Direction de lEnvironnement Littoral de lIFREMER Brest UBO URA CNRS D1513

DESS GRNR USTL-LILLE 1

INFLUENCE DE LENVIRONNEMENT SUR LES PHASES DE REPRODUCTION FECONDATION ET

DEVELOPPEMENT LARVAIRE DES OURSINS CAS DE SPHAERECHINUS GRANULARIS

EN RADE DE BREST

Antoine JUDAS

DEL Brest 94-16 Rapport Interne

IFREMER Bibliot heque de BREST

1111111111111 111111 1111111111 11111111111111111 1111 OE L05 266

UNIVERSITE DES SCIENCES ET TECHNOLOGIES

DELILLE

DIPLOcircME DETUDES SUPERIEURES SPECIALISEES

Gestion des ressources naturelles renouvelables et ameacutelioration de la

qualiteacute de la vie

Option Geacutenie de lEnvironnement

INFLUENCE DE LENVIRONNEMENT SUR LES PHASES DE REPRODUCTION FECONDATION ET DEVELOPPEMENT LARVAIRE DES OURSINS

CAS DE SPHAERECHINUS GRANULARIS EN RADE DE BREST

( INFLUENCE OF THE E~IRONMENT ON REPRODUCTIVE

STAGES FERTILIZATION AND DEVELOPMENT OF LARVAE IN

THE SEA URCHIN SPHAERECHINUS GRANULARlS

FROM THE BAY OF BREST)

Avril - Aoucirct 94

DBO DRA CNRS D1513 IFRE~IER-BREST DELIEX Antoine JUDAS

RESUME

Dans le cadre du programme deacutetudes pluridisciplinaire du contrat de baie mis en œuvre par la

Communauteacute Urbaine de Brest un travail dobservation inteacutegrant certains paramegravetres

biologiques (Indices Gonadique et de Reacutepleacutetion) eacutecotoXIcirccologiques (feacutecondation et

deacuteveloppemnt larvaire) et geacuteneacutetiques a eacuteteacute meneacute au laboratoire deacutecologie benthique de

lUniversiteacute des Sciences de Brest et au laboratoire deacutecotoXIcirccologie de lIFREMER-Brest sur

les oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis de la rade en tant quindicateurs biologiques

de pollution Le site de larchipel des Gleacutenan (Finistegravere-Sud) a eacuteteacute choisi agrave titre de reacutefeacuterence TI

ressort de leacutetude que la station placeacutee dans le goulet en communication directe avec la mer

dIroise preacutesente des reacutesultats comparables aux Gleacutenan et ne semble pas atteinte par les effets

anthropiques contrairement aux stations proches de la zone portuaire La population doursins

de la pointe de lArmorique savegravere seacutevegravereacutement perturbeacutee tant dans son cycle biologique que

dans son deacuteveloppement larvaire et preacutesente une perte de variabiliteacute geacuteneacutetique par rapport agrave la

station voisine (pointe MarIoux) Parmi les causes possibles de tels pheacutenomegravenes lhypothegravese

dune contamination par les meacutetaux lourds a eacuteteacute conforteacutee par les reacutesultats danalyses effectueacutees

par le Laboratoire Municipal La responsabiliteacute des actnireacutes militaires pratiqueacutees sur ce site est

discuteacutee dans ce rapport

Remerciements

Je tiens agrave exprimer ma gratitude agrave toutes les personnes qui mont aideacute pendant ce travail en

commenccedilant par mes responsables de stage

Madame Monique GUILLOU pour sa disponibiliteacute malgreacute quelques ennuis de santeacute et

pour son aide dans les moments importants Madame Franccediloise QUlNIOU pour avoir

parfois sacrifieacute ses jours de repos pour venir massister Monsieur Dario MORAGA pour tout

ce quil ma appris de la geacuteneacutetique des populations

Je remercie tout speacutecialement Christian TARTU Robert ~1ARC et Seacutebastien DAO

pour leurs compeacutetences techniques et pour leur agreacuteable compagnie agrave chaque sortie en mer

Je voudrais dire merci eacutegalement agrave Laurent CHAUVEAU et Lucky LUMlNGAS en

thegravese actuellement qui ont bien voulu partager avec moi une partie des donneacutees quils ont

recueillies sur le terrain

Je ne voudrais pas oublier Franccediloise DENIS pour mavoir fait part de son expeacuterience dans

le domaine de leacutelectrophoregravese et dans lutilisation du logiciel BIOSYS l

Je remercie aussi Madame ~1arie-Reneacutee LE LIART pour son accueil agrave mon arriveacutee agrave la

faculteacute et pour raide quelle ma apporteacutee pour reacutesoudre mes problegravemes dordre mateacuteriel

Je remercie bien sucircr les responsables de ma formation Madame Nicole DHAINAUT et

Monsieur Daniel PETIT pour mavoir permis deffectuer ce stage dans le cadre du DESS

Gestion des Ressources Naturelles Renouvelables et Ameacutelioration de la qualiteacute de la vie

Enfin je tiens agrave exprimer ma profonde reconnaissance au responsable du laboratoire

deacutecologie benthique Monsieur Michel GLElLREC qui ma beaucoup soutenu et que je

remercie de sa confiance

2

SOMMAmE

CADRE DU STAGE p4

1 INTRODUCTION p6

II MATERIEL ET METHODE

1deg - Lespegravece p7

2deg - Le milieu p7

3deg - Echantillonnage p10

Indices physiologiques p 10

Feacutecondations in vitro p 10

4deg - Meacutethodes p 10

Indices physiologiques p10

Tests de feacutecondation pU

Geacuteneacutetique des population p12

5deg -Traitement des donneacutees p 15

IDRESULTATS

1deg - Indices physiologiques p 19

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire p 20

3deg - Geacuteneacutetique des populations p 24

IV DISCUSSION p26

V CONCLUSION p32

VI BIBLIOGRAPHIE p 33

3

CADRE DU STAGE

Ce stage sinscrit dans le programme Ameacutelioration de la qualiteacute des eaux sauvegarde et

restauration de leacutecosystegraveme marin en rade de Brest meneacute par la Communauteacute Urbaine de

Brest dans le cadre dun contrat de baie qui fait lobjet de conventions deacutetudes avec diffeacuterents

organismes de recherche (cf extraits de la circulaire ministeacuterielle du 1305191 preacutesenteacutee en

annexe) Loriginaliteacute du programme reacuteside dans sa pluridisciplinariteacute il integravegre aussi bien le

domaine continental que le domaine marin et associe disciplines scientifiques socioshy

eacuteconomiques et juridiques il vise dune maniegravere geacuteneacuterale agrave preacuteciser les meacutecanismes de

deacutegradation de leacutecosystegraveme de la rade en examinant parmi les processus connus en biologie

marine fondamentale lesquels sappliquent agrave cette zone particuliegravere et agrave mettre en place les

reacuteseaux dobservation et les outils de suivi de la qualiteacute du milieu gracircce auxquels il devrait ecirctre

possible de quantifier cette qualiteacute et preacutevoir ses conseacutequences sur les ressources halieutiques

Les reacutesultats du programme deacutetudes sont soumis au Comiteacute Scientifique du contrat de baie

et preacutesenteacutes ensuite agrave un Comiteacute dExpertise Scientifique International puis agrave un Comiteacute Pilote

pour deacutecision opeacuterationnelle

Le contrat rade de Brest doit aboutir agrave la mise au point de meacutethodes de lutte approprieacutees

contre les polluants et la fourniture aux deacutecideurs politiques et administratifs dun outil daide agrave

la deacutecision

Le stage sest deacuterouleacute dune part dans lUniteacute de Recherche Associeacutee au CNRS D 1513 agrave la

