Intérêt des allergènes recombinantsIntérêt des allergènes recombinantsen pratiqueen pratique

Dr Jean-François Fontaine - ReimsDr Jean-François Fontaine - Reims

Allergènes recombinantsAllergènes recombinantsTechnique de productionTechnique de production

Clonage de la séquence codanteClonage de la séquence codante– Obtention d’ARN m à partir de l’agent allergénique puis obtention d’ADN Obtention d’ARN m à partir de l’agent allergénique puis obtention d’ADN

c double brinc double brin– Ou technique de PCROu technique de PCR– Introduction dans une bactérie ou une levureIntroduction dans une bactérie ou une levure

Production de la protéine allergénique Production de la protéine allergénique recombinanterecombinante– Système procaryoteSystème procaryote– Système eucaryoteSystème eucaryote

PurificationPurification

Allergènes recombinantsAllergènes recombinantsTechnique de productionTechnique de production

Clonage de la séquence codanteClonage de la séquence codante– Obtention d’ARN m à partir de l’agent allergénique puis obtention d’ADN Obtention d’ARN m à partir de l’agent allergénique puis obtention d’ADN

c double brinc double brin– Ou technique de PCROu technique de PCR– Introduction dans une bactérie ou une levureIntroduction dans une bactérie ou une levure

Production de la protéine allergénique Production de la protéine allergénique recombinanterecombinante– Système procaryote Système procaryote non glycosylée non glycosylée– Système eucaryote Système eucaryote glycosylée glycosylée

PurificationPurification

Allergènes recombinantsAllergènes recombinantsMolécules disponibles pour dosage d’IgE spécifiquesMolécules disponibles pour dosage d’IgE spécifiques

PneumallergènesPneumallergènes– Chat :Chat : rFel d 1rFel d 1– Phléole :Phléole : rPhl p 1rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 4, , rPhl p 2, rPhl p 4, rPhl p 5brPhl p 5b, rPhl p 6, , rPhl p 6, rPhl p rPhl p

77, rPhl p , rPhl p 11, 11, rPhl p 12rPhl p 12, , rPhl p 1-r Phl p 5brPhl p 1-r Phl p 5b, , rPhl p 7-rPhl p 7-rPhl p 12rPhl p 12

– Bouleau :Bouleau : rBet v 1rBet v 1, , rBet v 2rBet v 2, , rBet v 4rBet v 4, rBet v 6, rBet v 2-rBet v 4, rBet v 6, rBet v 2-rBet v 4– Olivier :Olivier : nOle e 1nOle e 1– Pariétaire:Pariétaire: rPar j 2 rPar j 2– Alternaria:Alternaria: rAlt a 1 rAlt a 1– Aspergillus:Aspergillus: rAsp f 1, rAsp f 2, rAsp f 3, rAsp f 1, rAsp f 2, rAsp f 3, rAsp f 4, rAsp f 6rAsp f 4, rAsp f 6

TrophallergènesTrophallergènes– Arachide :Arachide : r Ara h1, r Ara h 2, r Ara h 3r Ara h1, r Ara h 2, r Ara h 3, , rAra h 8rAra h 8– Blé :Blé : rTri a 19rTri a 19– Carpe :Carpe : rCyp c 1rCyp c 1– Crevette :Crevette : rPen a 1rPen a 1– Pêche :Pêche : rPru p 1, rPru p 3, rPru p 4rPru p 1, rPru p 3, rPru p 4– Soja :Soja : rGly m 4rGly m 4

Allergènes recombinantsAllergènes recombinantsMolécules disponibles pour dosage d’IgE spécifiquesMolécules disponibles pour dosage d’IgE spécifiques

LatexLatex

Identification Poids moléculaire Réactivité croisée

Hev b 1

Facteur d'élongation du latex

15 kD -

Hev b 2 Endo -1,3-b glucosidase 36 kD - Hev b 3 24 kD - Hev b 4 50-57 kD - Hev b 5 Homologie avec la prot éine pKIWI 501

Hev b 6.01 Pro-héveïne 16 kD Avocat, banane, kiwi Hev b 6.02 Héveïne 4,7 kD Avocat, banane, kiwi, … +++ Hev b 6.03 Domaine C de la prohévéïne 14 kD Homologie avec protéines de stress

