalogue
B1 TSA Cell Signaling 9950
B2 5-Aza Calbiochem 189825
B3 Inhibiteur de c-Myc Calbiochem 475956
B4 JQ1 Biovision 2070-01-01
Numéro Produit Compagnie Catalogue
C1 Pétri de 100 mm Fisher Scientific 12556002
C2 Solution de lyse Sigma-aldrich L8285
C3 Colonne de filtration Sigma-aldrich C9346
C4 Colonne d'attachement de l'ARN Sigma-aldrich C9471
C5 Solution de lavage I Sigma-aldrich W3136
C6 DNAse I sur colonne Sigma-aldrich DNASE70-1SET
C7 Solution de lavage II Sigma-aldrich W3261
C8 solution d’élution Sigma-aldrich E8024
Numéro Produit Compagnie Catalogue
D1 Mélange d'amorces d'hexamètres et
d'ancres poly-dT
New England
Biolabs S1330S
D2 Transcriptase inverse New England
Biolabs M0253L
D3 Tampon de transcriptase inverse New England
Biolabs B0253S
102
D4 Inhibiteur de RNAses New England
Biolabs M0307S
Numéro Produit Compagnie Catalogue
E1 Green-2-Go Sybr Green Bio Basic Inc. QPCR004-S
E2 Plaque de qPCR 96 puits Thermo
Scientific AB-0700
E3 Film collant pour plaque qPCR 96
puits BIO-RAD MSB1001
Numéro Produit Compagnie Catalogue
F1 Pétri de 150 mm Fisher Scientific 12556003
F2 Formaldéhyde Sigma-Aldrich F8775
F3 Glycine Sigma-Aldrich G8898
F4 Tube 1.5 ml Axygen MCT-150-C
F5 NaCl Sigma-Aldrich S7653
F6 Tris Fisher Scientific BP152-1
F7 Hcl J.T.Baker 9535-02-01
F8 EDTA Sigma-Aldrich E4884
F9 NP-40 Fluka 74385
F10 Triton X-100 ICN
Biomedicals Inc. 807426
F11 PMSF Sigma-Aldrich P7626
F12 Leupeptine Sigma-Aldrich L8411
F13 Sonicateur Sonic Dismembrator Fisher Scientific Modèle 60
F14 Sonde 1/8 Fisher Scientific 15338253
F15 Tube 15 ml Sarstedt 62.554.205
F16 Billes d’agarose A Genscript L00210
F17 Billes d’agarose G Genscript L00209
F18 Chelex-100 BIO-RAD 142-1253
F19 Protéinase K Sigma-aldrich P2308
F20 Acide acétique glacial Sigma-aldrich 695084
F21 Échelle de 100 paires de bases New England
Biolabs N3231S
Numéro Produit Compagnie Catalogue
G1 Pfu ADN polymérase Phire II Finnzymes F-122S
G2 Tampon de Phire II Finnzymes F-524
G3 dNTP Omega P01-01, P02-01,P03-
01 et P04-01
G4 DMSO Finnzymes F-515
G5 Taq polymérase Qiagen 1032502
G6 Tampon de Taq polymérase Qiagen 1005479
103
G7 MgCl2 Qiagen 1005482
G8 échelle de 1000 paires de bases New England
Biolabs N3232S
G9 Tampon QX1 Qiagen 20912
G10 Tampon QX2 Qiagen 20902
G11 Tampon PE Qiagen 19065
G12 Tampon 1 New England
Biolabs B7001S
G13 Tampon 2 New England
Biolabs B7002S
G14 Tampon 3 New England
Biolabs B7003S
G15 Tampon 4 New England
Biolabs B7004S
G16 BSA New England
Biolabs B9001S
G17 Tampon de la alcaline phosphatase New England
Biolabs B7003S
G18 Alcaline phosphatase New England
Biolabs M0290S
G19 Ligase T4 et son tampon New England
Biolabs M2029S
G20 Milieu LB Fisher Scientific BP1426500
G21 Glycérol Fisher Scientific BP229-4
G22 Solution I Bio Basic Inc. BS614