Faculteacute des Sciences de Brest~ et dautre part au laboratoire deacutecotoxicologie du centre

IFREMER de Brest dont les organisations sont preacutesenteacutees ci-apregraves Lobjectif de cette

coopeacuteration dans le programme deacutetude se situe dans la surveillance et lappreacuteciation de la

qualiteacute du milieu par lobservation dindicateurs biologiques de pollution Son but est deacutevaluer

la situation preacutesente de la rade et permettre un suivi de limpact des actions de deacutepollution

4

ORGANISATION DES STRUCTURES DACCUEIL

URA CNRS D1513

Uniteacute de recherche associeacutee au CNRS

Flux de matiegravere et reacuteponses du vivant

(Chef P TREGUER)

Biogeacuteochimie Physique Ecologie benthique

(P TREGUER) (M GLEMAREC)

resp stage M GUILLOU (eacutecologie des eacutechinodermes)

Biologie marine

(M LE PENNEC) resp stage D MORAGA

(geacuteneacutetique des populations)

Geacutenotoxiciteacute

des polluants

(F GALGANI)

IFREMER Direction de lEmironnement ~

et de lAmeacutenagement Littoral )

( Laboratoire dEcototicoJogie

(directeur F GALGAl)

~--------~

Etudes ponctuelles Transfert Tests qualiteacute deau de surveillance - action des pesticidessurveillance 1

1

(EHIS)biologiquei 1(F GALGAl-H) (T BURGEOT) - test tnverteacutebreacutes

(F Qulv70U resp stage)

(F TOLLARASTEL)

5

Il INTRODUCTION

Les oursins sont reconnus pour ecirctre tregraves sensibles aux modifications des conditions

environnementales Leur plasticiteacute face aux conditions du milieu et leur mode de vie en font de

bons indicateurs biologiques de pollution marine (Augier 1987a Kobayashi 1971) Dailleurs

depuis plus dune vingtaine danneacutees gamegravetes embryons et larves doursins constituent un

mateacuteriel de base dans les domaines de la pharmacologie toxicologie ou eacutecotoxicologie

(Hagstrom amp Lonning 1974 Bougis 1981 Dinnel et al 1987 Pagano amp Romafia 1991)

Leur sensibiliteacute aux conditions du milieu se manifeste par des perturbations du cycle de

reproduction des baisses de feacuteconditeacute ou des troubles du deacuteveloppement larvaire et les effets

observeacutes en zones perturbeacutees sur les populations doursins ont eacuteteacute souvent deacutecrits (Harmelin et

al 1981 Delmas amp Reacutegis 1984)

Dautre part les biologistes de lobservatoire marin de Roscoff (Nord-Finistegravere) utilisant

reacuteguliegraverement des oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis (Lamarck) preacuteleveacutes en rade de

Brest sur le site de la pointe de lArmorique ont signaleacute depuis 1985 des anomalies du

deacuteveloppement cellulaire Suite agrave ces observations des travaux preacuteliminaires ont mis en

eacutevidence sur ce mecircme site des perturbations du deacuteveloppement de la population et un faible

taux de croissance des individus (Chevallier 1993)

Ces indications ont motiveacute le choix de Sphaerechimls granularis tregraves commun dans la rade

et dont la biologie est par ailleurs bien connue (Fenaux 1972 Semroud amp Senoussi 1989

Guillou amp Michel 1993) comme bioindicateur de la qualiteacute du milieu dans le cadre du

Programme deacutetudes pluridisciplinaire de la rade de Brest Leacutetude porte sur trois stations de la

rade distribueacutees le long dun gradient de pollution et une quatriegraveme dans larchipel des Gleacutenan

(Bretagne Sud) exempt de pollution anthropique et choisi comme site de reacutefeacuterence

Lobservation consiste agrave suivre leacutevolution dindices physiologiques (Indice Gonadique et

Indice de Reacutepleacutetion) reacuteveacutelateurs de la condition des inampidus et agrave effectuer des feacutecondations

in vitro en vue de mesurer le taux de reacuteussite de stade pluteus obtenu pour chaque site de

maniegravere agrave mettre en eacutevidence une eacuteventuelle deacutegradation de lenvironnement

Par ailleurs lestimation de linfluence des conditions emironnementales saccompagne dune

eacutetude de geacuteneacutetique inspireacutee des meacutethodes employeacutees sur dautres inverteacutebreacutes marins (faune

6

profonde et intertidale) pour mesurer les adaptations geacuteneacutetiques de ces animaux vis agrave vs des

contraintes eacutecologiques (Siebenaller 1978 Bristow amp Vadas 1991) Ce travail vise agrave eacutevaluer

la variabiliteacute geacuteneacutetique preacutesenteacutee par S granularis dans les populations des deux stations les

plus exposeacutees qu~ quoique voisines geacuteographiquement ont montreacute des diffeacuterences

morphologiques et deacutemographiques tregraves marqueacutees (Lumingas amp Guillou sous presse) Cette

partie a eacutegalement pour but de mesurer le degreacutes de diffeacuterenciation existant entre ces deux

populations pour apporter une explication geacuteneacutetique agrave ces observations

A terme ce travail tend agrave mieux connaicirctre les reacuteponses de lespegravece et agrave estimer leacutetat de

pollution de la rade sur les sites choisis en diagnostiquant si possible les agents responsables

des deacuteregraveglements observeacutes

il 1MATERIEL ET METHODES

1deg - Lespegravece

Sphaerechinus granularis (Echinodermata Echinoidea Toxopneustidae) est une espegravece

comestible de grande taille pouvant atteindre 14 cm commune dans lheacutemisphegravere Nord sur les

cocirctes de lAtlantique-Est depuis la Manche occidentale jusquau Golfe de Guineacutee (Koehler

1921) ainsi quen Meacutediterraneacutee (Tortonese 1965) Sa reacutepartition verticale seacutetend de la zone

intertidale jusquagrave 130 m (Cherbonnier 1958) sur divers substrats en fonction des classes dacircge

et des preacutefeacuterences alimentaires (Guillou amp Michel 199) En rade de Brest les plus f011es

populations se rencontrent essentiellement sur les fonds seacutedimentaires grossiers recouverts de

maeumlrl vivant (Lithothamnium corallinoiumldes Crouan)

2deg - Le milieu

La rade de Brest est une vaste eacutetendue deau de plus de 150 km2 qui communique avec la

mer dIroise par un goulet de 18 km de large et de 20 m de profondeur Elle reccediloit les apports

de deux riviegraveres principales au Nord-Est lElorn (6m3 s de deacutebit moyen) au Sud-Est lAulne

(24m3s de deacutebit moyen) Les bassins versants de la rade repreacutesentent pregraves de 2800 km2 qui

sont essentiellement consacreacutes agrave lagriculture

7

Il est possible pour simplifier de subdiviser la rade elle-mecircme en trois zones un bassin

Nord tout dabord agrave lembouchure de lElorn ougrave se concentrent les activiteacutes portuaires de

Brest ensuite un bassin Sud recevant les eaux de lAulne moins urbaniseacute et mieux proteacutegeacute de

linfluence portuaire mais plus exposeacute aux effluents agricoles enfin une zone de meacutelange

formant un tourbillon dans la partie centrale de la rade allant des alentours de la presquicircle de

Quelem jusque dans le goulet

Le choix des sites sest porteacute sur quatre zones propices au deacuteveloppement de S gramllaris

dont trois dans la rade la derniegravere dans les icircles Gleacutenan en fonction de leurs diffeacuterentes

caracteacuteristiques La situation geacuteographique de chaque station se trouve illustreacutee en figure 1

