Intérêt de la PCRq en CGH array

Dr Nathalie LE DÛLaboratoire de cytogénétique

GH Cochin – St Vincent de PaulPARIS

XXIème colloque ATC - Rouen – 22/23 Sept 2011

Quelles anomalies peut-on « voir », avec quelle technique cytogénétique ?

Notion de « résolutionrésolution »

Caryotype standard: 10 – 20 Mb Caryotype en « haute résolution »: 5 Mb FISH: 150 kb (BAC) à 50 kb (cosmide) CGH array:

Puce BAC: 500 kb à 1 Mb Puce oligos: 100 kb (sur tout le génome) voire moins pour certains types de puces (< 1 kb)

PCRq: amplicon = 90 à 150 pb

Techniques de plus en plus fines pour explorer le génomeTechniques de plus en plus fines pour explorer le génome

Principe de la PCR

Technique d'amplification enzymatique qui permet, à partir d'un fragment d’ADN, d'obtenir plusieurs millions de copies identiques de ce même fragment

En PCR classiquePCR classique, l’amplification d’une séquence d’ADN suit 3 étapes:- dénaturation de l’ADN double-brin- hybridation des amorces- synthèse du brin complémentaire (ADN polymérase)

Au fil des cycles, la quantité d'amplicons va augmenter de façon exponentielle. Dans la pratique, une PCR de 30 cycles produit environ 106 copies. Le produit amplifié est détecté lorsque les cycles de PCR sont terminés.

Un des avantages majeurs de la PCR quantitativePCR quantitative est de pouvoir quantifier le nombre de copies d’ADN initialement présentes dans le prélèvement.détection du produit amplifié au cours de la réaction (détection rendue possible en ajoutant une molécule fluorescente au mélange réactionnel) PCR « en temps réel »

Le Thermocycler mesure une émission de fluorescence proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié à chaque cycle.

PCR classique versus PCR en temps réel

Cinétique de la PCRq

Phase exponentielle d’amplification =

phase la plus reproductible de la réaction, seul

moment où la PCR est modélisable donc

QUANTIFIABLE

Modes de détection

Plusieurs types de détectiondétection du produit PCR:- grâce à une molécule se liant à l’ADN (SYBRGreen®)- grâce à une sonde moléculaire spécifique (Taqman®,…)

Chimie SybrGreen (1)

Fluorochrome s’intercalant spécifiquement dans l’ADN double brin nouvellement synthétisé.

Sous une excitation UV, émission d’un signal de fluorescence dont la mesure permet de quantifier l’ADN double brin.

Chimie SybrGreen (2)

Chimie TaqMan

Sonde marquée par 2 fluorophores:- extrêmité 5’ de la sonde = fluorophore donneur ou émetteur- extrêmité 3’ = fluorophore extincteur ou quencher

Le quencher étant à proximité du donneur inhibe l’émission de fluorescence par ce dernier.

Lorsque la sonde est hydrolysée par la Taq polymérase, le fluorophore et le quencher s’éloignent entrainant une émission de fluorescence proportionnelle à la quantité de cible hydrolysée.

Notion de cycle seuil (Ct)

Pour quantifier un échantillon par PCR en temps réel, on détermine le nombre de cycles à partir duquel le produit PCR est détectable

Le moment d’apparition de ce signal seuil dénommé cycle seuil ou Ct (Cycle threshold) est dépendant de la quantité de matrice initialement présente dans l’échantillon amplifié

Seuil

Quantification (1)

Plusieurs façons de quantifier l’ADNquantifier l’ADN:

- quantification absolue dilutions standards de concentrations connues puis détermination de la concentration absolue du gène

cible

Quantification (2)

- quantification relativequantification relative fait intervenir un gène de ménage (GAPDH, Albumine, beta-actine, …) qui va servir de normalisateur (considéré comme stable dans le modèle présenté) et ne subira pas de changement d’expression en fonction des conditions analysées. Ce gène de contrôle va permettre de compenser d’éventuels biais de PCR provenant de :- variations dans la quantité et la qualité des échantillons- rendement d’extraction différent entre échantillons- variations dans les erreurs de pipetage - variations d’efficacité de PCR

le gène de référence est quantifié en même temps que le gène cible étudié. La concentration de ce dernier est ensuite normalisée par rapport à celle connue du gène de référence

Avantages/Inconvénients de la chimie SybrGreen®

Avantages: Spécifique Quantitatif Reproductible Peu coûteuse « Rapide » …

Limites: Absence de spécificité de la fluorescence mesurée +++

1 - risque de détection de dimères d’oligonucléotides Choix judicieux des primers en amont pour

assurer la spécificité2 - ou d’un produit PCR non spécifique

contrôle de la présence d’un seul produit PCR par évaluation du Tm du produit PCR à l’aide

de la courbe de fusion

Etapes de vérification en PCRq

Recherche de primers dans la région: Vérifier l’absence de variants (Ensembl, UCSC) Cibler plusieurs exons d’un même gène ou plusieurs gènes de la

région (UCSC) Faire un BLAST pour rechercher les homologies sur d’autres

chromosomes et les « masquer » Rechercher les snp et les masquer Rechercher les séquences répétées Obtention d’une séquence « épurée » Choix des primers (attention: dimères)

Réalisation des courbes standards avec les primers choisis, calcul d’efficacité de PCR

Réalisation de la PCR quantitative pour le patient Interprétation du dosage

- Confirmation ou infirmation de l’anomalie suspectée en CGH array- Analyse des parents:

Polymorphisme (CNV) ?Duplication pathogène ?

