Introduction à la microscopie de fluorescence · 2019-01-10 · Principes de la fluorescence F....

Introduction à la microscopie de fluorescence

François MICHEL PhD

Rev : 10/01/2019

Quelques images en fluorescenceF. Michel 10.01.19

I. Microscopie en transmission

II. Microscopie de fluorescence

➢ 2.1 Fluorescence ??

➢ 2.2 Microscopie à épi-fluorescence

➢ 2.3 Entrons dans la 3ème dimension

➢ 2.4 Imagerie multiphoton

➢ 2.5 Transparisation et feuillet de lumière

III. Imagerie avancée

Ce qui vous attendF. Michel 10.01.19

Principes de la fluorescenceF. Michel 10.01.19

e-

État stable (S0)

État excité (S1) : orbitale électronique extérieure

S0

S12-Relaxation

(10-12 s.)

3-Fluorescence(10-9 à 10-7 s.)

1-Excitation(10-15 s.)

Diagramme énergétique(très simplifié) de Jablonski

Excitation= apport d’énergie

Perte d’énergie (potentielle, thermique, cinétique…) : relaxation

Emission de fluorescence

= perte d’énergie

Molécule fluorescente = Fluorophore


400 500 600 700

Longueur d’onde l (en nm)

UV

Eγ

L’excitation et l’émission sont des phénomènes quantiques : la molécule accepte une certaine quantité d’énergie, ni trop ni trop peu, pour être excitée

et réémet cette énergie autour d’une valeur privilégiée (pic d’émission).

L’énergie d’un photon est : Eγ = hc/λ Où h et c sont des constantes (Planck ; vitesse de la lumière dans

le vide)

IR

S0

S1

ELes différents états

vibrationnels et rotationnels des niveaux

d’énergie se reflètent dans les spectres d’émission et

d’excitation.

488 nm


Exemple : DAPI

Inte

nsi

té d

e f

luo

resc

en

ce

Excitation

l (nm)

Perte d’énergie entre excitation et émissionDécalage vers le rouge : (Stokes shift)

Emission

Plus assez d’énergie pour exciter

Chaque molécule fluorescente a des spectres d’excitation et d’émission qui lui sont propres (influencés par la structure chimique de la molécule et les

conditions physique (pH, T…)).

E1 E2

E1>E2

Pic d’excitation = efficacité d’acceptation des photons

maximale

Pic d’émission

400 500 600300


L’intérêt majeur de la fluorescence résidedans son rapport signal sur bruit trèsfavorable.On peut ajouter d’autres avantages:- spécificité du marquage- compatible in vivo et non toxique- simple d’utilisation- peu chère- versatile…

Protéines fluorescentesF. Michel 10.01.19

Excitation EmissionMax. (nm) Max (nm)

CFP 434 477GFP 489 508YFP 514 527Ds Red 558 583

« Brainbow mouse » Livet et al. Nature 2007

Gènes de méduses ou de coraux optimisées pourdifférentes fonctions et caractéristiques telle que :brillance, spectrale, stabilité, vitesse d’expression, suivi del’activité enzymatique, sensibilité au pH, au Ca2+, au Cl- …

R Tsien : Nobel chimie 2008

Microscope à épi-fluorescenceF. Michel 10.01.19

Illumination Généralement blanche

(Lampe à vapeur de mercure)

Détection

Filtre d’excitation

Miroir dichroïque

Objectif

Caméra

Lumière d’émission

Echantillon

Différents types de filtresF. Michel 10.01.19

lpasse-bas(LP xxx)

passe-bande(BP xxx/yy)

BP 525/50 signifie : le filtretransmet de 500 à 550 nm

tran

smis

sio

n

passe-haut(HP xxx)

400 500 600 700 Longueur d’onde l (en nm)

