La génomique

7/23/2019 La gnomique

1/21

La gnomique: les outils utiliss enbiologie molculaire

Sommaire

Introduction" 2I. Les outils utiliss en biologie molculaire " 3

I.A. Les enzymes de restrictions! 3I.B. Le clonage et la construction de banque! 3I.C. Les techniques dhybridation! 5I.D. Lamplification enzymatique (PCR)! 6I.E. Le squenage! 6

I.E.1. Mthode de Maxam et Gilbert 6

I.E.2. Mthode de Sanger 7

II. Les espces analyses " 8II.A. Saccharomyces cerevisiae! 8II.B. Arabidopsis thaliana! 9II.C. Caenorhabditis elegans! 9II.D. Drosophila melanogaster! 9II.E. Mus musculus! 9

III. Les cartes de liaison" 9III.A. Les cartes gntiques! 10

III.A.1. Les marqueurs RFLP 10

III.A.2. Les microsatellites 11

III.A.3. Obtention des cartes gntiques humaines 11

III.1.4. Les cartes d'hybrides d'irradiation 12

III.B. Le squenage! 13III.C. Les cartes physiques! 14

III.C.1. Les cartes locales ou de petits gnomes 14

III.C.2. Les cartes locales chez l'Homme 14

III.D. La cartographie physique du gnome humain! 16III.E. Identification d'un gne responsable d'une maladie monognique! 19

IV. Analyse des gnomes" 20

Gntique

1 sur 21


2/21

Introduction

Dfinition: tude globale du gnome dans une condition particulireDfinition du gnome : lensemble du matriel gntique (gnes contenus dans leschromosomes au sein du noyau) dun organisme

La gnomique consiste en ltude de lensemble des gnes

La gnomique consiste dresser linventaire de lensemble des gnes dun organisme

pour en tudier leur fonction. La gnomique se compose de 2 volets complmentaires:- La gnomique structurale dcrit lorganisation du gnome, ralise son squenage

et dresse linventaire des gnes- La gnomique fonctionnelle tudie la fonction des gnes, leur mode de rgulation

et leurs interactions

La gnomique structurale : Elle sest dveloppe grce au progrs de la biologiemolculaire, en particulier le squenage haut dbit et lanalyse de lexpression des

gnes. Depuis la fin des annes 80, le squenage des gnomes complets sest

considrablement dvelopp

Juillet 1984: premier gnome squenc EBV Juillet 1995 : premier gnome de procaryote squenc Haemophilis

influenza

Octobre 1996 : premier gnome eucaryote squenc Saccharomycescerevisiae

Septembre 1997: E.Coli Dcembre 1998 : premier gnome deucaryotes pluricellulaires (mtazoaire)

squencs

Caenorhabilis elegans Mars 2000: Drosophilia Megalonaster Dcembre 2000: premier gnome de plante squenc Arabidopsis Thaliana Fvrier 2001: premire carte du gnome humain

La volont de squencer le gnome humain sest heurte des problmes techniques

dus la complexit du gnome et la ncessit de squencer au pralable des organismes

modle

Gntique

2 sur 21


3/21

I. Les outils utiliss en biologie molculaire

" "" " I.A. Les enzymes de restrictionsIls sont capables de reconnaitre spcifiquement une squence de 4 10pb, et de cliverlADN au site reconnu plus loin. Ils permettent de fragmenter lADN et permettent le

clonage. Plusieurs centaines denzymes de restriction ont t identifis

Ces outils permettent dtablir des cartes de restriction de toute molcule dADN, en

couplant la digestion avec une lectrophorse permettant de calculer la taille des

fragments gnrs

" " I.B. Le clonage et la construction de banqueDe grandes molcules dADN (chromosomes) ne sont pas directement travaillables. Il faut

les cloner pour pouvoir les manipuler. Le clonage consiste en

linsertion dun fragment dADN dans un vecteur, ce vecteur

tant propag dans une cellule hte (le plus souvent un

procaryote). La culture de ces cellules et la purification de ce

vecteur permettent de produire de grandes quantits du

fragment dADN clon. Les vecteurs de clonage bactrien sont

les plasmides, les phages ou les cosmides qui permettentlinsertion, respectivement, de 10, 20 et 45 kbp. Les BAC (bacterial artificial chromosomes)

permettent des insertions de 100 300 kpb

Gntique

3 sur 21


4/21

Le clonage concerne un fragment dADN unique (purifi ou obtenu par PCR) pour une

population dADN: on parle alors de banque. Le gros problme de ce type de construction

est la reprsentativit de la banque. On peut construire des banques dADN gnomique

comprenant lensemble du gnome, ou une banque dADN complmentaire (ADNc)