- (1) Pointe Marloux situeacutee dans le bassin Nord proche de la zone portuaire dans une

zone de calme relatif laquo1 noeud en vives eaux) Le fond est constitueacute de maeumlrl pur la

profondeur est faible (5 m) Une eacutetude de la dynamique des populations a reacuteveacuteleacute de fortes

irreacutegulariteacutes dans le recrutement (Lumingas et GuiIlou sous presse)

- (2) Pointe de lArmorique situeacutee agrave lembouchure de lAulne ougrave la preacutesence de lIle Ronde

concentre les courants de mareacutee dans un chenal eacutetroit qui amplifie leur vitesse Gusquagrave 3

noeuds) Linfluence estuarienne y est encore ressentie le seacutediment est heacuteteacuterogegravene composeacute de

sable coquillier grossier et de deacutebris de maeumlrl la profonegraveeur peut atteindre jusquagrave 20 m au

milieu du chenal

- (3) Anse du DelIee zone rocheuse situeacutee dans le goulet de Brest directement sous

influence oceacuteanique Lhydrodynamisme est assez fort (gt2 noeuds en vives eaux) favorable au

deacuteveloppement dune couverture algale importante La zone de preacutelegravevement se situe sur une

pointe rocheuse appeleacutee pointe du Diable agrave labri des effets de lagglomeacuteration voisine agrave une

profondeur maximale de 10 m

- (4) Archipel des Gleacutenan en Baie de Concarneau Bretagne-Sud agrave leacutecart de toute

pollution anthropique et ougrave la population doursins connaicirct un large essor (Guillou et Michel

1993) et fait lobjet dune pecirccherie artisanale Cette derniegravere station sera consideacutereacutee comme site

de reacutefeacuterence

8

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

UNIVERSITE DES SCIENCES ET TECHNOLOGIES

DELILLE

DIPLOcircME DETUDES SUPERIEURES SPECIALISEES

Gestion des ressources naturelles renouvelables et ameacutelioration de la

qualiteacute de la vie

Option Geacutenie de lEnvironnement

INFLUENCE DE LENVIRONNEMENT SUR LES PHASES DE REPRODUCTION FECONDATION ET DEVELOPPEMENT LARVAIRE DES OURSINS

CAS DE SPHAERECHINUS GRANULARIS EN RADE DE BREST

( INFLUENCE OF THE E~IRONMENT ON REPRODUCTIVE

STAGES FERTILIZATION AND DEVELOPMENT OF LARVAE IN

THE SEA URCHIN SPHAERECHINUS GRANULARlS

FROM THE BAY OF BREST)

Avril - Aoucirct 94

DBO DRA CNRS D1513 IFRE~IER-BREST DELIEX Antoine JUDAS

RESUME

Dans le cadre du programme deacutetudes pluridisciplinaire du contrat de baie mis en œuvre par la

Communauteacute Urbaine de Brest un travail dobservation inteacutegrant certains paramegravetres

biologiques (Indices Gonadique et de Reacutepleacutetion) eacutecotoXIcirccologiques (feacutecondation et

deacuteveloppemnt larvaire) et geacuteneacutetiques a eacuteteacute meneacute au laboratoire deacutecologie benthique de

lUniversiteacute des Sciences de Brest et au laboratoire deacutecotoXIcirccologie de lIFREMER-Brest sur

les oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis de la rade en tant quindicateurs biologiques

de pollution Le site de larchipel des Gleacutenan (Finistegravere-Sud) a eacuteteacute choisi agrave titre de reacutefeacuterence TI

ressort de leacutetude que la station placeacutee dans le goulet en communication directe avec la mer

dIroise preacutesente des reacutesultats comparables aux Gleacutenan et ne semble pas atteinte par les effets

anthropiques contrairement aux stations proches de la zone portuaire La population doursins

de la pointe de lArmorique savegravere seacutevegravereacutement perturbeacutee tant dans son cycle biologique que

dans son deacuteveloppement larvaire et preacutesente une perte de variabiliteacute geacuteneacutetique par rapport agrave la

station voisine (pointe MarIoux) Parmi les causes possibles de tels pheacutenomegravenes lhypothegravese

dune contamination par les meacutetaux lourds a eacuteteacute conforteacutee par les reacutesultats danalyses effectueacutees

par le Laboratoire Municipal La responsabiliteacute des actnireacutes militaires pratiqueacutees sur ce site est

discuteacutee dans ce rapport

Remerciements

Je tiens agrave exprimer ma gratitude agrave toutes les personnes qui mont aideacute pendant ce travail en

commenccedilant par mes responsables de stage

Madame Monique GUILLOU pour sa disponibiliteacute malgreacute quelques ennuis de santeacute et

pour son aide dans les moments importants Madame Franccediloise QUlNIOU pour avoir

parfois sacrifieacute ses jours de repos pour venir massister Monsieur Dario MORAGA pour tout

ce quil ma appris de la geacuteneacutetique des populations

Je remercie tout speacutecialement Christian TARTU Robert ~1ARC et Seacutebastien DAO

pour leurs compeacutetences techniques et pour leur agreacuteable compagnie agrave chaque sortie en mer

Je voudrais dire merci eacutegalement agrave Laurent CHAUVEAU et Lucky LUMlNGAS en

thegravese actuellement qui ont bien voulu partager avec moi une partie des donneacutees quils ont

recueillies sur le terrain

Je ne voudrais pas oublier Franccediloise DENIS pour mavoir fait part de son expeacuterience dans

le domaine de leacutelectrophoregravese et dans lutilisation du logiciel BIOSYS l

Je remercie aussi Madame ~1arie-Reneacutee LE LIART pour son accueil agrave mon arriveacutee agrave la

faculteacute et pour raide quelle ma apporteacutee pour reacutesoudre mes problegravemes dordre mateacuteriel

Je remercie bien sucircr les responsables de ma formation Madame Nicole DHAINAUT et

Monsieur Daniel PETIT pour mavoir permis deffectuer ce stage dans le cadre du DESS

Gestion des Ressources Naturelles Renouvelables et Ameacutelioration de la qualiteacute de la vie

Enfin je tiens agrave exprimer ma profonde reconnaissance au responsable du laboratoire

deacutecologie benthique Monsieur Michel GLElLREC qui ma beaucoup soutenu et que je

remercie de sa confiance

2

SOMMAmE

CADRE DU STAGE p4

1 INTRODUCTION p6

II MATERIEL ET METHODE

1deg - Lespegravece p7

2deg - Le milieu p7

3deg - Echantillonnage p10

Indices physiologiques p 10

Feacutecondations in vitro p 10

4deg - Meacutethodes p 10

Indices physiologiques p10

Tests de feacutecondation pU

Geacuteneacutetique des population p12

5deg -Traitement des donneacutees p 15

IDRESULTATS

1deg - Indices physiologiques p 19

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire p 20

3deg - Geacuteneacutetique des populations p 24

IV DISCUSSION p26

V CONCLUSION p32

VI BIBLIOGRAPHIE p 33

3

CADRE DU STAGE

Ce stage sinscrit dans le programme Ameacutelioration de la qualiteacute des eaux sauvegarde et

restauration de leacutecosystegraveme marin en rade de Brest meneacute par la Communauteacute Urbaine de

