Interaction de Interaction de Neisseria meningitidisNeisseria meningitidis avec avec l’endothelium :l’endothelium :

Un rôle du récepteur béta-2-adrénergique ?Un rôle du récepteur béta-2-adrénergique ?

Interaction Neisseria meningitidis et cellules endothélialesInteraction Neisseria meningitidis et cellules endothéliales

??

Ezrine recrutéeet phosphorylée

RhoCdc 42

Polymerisation d’actine

Microvillosités

????

Résistance au fluxRésistance au fluxInternalisationInternalisation??

Formation des microvillositésFormation des microvillosités

Eugene, J Cell Sci 2002

PIP2PIP2PIP2PIP2

PP

Rho kinasePKCα

Nck interacting kinase

PIP2PIP2

Recrutement et activation de l’ezrineRecrutement et activation de l’ezrine

Bretscher, Nat Rev Cell Biol 2002

Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine

Cant, Mol Biol Cell 2005

Induction de Induction de rufflesruffles par l’Ach. Ces par l’Ach. Ces rufflesruffles sont riches en ERM phosphorylée sont riches en ERM phosphorylée

L’induction des L’induction des rufflesruffles par Ach nécessite l’ezrine par Ach nécessite l’ezrine

Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine

Cant, Mol Biol Cell 2005

Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine

GRK2 est capable de phosphoryler l’ezrine sur son site « habituel » GRK2 est capable de phosphoryler l’ezrine sur son site « habituel » d’activation in vitro. d’activation in vitro. Cette phosphorylation est dépendante de la présence de PIP2 et de Cette phosphorylation est dépendante de la présence de PIP2 et de GG : : nécessité activation récepteur ? nécessité activation récepteur ?

Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine

Cant, Mol Biol Cell 2005

Le Le rufflingruffling induit par ACh dépendant de GRK2 et de la phosphorylation de induit par ACh dépendant de GRK2 et de la phosphorylation de l’ezrinel’ezrine

Dominant négatif

GRK2

GRK2 sans a

ctivit

é kinase

GRK2 non recru

table

Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine

Cant, Mol Biol Cell 2005

Induction de l’endocytose du récepteur 2 adrénergique par l’isprotérénol (agoniste).Cette endocytose est connue

pour être dépendante de l’actine.

Il existe une Il existe une colocalisation avec les colocalisation avec les pERMpERM

Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine

Cant, Mol Biol Cell 2005

L’endocytose du β2-AR induit par un agoniste, phénomène dépendant de l’actine, nécessite nécessite l’ezrine.l’ezrine.

Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine

Cant, Mol Biol Cell 2005

rôle possible des GPCR dans les modifications du cytosquelette d’actine rôle possible des GPCR dans la phosphorylation de l’ezrine via GRK2 certains GPCR sont endocytés après fixation de l’agoniste, dans un processus nécessitant l’ezrine et la polymerisation d’actine.

Existe-t-il un lien entre la formation de la plaque corticale Existe-t-il un lien entre la formation de la plaque corticale induite par induite par NmNm et un GPCR ? et un GPCR ?

Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine

CCR5Β2-adrenergic R

CXCR4ATI-R

Il existe un recrutement de GPCR au niveau de la plaque Il existe un recrutement de GPCR au niveau de la plaque corticalecorticale

L’induction de l’endocytose (agoniste) du L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe 2AR inhibe le recrutement d’ezrinele recrutement d’ezrine

Ezrin recruitment

0%

20%

40%

60%

80%

100%

cont

rol

Iso SDF1

MIP

1β IL8

AT2

5 à10 x Kd

% o

f re

cru

itin

g c

olo

ny

ββ-agonist-agonist

Ct 0,0001 0,01 1 10

Ezrin recruitment

Isoproterenol (μM)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

% o

f re

cru

itin

g c

olo

ny

- 10µM 10µM 1µM 1µM - - + - +

Ezrin recruitment

0%

20%

40%

60%

80%

100%

IsoproterenolPropranolol

% o

f re

cru

itin

g c

olo

ny

Cet effet est bien du à l’action spécifique de l’isoprotérénol sur son récepteur 2AR

L’induction de l’endocytose (agoniste) du L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe 2AR inhibe le recrutement d’ezrinele recrutement d’ezrine

0

20

40

60

80

100%

of

recr

uiti

ng

co

lon

yEzrin recruitment

Control Propranolol10 uM

ββ-antagonist-antagonist

Nm n’interagit pas avec le site actif du 2AR

L’induction de l’endocytose (agoniste) du L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe 2AR inhibe le recrutement d’ezrinele recrutement d’ezrine

0

20

40

60

80

100

Control PKA-PS

20uM 10uM

Forkolin10-5 M

PKA-PS Forkolin10-6 M

Ezrin recruitment

% o

f re

cru

itin

g c

olo

ny

Le recrutement d’ezrine induit par l’interaction Nm/2AR n’est pas dépendant de la voie des protéines G

L’induction de l’endocytose (agoniste) du L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe 2AR inhibe le recrutement d’ezrinele recrutement d’ezrine

Il existe une deuxième voie de transduction du signal Il existe une deuxième voie de transduction du signal 2adrénergique2adrénergique

Lefkowitz, Science 2005

Il existe une deuxième voie de transduction du signal Il existe une deuxième voie de transduction du signal 2adrénergique2adrénergique

Beta-arrestin2-GFP ezrin GRK2-GFP ezrin

Ezrin recruitment

0%

20%

40%

60%

80%

100%

ControlsiRNA

Arrestin 1+2sirRNA

FLNA sirRNA GRK2 sirRNA

Ezrin

Il existe une deuxième voie de transduction du signal Il existe une deuxième voie de transduction du signal 2adrénergique2adrénergique

30 min

2C43-GFP + isoproterenol

2C43-GFP

90 min 150 min 210 min 270 min

Nm, Nm, 2AR et microvillosités2AR et microvillosités

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

ct 0h ct 1h ct 2h ct 3h Ct 4h

0 à 12µm

12 à 48µm

48 à 192µm

+ de 192

Nm, Nm, 2AR et microvillosités2AR et microvillosités

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

ct 0h ct 1h ct 2h ct 3h Ct 4h

0 à 12µm

12 à 48µm

48 à 192µm

+ de 192

+ iso :+ iso :

* séquence de recrutement des GPCR

* si RNA 2AR

* vérifier l’activation de 2AR (voie des protéines G)

* screening des GRK impliqués

A court terme …A court terme …