Gntique

4 sur 21


5/21

reprsentant lensemble des ADN messagers dun tissu choisi, pralablement recopis en

ADN

" " I.C. Les techniques dhybridationElles permettent de dtecter une squence donne parmi une population de squence,

laide dune sonde, fragment dADN (dans certains cas dARN), dont la squence estcomplmentaire de celle recherche. La sonde est marque par incorporation de

nuclotides radioactifs, fluorescents ou facilement dtectables. Le Southern-blot permet

Gntique

5 sur 21


6/21

de dtecter de lADN, le Nothern-blot de lARN. La sensibilit de la mthode permet de

dtecter un ARN messager reprsent une fois sur 10000" " I.D. Lamplification enzymatique (PCR)La technique de PCR consiste amplifier un fragment dADN encadr par 2 squencesconnues. Elle ncessite une polymrase thermostable et des oligonuclotides servant de

primers. Un enchainement de cycles successifs de dnaturation de lADN cible,

hybridation des amorces et polymrisation dune molcule dADN identique celle situe

entre les amorces

Les applications sont nombreuses: Mutagense dirige

Production dun fragment dADN en grande quantit

Prsence ou pas dun transcrit (RT-PCR)

tudes transcriptomiques

Criblage de banque

" " I.E. Le squenageLa dcouverte des techniques de squenage de lADN a permis de raliser le

squenage de gnome entier. Un certain nombre dorganismes modles ont t ainsi

compltement squencs

Historiquement, on distingue 2 mthodes de squenage:- Le squenage selon Maxam et Gilbert

- La mthode de Sanger

! ! ! ! I.E.1. Mthode de Maxam et Gilbert

Cette mthode a t dveloppe au dbut des annes 70Le principe de la mthode repose sur:

- Le marquage radioactif du brin dADN squencer (permets une identification

par

autoradiographie)

- Des coupures spcifiques, mais incompltes

- La sparation des fragments par lectrophorse (PAGE)

Gntique

6 sur 21


7/21

! ! ! ! I.E.2. Mthode de SangerCette mthode ncessite des didsoxynuclotides (qui ne possdent pas un CH

ncessaire la liaison avec un dNTP en 3)

On place un brin dADN avec une amorce, les 4 DNTP et un des 4 ddNTP en quantit telle

que lADN polymrase ait le choix chaque fois entre choisir un DNTP ou le ddNTP

Gntique

7 sur 21


8/21

On obtient ces diffrentes situations, car chaque fois que lADN polymrase doitincorporer un A, elle peut soit incorporer un dATP et la rplication continue ou un ddATP,

alors la rplication sarrte

On ralise la mme exprience avec des ddCTP, ddGTP et ddTTP et on fait migrer le tout

par lectrophorse comme pour la mthode de Maxam et Gilbert

II. Les espces analyses

Les espces analyses par ces mthodes sont surtout des procaryotes tels E. Coli,

Streptococcus, car leur gnome est de petite taille et ils possdent un chromosome unique

ce qui favorise le squenage. Cependant certains procaryotes possdent plusieurs

chromosomes comme Bacillus cereus, Rhodobacter sphaeroides, Vibrio cholerae

De nombreux eucaryotes sont ce jour squencs : Saccharomyces cerevisiae,

Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Mus musculus (souris), Arabidopsis

thaliana et lHomme

Lutilisation dorganismes modles est justifie par lunicit structurale et fonctionnelle du

vivant et par la faible taille des gnomes de ces espces

II.A. Saccharomyces cerevisiaeS. cerevisiae est un champignon unicellulaire pouvant se maintenir un tat haplode ou

diplode et pouvant vivre avec ou sans mitochondrie. Cet organisme est utilis engntique, biologie molculaire et cellulaire. Cest le premier organisme eucaryote dont le