Etude du mécanisme de survenue par Hybridation in situ

Avantages/Inconvénients de la chimie SybrGreen®

Les dimères

HAIRPIN: replie d’un primer sur lui-même

CROSS DIMER: intéraction intermoléculaire entre le primer Forward et le primer Reverse quand ils présentent des homologies (F-R ou R-F)

SELF DIMER: intéraction intermoléculaire entre primers du même sens (F-F ou R-R)

Avantages/Inconvénients de la chimie SybrGreen®

Courbes de fusion (= de dissociation)

Pour vérifier qu’un seul produit PCR a été amplifié, on réalise une courbe de fusioncourbe de fusion en fin de réaction.

Réalisée en soumettant les amplicons à une température progressant de 55°C à 95°C et en mesurant l'intensité de fluorescence en continu.

Tm (température de fusiontempérature de fusion) = température à laquelle 50% des brins sont désappariés (spécifique)

Interprétation des courbes de fusion

Un seul pic même Tm pour toutes les amplifications

PCR SPECIFIQUEPCR SPECIFIQUE

épaulement traduisant la présence d’un second produit PCR minoritaire

PCR NON SPECIFIQUEPCR NON SPECIFIQUE

Tm1 Tm2

Résultats

Les résultats sont exprimés par un rapport cible/référence de chaque échantillon normalisé par le rapport cible/référence d’un échantillon appelé calibrateur. La précision du résultat dépend des efficacités de PCR des gènes cibles et référence.

L’efficacité de PCR est un facteur important pour la reproductibilité des résultats. Plus l’efficacité PCR est grande, plus la PCR sera robuste, en particulier lorsque l’on travaille avec des échantillons présentant un faible nombre de copies.

Ratio = 1.5 duplication

Ratio = 0.5 délétion

Pourquoi choisir la chimie SybrGreen ?

De façon idéale, chimie TaqMan: mieux ++ plus spécifique Pas de dimères Mais coûteux Et design des amorces/sonde long

Choix de la chimie SybrGreen: Moins coûteux Design moins long mais à recommencer à chaque vérification de CGH

… Pb des dimères

Choix stratégique et financier …

Arbre décisionnel – Cochin/St Vincent de Paul

Patient dysmorphie / retard mentalPatient dysmorphie / retard mental

Caryotype

Anormal Normal

Arrêt investigationcytogénétique

CGH Array (puce)

Normale

Arrêt investigationcytogénétique

Suspicion del ou dup

vérification par PCRq

- Choix des amorces (UCSC, Primer Express, Primer Blast)

- Vérifi cation absence de variants (Ensembl, UCSC)

- PCRq- Vérifi cation du rendement de la PCR- Vérifi cation de la spécificité de l’amplifi cation

QuantificationQuantification: Confirmation ou infirmation: Confirmation ou infirmationdes rdes réésultats de CGH sultats de CGH arrayarray

Vérification par FISH

deldup

Patient dysmorphie / retard mentalPatient dysmorphie / retard mental

Caryotype

Anormal Normal

Arrêt investigationcytogénétique

CGH Array (puce)

Normale

Arrêt investigationcytogénétique

Suspicion del ou dup

vérification par PCRq

- Choix des amorces (UCSC, Primer Express, Primer Blast)

- Vérifi cation absence de variants (Ensembl, UCSC)

- PCRq- Vérifi cation du rendement de la PCR- Vérifi cation de la spécificité de l’amplifi cation

QuantificationQuantification: Confirmation ou infirmation: Confirmation ou infirmationdes rdes réésultats de CGH sultats de CGH arrayarray

Vérification par FISH

deldup

Arrêt investigation

cytogénétique ou

grande del

dup ou petite del

Comparaison FISH/PCRq: cas d’une « grande » délétion 22q11.2

(délétion 22q11.2 non visible)délétion visible

sur mitoses et sur noyaux

Caryotype standard FISH

22q11.2/22q13.3

Comparaison FISH/PCRq: cas d’une « grande » délétion 22q11.2

ConclusionConclusion:Grande délétion vue en FISH et en PCRq

Comparaison FISH/PCRq: cas d’une duplication 22q11.2

duplication 22q11.2 non visible

duplication non visible

sur la quasi totalité des mitoses,

visible sur quelques noyaux mais …

asymétrie de signalsur certaines mitoses,

non visible sur de nombreux noyaux

3 spots

2 spots

Conclusion ??

