Projet « VIRELEC2 » du Défi Nano 2014

La microscopie électrochimique à force atomiqueà médiateur lié (Mt/AFM-SECM) :

un outil d’imagerie fonctionnelle pour la nanotechnologie virale.

Agnès Anne, Arnaud Chovin, Christophe Demaille

Systèmes Biomacromoléculaires - Transport d'électrons à l'échelle nanométrique

Laboratoire d'Electrochimie Moléculaire (LEM)Université Paris Diderot - Paris 7, UMR CNRS 7591

y p q

http://www.lemp7.cnrs.fr

Equipe de Virologie Végétale

Noëlle Carette,Thierry Michon

Laboratoire de Biologie du Fruit et Pathologie (BFP) Université Bordeaux 1–UMR INRA 1332,

Equipe de Virologie Végétale

https://www6.bordeaux-aquitaine.inra.fr/bfp

Journées de l’Interdisciplinarité 10/12/2014

https://www6.bordeaux aquitaine.inra.fr/bfp

Projet « VIRELEC2 » du Défi Nano 2014

Objectif :

Imagerie fonctionnelle de cascades enzymatiques reconstituées…..

Objectif :

Métabolite

Mét b lit

Substrat

ProduitDiffusion !

Métabolite

Enzyme 1 Enzyme 2

« Canalisation »

« Nano » échafaudage : - Naturel (protéique)- Artificiel (Origami d’ADN)

distance inter-enzyme, d

VEnzymatique augmente si d diminue (~10nm)

« Canalisation » ou diffusion via la solution ? Sonder le fonctionnement d’un système Isolé (individuel)

Idan, O.; Hess, H. Diffusive Transport Phenomena in Artificial Enzyme Cascade on Scaffolds. Nat. Nanotechnol. 2012, 7, 769-770.

Projet « VIRELEC2 » du Défi Nano 2014

Défis interdisciplinaires:Défis interdisciplinaires:

1- Maitriser l'organisation spatiale de molécules d’enzymes

Apport du partenaire biologiste

La nanotechnologie viraleLa nanotechnologie virale

T. Michon et al. Trends Biotechnol. 2012

Nano-porteurs viraux

2- Sonder le fonctionnement d’un nano-système enzymatique individuel

itip

Tête ferrocene

Chaine PEG

Sonde AFM-SECM

Apport du partenaire électrochimiste

e-Tête ferrocene

In -Situe-

Nouvel outil de nano-métrologie

fonctionnelle in-situ

e-

Microscopie AFM-SECM à médiateur lié(Mt/AFM-SECM)

eAnne, A; Chovin, C.; Demaille.,C.; Goyer, C.

ACS Nano 2009

Projet « VIRELEC2 » du Défi Nano 2014

Imagerie fonctionnelle de cascades enzymatiques reconstituées à laImagerie fonctionnelle de cascades enzymatiques reconstituées à la surface de virus, par microscopie électrochimique à force atomique à

médiateur lié à la sonde.

Système d’étude type

Couplage entre la lipase CalB et

e-

itip

Tête ferrocene

Chaine PEG

Sonde AFM-SECM

l’enzyme redox GOx….

L’architecture virale permet de contrôler le positionnement relatif

e-

Glucose

+ Gluconolactone

In -Situe-

des 2 enzymes(reconnaissance moléculaire, ingénierie des protéines….) … autant de concepts inédits à

valider expérimentalement…

GOx GOx

CalB

Les particules virales individuelles sont localisées et

imagées par la sonde(topographie)

GOx GOx

Acetyl-D-glucoseNanoparticule virale

La cinétique du fonctionnement de l’enzyme redox (GOx) est mesurée simultanément (courant)

distances inter-enzyme, d

Système Isolé (adsorbé sur une surface)

Projet « VIRELEC2 » du Défi Nano 2014

Validation de l’adressage électrochimique par microscopie Mt/AFMValidation de l adressage électrochimique par microscopie Mt/AFM-SECM de biomolécules organisées à la surface de virus.

Conception de systèmes modèlesp y

Contrôle positionnel d’anticorps à marqueur redox sur nano-porteurs viraux

Coat protein CP equiv 2000 copies / virus CP marking

~ 10 nmTS gold

Au

Coat protein CP equiv. 2000 copies / virus

Genome-linked Protein VPg only one / virus~ 850 nm

CP marking

potyVirus particle LMV

Antifouling Protection

LMVsAdsorption

* RedoxImmunomarking

Au

Random array of LMVs

g

Au Au1. PEG2K-SS2. BSA

Steps 1. 2.

VPg marking

2 µm

contrôle AFM

Anti CPrabbit IgG

Fc-PEGylatedanti rabbit IgG

Anti VPgrabbit IgG

* Redox ImmunomarkingStep 1. Primary antibody Step 2. Redox antibody

1. CP marking 1. VPg marking

Ferrocenehead (Fc)

Antibody(IgG)

PEG3.4K chainAu

VPg marking

Construction immunologique pas à pas d’édifices de macromolécules sur virus adsorbé en surface .

rabbit IgG anti-rabbit IgGrabbit IgG(IgG) Au

Projet « VIRELEC2 » du Défi Nano 2014

Validation de l’adressage électrochimique par microscopie Mt/AFM-

Imagerie Mt/AFM-SECM de virus LMV redox immuno-é M d l téi CP

Sonde AFM-SECM nue

Validation de l adressage électrochimique par microscopie Mt/AFM-SECM de biomolécules organisées à la surface de virus.

marqués: Marquage de la protéine CPSonde AFM SECM nue

Valide le concept d’imagerie combinée Mt/AFM-SECM de virus

fonctionnalisés:

• Localisation et acquisition de la topographie de particules virales.

