La biocatalyse pour une chimie verte: enjeux et … · réduisant des rejets toxiques ......

La biocatalyse pour une chimie verte:

enjeux et perspectives

Colloque «Bioprocédés et Bioproduction», CNRS Paris, 10 juillet 2014

Pr. Laurence Hecquet

Institut de Chimie de Clermont-Ferrand, UMR CNRS 6296, Equipe SEESIB

Présidente du Club Bioconversion en Chimie Organique (CBSO)

Plan

Défis de l’industrie chimique

Biocatalyse en synthèse organique

▪ Atouts

▪ Limites

▪ Leviers

Club Biocatalyse en Synthèse Organique (CBSO)

Enjeux et perspectives

2

Utilisation de matières premières renouvelables

Préserver l’équilibre environnemental

réduisant des rejets toxiques

et gaz à effets de serre

minimisant

les coûts de production

limitant les dépenses

en énergie

Nouveaux

procédés

chimiques

propres



3

4

1998 : Paul Anastas et John Warner (USA) publient dans leur livre “Green

Chemistry: Theory and Practice” les 12 principes de la chimie verte

1. Limiter la pollution à la

source

2. Economie d’atomes

3. Synthèses chimiques

moins toxiques

4. Produits chimiques

plus sûrs

5. Réduire l’utilisation

de solvants et

d’auxiliaires 6. Dépenses

énergétique 7. Matières

premières

renouvelables

8. Réduire les produits

dérivés (groupes

protecteurs)

9. Catalyse

10. Conception de la

dégradation finale

11. Analyser en temps réel

pour prévenir la pollution

12. Minimiser le risque

d’accidents

12 principes de la chimie verte

Substrat Produit

Catalyseur

«Un catalyseur est une espèce, qui en

petite quantité, augmente la vitesse

d’une réaction sans figurer dans

l’équation de la réaction et sans modifier

la composition du système à l’état final.»

Les enzymes sont des catalyseurs

biologiques.



Substrat Produit

Enzyme


Intérêts des enzymes


5

La biocatalyse est l'utilisation d’enzymes, catalyseurs naturels, dans une

réaction de synthèse organique.

6

Obtention à partir de matières premières renouvelables

Conditions douces (température, pression, pH)

Sélectivité (régio-, stéréo-, énantiosélectivité)

Economie d’étapes et d’atomes


Intérêts des enzymes

Substrat Produit

Enzyme


6

Méthodes et techniques utilisant les matières et outils du monde

vivant pour la préparation de produits chimiques

Biotechnologie Blanche

Biocarburants Biopolymères Chimie de spécialités

Agroalimentaire Pharmacie

Chimie des intermédiaires Chimie de base

7


Positionnement de la biocatalyse dans le domaine des biotechnologies


7

L’idée d’utiliser des biocatalyseurs n’est pas neuve !

1897

1908

1916

1936

1960

1980

1990 2000

Utilisation d’enzymes

isolées hors de la

cellule

Cyanhydrine par des

D-oxynitrilase

Immobilisation de l’invertase

Synthèse enzymatique d’ester

en présence de lipase

Production de protéases à grande

échelle par NOVO

Clonage et surexpression : commercialisation

d’une plus grande variété d’enzymes

Modification d’enzymes par mutagenèse

Evolution in vitro

Enoncé des 12 principes

de la chimie verte



8

9

9

Classification des enzymes

4600 enzymes répertoriées

de nombreuses autres non identifiées…


EC 1. Oxydo-réductases

EC 2. Transférases

EC 3. Hydrolases

EC 4. Lyases

EC 5. Isomérases

EC 6. Ligases


Protéases

Nitrilases

Lipases

Lyases

Oxygénases

Esterases

Autres

enzymes

Autres hydrolases

Lyases

HYDROLASES

Enzyme Catalysis, Ed. K. Drauz and H. Waldmann, Wiley-VCH verlag GmbH, Weinheim 2002

Hydrolyse ou formation d’esters

Hydrolyse ou formation d’amides

Hydrolyse d’époxydes

Hydrolyse de nitriles

Epoxydation,

hydroxylation

Oxydoréduction

d’alcools et de cétones

Formation de liaisons

C-C, C-N

Oxydo réductases


Enzymes plus particulièrement employées en biocatalyse


10

Substrat Produit

. Source microbienne

. Accessibilité (commerciale

ou produite au laboratoire)

Constantes cinétiques :

KM, Vm, kcat kcat/KM

Etude des conditions

réactionnelles (T°, pH,...)