Brest dans le cadre dun contrat de baie qui fait lobjet de conventions deacutetudes avec diffeacuterents

organismes de recherche (cf extraits de la circulaire ministeacuterielle du 1305191 preacutesenteacutee en

annexe) Loriginaliteacute du programme reacuteside dans sa pluridisciplinariteacute il integravegre aussi bien le

domaine continental que le domaine marin et associe disciplines scientifiques socioshy

eacuteconomiques et juridiques il vise dune maniegravere geacuteneacuterale agrave preacuteciser les meacutecanismes de

deacutegradation de leacutecosystegraveme de la rade en examinant parmi les processus connus en biologie

marine fondamentale lesquels sappliquent agrave cette zone particuliegravere et agrave mettre en place les

reacuteseaux dobservation et les outils de suivi de la qualiteacute du milieu gracircce auxquels il devrait ecirctre

possible de quantifier cette qualiteacute et preacutevoir ses conseacutequences sur les ressources halieutiques

Les reacutesultats du programme deacutetudes sont soumis au Comiteacute Scientifique du contrat de baie

et preacutesenteacutes ensuite agrave un Comiteacute dExpertise Scientifique International puis agrave un Comiteacute Pilote

pour deacutecision opeacuterationnelle

Le contrat rade de Brest doit aboutir agrave la mise au point de meacutethodes de lutte approprieacutees

contre les polluants et la fourniture aux deacutecideurs politiques et administratifs dun outil daide agrave

la deacutecision

Le stage sest deacuterouleacute dune part dans lUniteacute de Recherche Associeacutee au CNRS D 1513 agrave la

Faculteacute des Sciences de Brest~ et dautre part au laboratoire deacutecotoxicologie du centre

IFREMER de Brest dont les organisations sont preacutesenteacutees ci-apregraves Lobjectif de cette

coopeacuteration dans le programme deacutetude se situe dans la surveillance et lappreacuteciation de la

qualiteacute du milieu par lobservation dindicateurs biologiques de pollution Son but est deacutevaluer

la situation preacutesente de la rade et permettre un suivi de limpact des actions de deacutepollution

4

ORGANISATION DES STRUCTURES DACCUEIL

URA CNRS D1513

Uniteacute de recherche associeacutee au CNRS

Flux de matiegravere et reacuteponses du vivant

(Chef P TREGUER)

Biogeacuteochimie Physique Ecologie benthique

(P TREGUER) (M GLEMAREC)

resp stage M GUILLOU (eacutecologie des eacutechinodermes)

Biologie marine

(M LE PENNEC) resp stage D MORAGA

(geacuteneacutetique des populations)

Geacutenotoxiciteacute

des polluants

(F GALGANI)

IFREMER Direction de lEmironnement ~

et de lAmeacutenagement Littoral )

( Laboratoire dEcototicoJogie

(directeur F GALGAl)

~--------~

Etudes ponctuelles Transfert Tests qualiteacute deau de surveillance - action des pesticidessurveillance 1

1

(EHIS)biologiquei 1(F GALGAl-H) (T BURGEOT) - test tnverteacutebreacutes

(F Qulv70U resp stage)

(F TOLLARASTEL)

5

Il INTRODUCTION

Les oursins sont reconnus pour ecirctre tregraves sensibles aux modifications des conditions

environnementales Leur plasticiteacute face aux conditions du milieu et leur mode de vie en font de

bons indicateurs biologiques de pollution marine (Augier 1987a Kobayashi 1971) Dailleurs

depuis plus dune vingtaine danneacutees gamegravetes embryons et larves doursins constituent un

mateacuteriel de base dans les domaines de la pharmacologie toxicologie ou eacutecotoxicologie

(Hagstrom amp Lonning 1974 Bougis 1981 Dinnel et al 1987 Pagano amp Romafia 1991)

Leur sensibiliteacute aux conditions du milieu se manifeste par des perturbations du cycle de

reproduction des baisses de feacuteconditeacute ou des troubles du deacuteveloppement larvaire et les effets

observeacutes en zones perturbeacutees sur les populations doursins ont eacuteteacute souvent deacutecrits (Harmelin et

al 1981 Delmas amp Reacutegis 1984)

Dautre part les biologistes de lobservatoire marin de Roscoff (Nord-Finistegravere) utilisant

reacuteguliegraverement des oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis (Lamarck) preacuteleveacutes en rade de

Brest sur le site de la pointe de lArmorique ont signaleacute depuis 1985 des anomalies du

deacuteveloppement cellulaire Suite agrave ces observations des travaux preacuteliminaires ont mis en

eacutevidence sur ce mecircme site des perturbations du deacuteveloppement de la population et un faible

taux de croissance des individus (Chevallier 1993)

Ces indications ont motiveacute le choix de Sphaerechimls granularis tregraves commun dans la rade

et dont la biologie est par ailleurs bien connue (Fenaux 1972 Semroud amp Senoussi 1989

Guillou amp Michel 1993) comme bioindicateur de la qualiteacute du milieu dans le cadre du

Programme deacutetudes pluridisciplinaire de la rade de Brest Leacutetude porte sur trois stations de la

rade distribueacutees le long dun gradient de pollution et une quatriegraveme dans larchipel des Gleacutenan

(Bretagne Sud) exempt de pollution anthropique et choisi comme site de reacutefeacuterence

Lobservation consiste agrave suivre leacutevolution dindices physiologiques (Indice Gonadique et

Indice de Reacutepleacutetion) reacuteveacutelateurs de la condition des inampidus et agrave effectuer des feacutecondations

in vitro en vue de mesurer le taux de reacuteussite de stade pluteus obtenu pour chaque site de

maniegravere agrave mettre en eacutevidence une eacuteventuelle deacutegradation de lenvironnement

Par ailleurs lestimation de linfluence des conditions emironnementales saccompagne dune

eacutetude de geacuteneacutetique inspireacutee des meacutethodes employeacutees sur dautres inverteacutebreacutes marins (faune

6

profonde et intertidale) pour mesurer les adaptations geacuteneacutetiques de ces animaux vis agrave vs des

contraintes eacutecologiques (Siebenaller 1978 Bristow amp Vadas 1991) Ce travail vise agrave eacutevaluer

la variabiliteacute geacuteneacutetique preacutesenteacutee par S granularis dans les populations des deux stations les

plus exposeacutees qu~ quoique voisines geacuteographiquement ont montreacute des diffeacuterences

morphologiques et deacutemographiques tregraves marqueacutees (Lumingas amp Guillou sous presse) Cette

partie a eacutegalement pour but de mesurer le degreacutes de diffeacuterenciation existant entre ces deux

populations pour apporter une explication geacuteneacutetique agrave ces observations

A terme ce travail tend agrave mieux connaicirctre les reacuteponses de lespegravece et agrave estimer leacutetat de

pollution de la rade sur les sites choisis en diagnostiquant si possible les agents responsables

des deacuteregraveglements observeacutes

il 1MATERIEL ET METHODES

1deg - Lespegravece

Sphaerechinus granularis (Echinodermata Echinoidea Toxopneustidae) est une espegravece

comestible de grande taille pouvant atteindre 14 cm commune dans lheacutemisphegravere Nord sur les

cocirctes de lAtlantique-Est depuis la Manche occidentale jusquau Golfe de Guineacutee (Koehler

1921) ainsi quen Meacutediterraneacutee (Tortonese 1965) Sa reacutepartition verticale seacutetend de la zone

intertidale jusquagrave 130 m (Cherbonnier 1958) sur divers substrats en fonction des classes dacircge

et des preacutefeacuterences alimentaires (Guillou amp Michel 199) En rade de Brest les plus f011es

populations se rencontrent essentiellement sur les fonds seacutedimentaires grossiers recouverts de

maeumlrl vivant (Lithothamnium corallinoiumldes Crouan)

2deg - Le milieu

La rade de Brest est une vaste eacutetendue deau de plus de 150 km2 qui communique avec la

mer dIroise par un goulet de 18 km de large et de 20 m de profondeur Elle reccediloit les apports

de deux riviegraveres principales au Nord-Est lElorn (6m3 s de deacutebit moyen) au Sud-Est lAulne

