La PCR

• Applications en santé animale (aperçu)

• Voir l’ADN : l’électrophorèse

• But de la PCR

• Comment ça marche?

• Comment procéder?

• Quelques exemples Julie Lavoie, enseignante au Collège Lionel-Groulx

PCR : de nombreusesapplications en santé animale

• Diagnostic de maladies infectieuses

• Détection d’allèles récessifs chez des hétérozygotes

• Génotypage d’animaux de laboratoire

• Sexage animal

• Tests de filiation

Voir l’ADN : l’électrophorèse

• L’ADN : observation directe impossible

• Y accrocher des molécules* qui s’illuminent aux UV

• Grande quantité d’ADN… mais quel ADN?

*Des molécules qui s’accrochent à l’ADN et qui s’illuminent aux UV :

–Le bromure d’éthydium (EtBr)–Le Vistra Green–Le SYBR Green

Ces produits doivent être utilisés avec des précautions extrêmes (on sait notamment que le bromure d’éthydium est un mutagène extrêmement puissant)

Électrophorèse – animation :Pour accéder au site, cliquez ICI ou lien sur page web EDC. Sur le site, choisir successivement : 1-Manipulation

2-Techniques3-Sorting and sequencing

4-Gel electrophoresis : animation 2D

But de la technique PCR

• Amplifier un segment d’ADN d’intérêt** afin de pouvoir le visualiser (en électrophorèse)

**Des segments d’ADN d’intérêt (1/3) :

• Pour dépister un agent infectieux, amplifier un segment

spécifique au génome du pathogène recherché, par ex.:

• virus (ex.: ADN du Coronavirus entérique félin « PIF »)

• bactéries (ex.: ADN de Chlamydia)

• parasites (ex.: ADN du Ver du cœur canin)

• Pour déceler un allèle récessif, amplifier un segment

spécifique à l’allèle récessif causant la maladie, par ex.:

• ex.: Syndrome du porc stressé « PSS »

Suite…

**Des segments d’ADN d’intérêt (2/3) :

• Pour tester le génotype d’un animal de laboratoire, amplifier un

segments correspondant à la particularité génétique à contrôler

pour cet animal, par ex.:

• Un gène inactivé (knock-out) ou un gène ajouté dans un animal transgénique

• Pour sexer un animal, amplifier des segments spécifiques aux

chromosomes sexuels, donc :

• Des gènes situés uniquement sur le chromosome X, sur le Y, sur le Z ou sur le W

Suite…

**Des segments d’ADN d’intérêt (3/3) :

• Pour établir la parenté (ex.: test de paternité)

ou l’identité d’un individu (ex.: domaine judiciaire),

amplifier plusieurs segments d’ADN non codant

très polymorphes (hypervariables) entre individus,

par exemple les microsatellites.

Pour chacun de ces segments, chaque individu possède deux

allèles parmi des dizaines possibles. Le

résultat d’ensemble est donc unique pour chaque individu.

• Imite « in vitro » la réplication de l’ADN***, mais

seulement pour un segment d’ADN bien précis

• On utilise une enzyme, la Taq polymérase, qui est

une ADN polymérase thermorésistante ; (cette enzyme a été isolée chez une bactérie vivant dans les

sources thermales du Parc Yellowstone!)

• PCR : polymerase chain reaction

ou ACP : amplification en chaîne par la polymérase

La PCR : comment ça marche? (1/3)

***La réplication de l’ADN « in vivo » (rappel) :

•Les nucléotides « libres » s’unissent aux brins d’ADN «exposés», par complémentarité de leurs bases azotées :

(A – T ) (C – G)

•Le travail (ouverture de la double hélice, assemblage des nucléotides ajoutés et fermeture des deux doubles hélices) est effectué par une équipe d’enzymes dont

l’ADN polymérase.

•Réf. pour plus de détails : Lien/animation et Tortora et al. (2002) p. 137

• L’ensemble des ingrédients est mis dans un microtube :

– Extrait d’ADN

– Amorces (« primers ») spécifiques à la région à amplifier

– Taq polymérase et tampon de réaction

– dNTP (nucléotides, portant les bases A, C, G et T)

– H2O stérile

• TOUT doit être fait pour éviter de contaminer les échantillons à analyser : stérilité du matériel et des solutions, travail en asepsie, etc.

La PCR : comment ça marche? (2/3)

• Le microtube est mis dans un thermocycleur

(machine à PCR) et subit une série de cycles au

cours desquels la température varie.

• Animation :• http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm

Liens vers une autre animation sur la PCR : voir Médiagraphie ou

page web EDC

La PCR : comment ça marche? (3/3)

La PCR : comment procéder? (1/2)

1°) Prélevement d’un échantillon contenant de l’ADN :

• Recherche d’un pathogène dans un animal malade ou mort : prélèvement sanguin ou de viscères, car l’ADN du pathogène peut être détecté dans les tissus de l’animal (sang, foie, cerveau)…

• Analyse des gènes de l’animal (pour déterminer son sexe, son espèce, ses allèles…) : prélèvement sanguin, cutané (buccal), de poils ou de plumes, ou même parfois ses fèces (excréments).

*Important : Bien identifier l’échantillon et indiquer quel test est à effectuer, car les amorces diffèrent pour chaque test.

2°) Extraction d’ADN à partir de l’échantillon

Après cette étape, le microtube d’extrait contient tout l’ADN contenu dans l’échantillon : celui de l’animal tout comme celui des pathogènes présents dans les tissus prélevés.

3°) Amplification par PCRAprès cette étape, le microtube à PCR contient des millions de copies

du segment d’ADN recherché, celui auxquelles les amorces utilisées sont spécifiques.

4°) Visualisation des résultats par électrophorèse

5°) Interprétation du résultat

La PCR : comment procéder? (2/2)

Exemple : Sexage d’oiseaux

 

• De gauche à droite :

• Puits #1 = un standard, donc un mélange de fragments d’ADN de tailles connues, utilisés comme repères pour déterminer la taille des fragments obtenus par PCR

• Les puits #2 et 3 = ADN de deux individus de sexe…

• Les puits #4 à 7 = ADN de quatre individus de sexe…

1 2 3 4 5 6 7

Médiagraphie• Sources des images :

• Thermocycleur : www.vignovin.com• Modèle moléculaire de l’ADN :

http://www.futura-sciences.com/news-100-milliards-bases-banques-donnees-adn-arn_6997.php• Gel - sexage d’oiseaux : http://www.lavoliere.com/elevage/adn/adn_03.htm• Électrophorèse aux UV : http://www.mediscan.co.uk/cfm/resultssearch.cfm?box=DN&mediatype=image&log=nk• Réplication de l’ADN : http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Dna-split.png

• Sites pertinents :

• Informations sur différents tests PCR disponibles en santé animale :

• Lien vers l’animation sur la PCR : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm

• Lien vers 3 images « fixes » tirées de l’animation précédente, avec courts textes : http://alexandre.alapetite.net/iup-gmi/cbgp/annexes.html#amplification

• Lien vers une autre animation sur la PCR : http://www.dnai.org/index.htm une fois sur le site, choisir : Manipulation ; Techniques ; AmplifyingDans le même site est disponible également une animation sur le séquençage (dont la réaction est très semblable à celle de la PCR). Il est donc intéressant de comparer les deux dans ce même site.

• Lien vers une animation sur la réplication de l’ADN « in vivo » et les enzymes impliquées : http://www.colvir.net/prof/chantal.proulx/animations/Replication-ADN.html