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Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon-CRCLINSERM U1052-CNRS UMR 5286. France
Muriel Le Romancer
La signalisation non génomique des œstrogènesdans les cancers du sein
39èmes journées de la Société française de Sénologie et de pathologie mammaire
8 novembre 2017, Lille
Pas de Conflit d’intérêts à déclarer
Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon-CRCLINSERM U1052-CNRS UMR 5286. France
Muriel Le Romancer
39èmes journées de la Société française de Sénologie et de pathologie mammaire
8 novembre 2017, Lille
E2/ER et cancer du sein
Les oestrogènes sont impliquées dans le développement du cancer du
sein.
70% des tumeurs sont ERα-positive: ERα est un marqueur pronostic et
une cible thérapeutique.
Cependant,environ 50% des patientes sont ou deviennent résistantes aux thérapies endocriniennes
Agents bloquant la synthèse (anti-aromatases) ou les effets
des oestrogènes (anti-oestrogènes).
Signalisation des oestrogènesSignalisation des oestrogènes
Growth factors
Chemokines
Hsp90
ER
Hsp90
Prolifération Survie cellulaire
ERE RE ERE
ERE2E2
E2
E2
ER
ERE2
E2
ER
ERE2
E2
CoRegER
ERE2
E2
CoReg
TFP
ERER
P
RE
TF
CoReg
MAPK
ERER
PP
RTK PI3KSrc
Akt
ERα
ERαE2
E2
ERα
E2
Ras
ERK1/2
Facteurs de croissance
Le Romancer M et al, Endo Rev., 2011
C4
47
PATLocalisation
à la membrane plasmique
EGFR,P56lck,p60c-src
R26
0
PRMT1 Me
S10
6S1
04
DBD LBD AF -2AF -1 HingeERα
P PP PPP P PP P PP PP
S30
5
P
Y53
7
T311
S29
4
S28
2
S10
2
S11
8
S154
S16
7
S23
6
S559
Y52
Y21
9
c-Abl GSK3
CyclinA-Cdk2
MAPK
Cdk7IKKα
MAPK
MAPK
ND
AktS6K1RSKAkt
* *
ND**CK2
PKA
c-Abl* p38 MAPK
Loca
lisat
ion
n
ucl
éai
re
AktPKAPak1
*
*CK2
Calf uterine kinase,p60c-src
**
*
K2
66
K2
68
K29
9
K30
2
K30
3
Ub
Me
Ac
Ub
SUMO-1
p300**
*Ubiquitin
Set7
Dégradation protéosomal
Stabilité
SUM
O
SUM
O
SUM
O
SUM
O
SUM
O
Ac Ac Ac Ac
P
Me
Ub
SUMO
Ac
: palmitoylation: ubiquitinylation
: sumoylation : méthylation
: acétylation : phosphorylation* : transcription
Le Romancer M, Poulard C et al., Endocr Rev., 2011
Les modifications post-traductionnelles de ERa
ERa est un nouveau substrat de PRMT1
ER
2631 180 302 553 595
R G G
260 261 262
ERa
0 5’ 15’ 60’ 24h
ERa
MCF-7 cells
input
Temps (E2)
IP : anti- mERα
A/B C D E F
AF-1 DBD Hinge LBD
Le Romancer et al, Mol Cell,2008
AdoMet
+ +- -
+ +- -
+ + - -
Coloration Coomassie
WB: anti-Met-ERa
GST- ER251-305
GST-ER251-305(R260A)
R G G
555 556 557
Anticorps spécifique de metR260
Le Romancer et al Mol Cell, 2008
Le Romancer et al,Steroids,2010
Teyssier, Le Romancer,TEM, 2010
Le Romancer et al,Endocrine rev 2011
metERa est un prérequis pour la signalisation non genomique
E2
ERa
ERa
Akt activation
PRMT1E2 (5 min)
ERa
ERa
CH3
ERa
ERa
CH3
Src
P
FAK
P P
PI3K
SrcP
FAK
P P
CH3
PI3K
PI3K
PI3KP
I3K
E2 (15 min)
ERa
ERa
ProliferationSurvie
ERα -ERα+ERα+
55% des tumeurs expriment metERa independemment
de l’expression d’ERa nucléaire
IHC : a
nti-
metE
Rα
164 tumeurs
Le Romancer et al., Mol Cell, 2008
Expression de metERa dans le cancer du sein
STRATEGIE: Etudier l’expression de metERα/Src/PI3K et p-Akt dans des tumeurs mammaires.