(24m3s de deacutebit moyen) Les bassins versants de la rade repreacutesentent pregraves de 2800 km2 qui

sont essentiellement consacreacutes agrave lagriculture

7

Il est possible pour simplifier de subdiviser la rade elle-mecircme en trois zones un bassin

Nord tout dabord agrave lembouchure de lElorn ougrave se concentrent les activiteacutes portuaires de

Brest ensuite un bassin Sud recevant les eaux de lAulne moins urbaniseacute et mieux proteacutegeacute de

linfluence portuaire mais plus exposeacute aux effluents agricoles enfin une zone de meacutelange

formant un tourbillon dans la partie centrale de la rade allant des alentours de la presquicircle de

Quelem jusque dans le goulet

Le choix des sites sest porteacute sur quatre zones propices au deacuteveloppement de S gramllaris

dont trois dans la rade la derniegravere dans les icircles Gleacutenan en fonction de leurs diffeacuterentes

caracteacuteristiques La situation geacuteographique de chaque station se trouve illustreacutee en figure 1

- (1) Pointe Marloux situeacutee dans le bassin Nord proche de la zone portuaire dans une

zone de calme relatif laquo1 noeud en vives eaux) Le fond est constitueacute de maeumlrl pur la

profondeur est faible (5 m) Une eacutetude de la dynamique des populations a reacuteveacuteleacute de fortes

irreacutegulariteacutes dans le recrutement (Lumingas et GuiIlou sous presse)

- (2) Pointe de lArmorique situeacutee agrave lembouchure de lAulne ougrave la preacutesence de lIle Ronde

concentre les courants de mareacutee dans un chenal eacutetroit qui amplifie leur vitesse Gusquagrave 3

noeuds) Linfluence estuarienne y est encore ressentie le seacutediment est heacuteteacuterogegravene composeacute de

sable coquillier grossier et de deacutebris de maeumlrl la profonegraveeur peut atteindre jusquagrave 20 m au

milieu du chenal

- (3) Anse du DelIee zone rocheuse situeacutee dans le goulet de Brest directement sous

influence oceacuteanique Lhydrodynamisme est assez fort (gt2 noeuds en vives eaux) favorable au

deacuteveloppement dune couverture algale importante La zone de preacutelegravevement se situe sur une

pointe rocheuse appeleacutee pointe du Diable agrave labri des effets de lagglomeacuteration voisine agrave une

profondeur maximale de 10 m

- (4) Archipel des Gleacutenan en Baie de Concarneau Bretagne-Sud agrave leacutecart de toute

pollution anthropique et ougrave la population doursins connaicirct un large essor (Guillou et Michel

1993) et fait lobjet dune pecirccherie artisanale Cette derniegravere station sera consideacutereacutee comme site

de reacutefeacuterence

8

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

RESUME

Dans le cadre du programme deacutetudes pluridisciplinaire du contrat de baie mis en œuvre par la

Communauteacute Urbaine de Brest un travail dobservation inteacutegrant certains paramegravetres

biologiques (Indices Gonadique et de Reacutepleacutetion) eacutecotoXIcirccologiques (feacutecondation et

deacuteveloppemnt larvaire) et geacuteneacutetiques a eacuteteacute meneacute au laboratoire deacutecologie benthique de

lUniversiteacute des Sciences de Brest et au laboratoire deacutecotoXIcirccologie de lIFREMER-Brest sur

les oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis de la rade en tant quindicateurs biologiques

de pollution Le site de larchipel des Gleacutenan (Finistegravere-Sud) a eacuteteacute choisi agrave titre de reacutefeacuterence TI

ressort de leacutetude que la station placeacutee dans le goulet en communication directe avec la mer

dIroise preacutesente des reacutesultats comparables aux Gleacutenan et ne semble pas atteinte par les effets

anthropiques contrairement aux stations proches de la zone portuaire La population doursins

de la pointe de lArmorique savegravere seacutevegravereacutement perturbeacutee tant dans son cycle biologique que

dans son deacuteveloppement larvaire et preacutesente une perte de variabiliteacute geacuteneacutetique par rapport agrave la

station voisine (pointe MarIoux) Parmi les causes possibles de tels pheacutenomegravenes lhypothegravese

dune contamination par les meacutetaux lourds a eacuteteacute conforteacutee par les reacutesultats danalyses effectueacutees

par le Laboratoire Municipal La responsabiliteacute des actnireacutes militaires pratiqueacutees sur ce site est

discuteacutee dans ce rapport

Remerciements

Je tiens agrave exprimer ma gratitude agrave toutes les personnes qui mont aideacute pendant ce travail en

commenccedilant par mes responsables de stage

Madame Monique GUILLOU pour sa disponibiliteacute malgreacute quelques ennuis de santeacute et

pour son aide dans les moments importants Madame Franccediloise QUlNIOU pour avoir

parfois sacrifieacute ses jours de repos pour venir massister Monsieur Dario MORAGA pour tout

ce quil ma appris de la geacuteneacutetique des populations

Je remercie tout speacutecialement Christian TARTU Robert ~1ARC et Seacutebastien DAO

pour leurs compeacutetences techniques et pour leur agreacuteable compagnie agrave chaque sortie en mer

Je voudrais dire merci eacutegalement agrave Laurent CHAUVEAU et Lucky LUMlNGAS en

thegravese actuellement qui ont bien voulu partager avec moi une partie des donneacutees quils ont

recueillies sur le terrain

Je ne voudrais pas oublier Franccediloise DENIS pour mavoir fait part de son expeacuterience dans

le domaine de leacutelectrophoregravese et dans lutilisation du logiciel BIOSYS l

Je remercie aussi Madame ~1arie-Reneacutee LE LIART pour son accueil agrave mon arriveacutee agrave la

faculteacute et pour raide quelle ma apporteacutee pour reacutesoudre mes problegravemes dordre mateacuteriel

Je remercie bien sucircr les responsables de ma formation Madame Nicole DHAINAUT et

Monsieur Daniel PETIT pour mavoir permis deffectuer ce stage dans le cadre du DESS

Gestion des Ressources Naturelles Renouvelables et Ameacutelioration de la qualiteacute de la vie

Enfin je tiens agrave exprimer ma profonde reconnaissance au responsable du laboratoire

deacutecologie benthique Monsieur Michel GLElLREC qui ma beaucoup soutenu et que je

remercie de sa confiance

2

SOMMAmE

CADRE DU STAGE p4

1 INTRODUCTION p6

II MATERIEL ET METHODE

1deg - Lespegravece p7

2deg - Le milieu p7

3deg - Echantillonnage p10

Indices physiologiques p 10

Feacutecondations in vitro p 10

4deg - Meacutethodes p 10

Indices physiologiques p10

Tests de feacutecondation pU

Geacuteneacutetique des population p12

5deg -Traitement des donneacutees p 15

IDRESULTATS

1deg - Indices physiologiques p 19

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire p 20

3deg - Geacuteneacutetique des populations p 24

IV DISCUSSION p26

V CONCLUSION p32

VI BIBLIOGRAPHIE p 33

3

CADRE DU STAGE

Ce stage sinscrit dans le programme Ameacutelioration de la qualiteacute des eaux sauvegarde et

restauration de leacutecosystegraveme marin en rade de Brest meneacute par la Communauteacute Urbaine de

