Interferon Gamma Release Assay - Rhumatos
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LES TESTS DE LA TUBERCULOSE DOSSIER 344 Rhumatos • Novembre 2011 • vol. 8 • numéro 72 PRINCIPE DU TEST QUANTIFERON-TB GOLD IN TUBE® Le test QTF est basé sur le fait que les lymphocytes T spécifiques de M. tuberculosis synthétisent des cytokines de type Th1, notamment de l’interféron gamma (IFNγ) lorsqu’ils sont mis en présence d’antigènes mycobactériens (Fig. 1). La détection de l’IFNγ est la base de ces nouveaux tests. Les 3 anti- gènes utilisés sont ESAT 6 (Early Secretory Antigenic Target 6), CFP 10 (Culture Filtrate Protein 10) et TB7.7 (Tuberculosis 7.7). Les gènes codant pour ces anti- gènes sont tous situés dans une région génomique particulière de Mycobacterium tuberculosis (re- gion of difference 1 ou RD 1). Ils ne sont pas présents dans le génome du BCG (vaccin par le bacille de Calmette et Guérin), ni dans la plupart des mycobactéries non tu- berculeuses, mais existent dans le génome de M. kansasii, M. szulgai et M. marinum (1). *Rhumatologue, CHU de Bordeaux LES TESTS ELISA Le test QTF est un système de do- sage sur sang total (Fig. 2). Le sang est prélevé sur tubes héparinés. Les cellules mononucléées du sang périphérique sont incubées avec des protéines de M. tubercu- losis ou des protéines contrôles. Après incubation pendant la nuit, puis centrifugation, le plasma est 3 x 1 ml de sang total Centrifugation pendant 5 min Lavage et addition du substrat Plasma + conjugué Incubation 2 heures à température ambiante Lecture des DO après 30 min Échantillon stable, conservable pendant 8 semaines Incubation a 37 o C pendant 16 à 24 heures Cellule présentatrice d'antigène (CPA) Cellule T spécifique de l’Ag Processing de l’Ag par la CPA Présentation de l’Ag à la cellule T spécifique Production d’IFNγ par la cellule T spécifique de l’Ag IFNγ Antigène Figure 2 - Réalisation du QuantiFERON-TB Gold in tube®. Figure 1 - Principe du test QuantiFERON-TB Gold in tube®. 1 Test de détection de l’IFN γ (Interferon Gamma Release Assay) Comment ça marche ? n Deux tests dont le but est de pallier les limites de l’IDR (Intradermoréaction à la tuberculine) ont récemment été commercialisés : le QuantiFERON-TB Gold in tube ® (QTF) et le T-SPOT. TB ® . Ces tests permettent de mettre en évidence in vitro une réponse immunitaire à l’égard de M. tuberculosis. Dr Laurence Cabantous*
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Les tests de La tubercuLose
DO
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344� Rhumatos • Novembre 2011 • vol. 8 • numéro 72
PRIncIPE Du tESt QuantIFEROn-tB GOlD In tuBE®Le test QTF est basé sur le fait que les lymphocytes T spécifiques de M. tuberculosis synthétisent des cytokines de type Th1, notamment de l’interféron gamma (IFNγ) lorsqu’ils sont mis en présence d’antigènes mycobactériens (Fig. 1). La détection de l’IFNγ est la base de ces nouveaux tests. Les 3 anti-gènes utilisés sont ESAT 6 (Early Secretory Antigenic Target 6), CFP 10 (Culture Filtrate Protein 10) et TB7.7 (Tuberculosis 7.7). Les gènes codant pour ces anti-gènes sont tous situés dans une région génomique particulière de Mycobacterium tuberculosis (re-gion of difference 1 ou RD 1). Ils ne sont pas présents dans le génome du BCG (vaccin par le bacille de Calmette et Guérin), ni dans la plupart des mycobactéries non tu-berculeuses, mais existent dans le génome de M. kansasii, M. szulgai et M. marinum (1).
*Rhumatologue, CHU de Bordeaux
lES tEStS ElISaLe test QTF est un système de do-sage sur sang total (Fig. 2). Le sang est prélevé sur tubes héparinés. Les cellules mononucléées du
sang périphérique sont incubées avec des protéines de M. tubercu-losis ou des protéines contrôles. Après incubation pendant la nuit, puis centrifugation, le plasma est
3 x 1 ml de sang totalCentrifugationpendant 5 min
Lavage etaddition du
substrat
Plasma +conjugué
Incubation2 heures à
températureambiante
Lecture desDO après
30 min
Échantillon stable,conservable
pendant8 semaines
Incubation a 37oCpendant 16 à 24 heures
Cellule présentatrice d'antigène (CPA)
Cellule Tspécifique de l’Ag
Processing de l’Agpar la CPA
Présentation de l’Agà la cellule Tspécifique
Production d’IFNγ par la cellule T
spécifique de l’Ag
IFNγ
Antigène
Figure 2 - Réalisation du QuantiFEROn-tB Gold in tube®.
Figure 1 - Principe du test QuantiFEROn-tB Gold in tube®.
1 test de détection de l’IFnγ (Interferon Gamma Release Assay)
comment ça marche ?
n Deux tests dont le but est de pallier les limites de l’IDR (Intradermoréaction à la tuberculine)
ont récemment été commercialisés : le QuantiFERON-TB Gold in tube® (QTF) et le T-SPOT.