• Détection électrochimique simultanée de biomolécules redox

(anticorps redox) assemblés à leur surface.

Valide le concept de construction immunologique pas à pas d’édifices de

macromolécules sur virus adsorbé en surface .

… zoomons un peu…..

Projet « VIRELEC2 » du Défi Nano 2014

Validation de l’adressage électrochimique par microscopie Mt/AFM-

Première « Imagerie » fonctionnelle d’un nano-système individuel à gabarit viral

Validation de l adressage électrochimique par microscopie Mt/AFMSECM de biomolécules organisées à la surface de virus.

S’agissant de « nano-

systèmes » leurs propriétés

Visualisation de la

fonction redox des

y p p

(notamment fonctionnelles)

varient d’une particule à

l’autreparticules virales

individuelles La Mt/AFM-SECM

permet de résoudre des

l autre

permet de résoudre des

particules individuelles et

donc de sonder cette

dispersion.

* statistique d’une particule à l’autre

* spatiale: le long de particulesLes anticorps redox forment une succession de « clusters »

Soumis à ACS Nano

Projet « VIRELEC2 » du Défi Nano 2014

Validation de l’adressage électrochimique par microscopie Mt/AFM-

Imagerie Mt/AFM-SECM de virus LMV redox immuno-marqués: Marquage de la protéine terminale VPg

Validation de l adressage électrochimique par microscopie Mt/AFMSECM de biomolécules organisées à la surface de virus.

Sélectivité du contrôle

positionnel

In situe-

itip

e-

Etip = +0.3 V/SCE de macromolécules

(anticorps redox)

sur nano-porteurs viraux

e-

FcFc+

par réaction immunologique

Défi en nanométrologie :

accroitre la résolution spatiale et

la sensibilité aux très faibles

Un cluster visible uniquement à une seule des extrémités du virus: en courant mais aussi en topographie

courants de la Mt/AFM-SECM

Démontre la possibilité de localiser une protéine individuelle par Mt/AFM-SECM

Plus haute résolution jamais atteinte en Mt/AFM-SECM rendue possible par une sonde AFM-SECM hyper-fine

Alliance de la résolution nanométrique de l’AFM à la sélectivité de la détection électrochimiqueSoumis à ACS Nano

Prochaines étapes (2015)

Projet « VIRELEC2 » du Défi Nano 2014

Prochaines étapes (2015)

itip

GO

GOx

e-

e-

In situAssemblage d’un système enzymatique intégré sur

nanoporteur viral

Reconstitution et interrogation fonctionnelle de cascades multi-enzymatiques

GOxGlucose

Interrogation fonctionnelle de nano-dispositifs

catalytiques individuels

(2016)

Sonder le fonctionnement deMica

Nano-bio-systèmes fonctionnels

Sonder le fonctionnement de

molécules d’enzymes individuelles

puis corréler les informations

cinétiques obtenues avec la position i

In situe-

Passage à une configuration de médiateur attaché à la

sonde AFM-SECM

q p

de l’enzyme dans la cascade (c.à.d.

sa position physique sur le virus).

itip

GOx

GOxe-

GlucoseInterrogation fonctionnelle d’un nano-système à

enzyme redox sur

Mise en évidence de l’élusif

phénomène de « canalisation » des

ét b lit ?

Mica

enzyme redox sur nanoporteur viral

métabolites…..?

Projet « VIRELEC2 » du Défi Nano 2014

Moyens Humains

Christophe Demaille, DR CNRSAgnès Anne, DR CNRS

Chercheurs permanents

Agnès Anne, DR CNRSArnaud Chovin, MCF IUT

Thierry Michon, DR INRA

Doctorants et post-doctorants

2013 Laurent Nault, post-doctorant ANR PIRIBIO 2009

2012 - Cecilia Taofifenua, doctorante MRT thèse septembre 2015

2015 -- Carlos Marcuello, post-doctorant ANR AAP générique 2014

Merci pour votre attention !Merci pour votre attention !

Merci aux organisateurs pour l’invitation !

Merci à la M.I. du CNRS pour le financement !

Etude statistique du CP-marquage du LMV à partir des images Mt/AFM-SECM:

Quantifier la distribution du marquage d’un virus à l’autre

Distribution du marquage (nombre de clusters et d’IgG-PEG Fc) d’un virus à l’autreDistribution du marquage (nombre de clusters et d IgG PEG Fc) d un virus à l autre

Visualisation des raisons de la disparité du marquage:

-Le nombre de clusters par virus varie

-Le nombre d’IgG-PEG-Fc par cluster est largement distribué

Détermination rendue

uniquement possible g p g

Existence de plusieurs populations de virus (en terme de marquage):

- 45 % sont marqué comme la moyenne des virus

- 25 % deux fois moins que la moyenne

par la capacité de la

Mt/AFM-SECM

à interroger des particules

- Au total 20% des virus sont moins marqué que la moyenne et 35 % plus. virales individuels

Etude statistique du CP-marquage du LMV à partir des images Mt/AFM-SECM

Quantifier la distribution spatiale du marquage le long des particules virales

Une des extrémités du virus présente particulièrement peu de clusters

Répartition des clusters extrêmement régulière

Corrélation croisée courant de cluster / position : les clusters à l’extrémité « pauvre en clusters » sont également moins p p g

lumineux

Marquage « polarisé » propre au LMV