Gntique

8 sur 21


9/21

gnome a t squenc, car il y avait des cartes gntiques assez compltes au

pralable

II.B. Arabidopsis thaliana

A. thaliana est un crucifre servant de modle pour les vgtaux suprieurs, car cestlangiosperme dont le gnome est le plus petit (120Mb) et sa gntique est simple

II.C. Caenorhabditis elegansC. elegans est le premier animal pluricellulaire squenc. Il est utilis en embryologie et en

neurobiologie, car ces animaux sont transparents ce qui permet de suivre chaque cellule

individuellement. Ladulte possde 959 cellules dont on connat prcisment le devenir au

cours du dveloppement. Il y a 352 neurones dont lensemble des jonctions synaptiques

est connu. Un animal XX est hermaphrodite et un animal XO est un mle

De nombreux gnes de lHomme ont dabord t identifis chez cet organisme

II.D. Drosophila melanogasterCet organisme a t utilis pour les travaux gntiques de Morgan. Il possde 4 paires de

chromosomes et il y a prsence de chromosomes polytniques dans les glandes

salivaires contenant 1024 molcules dADN. La drosophile a servi la ralisation de

cartes physiques du gnome (il existe par coloration 5100 bandes, taille moyenne de26 Kb). Elle a t squence, car il y avait de trs nombreux mutants et ses cartesgntiques taient assez compltes et prcises

II.E. Mus musculusLe gnome de la souris est plus petit que celui de lHomme, mais cest lorganisme qui

sen rapproche le plus. De plus, elle prsente lavantage de pouvoir raliser tous les

croisements possibles, il existe des lignes pures et de nombreux mutants. Certainesmaladies de la souris sont proches de maladies humaines

III. Les cartes de liaison

Ltude des gnomes a ncessit ltablissement de cartes qui permettent de reprer les

marqueurs le long des chromosomes. On distingue les cartes gntiques des cartes

physiques. Les cartes de liaisons (carte gntique et carte dirradiation) sont construites

partir de marqueurs correspondant des fragments dADN gnomique dfinissant un

Gntique

9 sur 21


10/21

locus unique. Ces cartes indiquent la position de marqueur les uns par rapport aux autres.

Elles ont ensuite t utilises pour tablir les cartes physiques

Il y a une diffrence de taille entre une carte physique et une carte gntique. En effet,

une carte gntique est base sur le nombre de crossing-over et des zones paraissent

plus grandes et dautres plus petites, car il y a des rgions o les crossing-over sontfavoriss, dautres o ils sont dfavoriss

Pour une carte gntique, les marqueurs sont ordonns grce lanalyse de leur

sgrgation au cours de gnrations. Ces cartes sont faciles obtenir chez des

organismes ou le nombre de mutants est lev, et/ou la fcondit est forte et le temps de

gnration faible

Les premires cartes ont t ralises par Morgan et Sturtevant sur la drosophile. Leurstravaux montraient que 2 margeurs (gnes) situs sur le mme chromosome taient

transmis prfrentiellement la gnration suivante. Cependant, les observations ont

montr que lon ne peut observer la distance entre 2 marqueurs que sils sont

polymorphes (reprsents par des allles diffrents et identifiables). De plus, le calcul

tant statistique, les expriences doivent tre ralises sur des populations importantes

Pour un certain nombre dorganismes, la cartographie gntique a t ralise en utilisant

comme marqueurs des gnes avec des mutations polymorphes visibles sur le phnotype.