22q11.2/22q13.3

Comparaison FISH/PCRq: cas d’une duplication 22q11.2

ConclusionConclusion: duplication 22q11.2 vue en PCRq, douteuse en FISH+ étude simultanée des parents (de novo )

Quid du conseil génétique ?

CGH, PCRq: aucun renseignement sur le mécanisme Importance de la FISH ++ Implication d’un 3ème chromosome dans 1.5 à 10% des cas de duplications

(selon les publications)

« the potential for an otherwise benign duplication to result in a clinically relevant outcome through the disruption of a gene necessitates the use of FISH to determine

whether copy-number gains detected by array CGH represent tandem duplications or unbalanced insertions »

Recurrence, submicroscopic complexity, and potential clinical relevance of copy gains detected by array CGH that are shown to be unbalanced insertions by FISH.

Neill NJ, Ballif BC, Lamb AN, Parikh S, Ravnan JB, Schultz RA, Torchia BS, Rosenfeld JA, Shaffer LG.

Genome Res. 2011 Apr;21(4):535-44

Exemple

Duplication 9p12 en CGHa

Duplication confirmée par la PCRq (ratio 1.5, 3 copies)

Hypothèse 1 = duplication en tandem ? Hypothèse 2 = insertion dans un 3ème chromosome ?

Insertion de matériel chromosomique

9p12-p21 dans le bras court du chromosome 5 = Hypothèse 2Hypothèse 2

FISH

Demander les parents

De novo

Conseil génétique ++Conseil génétique ++(trisomie 9p, monosomie 9p)

Hérité d’un des 2 parents (insertion équilibrée)

PCRq et FISH = techniques COMPLEMENTAIRES ++PCRq et FISH = techniques COMPLEMENTAIRES ++

En pratique …

CAS 1

Enfant M. Lilou, 2 ans Clinique: crises épilepsie, dilatation ventriculaire, gesticulation

excessive, hypotonie axiale Cytogénétique:

Caryotype: normal 46,XX Etude subtélomères: normale

CGH array: suspicion de délétion en Xp22.13 (40 kb40 kb) emportant le début du gène CDKL5

23 exons, 2 isoformes Exprimé dans le cerveau fœtal humain (isoforme II) Impliqué dans la survenue de l’encéphalopathie épileptique

infantile Mutations ++ translocations X-autosome interrompant le gène CDKL5,

microdélétions, …

Interprétation CGH

Logiciel Genoglyphix

Logiciel Signal Map

PCRq

Choix des primers dans le gène CDKL5, exon 1

Confirmation de la délétion en Xp22.13

FISH: Région trop petite (40 kb), pas de BAC

Etude des parents en PCRq: caractère hérité ou de novo ?

CAS 2

CGH array: dup Xq11.1 (411 kb)

PCRq: primers choisis dans le gène ZC4H2

Etude des parents en PCRq: Dup origine maternelle

Confirmation de la duplication Xq11.1

Patient Mère Père T. CGH T. fille

RP11-90I7 RP11-90I7

Sur noyaux: pas de duplication (RP11-90I7) Sur métaphases: pas de duplication (RP11-90I7)

Duplication Xq11.1 mat vue en PCRq mais pas en FISH (411 kb)pas en FISH (411 kb)

CAS 3

Patient Mère Père Témoin fille

PCRq: choix des primers dans le gène CRLF2 (PAR2)

CGH array: dup Xp22.33 (636 kb)

Confirmation de la duplication Xp22.33origine maternelle

RP11-892B14 RP11-892B14

sur métaphases: pas de duplication (RP11-892B14)Sur noyaux: pas de duplication (RP11-892B14)

Dup Xp22.33 mat vue en PCRq mais pas en FISHpas en FISH (636 kb)

CAS 4

PatientTémoin CGH

Témoin labo

PCRq: primers choisis dans le gène NUD7

Confirmation de la duplication 16q23.1

CGH array: dup 16q23.1 (522 kb)

sur métaphases: asymétrie de signal (RP11-24I3) ?

Sur noyaux: duplication dans 60% des noyaux

Dup 16q23.1 vue en PCRq et FISH (noyaux ++)

RP11-24I3RP11-24I3RP11-24I3

CAS 5

PCRq: primers choisis dans le gène ZBTB20

Confirmation de la délétion 3q13.31

Etude des parents en PCRq: del 3q13.31 de novo

CGH array: del 3q13.31 (430 kb)

Témoin Patient Père Mère

sur métaphases: pas de délétion (RP11-107J18

Délétion 3q13.31 dn vue en PCRq mais pas en FISH (430 pas en FISH (430 kb)kb)

Sur noyaux: pas de délétion (RP11-107J18

RP11-107J18

RP11-107J18

Conclusion

Complémentarité des techniquesComplémentarité des techniques: CGH array: dépistage PCRq: vérification, quantification FISH: étude du mécanisme chromosomique

Pb de la détection des mosaiquesmosaiques (seuil ?)

Confrontation des expériencesConfrontation des expériences: autres techniques de vérification labos « FISH exclusive »