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iQ-Check® Legionella spp pour la recherche et le dénombrement des legionella spp dans tous types d’eau Janvier 2020

Méthode qualitative et quantitative

Attestation n° BRD 07/15-12/07 BIORAD 3 boulevard Raymond Poincaré 92430 MARNES – LA - COQUETTE FRANCE

Ce rapport comprend 28 pages dont 6 annexes. La reproduction de ce rapport n’est autorisée que sous

sa forme intégrale.

AFNOR Validation Rapport de ynthèse iQ-Check® Legionella spp

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Preambule Méthode étudiée: iQ-Check® Legionella spp Protocole de validation: Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0 Méthode de référence : NF T90-471 (juin 2015) : Qualité de l’eau - Détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (RT-PCR). ISO/TS 12869 (avril 2019) : Qualité de l'eau - Détection et quantification de Legionella spp. et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR). Domaine d’application: Tous types d’eau Organisme de certification: AFNOR Certification (http://nf-validation.afnor.org/)

AFNOR Validation Rapport de synthèse iQ-Check® Legionella spp

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1 INTRODUCTION 5

2 ETAT DES MODIFICATIONS INTERVENUES DEPUIS LA PRECEDENTE VALIDATION 5

2.1 HISTORIQUE DE LA VALIDATION 5

2.2 BILAN DES MODIFICATIONS INTERVENUES DANS LA METHODE ALTERNATIVE 7

2.3 BILAN DES RECLAMATIONS UTILISATEURS CONCERNANT LA METHODE 7

3 PROTOCOLES DES METHODES 7

3.1 PRINCIPE DE LA METHODE 7

3.2 REFERENCES DU PROTOCOLE 9

3.3 RESTRICTIONS 9

3.4 METHODE DE REFERENCE 9

4 SYNTHESE DES RESULTATS OBTENUS 10

4.1 ETUDE COMPARATIVE 10

4.1.1 RACCORDEMENT DE LA SOLUTION CALIBRANTE ET DU MATERIAU DE REFERENCE A L’ETALON PRIMAIRE. 10

4.1.2 FONCTION DE CALIBRAGE 11

4.1.3 VALIDATION DE LA LIMITE DE DETECTION 12

4.1.4 VALIDATION DE LA LIMITE DE QUANTIFICATION 13

4.1.5 RESULTATS 14

4.1.6 SEUIL DE POSITIVITE 14

4.1.7 ETUDE DU RENDEMENT ET DE LA ROBUSTESSE DE L’EXTRACTION 14

4.1.8 SELECTIVITE : INCLUSIVITE ET EXCLUSIVITE 15

4.1.9 PRATICABILITE 16

4.2 ETUDE INTERLABORATOIRE 17

4.2.1 METHODOLOGIE 17

4.2.2 RESULTATS 17

4.2.3 CONCLUSION 18

5 CONCLUSIONS 18

6 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 18

ANNEXE 1 : RACCORDEMENT A L’ETALON PRIMAIRE 20

ANNEXE 2 : FONCTION DE CALIBRAGE 21

ANNEXE 3 : LIMITE DE DETECTION 22

ANNEXE 4 : LIMITE DE QUANTIFICATION 23


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4

ANNEXE 5 : RENDEMENT ET ROBUSTESSE 24

ANNEXE 6 : SELECTIVITE 27


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1 Introduction Les kits iQ Check® Legionella spp. et iQ Check® Legionella pneumophila ont été validés en 2007. Puis, ils ont fait l’objet de reconduction en 2011 et 2015 et d’une extension en 2012. BIORAD souhaite reconduire la méthode iQ Check® Legionella pneumophila selon le « Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0 ».

2 Etat des modifications intervenues depuis la précédente validation

2.1 Historique de la validation 2007 : � La méthode a été initialement validée en 2007. 2011 : � L’étude réalisée en 2010/2011 en vue de la reconduction de validation, a tenu

compte des modifications apportées à la fois au kit validé et au protocole de validation (révision n°1 prenant en compte la norme NF T90-471 publiée en avril 2010).