Cette approche tait impossible sur lHomme, car la taille des familles est rduite, les

marqueurs peu polymorphes

Pour les cartes humaines, les marqueurs utiliss ont t de 2 types. Ce sont des

fragments dADN dfinissant un locus unique dans le gnome. De plus, ces fragments

sont visualisables de manire prcise en observant des variations de squences entre les

allles. Cependant, ces variations ne s manifestent pas au niveau phnotypique par la

modification dun caractre observable: ce sont des marqueurs anonymes2 types de marqueurs ont t utiliss: les RFLP et les microsatellites" " III.A. Les cartes gntiquesChez la drosophile ou la souris, les cartes gntiques ont t dresses aprs ltude de

nombreux croisements. Chez lHomme, le nombre rduit de mutants polymorphiques et de

familles nombreuses na pas permis de raliser des cartes gntiques par ce moyen

! ! ! ! III.A.1. Les marqueurs RFLP

Gntique

10 sur 21


11/21

Les fragments RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) sont des fragments dADN

gnomique qui, lorsquil est utilis comme sonde, permet, aprs digestion enzymatique, la

dtection de bandes de taille diffrente. Cette diffrence de taille est due ou des

diffrences de position de sites enzymatiques ou la prsence de minisatellites

diversement rpts

! ! ! ! III.A.2. Les microsatellitesCe sont des courtes squences dADN rptes en tandem (de 1 13 pb). Chaquemicrosatellite correspond un locus unique dans le gnome, les rgions entourant ce site

tant parfaitement dfini. Le polymorphisme de ces loci est d des variations dans la

longueur de la rptition qui identifie chaque allle

Les microsatellites sont beaucoup plus polymorphes que les marqueurs RFLP

! ! ! ! III.A.3. Obtention des cartes gntiques humainesLes cartes gntiques ont t construites de la faon suivante:

Gntique

11 sur 21


12/21

Les marqueurs ont t localiss sur un chromosome grce l'utilisation

d'hybrides somatiques mono-chromosomiques, soit par FISH (cas des RFLP),

soit par PCR (microsatellites)

Lhybride est instable, car le gnome du Hamster prend le dessus et les chromosomes

humains sont perdus. On drive une srie de cellules qui a le gnome du hamster + un

chromosome humain. On fait ensuite migrer les ARN et on ajoute une sonde ce qui permetde localiser un marqueur sur un chromosome

Les marqueurs sont examins 2 2 pour dterminer les groupes de liaison

Les groupes de liaison sont ordonns sur les chromosomes

! ! ! ! III.1.4. Les cartes d'hybrides d'irradiation

Les cartes dhybrides dirradiation sont bases sur le mme principe, mais on irradie lescellules humaines somatiques par des rayons X qui vont couper le gnome en morceau

L'avantage: il n'est pas ncessaire d'avoir un polymorphisme des marqueurs

Gntique

12 sur 21


13/21

" "III.B. Le squenage

2 mthodes ont t dveloppes permettant le squenage rapide des ADN:- Mthode de Maxam et Gilbert

- Mthode de Sanger

cf: Premire partie" "

Gntique

13 sur 21


14/21

" " III.C. Les cartes physiques! ! ! ! III.C.1. Les cartes locales ou de petits gnomesCe sont souvent des cartes de restriction qui sont ralises

Chez certaines espces, les caractristiques particulires des chromosomes permettent laralisation de carte physique. Exemple des chromosomes polythnes chez les diptres

! ! ! ! III.C.2. Les cartes locales chez l'HommeLes cartes locales ont t ralises grce aux techniques de marche sur lechromosome ou de saut sur le chromosomeLa technique de marche sur le chromosome consiste prendre un clone A dont on tire

une sonde. On squence alors jusqu trouver un deuxime clone B dont on tire une

nouvelle fois une sonde et ainsi de suite

Gntique

14 sur 21


15/21

Le gne de la mucoviscidose a t squenc de cette faon avant le squenage du

gnome humain; il a t publi de 1989 et fait environ 200kb. Ils sont partis du gne IRPqui a t identifi comme sgrgeant prfrentiellement avec la maladie

La technique du saut sur le chromosome a galement t utilise dans le squenage du

gne de la mucoviscidose. Cette technique est plus rapide, mais il y a possibilit de retouren arrire