Génie des bioprocédés

Approche intégrative des procédés biocatalytiques


Immobilisation

Enzyme

Mise en œuvre

de la réaction à l’échelle

préparative

Choix

de l’enzyme

Essais

analytiques


11

Extraction et

purification

du produit

Exemples de composés produits par biocatalyse à l’échelle industrielle

A. Schmid, J. S. Dordick, B. Hauer, . Kiener, M. Wubbolts, B. Witholt, Nature, 2001, 409, 258-268

Z. Aleksey, Current Opinion in Chemical Biology, 2001, 5, 130-136

S. Panke, M. Held, M. Wubbolts, Current Opinion in Biotechnology, 2004, 15, 272-279

Gist/brocades/Novo-Nordisk D-Fructose >250 000

Nitto Chemical Industry Acrylamide >30 000

Toray Industries Lysine 4 000

Lonza AG Vitamine B3 3 000

DSM aspartame > 2 000

Chem ferm Pénicillines hémisynthétiques 2 000

Amino GmbH acide malique 2 000

Zenca Acide (S)-chloroprpionique 2 000

Degussa-Hüls AG L-aminoacides 200

Hoechst Marion acide 7-amino céphalosporanique 200

BASF (R)-phényléthylamine >100

Monsanto acides aminés >10

Dupont 5-cyanovaléramide 10

Compagnie Production Tonnes/an

Gist/brocades/Novo-Nordisk D-Fructose >250 000

Nitto Chemical Industry Acrylamide >30 000

Toray Industries Lysine 4 000

Lonza AG Vitamine B3 3 000

DSM Aspartame > 2 000

Chem ferm Pénicillines hémisynthétiques 2 000

Amino GmbH acide malique 2 000

Zenca Acide (S)-chloroprpionique 2 000

Degussa-Hüls AG L-aminoacides 200

Hoechst Marion acide 7-amino céphalosporanique 200

BASF (R)-phényléthylamine >100

Monsanto Acides aminés >10

Dupont 5-cyanovaléramide 10

Compagnie Production Tonnes/an



12

D-Fructose Gist-Brocades/Novo-Nordisk > 250 000 tonnes/an

amidon D-glucose isomérisation séparation

D-glucose

42-90% D-fructose

Glucose isomérase isolée de divers sources microbiennes

Thermostables (50-60°), Immobilisées

D-fructose D-glucose

Pouvoir sucrant

Saccharose 1

D-glucose 0.7

D-frucrose 1.5




13

Acrylamide Nitto chemical Industry > 30 000 tonnes/an

Cellules entières : Rhodococcus rhodocrous

Concentration du nitrile : 1000g/L

Rdt >99.9%




14

Anticholestérol : médicament le plus vendu au monde 20 Md $ Lipitor (atorvastatine) Pfizer

N

H

O

N OH

O

F

OH OH

Lipitor (atorvastatine)


DSM

- Une étape : Intermédiaire à 6 carbones

avec les deux centres asymétriques

- Faible coût des substrats :

chloroacetaldehyde et acetaldehyde

-Procédé très compétitif : production par

DSM à l’échelle industrielle.



15

Cependant…

Les enzymes sont-elles l’avenir de la chimie ?

Conditions douces : économes en énergie, écocompatibles

Efficacité : turn-over élevé et accélérations souvent >108

Sélectivité : régio-, stéréo-, énantiosélectivité

Accessibilité : nombreuses enzymes sont commerciales

La plus part des réactions utilisées en synthèse organique

pourraient être catalysées par des enzymes



16

• Instabilité des enzymes dans des conditions non physiologiques pH extrême, températures élevées, présence de solvants organiques

• Spécificité des enzymes peut devenir un inconvénient Faible affinité vis-à-vis des composés ayant des structures éloignées des substrats naturels

• Rendements dans certains cas inférieurs à ceux obtenus par voie chimique Réactions équilibrées

Concentration en substrat souvent de l’ordre de 10 à 100nM en raison de phénomène d’inhibition


Les enzymes sont-elles l’avenir de la chimie ?