X UV IR radio

l l

xxx nm

xxx nm

xxx nm

yy nm


Excitation

DAPI Alexa 488 Alexa 555


Excitation

BP455-495

BP520-570

BP420-460(440/40) Passe-haut

HP 575

Emission

Passe-basLP 365

Fluo verte exclue pour éviter la pollution issue de l’excitation de l’A555

BP505-555

Cross-talk

Microscope à épi-fluorescenceF. Michel 10.01.19

Caméra

Miroir dichroïque

Filtre d’émission

Cube à fluorescence

Chaque trio (cube) : miroir dichroïque + filtres d’excitation et d’émission est

propre aux fluorophores observés individuellement et en combinaisons

(marquages multiples)

Bienvenue dans la 3ème dimension

La fluorescence générée hors focus induit un effet de flou qui altère l’image.

On collecte tous les photons issus de la colonne d’illumination (diabolo) .

Z

F. Michel 10.01.19

Bienvenue dans la 3ème dimension

La fluorescence générée hors focus induit un effet de flou qui altère l’image.

On collecte tous les photons issus de la colonne d’illumination (diabolo) .

F. Michel 10.01.19

Microscope à Illumination structurée

Caméra

"Grille"Réseau de lignes

+ +

plan focal de l’objectif

F. Michel 10.01.19

Microscope à Illumination structuréeF. Michel 10.01.19

MIS Plein champs


MIS

Plein champs

Microscope à Illumination structurée

Z : 43 µm

20 µm

40 X (ON=1.3) cube TR tps d’expo : 15 ms (87 plans DZ=0.5 µm)

F. Michel 10.01.19

La MIS peut doubler la résolution : Super-résolution

Microscope à Illumination structuréeMicroscope à Illumination structuréeF. Michel 10.01.19

Avantages de la MIS- Facilité d’utilisation- Sectionnement optique et génération de piles d’images.- Acquisition "rapide" <1 sec / image- Relativement bon marché (+/- 80k€)- Proposé par tous les fournisseurs- Imagerie multi-couleur facile- Peut améliorer la résolution Latérale (150 nm) et axiale

(300 nm)

Désavantages - Nécessite un bon signal- Faible résolution comparativement aux nouvelles

techniques de super-résolution (PALM, STORM …)- Plus faible pénétration Vs Confocal


Microscopie confocaleF. Michel 10.01.19

Microscopie confocale

Miroir dichroïque

• L’illumination par lasers• Illumine l’échantillon par balayage.• La fluorescence est captée par

l’objectif puis filtrée (dichroïque etfiltres d’émission) et envoyée versun détecteur.

• La vitesse de balayage, l’énergie et lepointé du laser jouent sur la qualitéde l’image.

Illumination

F. Michel 10.01.19

Plan focal

Miroirs de scan X-Y

laser

X

Y

Objectif

Microscopie confocaleDétection

Diaphragme(Pinhole)

PMT

F. Michel 10.01.19

Fluorophore hors focus

Microscopie confocale

PMTDétection

Les PMT mesurent la quantité de photons(quelque soit l) en fonction du temps(échantillonnage temporel) et la taille du pixelcorrespond donc au temps t d’intégration dusignal.Au temps t1 le point de scan de coordonnée(x1y1) la fluo a une intensité F1, au temps t2(x2y2) la fluo est F2... L’image est représentéepixel par pixel avec les valeurs Fn (XnYn).

Un PMT est un détecteur qui transformeles photons en électrons et qui amplifie lecourant généré par une forte différence depotentiel entre la photocathode d’entréeet l’anode de sortie (+ de 1000 V).L’amplification est due à l’utilisationd’électrodes intermédiaires (dynodes)portées à des potentiels positifs croissantsqui émettent une gerbe d’électrons àl’arrivé de chaque photo-électron incident.