LADN gnomique est digr par des enzymes coupant rarement afin davoir de gros

fragments; on fait ensuite migrer ces fragments sur gel dlectrophorse; on rcupre lesfragments dont la taille est comprise entre 80 et 150KbOn utilise ensuite un plasmide possdant un gne suppresseur de mutations comme le

gne supF qui supprime des mutations de lARNt. On sort supF du plasmide puis on le

mlange avec les fragments; on ralise ensuite une ligation avec les fragments dADN.Lutilisation dEcoR1 qui ne coupe pas dans supF va permettre dobtenir le gne supFflanqu de deux squences de quelques Kb mais tant en ralit spare de plusieurs

dizaines de Kb

On a donc ignor tout ce qui se situe entre ces deux squences; cest pourquoi cettetechnique sappelle saut sur le chromosome

Les squences obtenues sont clones dans des phages possdant une mutation ambre.

On tale alors ces phages sur des bactries supF - ; seuls les phages possdant des

insertions de supF + forment des plagesOn peut alors squencer ces squences

Remarque : Le problme est quon ne connat pas le sens de linsertion; il est doncpossible de revenir en arrire au lieu davancer sur le chromosome

Gntique

15 sur 21


16/21

Cette technique sert par exemple quand on ne trouve plus de clones pour continuer unemarche sur le chromosome

" " III.D. La cartographie physique du gnome humainDeux approches ont t utilises : une approche chromosome spcifique (squenagechromosome par chromosome ce qui a permis dviter la concurrence entre laboratoires)

et une approche gnome entier

Quelle que soit lapproche, il y a deux voies dordonnancement : top-dowm et bottom-up . Le top-dowm consiste se servir des cartes gntiques mises au point

comme point de dpart; on part dune sonde que lon hybride puis on squence jusqu unsecond marqueur; la technique bottom-up consiste squencer au hasard jusqu tombersur une squence connue (marqueur)

Diffrents types de vecteurs ont t utiliss: plasmide (10-12Kb), cosmides (45Kb), BAC(100-300Kb) et YAC (400Kb)

Gntique

16 sur 21


17/21

Cette technique permet dordonner les squences sur les cosmides; puis dordonner lessquences des cosmides sur les BAC et ainsi de suite de proche en proche (lordre est

prdfini)

Pour voir que deux clones sont chevauchants; il existe trois faons de faire: Comparaison des profils de restriction des cartes de restriction de chaque clone

recouvrant.Deux clones chevauchants prsenteront dans ce cas des fragments

de restriction (fingerprint) de mme taille

La cartographie par empreinte de restriction permet de gagner du temps, car on

ne doit pas tout squencer

Par hybridation : deux clones sont partiellement chevauchants si une sondedrive de lun shybride sur lautre; cette technique est assez peu utilise

Par un contenu commun en marqueur : deux clones sont partiellementchevauchants sils contiennent un mme marqueur unique. La technique utilise

est le criblage de la banque de clones; les clones sont tests par PCR avec unmarqueur donn (prsence: rponse positive ; absence: rponse ngative). LeSTS (squence-tagged site) est un marqueur de choix pour cette cartographie

physique

Gntique

17 sur 21


18/21

Pour tester de nombreux clones/vecteurs avec un nombre limit de manipulations, on

utilise des plaques puits (96). Pour le gnome humain, on a environ 30 000 clonesrpartis dans environ 300 plaques. Chaque puits dans la banque correspond un clone

de position connue sur le chromosome. Pour tester la prsence dune squence dintrt,

on ralise une amplification par PCR; les clones tant rpartis par super pools puis parpools au sein dun super pool; on peut ainsi faire un criblage selon le systme de pools etde super pools; ce qui permet un gain de temps

L'ensemble de ces donnes a permis la cartographie du gnome humain. Celle-ci doit

permettre l'identification rapide de gnes associs des maladies ou dsordres

hrditaires

Gntique

18 sur 21


19/21

Cette identification est possible pour les maladies monogniques, mais rarement pour les

maladies complexes rsultant de l'interaction de plusieurs gnes avec l'environnement

(cancer, diabte, insuffisance cardiaque...)