17

Substrat Produit







Enzyme

Extraction et

purification

du produit

Mise en œuvre


préparative

Sélection

de l’enzyme

Essais

analytiques


18

Substrat Produit







Enzyme

Extraction et

purification

du produit

Mise en œuvre


préparative

Sélection

de l’enzyme

Ingénierie

de l’enzyme

Essais

analytiques


19

Ingé,

Ingénierie du biocatalyseur

Résistance aux solvants

Thermostabilité Amélioration ou modification

de la spécificité, de la sélectivité


Substrat Produit Enzyme

Tests de criblage

Biologie

moléculaire

Modélisation

moléculaire


20

Enzyme

optimisée

Géne

Création de

diversité

Banque de

nouveaux génes

Enzyme



Approche aléatoire Mutagenèse aléatoire

Approche rationnelle Mutagenèse dirigée

Métagénomique


21

Géne

Banque de

nouvelles enzymes

Création de

diversité

Expression

Banque de

nouveaux génes

Enzyme

Nouvelle

Enzyme

Approche aléatoire Mutagenèse aléatoire

Approche rationnelle Mutagenèse dirigée

Métagénomique



L’enzyme

est-elle

optimisée ? NON OUI

Fin du

processus

Test de criblage


22

Nouvelle

enzyme

Expression

Tes de criblage

Nouveau

gène

n cycles

(générations)

Approche aléatoire Mutagenèse

aléatoire

Approche rationnelle Mutagenèse

dirigée

Evolution

In vitro

Banque de

nouvelles enzymes

Création de

diversité

Banque de

nouveaux génes



L’enzyme

est-elle

optimisée ? NON OUI

Fin du

processus

Chen, K . and Arnold, F.H., PNAS, 1993 ; Stemmer, W.P.C, Nature, 1994


23

Augmentation de la stabilité thermique de la subtilisine de Bacillus subtilis

Subtilisine

Tests de criblage colorimétrique

Génération 5 :

1 subtilisine mutée (9 mutations)

Génération

Ln

(d

em

i-vie

) à

65°C

StEP

StEP

DNA shuffling

DNA shuffling

DNA shuffling

200 fois plus active à 65°C

que l’enzyme sauvage

H. Zhao, F.H. Arnold, Protein Eng. 1999, 12, 47-53

HN

O

O HN

NO2

HN

OH

O

H2N NO2Succinyl-Ala-Ala-Pro +Succinyl-Ala-Ala-Pro



24

12, 47-53 (1999).

Amélioration de l’énantiosélectivité d’une lipase de Pseudomonas aeruginosa

0 1 2

Génération 3 :

1 lipase mutée (6 mutations)

E(S) > 51

E > 51

E = 32

E = 1,1

Cassette

mutagenesis

DNA shuffling ou

Cassette mutagenesis

E

M.T. Reetz et al, PNAS, 2004, 101, 5716-5722

Criblage de 8000 lipases mutées

1 2 3

Génération



25

Plan



▪ Atouts

▪ Limites

▪ Leviers

Club Biocatalyse en Synthèse Organique (CBSO)

Enjeux et perspectives

Un réseau de 15 laboratoires

français spécialisés en Biocatalyse

Des biotechnologies blanches pour une chimie verte

Club Biocatalyse en Synthèse Organique



28

Présidente

Laurence Hecquet – ICCF-Clermont-Ferrand

Secrétaire

Didier Buisson –MNHN-– Paris 5

Trésorier

Véronique Alphand– ISM2- Marseille

Membres industriels

Sandrine Moreau - Servier - Orléans

Sébastien Roy - Sanofi Aventis - Chilly Mazarin

Rob Ter Hall - Libragen - Toulouse

Membres acédémiques

Véronique de Bérardinis - Genoscope CEA-Evry

Bastien Doumèche - ICBMS- Lyon

Sandrine Morel- LISBP- Toulouse

Conseil d’administration



29

Ingénierie des enzymes (clonage, mutagenèse, évolution dirigée) Criblage de banques génomiques Etude des enzymes (cinétique, stabilité, activité en conditions non usuelles) Mise en oeuvre des réactions (déplacement d’équilibre, Immobilisation) Purification et caractérisation des produits Génie des bioprocédés