Outil : Proximity Ligation Assay (PLA)
PI3KSrc
Met
ERα
E2ERα
E2
Est-ce que la signalisation non génomique des
oestrogènes existe in vivo?
ERα/Src/PI3K dans les lignées tumorales (1)
MCF-7 (E2 10-8M )
PI3K
Src
ER Src
ERα/PI3K ERα/Src
ERα/Src/PI3K est localisé dans le cytoplasme
ERα/p300
PLA
ERα/PI3K
ERα/PI3K ERα/Src
ERα/met ERα
PLA
ERα DBD LBD AF -2AF -1 Hinge
HC20metER
Expression de ERα/Src/PI3K dans le sein normal
ERα/PI3K
ERα/PI3K ERα/Src
ERα/met ERα
Dots/cell
ERα/PI3K ERα/Src ERα/metERα
Sample 1 2 2 3
Sample 2 3 3 3
Sample 3 0 0 0
PLA
Expression de ERα/Src/PI3K dans le sein normal
ERα/PI3K ERα/Src ERα/metERα p-Akt
*** p<0.001
PLA IHC
ERα/PI3K 0,79*** 0,75*** 0,29***
ERα/Src 0,73*** 0,30***
ERα/metERα 0,33***
P-Akt
Poulard et al, Embo Mol Med, 2012
Expression de ERα/Src/PI3K dans 175 échantillons tumoraux
ERα/Src interaction
Test (p)0-4 dots/cells (N=79) >4 dots/cells (N=96)
N % N %
Age at diagnosis (years) Chi-2
P = 0.003< 50 16 20.3 40 41.7
>=50 63 79.7 56 58.3
Menopause Chi-2
P = 0.006ND 1 2
No 19 24.4 42 44.7
Yes 59 75.6 52 55.3
Tumor size (mm) Chi-2
P = 0.852< 20 mm 31 39.2 39 40.6
>= 20 mm 48 60.8 57 59.4
Histological grade (SBR) Chi-2
P = 0.3151 17 21.5 15 15.6
2/3 62 78.5 81 84.4
Lymph node involvement Fisher Exact
P = 0.038N0 34 43.0 42 43.8
Micro metastasis 12 15.2 4 4.2
Macro metastasis 33 41.8 50 52.1
Estrogen receptor : % marked cells Chi-2
P = 0.824ND 1 0
< 10% (ERα -) 19 24.4 22 22.9
>= 10% (ERα +) 59 75.6 74 77.1
Progesterone receptor : % marked cells Chi-2
P = 0.834ND 1 0
< 10% 28 35.9 33 34.4
>= 10% 50 64.1 63 65.6
HER2 status Chi-2
P = 0.935ND 9 1
0/+/++FISH- 60 85.7 81 85.3
++FISH+/+++ 10 14.3 14 14.7
CLINICAL P
ARAM
ETERS
175
bre
ast
tu
mo
rs
n=175ERα/Src ERα/PI3K
Poulard et al, Embo Mol Med, 2012
Une forte expression du complexe est associéeà une mauvaise survie des patientes
Confirmation des résultats dans une cohorte de 440 tumeurs mammaires (2001-2003)
Dépourvu des domaines AF-1 et AF-2
Un domaine C-Terminal unique
Localisation cytoplasmique et membranaire
Active la voie MAPK sous E2 et Tamoxifen
Wang et al, BBRC 2005, PNAS 2006
ERa36, un nouveau variant d’épissage d’ER,
acteur de la signalisation non génomique
Génération d’un anticorps anti-ERa-36
Tubulin
ERα
ERα-36
Tumor HBCx-8Tumor HBCx-12A
an
ti-E
Rα
-36
ERα-36
ERα
PR
HER2
Lignée
dérivée
Effet d’E2 sur la croissance tumorale
HBCx12A PDXHBCc-12A cells
Analyse bioinformatique du domaine C-TerminalDomain: D domain pour ERK2
ERa-36 interagit avec Erk2 active
input
GST GST-ERK2
MW
GST
GST-ERK272
55
43
34
26
ER
α-3
6/E
RK
2
0’ 5’
U1026
0’ 5’
E2 5’ E2 0’
E2 5’ E2 0’ E2 15’
E2 (Time)
P-ERK
ERK
ER
α-3
6/E
RK
2
