La fluorescence

Application à la biologieApplication à la biologie

La fluorescence

I. Principe de la fluorescence

II. Microscopie à épifluorescence

Généralités

• Les fluorophores sont avant tout des chromophores• Les chromophores sont des constituants moléculaires qui absorbent

la lumière hc/λ1,

Ce sont en général des composés aromatiques.

• Excités,les fluorophores peuvent, eux, émettre de la lumière à une longueur d’onde différente hc/λ2

4n+2 e-

Qu’est-ce qu’une molécule fluorescente ? Qu’est-ce qu’une molécule fluorescente ?

Photon(lumière d'excitation)

Émission de fluorescence,de plus faible énergie(plus grande longueur d’onde)

Perte d’énergie

La fluorescence est caractérisée par des transitions électroniques entre un état singulet fondamental et l'état singulet excité.La durée de vie moyenne de l'état excité est de l'ordre de 10-9 à 10-7 s

GFP : τ = 2,1 ns

e-

ENERGIE

Diagramme de Jablonski Diagramme de Jablonski (simplifié)(simplifié)

S0

S1

T1

ABS FL Relax th

PhospPhotoblanchiement

EEexcexc = E = Eemem + chaleur + chaleur (Eexc > Eem)

E = (hc)/ λλexcexc < < λλemem

Les molécules fluorescentes utiles en biologie

• Des protéines

• De petites molécules aromatiques

• Des nanocristaux de semiconducteurs

In

ten

sité

Longueur d’onde (nm)orange rouge

HcRed

EYFPEGFPECFPEBFP DsRed

0

20

60

80

40

100

350 400 450 500 550 600UV bleu vert

mRFP1

Longueur d’onde (nm)orange rouge

HcRed

EYFPEGFPECFPEBFP DsRed

0

20

60

80

40

100

350 400 450 500 550 600UV bleu vert

mRFP1

HcRed

EYFPEGFPECFPEBFP DsRed

0

20

60

80

40

100

0

20

60

80

40

100

350 400 450 500 550 600350 400 450 500 550 600UV bleu vert

mRFP1

Longueur d’onde (nm)

HcRed

EYFPEGFPECFPEBFP DsRed

0

20

60

80

40

100

400 450 500 550 600 700650

UV bleu vert orange rouge IR

mRFP1

Longueur d’onde (nm)

HcRed

EYFPEGFPECFPEBFP DsRed

0

20

60

80

40

100

20

60

80

40

100

400400 450450 500500 550550 600600 700700650650

UV bleu vert orange rouge IR

mRFP1

Ex (nm) Em (nm) ε (M-1. cm-1) F brillance (ε . UA) pKa Remarque

wtGFP neutre 395 508 25-30 000 0,79 21 600 4,5 Aequorea victoria

wtGFP phénolate 475 503 9,5-14 000 ~9 400 Aequorea victoria

EBFP 380 440 31 000 0,18 5 600 bleu

ECFP 434 477 26 000 0,40 10 000 cyan

EGFP 488 509 55 000 0,60 33 000 5,5 vert

EYFP 515 529 80 400 0,61 49 000 6,9 jaune

Venus YFP 510 530 92 000 0,57 52 000 6,0 insensible Cl-1

DsRed ; DsRed2 558 583 57 000 0,79 45 000 4,7 Discosoma striata

mRFP1 584 607 44 000 0,25 11 000 4,5 DsRed monomère

HcRed1 ; HcRed-2A 588 618 faible Heteractis crispa

fluorescéine 490 520 80 000 0,90 72 000 6,3

Quantum Dot 405/605 605 2 400 000 0,40 1 000 000 à valider

GFP

Absorption Rendement Q

Représentation d’une protéine fluorescente tétramérique (asFP595)

Chromophore (GFP) :

-S-Y-G-

Maturation post-traductionnelle du fluorophore de la GFP

Les marquages en immunofluorescenceLes marquages en immunofluorescence

Coupe semi-fine

Antigène

Anticorps secondaire

Anticorps primaire

Echantillon

fluorochrome

Représentation d’un fluorophore inorganique (Alexa 568)

Exemple de quadruple marquageExemple de quadruple marquage

Alexa 488

400 500 600 700 nm

TRITC

Cy5

DAPI ex em

UV IR

PhotoPhotoblanchimentblanchiment (p (photobleachinghotobleaching, fading), fading)F

luor

esce

nce

(%

val

eur

initi

ale)

Temps (secondes)

Alexa 488Oregon Green 514

BODIPYOregon Green 488Fluorescein

Spectre

continu

Observation en lumière transmise

Observation en fluorescence avec un jeu de filtre spécifique de la GFP

Trajet optiqueMicroscope droit

Observation en fluorescence avec un jeu de filtre spécifique de l’Alexa

568.