Colloques organisés tous les deux ans réunissant une centaine de participants venant de laboratoires académiques ou industriels pour favoriser les collaborations et le dialogue de scientifiques aux compétences complémentaires (biologie, chimie, génie des procédés).

Objectifs

Techniques

Actions

Partenaires

Industriels

Contrats

publics

Utilisation d’enzymes en tant que biocatalyseurs de réactions chimiques pour synthétiser

des composés de haute valeur ajoutée le plus souvent chiraux.

SCF (groupe chimie et biotechnologie) et de l’ADEBIOTECH

Liens

Rhodia-Solvay, L’Oreal, Adisseo, SERVIER, Limagrain, Tate&Lyle, Airbus, SOFIPROTEOL,

Carbios, Lesaffre, Roquette, Bonduelle, Proteus, LibraGen, Greentech, Goemar, BicT,

CorsicaEssence, Naturamole, IDCaps (contrat Cifre), Seprosys (contrat Cifre), LEA Nature,

Glycoteam, Ingredia, CTC, Gecco, Deinnove

Nationaux : 5 ANR en partenariat (20 ANR , 3 IA : TWB, PIVERT, IDELG)

Internationaux : 2 COST (1 projet FEDER-Région Bretagne, 1 Erasmus Mundus, 2 FP7)



LIENS, UMR 7266 La Rochelle Contacts : Pr. M. Graber; T. Maugard

Enzymes : lipases, glycosidases, protéases

Applications : Biocatalyse en milieux non conventionnels,

biocatalyse hétérogène

ICCF, UMR 6296 CNRS Clermont-Ferrand Contact : Pr. L. Hecquet

Enzymes : Aminotransférases, aldolases, transcétolases,

Applications: Biocatalyse, criblage, Immobilisation,

biocapteurs

ENSAIA, Nancy Contacts : Pr J.-M. Engasser, Pr M. Ghoul

Enzymes : Lipases, glycosidases, polymérisation

par laccases, peroxydases

ICBMS, UMR 5246, Lyon Contact : Pr. L. Blum, B. Doumèche

Enzymes : Laccases, Déshydrogenases, péroxydases

Applications : Biocatalyse hétérogène, biocapteurs,

Immobilisation, biopiles, luminescence

ISm2, UMR 7313 - Aix Marseille Université, Marseille . Groupe BioCat . Contact : V. Alphand