Brest dans le cadre dun contrat de baie qui fait lobjet de conventions deacutetudes avec diffeacuterents

organismes de recherche (cf extraits de la circulaire ministeacuterielle du 1305191 preacutesenteacutee en

annexe) Loriginaliteacute du programme reacuteside dans sa pluridisciplinariteacute il integravegre aussi bien le

domaine continental que le domaine marin et associe disciplines scientifiques socioshy

eacuteconomiques et juridiques il vise dune maniegravere geacuteneacuterale agrave preacuteciser les meacutecanismes de

deacutegradation de leacutecosystegraveme de la rade en examinant parmi les processus connus en biologie

marine fondamentale lesquels sappliquent agrave cette zone particuliegravere et agrave mettre en place les

reacuteseaux dobservation et les outils de suivi de la qualiteacute du milieu gracircce auxquels il devrait ecirctre

possible de quantifier cette qualiteacute et preacutevoir ses conseacutequences sur les ressources halieutiques

Les reacutesultats du programme deacutetudes sont soumis au Comiteacute Scientifique du contrat de baie

et preacutesenteacutes ensuite agrave un Comiteacute dExpertise Scientifique International puis agrave un Comiteacute Pilote

pour deacutecision opeacuterationnelle

Le contrat rade de Brest doit aboutir agrave la mise au point de meacutethodes de lutte approprieacutees

contre les polluants et la fourniture aux deacutecideurs politiques et administratifs dun outil daide agrave

la deacutecision

Le stage sest deacuterouleacute dune part dans lUniteacute de Recherche Associeacutee au CNRS D 1513 agrave la

Faculteacute des Sciences de Brest~ et dautre part au laboratoire deacutecotoxicologie du centre

IFREMER de Brest dont les organisations sont preacutesenteacutees ci-apregraves Lobjectif de cette

coopeacuteration dans le programme deacutetude se situe dans la surveillance et lappreacuteciation de la

qualiteacute du milieu par lobservation dindicateurs biologiques de pollution Son but est deacutevaluer

la situation preacutesente de la rade et permettre un suivi de limpact des actions de deacutepollution

4

ORGANISATION DES STRUCTURES DACCUEIL

URA CNRS D1513

Uniteacute de recherche associeacutee au CNRS

Flux de matiegravere et reacuteponses du vivant

(Chef P TREGUER)

Biogeacuteochimie Physique Ecologie benthique

(P TREGUER) (M GLEMAREC)

resp stage M GUILLOU (eacutecologie des eacutechinodermes)

Biologie marine

(M LE PENNEC) resp stage D MORAGA

(geacuteneacutetique des populations)

Geacutenotoxiciteacute

des polluants

(F GALGANI)

IFREMER Direction de lEmironnement ~

et de lAmeacutenagement Littoral )

( Laboratoire dEcototicoJogie

(directeur F GALGAl)

~--------~

Etudes ponctuelles Transfert Tests qualiteacute deau de surveillance - action des pesticidessurveillance 1

1

(EHIS)biologiquei 1(F GALGAl-H) (T BURGEOT) - test tnverteacutebreacutes

(F Qulv70U resp stage)

(F TOLLARASTEL)

5

Il INTRODUCTION

Les oursins sont reconnus pour ecirctre tregraves sensibles aux modifications des conditions

environnementales Leur plasticiteacute face aux conditions du milieu et leur mode de vie en font de

bons indicateurs biologiques de pollution marine (Augier 1987a Kobayashi 1971) Dailleurs

depuis plus dune vingtaine danneacutees gamegravetes embryons et larves doursins constituent un

mateacuteriel de base dans les domaines de la pharmacologie toxicologie ou eacutecotoxicologie

(Hagstrom amp Lonning 1974 Bougis 1981 Dinnel et al 1987 Pagano amp Romafia 1991)

Leur sensibiliteacute aux conditions du milieu se manifeste par des perturbations du cycle de

reproduction des baisses de feacuteconditeacute ou des troubles du deacuteveloppement larvaire et les effets

observeacutes en zones perturbeacutees sur les populations doursins ont eacuteteacute souvent deacutecrits (Harmelin et

al 1981 Delmas amp Reacutegis 1984)

Dautre part les biologistes de lobservatoire marin de Roscoff (Nord-Finistegravere) utilisant

reacuteguliegraverement des oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis (Lamarck) preacuteleveacutes en rade de

Brest sur le site de la pointe de lArmorique ont signaleacute depuis 1985 des anomalies du

deacuteveloppement cellulaire Suite agrave ces observations des travaux preacuteliminaires ont mis en

eacutevidence sur ce mecircme site des perturbations du deacuteveloppement de la population et un faible

taux de croissance des individus (Chevallier 1993)

Ces indications ont motiveacute le choix de Sphaerechimls granularis tregraves commun dans la rade

et dont la biologie est par ailleurs bien connue (Fenaux 1972 Semroud amp Senoussi 1989

Guillou amp Michel 1993) comme bioindicateur de la qualiteacute du milieu dans le cadre du

Programme deacutetudes pluridisciplinaire de la rade de Brest Leacutetude porte sur trois stations de la

rade distribueacutees le long dun gradient de pollution et une quatriegraveme dans larchipel des Gleacutenan

(Bretagne Sud) exempt de pollution anthropique et choisi comme site de reacutefeacuterence

Lobservation consiste agrave suivre leacutevolution dindices physiologiques (Indice Gonadique et

Indice de Reacutepleacutetion) reacuteveacutelateurs de la condition des inampidus et agrave effectuer des feacutecondations

in vitro en vue de mesurer le taux de reacuteussite de stade pluteus obtenu pour chaque site de

maniegravere agrave mettre en eacutevidence une eacuteventuelle deacutegradation de lenvironnement

Par ailleurs lestimation de linfluence des conditions emironnementales saccompagne dune

eacutetude de geacuteneacutetique inspireacutee des meacutethodes employeacutees sur dautres inverteacutebreacutes marins (faune

6

profonde et intertidale) pour mesurer les adaptations geacuteneacutetiques de ces animaux vis agrave vs des

contraintes eacutecologiques (Siebenaller 1978 Bristow amp Vadas 1991) Ce travail vise agrave eacutevaluer

la variabiliteacute geacuteneacutetique preacutesenteacutee par S granularis dans les populations des deux stations les

plus exposeacutees qu~ quoique voisines geacuteographiquement ont montreacute des diffeacuterences

morphologiques et deacutemographiques tregraves marqueacutees (Lumingas amp Guillou sous presse) Cette

partie a eacutegalement pour but de mesurer le degreacutes de diffeacuterenciation existant entre ces deux

populations pour apporter une explication geacuteneacutetique agrave ces observations

A terme ce travail tend agrave mieux connaicirctre les reacuteponses de lespegravece et agrave estimer leacutetat de

pollution de la rade sur les sites choisis en diagnostiquant si possible les agents responsables

des deacuteregraveglements observeacutes

il 1MATERIEL ET METHODES

1deg - Lespegravece

Sphaerechinus granularis (Echinodermata Echinoidea Toxopneustidae) est une espegravece

comestible de grande taille pouvant atteindre 14 cm commune dans lheacutemisphegravere Nord sur les

cocirctes de lAtlantique-Est depuis la Manche occidentale jusquau Golfe de Guineacutee (Koehler

1921) ainsi quen Meacutediterraneacutee (Tortonese 1965) Sa reacutepartition verticale seacutetend de la zone

intertidale jusquagrave 130 m (Cherbonnier 1958) sur divers substrats en fonction des classes dacircge

et des preacutefeacuterences alimentaires (Guillou amp Michel 199) En rade de Brest les plus f011es

populations se rencontrent essentiellement sur les fonds seacutedimentaires grossiers recouverts de

maeumlrl vivant (Lithothamnium corallinoiumldes Crouan)