� Une étude tierce partie a porté sur les 2 premières phases du protocole de validation, afin de vérifier les performances annoncées par le fournisseur pour la nouvelle formulation du kit iQ-Check® L. pneumophila :

- Phase 1 : étude des limites de détection et de quantification de l’étape PCR, de la fonction de calibrage, du raccordement à l’étalon primaire, du rendement et de la robustesse de l’extraction en utilisant le kit Aquadien™. Le nouveau thermocycleur CFX 96 a été mis en œuvre.

- Phase 2 : étude de l’inclusivité et de l’exclusivité, de la praticabilité et de la qualité des réactifs.

� L’étude inter-laboratoire réalisée en 2007, n’a pas été refaite


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� Les modifications intervenues depuis la validation initiale étaient les suivantes : - Dans le kit iQ-Check® L. pneumophila : origine différente de la Taq

polymerase et évolution de la chimie des sondes du contrôle interne (fluorophore TEXAS RED remplacé par le fluorophore HEX).

- Dans le kit Aquadien™ : 2 modalités d’utilisation selon la filtrabilité des échantillons (un protocole W2 pour échantillons colmatants s’ajoute au protocole classique) et la microfiltration double-tangentielle remplace la microfiltration horizontale pour l’étape de purification de l’ADN. Les membranes et matériaux restent de même composition.

- Un nouveau thermocycleur peut être utilisé : le CFX96 avec le logiciel CFX Manager Sofware Industrial Diagnostic Edition en version V1.1.

2012 : � Une extension de validation a été prononcée en 2012 suite à l’évolution des

caractéristiques du thermocycleur CFX96, qui devient le CFX96 Deep Well Touch. Les modifications portent sur le volume réactionnel du bloc chauffant, sur l’interface utilisateur (clavier et écran), et sur le logiciel CFX Manager qui passe en version V1.2.

� Le Bureau Technique d’AFNOR Certification a qualifié ces évolutions comme mineures et sans impact sur les performances du kit, aucun essai supplémentaire n’a donc été réalisé.

2013 : � Fin mai 2013 , la validation de la méthode iQ-Check® L. pneumophila a été

étendue à la norme ISO/TS 12869. Aucun complément d’étude de validation n’a été nécessaire : les essais précédemment réalisés selon la norme NF T90-471 répondent aux exigences de la norme ISO/TS 12869.

� Novembre 2013 : Evolution de la version du logiciel CFX manager IDE v2.1. Aucun complément d’étude de validation n’a été nécessaire

2015 : � Mars 2015 Evolution de la version du logiciel CFX manager IDE v2.2. Aucun

complément d’étude de validation n’a été nécessaire � Octobre 2015 : reconduction de la méthode iQ-Check® L. pneumophila avec

extension sur la détection (recherche qualitative) Legionella pneumophila sans test supplémentaire. Le Bureau Technique d’AFNOR Certification a qualifié cette évolution comme sans impact sur les performances du kit, aucun essai supplémentaire n’a donc été réalisé.

2018 : � Juin 2018 Evolution de la version du logiciel CFX manager IDE v3.0. Aucun

complément d’étude de validation n’a été nécessaire


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L’historique de validation est résumé dans le tableau ci-après :

Méthode

certifiée

Date

approbation Objet commentaires Labo expert

Protocole de validation

PCR

iQ-check®

Legionella

pneumophila

18/12/2007 Validation IPL SED Nord Rev. 0 (2006)

10/06/2011 Reconduction 1

Evolution du mix PCR

2 modalités d’extraction (protocole W2)

Mise à jour selon protocole version 1

IPL SED Nord Rev. 1 (2011)

04/04/2012 Extension 1 Nouveau thermocycleur (Deep Well touch) Eurofins IPL Nord Rev. 1 (2011)

27/05/2013 Extension 2 Protocole de validation V.2 NA Rev. 2 (2013)

05/11/2013 Modification Logiciel V2.1 NA Rev. 2 (2013)

09/03/2015 Modification Logiciel V2.2 NA Rev. 2 (2013)

18/12/2015 Reconduction 2

Les modifications entre la version 2.0 et 3.0 du protocole de validation AFNOR concerne le seuil de positivité (détection qualitatif) et n’ont pas engendrées d’étude complémentaire.