Enzymes : Epoxydes hydrolases, Baeyer-Villigerases, cyclopropanases,

lipoxygénases, laccases, …

Applications : Synthèses asymétriques biocatalysées, procédés biocatalytiques

. Plateforme Analyse et Valorisation de la Biodiversité. Contact :Pr. G. Iacazio

Applications : analyse génétique et fermentation

Ufip, FRE CNRS 3478 Nantes Contact: Pr. C. Tellier

Enzymes : Glycosidases, uronates lyases

Sciences Chimiques de Rennes , UMR 6226

Rennes Contacts : C. Nugier-Chauvin, Pr. V. Ferrières

Enzymes : Glycosidases , transglycosidases, lipases

Applications: Synthèses d’oligofuranosides rares,

Fonctionnalisation de glucanes

Genoscope, CEA-UMR 8030 CNRS Evry Contact : M. Salanouba , V. Bérardinis

Banque génomiques

Applications : Séquençage, criblage d’activités

enzymatiques, biocatalyse

Institut Pascal, UMR 6602 CNRS , Clermont-Ferrand Contact : Pr. C. Laroche

Applications : Génie des procédés, études des voies

métaboliques, production de métabolites

MCAM, UMR 7245 MNHN, Paris 5 Contact : D. Buisson

Enzymes : Micro-organismes entiers,

Applications: Sélection de souches, métabolisme,

Synthèses biocatalysées

ICMMO, UMR 8182 Orsay .Equipe G2M : Contact : C. Le Narvor

Enzymes : Sulfatases, sulfotransférases, Laccase

.Equipe Chimie Bioorganique et Bioinorganique

Contact : R.Ricoux

Enzymes : Hémoprotéines artificielles

Applications : Modifications enzymatiques d’oligosaccharides

IRECELYON, UMR 5256, Lyon Contact : L. Christ

Enzymes : Anhydrase Carbonique, Lipases

Applications : Captage CO2, transestérification

huile végétales

LISBP, UMR INSA/CNRS 5504 UMR INSA/INRA 792, Toulouse Contacts : Pr. M. Remaud-Simeon, Pr. P. Monsan

Enzymes : Lipases, Glucane saccharases, lignocellulases

Applications : Ingénierie d’enzymes, criblage de banques métagénomiques,

biocatalyse

ICOA, UMR 7311, Orléans Contact : Pr R. Daniellou

Enzymes : Glycosidases, Glycosyltransférases

Applications : synthèses chimio-enzymatiques

Institut Charles VIOLLETTE – Lille 1 Contacts : Pr P. Dhulster, Dr-HDR R. Froidevaux