G23 Solution II Bio Basic Inc. BS614
G24 Solution III Bio Basic Inc. BS614
G25 Colonnes Bio Basic Inc. BS423
G26 Solution de resuspension Sigma-Aldrich R1149
G27 Solution de lyse Sigma-Aldrich L1912
G28 Solution de neutralisation Sigma-Aldrich N1285
G29 Solution d'attachement Sigma-Aldrich B4683
G30 Seringues Sigma-Aldrich G8917
G31 Colonnes Sigma-Aldrich G4792
G32 Solution de lavage I Sigma-Aldrich W0263
G33 Solution de lavage II Sigma-Aldrich W4639
G34 Solution d'élution Sigma-Aldrich E7777
Numéro Produit Compagnie Catalogue
H1 DNAzol Invitrogen 10503-027
H2 NaOH Fisher Scientific S318-1
Numéro Produit Compagnie Catalogue
104
I1 Tampon de dilution Zymo Research D5001-2
I2 Bisulfite de sodium Zymo Research D5001-1
I3 Colonnes Zymo Research C1004-50
I4 Solution de lavage Zymo Research D5002-4
I5 Tampon de désulphonation Zymo Research D5001-5
I6 Solution de lavage Zymo Research D5002-4
I7 Solution d'élution Zymo Research D5001-6
Numéro Produit Compagnie Catalogue
J1 Acétate de sodium Matlab Sr-0190
J2 PEI Polysciences 23966-2
J3 Puromycine VWR CA80503-312
Numéro Produit Compagnie Catalogue
K1 SDS Fisher Scientific BP166-500
K2 Bleu de bromophénol Alfa Aesar 115-39-9
K3 β-mercaptoéthanol Sigma-Aldrich M7522
K4 Plaque blanche 96 puits BD Biosciences 353296
K5 Bradford BIO-RAD 500-0114
K6 Membrane de nitrocellulose Life Sciences P/N 66485
K7 Solution d'ECL GE Healthcare W398390
Numéro Produit Compagnie Catalogue
L1 Tampon de lyse passif Promega E1941
L2 Solution de luciférase et de renilla Promega E1910
Tableau 2 : Liste des anticorps
Nom Compagnie Numéro
AcH3 Millipore #06-599
H3K9me3 Millipore #05-1250
BRD4 Abcam #5716-1
c-MYC Santa Cruz Technology #sc-764
IgG Genscript #A01007
Suz12 Millipore #17-661
105
Tableau 3 : Liste des amorces Nom Forward Reverse
ChIP
pGAS1 TTA AAG CCT CGC TGC
TAA CG
GCG GGG AGA ACA AGA
AAG TC
pGAPDH CGG CTA CTA GCG GTT
TTA CG
AAG AAG ATG CGG CTG
ACT GT
pRHAG TTA CAA CAC AGC CAC
CTC CA
ATG TTT TGG AAA CGG
CAA TC
pgas1 GCC TCT CTC ATC CTG
TGA GG
GGA CTG TCC ACC TCT
CCA AA
qPCR humain
U6 CTC GCT TCG GCA GCA
CA
AAC GCT TCA CGA ATT
TGC GT
hGAS1 TGG GAC AGA TAG AAG
GGA TGG TT
ACC GGC TAC ACC AAG
TTG ACT T
hCMYC TTC GGG TAG TGG AAA
ACC AG
CAG CAG CTC GAA TTT
CTT CC
hMAX GGC AAG AAG ACC TGA
TTG GA
CTG CAA ATC TGT CCC
CAC TT
hZBTB17 AAG CCC TAC CAG TGC
GAC TA
TCA GCG ATG TGG ATC
TTC AG
hCDKN1A GCG ACT GTG ATG CGC
TAA T
GTC ACC CTC CAG TGG
TGT CT
hCEBPd ACA TAG GAG CGC AAA
GAA GC
CCT TAG CTG CAT CAA
CAG GA
qPCR murin
mgas1 GCG AAT CGG TCA AAG
AGA AC
CGC TGC TGC TCG TCA
TAT T
mdnmt1 TGA GGA AGG CTA CCT
GGC TA
GTC TGC CAT TTC TGC
TCT CC
mdnmt3a ACC AGG CCA CCT ACA
ACA AG
GCT TGT TCT GCA CTT
CCA CA
mdnmt3b GGT GTG AGG GAT ACG
AAG GA
GAG GAA CTA GGG GGT
TCT GG
106
107
7.4. Annexe quatre - Vecteurs d'expression
108
109