F. Michel 10.01.19

Microscopie Confocale (résolution)

Microscope à fluorescence Microscope confocal

Resxy=0.61l/ONResz=2l/ON2

Resxy=0.4l/ONResz=1.4l/ON2

Résolution max en xy 220 nmRésolution max en z 600 nm

Résolution max en xy 130 nmRésolution max en z 350 nm

Plus l’ON est grande, meilleure est la résolution

F. Michel 10.01.19

Microscopie Confocale(échantillonnage axial)

Il ne faut pas confondre résolution et épaisseur de coupe optiqueZ=f(ON, n, l, pinehole…)

Le pas optimal de déplacement en Z (DZ) est fonction de la résolution (Resz=1.4l/ON2)

et des lois de l’échantillonnage : 1/2 Resz< DZ <1/3 Resz

1

2

3

1

2

3

41

2

3

4

5

6

F. Michel 10.01.19

Pixels et Voxels …“Picture element” et “volumetric element” ; échantillonage

Z>> X=Y

Y=X et Z=0

X>> Y=Z

Y

Z

X

F. Michel 10.01.19

Microscopie confocale multidimensionnelle

X

Y

Temps

Z

Les dimensions peuvent être : la profondeur Z, le temps T, la couleur l … On peut donc faire des images 3, 4 voir 5D

F. Michel 10.01.19

X

YXY et Z Scan

XY Scan XY Scan

Limitations de la microscopie confocale

➢ Pénétration limitée dans la profondeur du tissu épais(<60 - 200 µm suivant le tissu et le fluorophore)

➢ Photo-blanchiment dans et en dehors du plan focal : limitation de la durée des expériences et du nombre d’image par champs.

➢ Photo-toxicité : Problèmes avec les tissues vivants due à l'énergie issue de l'excitation en lumière UV et au photo-blanchiment.

➢Résolution temporelle inadaptée pour les études in vivo

F. Michel 10.01.19

Microscopie Confocale à spinning disk (Nipkow)

➢ Pénétration limitée dans la profondeur du tissu épais (<40 - 100 µm suivant le tissu et le fluorophore)

➢ Photo-blanchiment dans et en dehors du plan focal plus faible qu’en balayage mono-faisceau

➢ Résolution temporelle adaptée pour les études in vivo (>50 Hz caméras EMCCD)

F. Michel 10.01.19

État virtuel signifie une fenêtre temporelle de 10-18 secondes(une attoseconde) et spatiale de l’ordre de 10-12 cm3 (nuageélectronique).

Eg = hc/l

S0

S1

Relaxation

Fluorescence

Excitation

Source Laser (continue)

g

Principes physiques de la microscopie multiphoton

F. Michel 10.01.19

S0

S1

Relaxation

g

Excitation

g

LASER IR pulsé (femtoseconde)

Fluorescence

État virtuel

(théorie par Maria Goppert-Mayer1929 (prix nobel 1963))

Principes physiques de la microscopie multiphoton

F. Michel 10.01.19

12 500 ps

Faisceau continu Puissance moyenne de 1 à 200 mW

Faisceau pulséPuissance moyenne de 1 à 5 W

= 0,1 ps

les conditions nécessaire à l’excitation bi-photonique impliquent une très haute densité de photons que ce soit d’un point de vue spatial et temporel, conditions remplies par

certain lasers pulsés.

Probabilité d’absorption bi-photonique : A2g = P2/ (.F)

.w>K donc pour 100 fs à 800 nm on a un pulse de 6,7 nmPour 20 fs le pulse est de 33,6 nm

P : puissance moyenne : durée du pulseF : fréquence

L'excitation bi-photonique estrestreinte au point focal

F. Michel 10.01.19

1 photon 2 photons

Point focal

1 photon 2 photons

Le balayage induit une coupe optique intrinsèquement confocale,

inutile d’enlever les photons hors focus (non générés).

Longueurs d’onde d’absorption optimalesF. Michel 10.01.19

Le spectre d’excitation biphotonn’est pas forcement le double

point à point du spectre d’excitation monophoton

(optique non-linéaire).

Excitation 3- photons Exemple : DAPI

Utilisation d’un laser Dont la longueur d’onde est fixe à 1030 nm : T-pulse

(Amplitude Systems).