Enzymes : Protéases, Lipases, Isomérases, kératinases

Applications : Biocatalyse, Immobilisation, Criblage à haut

débit d’enzymes, Bioprocédés, Plate-forme REALCAT


Substrat Produit

Enzymes utilisées en synthèse par les différents laboratoires

Biocatalyseur

Synthons


O

O

R*

S

OH

OHHO

HO

N

HO OH

CH2OH

H


32

Mono-, oligosaccharides Glycosidases Glycosylation

Transglycosidases Glycosylation

Glucanesaccharases Glycosylation

Glycosyltransférases Glycosylation

Thioligases Ligation

Lignocellulases Hydoxylation

Sulfatases Hydrolyse

Aldolases Liaison C-C

Transcétolase Liaison C-C

Laccases Oxydation, Hydroxylation

Polymérisation, dégradation de

lignine, réduction de l’oxygène

Peroxydases Chimiluminescence

Aminotransférases Transamination

Epoxydes hydrolases Hydrolyse d’époxydes

Baeyer-Villigerases Baeyer-Villiger, sulfoxydation

Cyclopropanases Cyclopropanation

Lipoxygénases Hydroperoxydation d’acides gras

Anhydrase carbonique Captage de CO2

Lipases Acylation, hydrolyse

Expertises pluridisciplinaires des laboratoires : approches intégratives



33

Biologie

moléculaire Modélisation

moléculaire

Bioprocédés

Biochimie

Substrat Produit Enzyme

Extraction et

purification

du produit

Mise en œuvre


préparative

Sélection

de l’enzyme

Essais

analytiques

Ingénierie

de l’enzyme

LIENS, UMR 7266 La Rochelle

Contacts : Pr. M. Graber; T. Maugard

Enzymes : lipases, glycosidases, protéases

Applications : Biocatalyse en milieux non conventionnels,

biocatalyse hétérogène

Biocatalyse-Bioprocédés, ENSAIA, Nancy

Contacts : Pr J.-M. Engasser, Pr M. Ghoul

Enzymes : Lipases, glycosidases, polymérisation

par laccases, peroxydases

ICBMS , UMR 5246, Lyon

Contact : Pr. L. Blum, B. Doumèche

Enzymes : Laccases, Déshydrogenases, péroxydases

Applications : Biocatalyse hétérogène, biocapteurs,

Immobilisation, biopiles, luminescence

Ufip, FRE CNRS 3478 Nantes

Contact: Pr. C. Tellier

Enzymes : Glycosidases, uronates lyases

Sciences Chimiques de Rennes , UMR 6226 Rennes

Contacts : C. Nugier-Chauvin, Pr. V. Ferrières

Enzymes : Glycosidases , transglycosidases, lipases

Applications: Synthèses d’oligofuranosides rares,

Fonctionnalisation de glucanes

Institut Pascal, UMR 6602 CNRS , Clermont-Ferrand

Contact : Pr. C. Laroche

Applications : Génie des procédés, études des voies

métaboliques, production de métabolites

MCAM, UMR 7245 MNHN, Paris 5

Contact : D. Buisson

Enzymes : Micro-organismes entiers,

Applications: Sélection de souches, métabolisme,

Synthèses biocatalysées

ICMMO, UMR 8182 Orsay

.Equipe G2M : Contact : C. Le Narvor

Enzymes : Sulfatases, sulfotransférases, Laccase

.Equipe Chimie Bioorganique et Bioinorganique

Contact : R.Ricoux

Enzymes : Hémoprotéines artificielles

Applications : Modifications enzymatiques d’oligosaccharides

IRECELYON, UMR 5256, Lyon

Contact : L. Christ

Enzymes : Anhydrase Carbonique, Lipases

Applications : Captage CO2, transestérification

huile végétales

ICOA, UMR 7311, Orléans

Contact : Pr R. Daniellou

Enzymes : Glycosidases, Glycosyltransférases

Applications : synthèses chimio-enzymatiques

Institut Charles VIOLLETTE –Lille 1

Contacts : Pr P. Dhulster, Dr-HDR R. Froidevaux

Enzymes : Protéases, Lipases, Isomérases, kératinases

Applications : Biocatalyse, Immobilisation, Criblage à haut

débit d’enzymes, Bioprocédés, Plate-forme REALCAT

Recherche de

nouvelles enzymes

34

COLLECTION OF~8000 ENZYMES

Dioxygenases

Decarboxylases

Other THPP- Enzymes

Nitrilases

Lipases

BKACE (DUF849)

ADP1 ORFeome

Transaminases

Dehydrogenases

Baeyer Villigerases

Hexokinases

Synthases

Approches intégratives basées sur la découverte de nouvelles enzymes

en partenariat avec le Genoscope/CEA-Evry

Aldolases

Transketolases

Recherche de nouveaux biocatalyseurs par criblage à grande échelle de familles d’enzymes issues de

banques génomiques sur des panels de substrats potentiellement pertinents pour la synthèse de divers

molécules d’intérêt (pharmacie, cosmétique chimie fine).

Experimental Gene Annotation


Banques

génomiques


35

Dioxygenases

Decarboxylases

Other THPP- Enzymes

Nitrilases

Lipases

BKACE (DUF849)

ADP1 ORFeome

Transaminases

Dehydrogenases

Baeyer Villigerases

Hexokinases

Synthases

Aldolases

Transketolases


Projets collaboratifs au sein du CBSO centrés sur la découverte de nouvelles

enzymes en partenariat avec le Genoscope/CEA-Evry


Adv. Syn. Catal. 2013

Adv. Synth. Catal. 2013

Chem. Commun. 2014

Biochimie, 2013

J. Mol. Catal. B : Enz., 2013



36

Dioxygenases

Decarboxylases

Other THPP- Enzymes

Nitrilases

Lipases

BKACE (DUF849)

ADP1 ORFeome

Transaminases

Dehydrogenases

Baeyer Villigerases

Hexokinases

Synthases

Aldolases

Transketolases


Projets collaboratifs au sein du CBSO centrés sur la découverte de nouvelles

enzymes en partenariat avec le Genoscope/CEA-Evry


Adv. Syn. Catal. 2013

Adv. Synth. Catal. 2013

Chem. Commun. 2014

Biochimie, 2013



37

Evaluation du gain sur le plan environnemental

Interdisciplinarité (biologie moléculaire / chimie / modélisation moléculaire)

Collaborations entre laboratoires académiques et industriels

Catalyse enzymatique / Catalyse chimique

Perspectives de la catalyse enzymatique

Amélioration et modification des enzymes par mutagenèse

Exploration de la biodiversité pour la recherche de nouvelles activités enzymatiques

Le rendement n’est plus le seul paramètre à considérer




38

La biocatalyse pour une chimie verte: enjeux et … · réduisant des rejets toxiques ......

Documents

Transcript of La biocatalyse pour une chimie verte: enjeux et … · réduisant des rejets toxiques ......