AdGene avec

extension sur test

qualitatif

Rev 3 (2015)

Juin 2018 Logiciel V3.0

Dec. 2019 Reconduction 3 AdGene Rev 3 (2015)

2.2 Bilan des modifications intervenues dans la méthode alternative

Le protocole de validation est identique à celui de la dernière reconduction. Modifications de la méthode alternative Il n’y a pas eu de modifications de la méthode alternative depuis la dernière reconduction. Il n’y a pas eu de modification de notice depuis la précédente reconduction.

2.3 Bilan des réclamations utilisateurs concernant la méthode Aucune réclamation client utilisateur n’a été enregistrée par AFNOR Certification.

3 Protocoles des méthodes

3.1 Principe de la méthode Le kit iQ Check® Legionella spp. est un kits destiné à la détection ou la quantification des bactéries du genre Legionella dans les échantillons d’eau, à l’aide de la PCR (Réaction de Polymérisation en Chaine) qui permet grâce à des séquences spécifiques du genre Legionella d’être amplifiées et détectées grâce à des sondes fluorescentes.


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Le principe repose sur trois étapes : - Filtration de l’échantillon - Extraction de l’ADN via le kit Aquadien™ (et protocole W2 pour les

échantillons colmatant) - Amplification des séquences cibles Legionella spp.

L’extraction de l’ADN via le kit Aquadien™ repose sur une lyse alcaline et un choc thermique suivi d’une purification par ultrafiltration. Une fraction de cet ADN est ensuite utilisée pour être amplifiée par PCR en temps réel. Au cours de la réaction de PCR, les amorces s’hybrident à la région cible. La Taq polymérase utilise alors ces amorces et les desoxynucléotides triphosphates (dNTPs) pour élonger l’ADN créant des copies de l’ADN cible de Legionella spp. Durant la PCR, la sonde oligonucléotidique spécifique s’hybride aux amplicons. Cette sonde est marquée par un fluorophore qui émet une fluorescence uniquement après hybridation aux amplicons. En présence d’ADN cible dans l’échantillon, l’intensité de la fluorescence croit proportionnellement à l’augmentation de la quantité de produits amplifiés. La fluorescence est mesurée directement par le module optique du thermocycleur pendant l’étape d’hybridation. Le logiciel associé à l’appareil affiche en temps réel l’intensité de la fluorescence mesurée en fonction du nombre de cycle d’amplification. Pour chaque réaction, le logiciel détermine un Ct (cycle à partir duquel la fluorescence est supérieure au bruit de fond). La lecture des valeurs de Ct permet de détecter la présence des séquences d’ADN cibles de Legionella spp., qui signale la présence de la bactérie dans l’échantillon d’eau analysée. La quantification est possible en utilisant des solutions d’ADN calibré iQ Check® Legionella Quantification Standards, raccordées à l’étalon primaire du Centre National de Référence des Légionelle. Pour chaque échantillon, un ADN synthétique servant de contrôle interne (IPC) est inclus dans la solution d’amplification pour détecter d’éventuels phénomènes d’inhibition de la PCR. L’IPC est amplifié en même temps que les séquences cibles de legionella spp., avec les mêmes amorces, mais détecter avec un autre fluorophore.


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Les kits iQ Check® Legionella spp. sont validés avec les matériels suivants :

Logiciel Opticon Monitor 3.4 CFX manager Software

Industrial Diagnostic

Edition v2.2

CFX manager Software

Industrial Diagnostic

Edition V3.0

Chassis PTC-200 C1000 C1000 touch

Tête optique / bloc chauffant Chromo4 CFX96 CFX96 Deep well touch

3.2 Références du protocole Aquadien™ (Réf. 3578121) : 12/2015 – Code : 881116 iQ-Check® Legionella spp (Réf. 3578102) : 12/2015 – Code : 881117

3.3 Restrictions

La certification du kit porte sur l’utilisation avec les thermocycleurs Bio-Rad Chromo™4 et CFX96 Deep well Touch.