F. MICHEL 2005

Imagerie bi-photon vs confocaleF. Michel 10.01.19

Confocal

-meilleure résolution

-meilleur rapport signal/bruit

Bi-photon

-plus de bruit

-coupes optiques plus épaisses

20 µm 40 µm 60 µm 80 µm

Faibles profondeurs : objectif 63X à huile

F. MICHEL 2005

Imagerie bi-photon vs confocaleF. Michel 10.01.19

100 µm 120 µm

100 µm 140 µm 170 µm 200 µm

Fin de la tranche…

Confocal

- augmentation de la puissance du laser

- augmentation du bruit

Bi-photon

- augmentation de la puissance

du laser

- acquisition plus facile qu’en

confocal

Pour des profondeurs plus importantes : objectif 63X à eau

F. MICHEL 2005

Immuno and Cell Bio 2010, 88(4):438-44

• Les fenêtres optique 700-900nm et 1100-1300nm sont optiquementtransparente

• Echauffement dans le domaine d’absorption de l’eau =>formation debulles, éclatement de l’échantillon.

Limites du multiphotonF. Michel 10.01.19

Spectre d’absorption de l’eau F. MICHEL 2005

Avantages du multiphotonF. Michel 10.01.19

AVANTAGES

- Volume d’excitation plus faible (intrinsèquement confocale)

- Élimination quasi-totale de la fluorescence hors plan focal

- Moindre photo-blanchiment général et photo-toxicité

- Pénétration plus grande des IR dans les tissus (jusqu’à 1 mm)

- Excitation des fluorophores UV sans lumière UV

- Bonne séparation des lumières d’excitation et d’émission

INCONVENIENTS

- Nécessité d’un important flux de photons

- Balance entre puissance et effets thermiques

délicate

- Coûts et maintenance de l’appareillage lourd

- Pour plus de détails voir film chapitre 3.2

• La Relation structure/fonction en 3D d’échantillons

biologiques est riche d’information

• Nous devons améliorer l’exploration des tissus et des

organes au plus proche de la morphologie in vivo à

des résolutions mésoscopique (du µm au cm)

• plusieurs phénomènes empêchent la transmission

correct de la lumière dans le tissu (diffusion…)

Pourquoi "transpariser" les tissus?F. Michel 10.01.19

La première radio par rayons X

Prix Nobel de physique en 1901 pour sa découverte des rayons X qui peuvent

traverser le corps humain

Wilhlem Conrad Röntgen

Pourquoi "transpariser" les tissus?F. Michel 10.01.19

Comme les rayons X, la lumière est une onde électromagnétique qui interagie avec la matière par :

- Absorption (mélanine, hémoglobine…)- Diffusion / diffraction qui induisent un retard de propagation de

l’onde lumineuse représenté par l’indice optique n ou RI.

Soit c = la vitesse de la lumière dans le videOn a n = la vitesse de propagation de l’onde dans le milieu conducteur

n est proportionnel à la densité de molécules et d’électrons qui vont interagir avec l’onde. Les lipides ont une forte densitéélectronique et ralentissent plus la lumièreque l’eau (nlipides = 1.46)

Un peu plus de physiqueF. Michel 10.01.19

n = c/n et n≥1 Milieu n @ 560 nmeau 1.33

Proteines 1.6Lipides 1.46

Mélanine 1.7Cytoplasme 1.37Membrane 1.48

Noyau 1.39

En pratique, un milieu homogène ne diffuse pas de lumière

L’objectif est d’homogénéiser les indices de réfraction dans les

tissus et d’éliminer les points de diffusion de la lumière. Le RI du

milieu peut être augmenté et/ou le RI des tissus diminué.