Hev b 7 Protéine patatine like 42,9 kD Homologie avec les protéines de stockage des solanaceae

Hev b 8 Profiline 13,9 kD Homologie avec d'autres profilines Hev b 9 Enolase 47,7 kD Homologie de séquence avec les énolases

de la tomate et de cladosporium Hev b 10 Mn superoxyde dismutase 22,9 kD Moisissures Hev b 11 Chitinase de classe I 33 kD Homologie avec chitinases d'autres sources Hev b 12 LTP 9,3 kD Fruits Hev b 13 Esterase 43 kD Pomme de terre

Les allergènes recombinants

Nouvel outil diagnostique

Cas clinique n°1Cas clinique n°1Camille L., 14 ans, urticaire généralisée et chocCamille L., 14 ans, urticaire généralisée et choc

AntécédentsAntécédents– Asthme avec allergie aux acariens – désensibilisation entre 8 et 11 ansAsthme avec allergie aux acariens – désensibilisation entre 8 et 11 ans

– Diarrhées et douleurs abdominales après consommation de fruitsDiarrhées et douleurs abdominales après consommation de fruits

– Eruptions cutanées épisodiquesEruptions cutanées épisodiques

Histoire de la maladieHistoire de la maladie– Urticaire généralisée, gêne à la déglutition et chute de TA à 70 mmHgUrticaire généralisée, gêne à la déglutition et chute de TA à 70 mmHg

– 30 mn après repas comprenant six crevettes, mayonnaise industrielle, 30 mn après repas comprenant six crevettes, mayonnaise industrielle, salade de tomates avec vinaigrette industrielle, gâteausalade de tomates avec vinaigrette industrielle, gâteau

Examen clinique normalExamen clinique normal

EFREFR : syndrome obstructif distal réversible : syndrome obstructif distal réversible

Cas clinique n°1Cas clinique n°1Camille L., 14 ans, urticaire généralisée et chocCamille L., 14 ans, urticaire généralisée et choc

Tests cutanésTests cutanés– Positifs pour D. Pteronyssinus, frêne, crevette, crabePositifs pour D. Pteronyssinus, frêne, crevette, crabe

– Douteux pour curry, isolats de blé et noisetteDouteux pour curry, isolats de blé et noisette

RASTsRASTs– Noisette Noisette < 0,10 kU/l< 0,10 kU/l

– Curry Curry < 0,10 kU/l< 0,10 kU/l

– Blé : Blé : 0,12 kU/l 0,12 kU/l

– D Pter. :D Pter. : 4,67 kU/l 4,67 kU/l

– Crevette : 3,21 kU/lCrevette : 3,21 kU/l

Allergie à la crevette probablement liée à une Allergie à la crevette probablement liée à une sensibilisation croisée avec les acarienssensibilisation croisée avec les acariens

Cas clinique n°1Cas clinique n°1Camille L., 14 ans, urticaire généralisée et chocCamille L., 14 ans, urticaire généralisée et choc

Tests cutanésTests cutanés– Positifs pour D. Pteronyssinus, frêne, crevette, crabePositifs pour D. Pteronyssinus, frêne, crevette, crabe

– Douteux pour curry, isolats de blé et noisetteDouteux pour curry, isolats de blé et noisette

RASTsRASTs– Noisette Noisette < 0,10 kU/l< 0,10 kU/l

– Curry Curry < 0,10 kU/l< 0,10 kU/l

– Blé : Blé : 0,12 kU/l 0,12 kU/l

– D Pter. :D Pter. : 4,67 kU/l 4,67 kU/l

– Crevette : 3,21 kU/lCrevette : 3,21 kU/l

Co-sensibilisation crevette – acariens ?Co-sensibilisation crevette – acariens ?