TB®. Ces tests permettent de mettre en évidence in vitro une réponse immunitaire à l’égard de
M. tuberculosis.� dr Laurence cabantous*
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décanté. L’IFNγ sécrétée est quan-tifiée par technique immuno-en-zymatique (ELISA).
En PRatIQuELe test comprend 3 tubes (Fig. 3) : • un tube témoin négatif (Nil), contenant uniquement le sang du patient ;• un tube “test” (antigène) contenant le sang du patient et les antigènes mycobactériens, ESAT 6, CFP 10 et TB7.7 ;• un tube “témoin positif” (mi-togène) contenant le sang du pa-tient et de la phytohémagglutine (PHA), un activateur non spéci-fique des lymphocytes. Ce tube peut être considéré comme une évaluation de la capacité des lym-phocytes T CD4 du patient à sécré-ter de l’IFNγ et donc de l’immunité cellulaire du patient.
Ces tubes doivent être achemi-nés rapidement au laboratoire et sont alors placés en incu-bation pour une durée de 16 à 24 heures. Cette durée d’incuba-tion doit être respectée scrupu-leusement, afin de ne recruter que des lymphocytes effecteurs ayant été récemment en contact avec les antigènes de la tuberculose.
Après incubation, les tubes sont centrifugés et la concentration d’IFNγ est mesurée dans le surna-geant de chaque tube par une mé-thode ELISA. La densité optique obtenue est convertie en unités internationales (UI) à l’aide d’une courbe d’étalonnage.
Le résultat du test est alors rendu “négatif”, “positif” ou “ininter-prétable”, selon les résultats du dosage d’IFNγ dans les trois tubes. L’algorithme d’interprétation est rappelé dans le tableau 1.
γ
Laver et compter les PBMC en utilisant un microscope et une chambre de comptage ou se servir d'un analyseur hématologique automatique.
Mettre les PBMC dans des puits contenant les antigènes et incuber une nuit à 37°C, sous CO2.
Compter les spots. Un spot = 1 cellule T.
Laver et ajouter le substrat
Laver et ajouter l'anticorps secondaire
Mettre l'échantillon de sang dans un tube de préparation cellulaire et centrifuger pour séparer les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)
Étape
1Étape
4
Étape
2Étape
5
Étape
3Étape
6
Avant la centrifugation
Après la centrifugation
Sang total
Gel
Solution dense
PBMC : •Monocytes• cellules B•cellules T (effectrices et mémoire)
Plasma
Globulesrouges
Puit pre-coaté
Cytokine
Antigène
Cellule T effectrice
Anticorps anti-
cytokine
Anticorps secondaire
Non Réactif
Antigènedu panel A
Antigène du panel B
Contrôle positif
RéactifNon
Réactif
Figure 3 - le QuantiFEROn-tB Gold in tube® en pratique.
Figure 4 - Principe du t-SPOt.tB®
nil* antigène moins nil* Mitogène Interprétation du quantiFEROn®≤ 8 uI < 0,35 uI 0,5 uI Négatif ≥ 0,35 et < 25 % Nil 0,5 uI ≥ 0,35 et ≥ 25 % Nil Quelle que soit la valeur < 0,35 uI < 0,5 uI Ininterprétable 0,35 et < 25 % Nil < 0,5 uI > 8 uI Quelles que soient les valeurs * témoin négatif
tableau 1 – Interprétation du QtF selon les résultats des trois tubes.
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t-SPOt tB® : un autRE tESt BaSé SuR la SécRétIOn D’IFnγParallèlement au QTF, un autre test a été développé sur le même principe : le T-SPOT TB® (Fig. 4). Ce dernier adapte à la tuberculose la technique de l’ELISpot. Il utilise les cellules mononucléées du sang, isolées après centrifugation d’un échantillon de sang total du patient. Ces cellules sont lavées puis comp-tées. Elles sont ensuite incubées en
présence ou en absence d’antigènes (ESAT 6 et CFP 10) ainsi qu’en pré-sence de PHA (contrôle interne), sur une plaque ELISpot de 96 puits. Si le patient est infecté par M. tu-berculosis, les lymphocytes vont re-connaître les antigènes et sécréter de l’IFNγ. Celui-ci va être capturé, dans l’entourage immédiat du lym-phocyte qui l’a produit, par les an-ticorps anti-IFNγ qui tapissent le fond de chaque puit. Une réaction enzymatique colorimétrique per-
met enfin de révéler les complexes IFNγ/anticorps anti-IFNγ, sous forme de spots. Chaque spot repré-sente un lymphocyte T sécrétant à sa périphérie de l’IFNγ (2-4) . n
Mots-clés : test de détection de l’interféron
gamma, QuantiFEROn-tB Gold in
tube®, t-SPOt tB, tuberculose
1. Has. test de détection de la production d’interféron gamma pour le diagnostic des infections tuberculeuses. 2006.2. andersen P, Munk Me, Pollock JM, doherty tM. specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet 2000 ; 356 : 1099-104.3. Herrmann JL, simonney N, Lagrange PH. advantages and draw-
backs of in vitro Interferon-gamma/t cell assays compared to the Mantoux test for the diagnosis of tuberculosis. arch Pediatr 2007 ; 14 : 207-11.4. Lalvani a. diagnosing tuberculosis infection in the 21st century: new to-ols to tackle an old enemy. chest 2007 ;131 : 1898-906.
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