3.4 Méthode de référence

� NF T90-471 (juin 2015) : Qualité de l’eau - Détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (RT-PCR).

� ISO/TS 12869 (Novembre 2012) : Qualité de l'eau - Détection et quantification

de Legionella spp. et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR).

� Protocole de validation PCR : Protocole de validation pour les méthodes

commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0


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4 Synthèse des résultats obtenus Les résultats présentés ci-dessous ont été obtenus avec la révision V1.0 du protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Ils sont également conformes avec la version V2.0 car elle ne contient aucune modification majeure engendrant d’étude complémentaire.

4.1 Etude comparative 4.1.1 Raccordement de la solution calibrante et du matériau de référence à

l’étalon primaire.

� Méthodologie Le raccordement de la solution calibrante de travail à l’étalon primaire est effectué pour couvrir le domaine de quantification avec 3 gammes de solutions d’ADN calibré iQ-Check® Legionella spp. et comprenant 4 niveau de concentration d’unités génome de Legionella pneumophila sérogroupe (QS1, QS2, QS3, QS4) et 3 gammes indépendantes d’étalon primaire préparées en ciblant les 4 niveaux de concentration de la gamme d’ADN calibré iQ-Check® Legionella Quantification Standards. Le raccordement du matériau de référence à l’étalon primaire a été évalué en analysant les résultats de deux dépôts du matériau de référence fourni avec le kit iQ-Check® Legionella spp. Les 6 gammes indépendantes obtenues et le matériau de référence ont été analysées avec le kit iQ-Check® Legionella spp. au cours de la même série d’amplification sur le thermocycleur CFX96.

� Résultats Les paramètres analysés pour évaluer le raccordement des solutions calibrantes et du matériau de référence à l’étalon primaire sur le thermocycleur CFX96 et chromo 4 sont repris dans le tableau suivant :


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Droite de régression Corrélation Efficacité (%)

Gamme de référence (CFX96) C(t) moyen = -3,198.log(x) + 39,076 0,998 105,5

Gamme de référence (Chromo 4) C(t) moyen = -2,891.log(x) + 38,674 0,995 121,75

Solution calibrante Erreur de calibrage

QS1 QS2 QS3 QS4

Par niveau (CFX96) 0,07 0,20 0,14 0,07

Par niveau (Chromo 4) 0,03 0,30 0,23 0,16

Moyenne (CFX96) 0,12

Moyenne (Chromo 4) 0,18*

Equivalence des pentes (CFX96) 0,00

Equivalence des pentes (Chromo 4) 0,13

Matériau de référence Erreur de calibrage

CFX96 0,19

Chromo 4 0,19

* Avec le thermocycleur Chromo 4, l’erreur de calibrage de la solution calibrante est de 0,18 log. Néanmoins, l’équivalence des pentes de la gamme de référence et de la solution calibrante est vérifiée. L’erreur de calibrage de la solution calibrante est inférieure à 0,15log. Les pentes de la gamme de référence et de la solution calibrante sont équivalentes. Les données brutes sont présentées en annexe 1.

� Conclusion

Sur le thermocycleur CFX96, la solution calibrante et le matériau de référence du kit iQ-Check® Legionella spp satisfont les conditions de raccordement à l’étalon primaire. Sur le thermocycleur Chromo 4, la solution calibrante satisfait globalement les conditions de raccordement à l’étalon primaire. Le matériau de référence du kit iQ-Check® Legionella spp satisfait les conditions de raccordement à l’étalon primaire. 4.1.2 Fonction de calibrage

� Méthodologie L’étude de la fonction de calibrage est réalisée en déposant 5 gammes différentes de solutions d’ADN calibré iQ-Check® Legionella Quantification Standards (comprenant 4 niveaux de concentration d’unités génomes de Legionella pneumophila), fournie avec le kit iQ-Check® Legionella spp. Les 5 mesures ont été effectuées avec le kit iQ-Check® Legionella spp. pour chaque niveau de concentration dans les conditions de reproductibilité.