Allergie aux crustacésAllergie aux crustacésAllergènesAllergènes

Au moins 13 allergènesAu moins 13 allergènes– dont certains spécifiques d’espèce dont certains spécifiques d’espèce (Morgan, JACI, 1989)(Morgan, JACI, 1989)

Tropomyosine (Pen a 1) = allergène majeurTropomyosine (Pen a 1) = allergène majeur– 80 % des patients allergiques 80 % des patients allergiques (Jeoung, JACI, 1997 – Reese, Clin Exp Allergy, 2006)(Jeoung, JACI, 1997 – Reese, Clin Exp Allergy, 2006)

– ThermostableThermostable

Tropomyosines allergéniquesTropomyosines allergéniques– crustacés : crevette (crustacés : crevette (Pen a 1Pen a 1), homard (), homard (Hom a 1Hom a 1), crabe (), crabe (Ch f 1Ch f 1))– Mollusques : calmar (Mollusques : calmar (Tod p 1Tod p 1), escargot (), escargot (Tur c 1Tur c 1), huître (), huître (Cra g 1Cra g 1))– Acariens : Acariens : Der p 10, Der f 10Der p 10, Der f 10– Blatte : Blatte : Per a 7Per a 7

Réactivité croiséeRéactivité croisée ++++++

Cas clinique n°1Cas clinique n°1Camille L., 14 ans, urticaire généralisée et chocCamille L., 14 ans, urticaire généralisée et choc

Tests cutanésTests cutanés– Positifs pour D. Pteronyssinus, frêne, crevette, crabePositifs pour D. Pteronyssinus, frêne, crevette, crabe

– Douteux pour curry, isolats de blé et noisetteDouteux pour curry, isolats de blé et noisette

RASTsRASTs– Noisette Noisette < 0,10 kU/l< 0,10 kU/l

– Curry Curry < 0,10 kU/l< 0,10 kU/l

– Blé : Blé : 0,12 kU/l 0,12 kU/l

– D Pter. :D Pter. : 4,67 kU/l 4,67 kU/l

– Crevette : 3,21 kU/lCrevette : 3,21 kU/l

Allergie croisée crustacés - acariensAllergie croisée crustacés - acariens

RAST r Pen a 1 : RAST r Pen a 1 : 1,86 kU/l1,86 kU/l

Cas clinique n°2Cas clinique n°2Solène P., 16 ans, urticaire généraliséeSolène P., 16 ans, urticaire généralisée

AntécédentsAntécédents– Rhino-conjonctivite saisonnière de mai à juilletRhino-conjonctivite saisonnière de mai à juillet

Histoire de la maladieHistoire de la maladie– Urticaire généralisée à deux reprises, sur le trajet du lycée effectué à Urticaire généralisée à deux reprises, sur le trajet du lycée effectué à

pied, en octobre et en novembrepied, en octobre et en novembre

– Second épisode accompagné d’un œdème et d’une sensation de Second épisode accompagné d’un œdème et d’une sensation de malaise mal définiemalaise mal définie

– Aucun facteur déclenchant évident, notamment alimentaire ou Aucun facteur déclenchant évident, notamment alimentaire ou médicamenteuxmédicamenteux

– Nature des repas précédentsNature des repas précédents11erer épisode : chocolat au lait, pain, confiture d’abricot, cake épisode : chocolat au lait, pain, confiture d’abricot, cake

22èmeème épisode : pizza jambon fromage, yaourt nature épisode : pizza jambon fromage, yaourt nature

Cas clinique n°2Cas clinique n°2Solène P., 16 ans, urticaire généraliséeSolène P., 16 ans, urticaire généralisée

Tests cutanésTests cutanés– Très positif pour graminéesTrès positif pour graminées

– Positif pour blé et farine de blé nativePositif pour blé et farine de blé native

– Négatifs pour tous les autre pneumallergènes et trophallergènes Négatifs pour tous les autre pneumallergènes et trophallergènes courantscourants

BiologieBiologie– RAST phléole : 35 kU/lRAST phléole : 35 kU/l

– RAST blé : 4,2 kU/lRAST blé : 4,2 kU/l

Allergie au blé ou simple sensibilisation croisée aux graminées ?

RAST rTri a 19 : 3,79 kU/l

Anaphylaxie d’effort au blé (oméga-5-gliadine)

Intérêt potentiel des allergènes recombinantIntérêt potentiel des allergènes recombinantExemple de l’allergie à la noisetteExemple de l’allergie à la noisette

G. Pauli – Annales Institut Pasteur 2003