Un peu plus de physiqueF. Michel 10/01/2019

Werner SpalteholzAnatomiste(1861-1940)

Comment "transpariser" les tissus?F. Michel 10.01.19

Belle M. et al 2017 Cell

Solvents

(3/i/U)-DISCO - BABB

Simple immersion

Sucrose, Focus

clear, SeeDB

Hyper-hydratation

Urée, Scale, CUBIC

Intégration dans un

hydrogel

Clarity, PACT

Comment "transpariser" les tissus?F. Michel 10.01.19

Milieu inhomogène, tissus biologiques classiques

Milieu homogène, tissus clarifiés

Procédure de clarification : Clarity, I-DISCO, CUBIC,…

Amélioration de la pénétration et réduction de la diffusion de la lumière,

conservation de la fluorescence, …

ClarificationF. Michel 10.01.19

multi-photon(Trimscope II)

TdtomatoCLARITY Oxytocin-GFP,

CUBIC

3 mm

Confocal

Oxytocin-GFP, CUBICTranche de tronc cérebral (1mm)

Observations (épi-fluorescence)F. Michel 10.01.19

Baude A, Tressard T, Matarazzo V, Felix MS … INMED

Avantages du SPIM :• Résolution axiale (1 à 10 µm)• Fort ratio signal/bruit (pas de signal hors focus) ; peu de photo-bleaching et de photo-toxicité• Très rapide (jusqu’à 200 fps) • Grand champs et possibilité de tracking• Prix

Pour revue lire : Huisken J et al 2012 Development

SPIM : la lumière en feuilletF. Michel 10.01.19

Photobleaching

Imaging speed

High

Slow

Low

Fast (1000x)

Observations (feuillet de lumière)F. Michel 10.01.19

Vitesse d’acquisition, photobleaching , grossissement, Résolution spatial, détection de photons…

Microscopie à feuillet de lumière

Microscopie confocaleChoix du microscope dépendant

de la question scientifique

ObservationsF. Michel 10.01.19

Compter les cellules ou quantifier les intensités du signal, dans une région anatomique précise en utilisant les informations d’annotation associées à un atlas

(Baude A, Bollmann Y… INMED)

Analyses à grande échelleF. Michel 10.01.19

Sources et RessourcesF. Michel 10.01.19

WEB divers➢ Molecular expressions http://micro.magnet.fsu.edu/index.html

➢Microscopy U (Nikon) : http://www.microscopyu.com➢Microscopy resource system (Olympus): http://www.olympusmicro.com/index.html

➢A whole world of microscopy knowledge (Zeiss): http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html➢Wikipédia

Plate-formes d’imagerie➢ PICSL http://www.picsl.univ-mrs.fr/ : MICROSCOPIE OPTIQUE (PDF indisponible)

➢ BIC http://www.bic.u-bordeaux2.fr/ : Microscopie à épi-fluorescence et microscopie confocale (PDF)➢Membres du GDR2588 CNRS (microscopie fonctionnelle des systèmes vivants) et

du RTmfm (Réseau technique de microscopie de fluorescence multidimensionnelle).

Cours ➢ Arnaud Sergé (université de la Méditerranée – Marseille II)➢Yves Husson (Université Joseph Fourrier – Grenoble)

➢Serge Monneret (Institut Fresnel, Marseille)➢Maxime Dahan (Laboratoire Kastler Brossel, ENS)➢François Waharte (institut Curie, UMR144)

Handbooks➢Fondamentaux d’optique et d’imagerie numérique à l’usage des microscopistes (C Cibert, ed. Cépaduès)

➢Handbook of biological confocal microscopy, third edition (JB. Pawley ed. Springer)➢Fundamentals of light microscopy and electronic imaging (DB. Murphy, ed Wiley-liss)

Commentaires, remarques, améliorations :[email protected]

http://micro.magnet.fsu.edu/index.html

http://www.microscopyu.com/

http://www.olympusmicro.com/index.html

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html

http://www.picsl.univ-mrs.fr/

http://www.bic.u-bordeaux2.fr/

http://www.gdr2588.cnrs.fr/

http://rtmfm.ibl.fr/

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