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� Résultats Dans ces conditions, l’équation de la droite de régression et l’efficacité de la réaction de PCR ont été définis. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.

Droite de régression -3,197.log(x) + 41,347

Efficacité 105,5%

Performances de la régression linéaire :

QS1 QS2 QS3 QS4

Biais 0,06 -0,10 0,00 0,04

Ecart type 0,12 0,06 0,08 0,05

Exactitude de linéarité 0,13 0,12 0,08 0,07

Incertitude de linéarité 0,42 0,37 0,27 0,22

Les données brutes sont présentées en annexe 2.

� Conclusion Pour chaque niveau de la gamme, la régression linéaire satisfait l’exigence d’exactitude inférieure à 0,15. La linéarité est donc vérifiée sur tout le domaine couvert par la gamme de solutions d’ADN calibré iQ-Check® Legionella Quantification Standards fournie avec le kit iQ-Check® Legionella spp. 4.1.3 Validation de la limite de détection

� Méthodologie L’évaluation de la limite de détection a été réalisée à partir de 30 dilutions indépendantes d’ADN de Legionella pneumophila à 5 UG par PCR. Les amplifications en duplicat ont été faites dans des conditions de répétabilité. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.


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� Résultats

L’ensemble des résultats est présenté en annexe 3.

� Conclusion

Les 30 duplicats sont positifs, la limite de détection est donc validée pour 5 UG/puits de PCR. L’ensemble des Ct présentés dans le tableau ci-dessus est inférieur à la l’intercept. La détection qualitative est conforme. 4.1.4 Validation de la limite de quantification

� Méthodologie L’évaluation de la limite de quantification est réalisée en analysant 30 dilutions indépendantes de Legionella pneumophila à 15 UG par puit de PCR. Les 30 solutions ont été amplifiées simultanément en duplicat. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.


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4.1.5 Résultats

Résultats Valeurs théoriques ou

critères de validation

Moyenne x’ (Log UG/puits) 1,309 1,279

Ecart-type (Log UG/puits) 0,097

Biais 0,030

Exactitude de LQ 0,101 0,15

Incertitude de la LQ 0,207

L’ensemble des résultats est présenté en annexe 4.

� Conclusion La valeur de l’exactitude de la limite de quantification estimée à 0,101. Cette valeur est inférieure à 0,15. La limite de quantification à 0,15 UG/puits PCR du kit iQ-Check® Legionella spp. est validée. 4.1.6 Seuil de positivité Le manuel utilisateur prévoit un Cq de 43 au-delà duquel les échantillons sont considérés comme étant inférieure à la limite de détection. L’ensemble des valeurs obtenues pour caractériser la limite de détection a un Cq plus faible que celui de 43. Cette valeur correspond donc bien à un seuil de positivité comme étant inférieure à la limite de détection. 4.1.7 Etude du rendement et de la robustesse de l’extraction

� Méthodologie Les études de rendement ont été réalisées avec le kit d’extraction Aquadien™ (pour les eaux propres), et Aquadien W2 (pour les eaux colmatantes). Le rendement a été évalué sur 10 échantillons indépendants, artificiellement contaminés à deux niveaux de concentration (1000 et 100 000 UG/puit PCR) de Legionella pneumophila ATCC 33152 et pour 3 matrices différentes : eau stérile, eau chaude sanitaire, eau de tour aéro-réfrigérante. Les échantillons ont été artificiellement contaminés par la suspension mère dont la concentration a été déterminée par 3 quantifications après une étape d’extraction de l’ADN par le protocole de lyse directe sur 3 aliquots. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.


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� Résultats

Rendement

Protocole Aquadien Protocole Aquadien W2

Log Moyenne Log Moyenne

Eau chaude sanitaire 1000 UG/L

100 000 UG/L

-0,29

-0,39 -0,34

-0,16

-0,45 - 0,30

Eau de tour

aéroréfrigérante

1000 UG/L

100 000 UG/L

-0,09

-0,31 -0,20

-0,45

-0,47 - 0,46

Eau minérale 1000 UG/L

100 000 UG/L

-0,25

-0,42 -0,33

-0,55

-0,46 - 0,50

Rendement moyen (log) -0,29 -0,41

Variance (log) 0,04 0,03

Incertitude globale élargie (log) 0,71 0,89

Les données brutes sont présentées en annexe 5.

