La réaction de hill Compte rendu TP bio cell 3

8/8/2019 La raction de hill Compte rendu TP bio cell 3

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RANGER Hlne Compte rendu de TP de biologie cellulaire n3DUMARGNE Emilien Du 01/10/09

La raction de Hill1. IntroductionLe TP n3 fait le 1 er octobre a pour but l'tude des chloroplastes prsents dans une feuille d'pinard

en plusieurs parties : De mettre en vidence les chloroplastes sur Malassez De les doser grce au spectrophotomtre de 2 manires :

Grce l'actone Grce la raction de Hill

L'intrt de ces diffrentes exprimentations est de prouver l'effet de la lumire sur les chloroplastesde plante verte.

Nous savons que les chloroplastes sont nombreux chez les plantes vertes (tel ici l'pinard) et qu'une

raction chimique a lieu pour que les chloroplastes produisent de l'ADP grce la lumire, maisquelles sont les longueurs d'ondes o l'absorbance de la chlorophyle A est forte et a quelleconcentration faut il qu'elle soit pour remplir son rle.

2. Isolement, observation et comptage au microscope photonique des chlMatriel et mthodeUne masse de 11,9 g de feuille d'pinard pur a t pes sur une balance puis l'aide des ciseauxnous avons coup ces feuilles qui ont maintenant sur balance de prcision une masse de 2,22g. Nousrajoutons par la suite la solution de tampon de broyage (35ml) en mme temps que d'craser l'aide

d'un mortier les feuilles.A l'aide d'une gaze le broya est filtr et mis dans un tube de 50 ml. Nous rajoutons un peu desolution de broyage la pipette pasteur pour galiser avec l'autre groupe en face de nous pour avoir un volume de 15,4 ml et on met le tube de solution mre la centrifugeuse pendant 5 min 2500Xg, 4C

Nous sparons le surnageant, puis nous ajoutons 8 ml de solution de lavage et enfin nous le plaonsdans un autre tube de 50 ml.

Nous sparons ensuite le culot vert du fond amylac et nous le laissons dans un petit tube en plastique de 1,5 ml

Rsultats

Nous observons par la suite une goutte de solution mre au microscope photonique pour compter lenombre de chloroplastes casss sur 30 chloroplastes vus, comme le montre le tableau ci dessous :

Tableau des rsultats du dnombrement des cellules casses sur une goutte de suspension mreobserve au microscope photonique

Nombre de cellules observes Nombre de cellules casses Pourcentage de cellules casses

30 9 30% (car 30x0,3=9)

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Nous dnombrons sur Malassez les chloroplastes et nous les comptons pour avoir la teneur enchlorplastes/ml de la suspension mre.

Tableau de rsultat du comptage du nombre de chloroplastes sur Malassez Carreaux/Ligne

s1 2 3 4 Total

1er carreau 47 41 53 60 201

2eme carreau 41 53 57 49 200

3eme carreau 60 63 57 63 223

4eme carreau 48 56 63 68 225

Calculs

Total sur les 4 cellules 849

Total sur Malassez 21225 (849x25)

3. Dosage des chlorophylles

Matriel et Mthode : Nous avons prlev sous la hotte grce une pipette gradue 800L dactone et 200L de tamponet un autre avec 800L de ctone et 200L de suspension-mre de chloroplastes. Il a fallu 10sec auvortex puis centrifuger pendant 5min 14000 tours/min. Nous avons transfr le surnageant dansune cuvette de spectro et nous avons pris les mesures dabsorbance 647, 652,663nm.

Rsultats :

ABS 647 : 0,694ABS 652 : 0,903ABS 663 : 1,402

Formule de Bruinsma :

[Chlorophylle A] = 0,903/36 = 0,025 g/L= 25g.L-1

Formule d'Arnon :[Chlorophylle A] = 20,2x1,402-8,02x0,694 = 25,26 g.L -1

Moyenne : (25+25,26)/2 = 25,17 g.0,1mL -1

= 252 g/mLDonc on doit diluer par 4 la suspension mre pour la raction de Hill car : 252/4 = 63 g/mL dechloroplastes total (proche de 60 g/mL).

Teneur moyenne : 60/25,17 = 2,38 Chlorophylle A totale/ml

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4. Raction de HillMatriel et Mthode :

Nous avons prpar 3 cuvette plastique : le tmoin (fait le 0, il n'y a pas de raction avec les

chloroplastes car il n'y en a pas, elle est compose en plusde 1,75 ml de solution de lavage et de 0,25 de DCPIP)

l'obscurit (le tube possde 0,25 ml de chloroplastes et at plac constamment dans l'obscurit pendant la ractionde Hill et les mesures au spectrophotomtre, elle estcompose en plus de 1,50 ml de solution de lavage et de0,25 de DCPIP )

la lumire (le tube possde 0,25 ml de chloroplastes et at plac constamment sous une lampe allume pendant laraction de Hill et les mesures au spectrophotomtre, elleest compose en plus de 1,50 ml de solution de lavage etde 0,25 de DCPIP )

Rsultats :

temps T0m 1,325

1m30 1,3193m 1,314

4m30 1,3226m 1,330

7m30 1,326

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9m 1,32210m30 1,326

12m 1,31213m30 1,323

temps L

30s 1,7472m 1,533m30 1,267

5m 0,9976m30 0,736

8m 0,6749m30 0,66411m 0,662

12m30 0,6614m 0,657

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temps O1m 1,736

2m30 1,7514m 1,738

5m30 1,7307m 1,728

8m30 1,71710m 1,70011m30 1,680

13m 1,68414m30 1,681

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> La courbe L : l'absorbance diminue au cours du temps donc il y a raction, la DCPIP est rduite(nous observons une descente en escalier que nous expliquons par le temps dattente entre chaquemesure).

> La courbe T : c'est le tmoin donc l'absorbance varie peu> La courbe O : l'absorbance varie peu, donc il n'y a pas de ractionIl n'y a que dans le tube L que la raction a lieu, ce qui prouve qu'il faut de la lumire pour que laraction dbute.

Calculs:> Q = [2x(|0,736-1,747|)-(|1,680-1,728|)]/[1,26.10 7x1]= 8,48.10 -8

> = (22,4.10 3x8,48.10 -8)/(2x(14,5-0,5))=6,784.10 -5 ml/min de dioxygneIl y a 2 au dnominateur car on doit calculer le dbit de dioxygne (O 2) et non d'oxygne donc ondoit diviser par 2.

> /m = 6,784.10 5x60(15,4/2)/2,22=0,014 h/g de O 2

5 . Conclusion :Grce la raction de Hill nous avons mis en vidence que le couplage des lectrons dans

les chloroplastes est possible seulement si il y a de la lumire (capture de photon), car l'absorbancedu tube la lumire diminue, la solution est de moins en moins bleue. Le DCPIP prouve cela, car une partie de celui-ci est rduite (devient incolore) lors de la raction de Hill et car il y adgagement de O 2. La capture des lectrons par NADP+ provoque la phosphorylation de l'ADP enATP.

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