U1026
GST GST-ERK2
Rompre l’interaction ERa-36/ERK2 pour comprendre son rôle
Input
ERα-36*ERα-36
L297A*
GST-ERK2 GST-ERK2
ERα-36*ERα-36
L297A*MW
72
55
43
34
E2 5’ E2 15’
Vecto
rC
TD
CT
D L
297A
E2 0’
ER
α-3
6/E
RK
2
ERK
P-ERK
Vector CTD CTD L297A
0’ 5’ 15’ 0’ 5’ 15’ 0’ 5’ 15’E2 (Time)
Vecto
rC
TD
ERK2/MKP3
E2 0’ E2 5’ E2 15’
CT
D L
197A
a
Vecto
rE
Rα
-36
E2 0’ E2 5’ E2 15’ E2 30’
ERK2/MKP3
P-P
XN
E2 0’ E2 5’ E2 15’
P-E
RK
P-ERK
ERK
PXN
P-PXN
0’ 5’ 15’E2 (Time)
CTD L297A
0’
Cyclin D1
P-PXN
P-ERK
PXN
ERK
5’ 15’ 0’ 5’ 15’ 0’ 5’ 15’
Vector CTD
E2 (Time)
Cyclin D1
P-PXN
P-ERK
PXN
ERK
0’ 5’ 15’ 0’ 5’ 15’
U1026
E2 (Time) 12hr 12hr 12hr 12hr 12hr
La signalisation d’ERa-36 en aval d’ERK dans les cellules
PDX traitées avec E2P
-ER
KP
-PX
NE
R
-36/S
rc
La signalisation d’ERa-36 dans les tissus
Modèle de régulation de l’activation d’ERK
MEK ERK2MPK3
E2
Src
P
E2 5 min
S126
nucleus
Cyclin D1
E2 3 min
P
PXN
ERK2 P
E2 13-15 min
Src
ERα-36
ERα-36
ERα-36
ERα-36
S126P
PXN
E2 12hrE2 7 min
Omarjee et al, Oncogene 2017
ERa-36 est un marqueur de mauvais pronostic dans le cancer du sein
IHC
ER-36
Analysis on 175 operable breast tumors from the Leon Berard Hospital (1999-2001)
Variable ER36 Low No. (%)
ER36 High No. (%)
P value
SBRGrade -Grade1-Grade2-Grade3
13(13.7%)50(52.6%)32(33.7%)
13(20%)21(32.3%)31(47.7%)
P=0.039
Variable ER36 Low No. (%)
ER36 High No. (%)
P value
Metastasis -NoMetastasis-Metastasis
73(76.8%)22(23.2%)
40(61.5%)25(38.5%)
P=0.037
Conclusions
ERα-36 pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique:
ERα-36 active et maintient la voie ERK en inhibant la
déphosphorylation d’ERK par MKP3.
metERα est un prérequis de la signalisation non génomique des
œstrogènes.
ERα/Src/PI3K est un nouveau facteur pronostic du cancer du sein.
Exprimé à la membrane des cellules tumorales et pas des cellules normales
Facteur de mauvais pronostic associé au développement de métastases
Accessible à l’extérieur de la cellule
Pas de ciblage actuellement: les anti-oestrogènes activent ERa-36
Suite des projets…
Ciblage d’ERα-36 en générant un ADC: CovERa36ADC (Covalab,
Villeurbanne).
Déterminer si la valeur pronostique d’ERa-36
est associée à un sous-type, 3ème cohorte.
Ciblage du complexe metERa/Src/PI3K dans des PDXs:
hormonothérapie + inhibiteurs de Src et de PI3K.
(Collaboration avec E. Marangoni, Institut Curie)
Acknowledgements
Olivier Trédan, CLB
Loay Kassem, Le Caire,Egypt
E. Marangoni, Curie, Paris
A. Dejaegere, IGBMC,IllkirchY. Chebaro
A BA B
PLA probe minus
PLA probe plus
A B A B
Proximity Ligation Assay (PLA)
Non genomic partners of ERaE
Rα
-36/S
rcE
Rα
-36/P
I3K
E2 0’ E2 5’ E2 15’
Src PI3K ERα-36