2deg - Le milieu

La rade de Brest est une vaste eacutetendue deau de plus de 150 km2 qui communique avec la

mer dIroise par un goulet de 18 km de large et de 20 m de profondeur Elle reccediloit les apports

de deux riviegraveres principales au Nord-Est lElorn (6m3 s de deacutebit moyen) au Sud-Est lAulne

(24m3s de deacutebit moyen) Les bassins versants de la rade repreacutesentent pregraves de 2800 km2 qui

sont essentiellement consacreacutes agrave lagriculture

7

Il est possible pour simplifier de subdiviser la rade elle-mecircme en trois zones un bassin

Nord tout dabord agrave lembouchure de lElorn ougrave se concentrent les activiteacutes portuaires de

Brest ensuite un bassin Sud recevant les eaux de lAulne moins urbaniseacute et mieux proteacutegeacute de

linfluence portuaire mais plus exposeacute aux effluents agricoles enfin une zone de meacutelange

formant un tourbillon dans la partie centrale de la rade allant des alentours de la presquicircle de

Quelem jusque dans le goulet

Le choix des sites sest porteacute sur quatre zones propices au deacuteveloppement de S gramllaris

dont trois dans la rade la derniegravere dans les icircles Gleacutenan en fonction de leurs diffeacuterentes

caracteacuteristiques La situation geacuteographique de chaque station se trouve illustreacutee en figure 1

- (1) Pointe Marloux situeacutee dans le bassin Nord proche de la zone portuaire dans une

zone de calme relatif laquo1 noeud en vives eaux) Le fond est constitueacute de maeumlrl pur la

profondeur est faible (5 m) Une eacutetude de la dynamique des populations a reacuteveacuteleacute de fortes

irreacutegulariteacutes dans le recrutement (Lumingas et GuiIlou sous presse)

- (2) Pointe de lArmorique situeacutee agrave lembouchure de lAulne ougrave la preacutesence de lIle Ronde

concentre les courants de mareacutee dans un chenal eacutetroit qui amplifie leur vitesse Gusquagrave 3

noeuds) Linfluence estuarienne y est encore ressentie le seacutediment est heacuteteacuterogegravene composeacute de

sable coquillier grossier et de deacutebris de maeumlrl la profonegraveeur peut atteindre jusquagrave 20 m au

milieu du chenal

- (3) Anse du DelIee zone rocheuse situeacutee dans le goulet de Brest directement sous

influence oceacuteanique Lhydrodynamisme est assez fort (gt2 noeuds en vives eaux) favorable au

deacuteveloppement dune couverture algale importante La zone de preacutelegravevement se situe sur une

pointe rocheuse appeleacutee pointe du Diable agrave labri des effets de lagglomeacuteration voisine agrave une

profondeur maximale de 10 m

- (4) Archipel des Gleacutenan en Baie de Concarneau Bretagne-Sud agrave leacutecart de toute

pollution anthropique et ougrave la population doursins connaicirct un large essor (Guillou et Michel

1993) et fait lobjet dune pecirccherie artisanale Cette derniegravere station sera consideacutereacutee comme site

de reacutefeacuterence

8

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

Remerciements

Je tiens agrave exprimer ma gratitude agrave toutes les personnes qui mont aideacute pendant ce travail en

commenccedilant par mes responsables de stage

Madame Monique GUILLOU pour sa disponibiliteacute malgreacute quelques ennuis de santeacute et

pour son aide dans les moments importants Madame Franccediloise QUlNIOU pour avoir

parfois sacrifieacute ses jours de repos pour venir massister Monsieur Dario MORAGA pour tout

ce quil ma appris de la geacuteneacutetique des populations

Je remercie tout speacutecialement Christian TARTU Robert ~1ARC et Seacutebastien DAO

pour leurs compeacutetences techniques et pour leur agreacuteable compagnie agrave chaque sortie en mer

Je voudrais dire merci eacutegalement agrave Laurent CHAUVEAU et Lucky LUMlNGAS en

thegravese actuellement qui ont bien voulu partager avec moi une partie des donneacutees quils ont

recueillies sur le terrain

Je ne voudrais pas oublier Franccediloise DENIS pour mavoir fait part de son expeacuterience dans

le domaine de leacutelectrophoregravese et dans lutilisation du logiciel BIOSYS l

Je remercie aussi Madame ~1arie-Reneacutee LE LIART pour son accueil agrave mon arriveacutee agrave la

faculteacute et pour raide quelle ma apporteacutee pour reacutesoudre mes problegravemes dordre mateacuteriel

Je remercie bien sucircr les responsables de ma formation Madame Nicole DHAINAUT et

Monsieur Daniel PETIT pour mavoir permis deffectuer ce stage dans le cadre du DESS

Gestion des Ressources Naturelles Renouvelables et Ameacutelioration de la qualiteacute de la vie

Enfin je tiens agrave exprimer ma profonde reconnaissance au responsable du laboratoire

deacutecologie benthique Monsieur Michel GLElLREC qui ma beaucoup soutenu et que je

remercie de sa confiance

2

SOMMAmE

CADRE DU STAGE p4

1 INTRODUCTION p6

II MATERIEL ET METHODE

1deg - Lespegravece p7

2deg - Le milieu p7

3deg - Echantillonnage p10

Indices physiologiques p 10

Feacutecondations in vitro p 10

4deg - Meacutethodes p 10

Indices physiologiques p10

Tests de feacutecondation pU

Geacuteneacutetique des population p12

5deg -Traitement des donneacutees p 15

IDRESULTATS

1deg - Indices physiologiques p 19

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire p 20

3deg - Geacuteneacutetique des populations p 24

IV DISCUSSION p26

V CONCLUSION p32

VI BIBLIOGRAPHIE p 33

3

CADRE DU STAGE

Ce stage sinscrit dans le programme Ameacutelioration de la qualiteacute des eaux sauvegarde et

restauration de leacutecosystegraveme marin en rade de Brest meneacute par la Communauteacute Urbaine de

Brest dans le cadre dun contrat de baie qui fait lobjet de conventions deacutetudes avec diffeacuterents

organismes de recherche (cf extraits de la circulaire ministeacuterielle du 1305191 preacutesenteacutee en

annexe) Loriginaliteacute du programme reacuteside dans sa pluridisciplinariteacute il integravegre aussi bien le

domaine continental que le domaine marin et associe disciplines scientifiques socioshy

eacuteconomiques et juridiques il vise dune maniegravere geacuteneacuterale agrave preacuteciser les meacutecanismes de

deacutegradation de leacutecosystegraveme de la rade en examinant parmi les processus connus en biologie

marine fondamentale lesquels sappliquent agrave cette zone particuliegravere et agrave mettre en place les

reacuteseaux dobservation et les outils de suivi de la qualiteacute du milieu gracircce auxquels il devrait ecirctre

possible de quantifier cette qualiteacute et preacutevoir ses conseacutequences sur les ressources halieutiques

Les reacutesultats du programme deacutetudes sont soumis au Comiteacute Scientifique du contrat de baie

et preacutesenteacutes ensuite agrave un Comiteacute dExpertise Scientifique International puis agrave un Comiteacute Pilote

pour deacutecision opeacuterationnelle

Le contrat rade de Brest doit aboutir agrave la mise au point de meacutethodes de lutte approprieacutees

contre les polluants et la fourniture aux deacutecideurs politiques et administratifs dun outil daide agrave

la deacutecision

Le stage sest deacuterouleacute dune part dans lUniteacute de Recherche Associeacutee au CNRS D 1513 agrave la

Faculteacute des Sciences de Brest~ et dautre part au laboratoire deacutecotoxicologie du centre