� Conclusion

L’étude du rendement et de la robustesse de la méthode permet d’évaluer le rendement moyen de :

- la méthode Aquadien à -0,29 log - la méthode Aquadien W2 à -0,41 log

Les rendements avec les deux méthodes d’extraction sont conformes aux critères -0,6 log / +0,3 log (ce qui correspond à un rendement compris entre 25 % et 199 %). 4.1.8 Sélectivité : inclusivité et exclusivité Pour chacune des souches testées, l’ADN a été extrait à partir d’une suspension bactérienne pure.

� Inclusivité Les essais d’inclusivité ont été réalisés sur des extraits d’ADN à une concentration d’environ 100 UG/puits PCR, estimée à partir de la suspension bactérienne par une mesure de la DO à 600 nm. Les ADN des 35 souches Legionella testées (15 Legionella pneumophila et 20 Legionella spp) ont montré une amplification. Les résultats sont présentés en annexe 7.


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� Exclusivité Les essais d’exclusivité ont été réalisés sur des extraits d’ADN à une concentration d’environ 10 000 UG/puits PCR estimée à partir de la suspension bactérienne par une mesure de la DO à 600 nm. Les ADN des 16 souches testées montrent l’absence d’amplification sauf pour 5 d’entre elles où une très faible amplification a été observée. Les résultats sont présentés en annexe 6.

� Conclusion La sélectivité du kit iQ-Check® Legionella spp. est satisfaisante. 4.1.9 Praticabilité

� Facilité d’utilisation : les réactifs sont tous fournis dans les kits, et sont prêts à l’emploi. Les séries d’analyse de 1 à 30 échantillons, dans le cadre d’une quantification, sont faciles à gérer. Un technicien connaissant les techniques de microbiologie, biologie moléculaire ainsi que le thermocycleur et son logiciel peut être formé en 1 jour.

� Rendu de résultats rapide : la durée des différentes phases est compatible avec

un délai de rendu des résultats court (5 heures).

� Sécurisation des résultats : elle est garantie par l’utilisation d’un contrôle interne d’inhibition (dans le même puits que l’échantillon), et par un logiciel d’analyse des résultats. L’utilisation du logiciel assure en outre la traçabilité complète des informations.


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4.2 Etude interlaboratoire 4.2.1 Méthodologie Une étude inter-laboratoire a été réalisée en 2007, avec 14 laboratoires collaborateurs. Les résultats d'un laboratoire n'ont pas été pris en compte en raison d’un problème technique ayant conduit à l’invalidation de l’étalonnage. Au final, 13 laboratoires ont été retenus pour l’exploitation statistique. La finalité de cette étude est d’évaluer la fidélité (répétabilité et reproductibilité) de la méthode iQ-Check® Legionella spp. :

- pour l’étape d’amplification génique seule (envoi de deux solutions d’ADN de L. anisa et L. pneumophila sg1 à deux niveaux de concentration différents);

- pour l’ensemble de l’analyse (concentration, lyse, extraction, purification et

amplification génique) sur des suspensions bactériennes caractérisées de L. pneumophila et Escherichia coli (CIP 54.8) à 2 niveaux de concentration différents;

- pour l’ensemble de l’analyse en situation réelle (eau chaude sanitaire

naturellement contaminée en L. pneumophila et Legionella non pneumophila).

- Egalement, une eau garantie sans ADN de Legionella a été envoyée.