Exemple d’image en épifluorescence (dendrites de neurone P-GFP)

C’est tout et c’est déjà pas mal !!!!

- immunofluorescence :FITC, TRITC, lissamine rhodamine, Texas Red, Cy3, Cy5, Alexa Fluors

- ADN :iodure de propidium, YOYO, Syto16, chromomycine A3, mithramycine; DAPI, Hoechst, DRAQ5, TOTO3

- mitochondie : sensible au potentiel membranaireRhodamine 123, DiOC6(3), DiOC7(3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post-fixation possible)

- membranes :FM1-43, FM4-64, fusions-GFP, divers anticorps de surface

- Viabilité : FDA, exclusion d’iodure de propidium,… morphologie, avec DIC

- réticulum endoplasmique:(non spécifique) DiOC6(5), GFP-taggée

- appareil de Golgi : GFP-taggée,anticorps, NBD-C6-ceramide (pas pour

végétaux)

- dépendance envers le pH :carboxy-SNARF-1, BCECF

- dépendance envers le calcium :Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed, CalciGreen, Indo-1, Cameleon

- divers :Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophylle,

- Protéines Autofluorescentes

Principaux fluorochromes utilisés en microscopie Principaux fluorochromes utilisés en microscopie en épifluorescence et confocaleen épifluorescence et confocale

Quelques documents

• Wikipedia http://fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescence

• Live Cell Imaging (Goldman&Spector, Cell Press)

• Invitation à la fluorescence moléculaire (Valeur, De Boeck)

• Cell Imaging Techniques (Mossman, Brooke, Taatjes, Douglas, Humanan Press)

• Fluorescence microscopy (Rost , Fre, Cambridge University Press)

Bonus

• GFP photoactivable, photoconversion

• Quantum dots

Les paramètres caractéristiques d’un fluorophore :http://fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescence

• Spectre d’absorption : capacité à absorber la lumière (chromophore) caractérisé par son maximum

• Spectre d’émission : capacité à émettre de la lumière après excitation caractérisé par son maximum

• Décalage de Stokes : mesure l’écartement des deux spectres précédents, en général on préfère les fluorophores ayant un grand « Stokes shift »

• Coefficient d'extinction molaire ε : il mesure la quantité de lumière absorbée par mole de fluorophore (excitabilité) (λ donné)

• Rendement quantique Φ : probabilité qu’un fluorophore excité émette un photon (efficacité de fluorescence) 0<Φ<1

• Brillance : proportionnelle à la quantité de lumière émise par fluorescence à une lumière d’excitation donnée. B = ε x Φ

• Cinétique de photoblanchiment : sensibilité du fluorophore

• Durée de vie à l’état excité (pour certaines applications)

e-

Photo-activation exemple : PA-GFP

Ando, Ryoko et al. (2002) PNAS. 99, 12651-12656

Quantum dot: particule fluorescente non aromatique !!!

10 - 15 nm

Core nanocrystals with size between 3-8 nm(CdSe, CdTe, CdS, ZnSe)

anorganic shell(ZnS, CdS)

organic shell (silica/siloxane,phospholipides, proteins)

Ordre de grandeur - Q-dot

Propriétés

300

200

100

emis

sion

inte

nsity

6040200 t (s)

sampling rate 26.7 Hz

Alexa 488

Q-Dot

bleach resistance of Q-Dots

Brillance = ε.ΦF

eGFP 33 000

Q Dot 1 000 000

• Forte brillance

• Résistance au photoblanchiement

• Clignotement

• Large gamme de spectre accessible en excitant dans le domaine UV

Exemple d’application : suivi de molécules uniques

1 μm