III.E. Identification d'un gne responsable d'une maladie

monognique

La gnomique structurale (squenage du gnome) a permis lidentification dun certain

nombre de gnes responsables de maladies hrditaires

Lorsquon veut rechercher le gne responsable dune maladie, on peut raliser plusieurs

approches: Clonage biochimique et les thalassmies (maladies du sang lies une

dficience en hmoglobine). Cela consiste un clonage fonctionnel; on connatla protine et on veut chercher le gne; cette approche fut la premire ralise,mais dsormais cest la moins utilise. On prlve lADN de membres de familles

atteintes par la maladie. On ralise une analyse de liaison avec 200 300

marqueurs rpartis le long du chromosome; et on voit avec quels marqueurssgrgent avec la pathologie. On peut alors identifier un intervalle gnralement

de plusieurs Mb. On utilise une carte physique pour dterminer les YAC

analyser

Quand la femme cde le chromosome avec les marqueurs 15. 21. 17, lindividu nest pas

malade; on peut ainsi localiser le gne responsable de la maladie. On peut aussi voir queles marqueurs sont lis de cette manire-l

Gntique

19 sur 21


20/21

Clonage par gnes candidats : des pathologies similaires chez certainsanimaux sont identifies et on recherche le gne humain correspondant. On

ralise un Northern Blot avec une sonde ADN dune autre espce dont on modifie

lastringence (de faon ce que ce ne soit pas trs spcifique) : zoo blot .Cette mthode nest quasiment plus utilise, car ce qui a t dcouvert la t,

mais elle pourrait ltre nouveau si on dcouvre de nouvelles maladies partransgense (chaos) chez la souris par exemple

Clonage positionnel

IV. Analyse des gnomes

Chez Saccharomyces cerevisiae, le squenage complet a t ralis en 1996. La

dtermination du nombre de gnes s'est base sur l'tude des ORF. Il existe 3 ORF par

brin donc 3 protines possibles par brin et 6 par double brin. Recherche au hasard des

AUG et des codons stop

Il existe 16 chromosomes pour 13,391 Mpb et environ 6200 gnes

65% des gnes ont une fonction connue:- 35% trouvs par exprimentation (expression puis fonction)- 30% par homologie de squences

Pour ces gnes, 9% sont des gnes spcifiques de la levure 91% sont partags avec d'autres espces

- 14 % des ORF ont une fonction inconnue avec des homologies ORF orphelines

- 12% sont des squences sans homologies squences orphelinesChez C. Elegans, beaucoup d'introns apparaissent. D'une manire gnrale, plus unorganisme est complexe, et plus le nombre d'introns augmente. Pour connaitre le nombre

Gntique

20 sur 21


21/21

de gnes, ralisation de banque d'ADNc. Utilisation des EST (pour expressed sequences

tag) qui permettent de reconnaitre 1 gne exprim et qui est spcifique de ce gne

Il existe 6 paires de chromosomes pour 100 Mpb et environ 19000 gnesIl y a apparition (par rapport la levure) de famille multignique : gnes qui seressemblent et qui s'expriment (sinon pseudognes). L'expression dans diffrents tissus,

des diffrents gnes qui peuvent avoir des fonctions diffrentes, voire antagonistesLes familles multigniques ont donc des gnes homologues (anctre commun) qui

peuvent tre orthologue (avoir la mme fonction) ou paralogue (fonctions diffrentes)

Chez les mammifres, il y a apparition de fonctions cognitives et sociales ce qui expliquent

l'augmentation du nombre de gnes

Par exemple chez l'Homme, 23 paires de chromosomes pour 3000 Mpb et 30000 gnesenviron. Le gnome est encombr de beaucoup de squence non codantes

Il y a 1,2% de squences codantes

0,7% d'UTR 5' et 3' rgions de rgulation post-transcriptionnelle 31% d'introns 6,5% d'ADN satellites dans les centromres et les tlomres. Ce sont souvent

des rptitions (CA)n ou (GT)n

Dans l'ADN intergnique, existe les pseudognes, qui sont apparus par duplication puis

mutations. Ces pseudognes reprsentent environ 1% du gnomeIl y a aussi un certain nombre d'lments gntiques mobiles (50% de l'ADN)

#

Gntique

La génomique

Documents

Transcript of La génomique