4.2.2 Résultats

Type d’échantillons Solution d’ADNs calibrés Eau de distribution dopée Echantillon naturel

Niveaux de

dopage

(UG/L)

L. pneumophila

ATCC 33152 2000 UG/µl 20000 UG/µl 4000 UG/200 ml 40000 UG/200 ml

Eau chaude sanitaire

naturellement contaminée L. anisa 500 UG/µl 5000 UG/µl 1000 UG/200 ml 10000 UG/200 ml

E. coli 5000 UG/200 ml 50000 UG/200 ml

Nombre de

laboratoires

participant 14 14 14 14 14

retenus 13 13 13 13 13

Test

d’homogénéité

Nbre d’analyses 20 20 9 9 9

Moyenne (Log) 2.91 3.97 3.42 4.41 3.76

Résultats

Moyenne (Log) 3.02 4.11 3.52 4.47 3.69

r (Log) 0.18 0.15 0.28 0.34 0.46

R (Log) 0.43 0.32 0.72 0.66 0.8

Sr (Log) 0.06 0.06 0.10 0.12 0.16

SR (Log) 0.14 0.10 0.24 0.20 0.23


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4.2.3 Conclusion Les valeurs de répétabilité en r (Log), se situent autour de 0,15 pour les solutions d’ADN (étape de PCR uniquement), et autour de 0,3 pour les suspensions bactériennes (méthode globale), ce qui est acceptable. Cela signifie qu’au sein d’un même laboratoire, on s’attend à des écarts de mesure, sur un même échantillon, de l’ordre d’un facteur 2. La répétabilité n’apparaît donc pas comme une source majeure d’erreur. Les valeurs de reproductibilité en R (Log) se situent autour de 0,4 pour les solutions d’ADN (étape de PCR uniquement), et autour de 0,7 pour les suspensions bactériennes (méthode globale). Par rapport à la répétabilité, cet ordre de grandeur reste conforme à ce que l’on a l’habitude de rencontrer en analyse microbiologique de l’environnement. Ce qui signifie qu’entre deux laboratoires, on s’attend à des écarts de mesure, sur un même échantillon, de l’ordre d’un facteur 5. La reproductibilité ne participe donc pas de manière démesurée à la dispersion des résultats.

5 Conclusions Les performances de la méthode iQ-Check® Legionella spp. sont conformes aux exigences des normes NF T90-471 et ISO/TS 12869 ainsi qu’au protocole de validation AFNOR : Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0. Le kit iQ-Check® Legionella spp est un kit validé pour la détection et la Détection et Quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (qPCR)

6 Etude bibliographique

Trois études ont été publiées depuis 2016 :

� Ditommaso, S., Giacomuzzi, M.,Elisa Ricciardi, M. Zotti, C., 2016. Cultural and Molecular Evidence of Legionella spp. Colonization in Dental Unit Waterlines: Which Is the Best Method for Risk Assessment? International Journal of Environmental Research and Public Health. 13(2): 211

� Montagna, M. T., et al. 2017. Evaluation of Legionella Air Contamination in

Healthcare Facilities by Different Sampling Methods: An Italian Multicenter Study. International Journal of Environmental Research and Public Health. 14(7): 670


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� Bonetta, S., Pignata, C., Bonetta, S., Meucci, L., Giacosa, D., Marino, E.,

Gilli, G., Carraro, E., 2017. Viability of Legionella pneumophila in Water Samples: A Comparison of Propidium Monoazide (PMA) Treatment on Membrane Filters and in Liquid. International Journal of Environmental Research and Public Health. 14(5), 467

Dans ces articles, les méthodes iQ-Check Legionella ont été employés avec satisfaction.

Il n’y a pas eu de validations externes réalisées par un autre organisme de certification.


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Annexe 1 : Raccordement à l’étalon primaire Résultats provenant iQ-Check™ Quanti Legionella spp – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement

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Annexe 2 : Fonction de calibrage Résultats provenant iQ-Check™ Quanti Legionella spp – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement

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Annexe 3 : Limite de détection Résultats provenant iQ-Check™ Quanti Legionella spp – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement

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Annexe 4 : limite de quantification Résultats provenant iQ-Check™ Quanti Legionella spp – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement

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Annexe 5 : Rendement et robustesse Résultats provenant iQ-Check™ Quanti Legionella spp – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement

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Annexe 6 : Sélectivité Résultats provenant iQ-Check™ Quanti Legionella spp – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement

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