IFREMER de Brest dont les organisations sont preacutesenteacutees ci-apregraves Lobjectif de cette

coopeacuteration dans le programme deacutetude se situe dans la surveillance et lappreacuteciation de la

qualiteacute du milieu par lobservation dindicateurs biologiques de pollution Son but est deacutevaluer

la situation preacutesente de la rade et permettre un suivi de limpact des actions de deacutepollution

4

ORGANISATION DES STRUCTURES DACCUEIL

URA CNRS D1513

Uniteacute de recherche associeacutee au CNRS

Flux de matiegravere et reacuteponses du vivant

(Chef P TREGUER)

Biogeacuteochimie Physique Ecologie benthique

(P TREGUER) (M GLEMAREC)

resp stage M GUILLOU (eacutecologie des eacutechinodermes)

Biologie marine

(M LE PENNEC) resp stage D MORAGA

(geacuteneacutetique des populations)

Geacutenotoxiciteacute

des polluants

(F GALGANI)

IFREMER Direction de lEmironnement ~

et de lAmeacutenagement Littoral )

( Laboratoire dEcototicoJogie

(directeur F GALGAl)

~--------~

Etudes ponctuelles Transfert Tests qualiteacute deau de surveillance - action des pesticidessurveillance 1

1

(EHIS)biologiquei 1(F GALGAl-H) (T BURGEOT) - test tnverteacutebreacutes

(F Qulv70U resp stage)

(F TOLLARASTEL)

5

Il INTRODUCTION

Les oursins sont reconnus pour ecirctre tregraves sensibles aux modifications des conditions

environnementales Leur plasticiteacute face aux conditions du milieu et leur mode de vie en font de

bons indicateurs biologiques de pollution marine (Augier 1987a Kobayashi 1971) Dailleurs

depuis plus dune vingtaine danneacutees gamegravetes embryons et larves doursins constituent un

mateacuteriel de base dans les domaines de la pharmacologie toxicologie ou eacutecotoxicologie

(Hagstrom amp Lonning 1974 Bougis 1981 Dinnel et al 1987 Pagano amp Romafia 1991)

Leur sensibiliteacute aux conditions du milieu se manifeste par des perturbations du cycle de

reproduction des baisses de feacuteconditeacute ou des troubles du deacuteveloppement larvaire et les effets

observeacutes en zones perturbeacutees sur les populations doursins ont eacuteteacute souvent deacutecrits (Harmelin et

al 1981 Delmas amp Reacutegis 1984)

Dautre part les biologistes de lobservatoire marin de Roscoff (Nord-Finistegravere) utilisant

reacuteguliegraverement des oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis (Lamarck) preacuteleveacutes en rade de

Brest sur le site de la pointe de lArmorique ont signaleacute depuis 1985 des anomalies du

deacuteveloppement cellulaire Suite agrave ces observations des travaux preacuteliminaires ont mis en

eacutevidence sur ce mecircme site des perturbations du deacuteveloppement de la population et un faible

taux de croissance des individus (Chevallier 1993)

Ces indications ont motiveacute le choix de Sphaerechimls granularis tregraves commun dans la rade

et dont la biologie est par ailleurs bien connue (Fenaux 1972 Semroud amp Senoussi 1989

Guillou amp Michel 1993) comme bioindicateur de la qualiteacute du milieu dans le cadre du

Programme deacutetudes pluridisciplinaire de la rade de Brest Leacutetude porte sur trois stations de la

rade distribueacutees le long dun gradient de pollution et une quatriegraveme dans larchipel des Gleacutenan

(Bretagne Sud) exempt de pollution anthropique et choisi comme site de reacutefeacuterence

Lobservation consiste agrave suivre leacutevolution dindices physiologiques (Indice Gonadique et

Indice de Reacutepleacutetion) reacuteveacutelateurs de la condition des inampidus et agrave effectuer des feacutecondations

in vitro en vue de mesurer le taux de reacuteussite de stade pluteus obtenu pour chaque site de

maniegravere agrave mettre en eacutevidence une eacuteventuelle deacutegradation de lenvironnement

Par ailleurs lestimation de linfluence des conditions emironnementales saccompagne dune

eacutetude de geacuteneacutetique inspireacutee des meacutethodes employeacutees sur dautres inverteacutebreacutes marins (faune

6

profonde et intertidale) pour mesurer les adaptations geacuteneacutetiques de ces animaux vis agrave vs des

contraintes eacutecologiques (Siebenaller 1978 Bristow amp Vadas 1991) Ce travail vise agrave eacutevaluer

la variabiliteacute geacuteneacutetique preacutesenteacutee par S granularis dans les populations des deux stations les

plus exposeacutees qu~ quoique voisines geacuteographiquement ont montreacute des diffeacuterences

morphologiques et deacutemographiques tregraves marqueacutees (Lumingas amp Guillou sous presse) Cette

partie a eacutegalement pour but de mesurer le degreacutes de diffeacuterenciation existant entre ces deux

populations pour apporter une explication geacuteneacutetique agrave ces observations

A terme ce travail tend agrave mieux connaicirctre les reacuteponses de lespegravece et agrave estimer leacutetat de

pollution de la rade sur les sites choisis en diagnostiquant si possible les agents responsables

des deacuteregraveglements observeacutes

il 1MATERIEL ET METHODES

1deg - Lespegravece

Sphaerechinus granularis (Echinodermata Echinoidea Toxopneustidae) est une espegravece

comestible de grande taille pouvant atteindre 14 cm commune dans lheacutemisphegravere Nord sur les

cocirctes de lAtlantique-Est depuis la Manche occidentale jusquau Golfe de Guineacutee (Koehler

1921) ainsi quen Meacutediterraneacutee (Tortonese 1965) Sa reacutepartition verticale seacutetend de la zone

intertidale jusquagrave 130 m (Cherbonnier 1958) sur divers substrats en fonction des classes dacircge

et des preacutefeacuterences alimentaires (Guillou amp Michel 199) En rade de Brest les plus f011es

populations se rencontrent essentiellement sur les fonds seacutedimentaires grossiers recouverts de

maeumlrl vivant (Lithothamnium corallinoiumldes Crouan)

2deg - Le milieu

La rade de Brest est une vaste eacutetendue deau de plus de 150 km2 qui communique avec la

mer dIroise par un goulet de 18 km de large et de 20 m de profondeur Elle reccediloit les apports

de deux riviegraveres principales au Nord-Est lElorn (6m3 s de deacutebit moyen) au Sud-Est lAulne

(24m3s de deacutebit moyen) Les bassins versants de la rade repreacutesentent pregraves de 2800 km2 qui

sont essentiellement consacreacutes agrave lagriculture

7

Il est possible pour simplifier de subdiviser la rade elle-mecircme en trois zones un bassin

Nord tout dabord agrave lembouchure de lElorn ougrave se concentrent les activiteacutes portuaires de

Brest ensuite un bassin Sud recevant les eaux de lAulne moins urbaniseacute et mieux proteacutegeacute de

linfluence portuaire mais plus exposeacute aux effluents agricoles enfin une zone de meacutelange

formant un tourbillon dans la partie centrale de la rade allant des alentours de la presquicircle de

Quelem jusque dans le goulet

Le choix des sites sest porteacute sur quatre zones propices au deacuteveloppement de S gramllaris

dont trois dans la rade la derniegravere dans les icircles Gleacutenan en fonction de leurs diffeacuterentes

caracteacuteristiques La situation geacuteographique de chaque station se trouve illustreacutee en figure 1

- (1) Pointe Marloux situeacutee dans le bassin Nord proche de la zone portuaire dans une

zone de calme relatif laquo1 noeud en vives eaux) Le fond est constitueacute de maeumlrl pur la

profondeur est faible (5 m) Une eacutetude de la dynamique des populations a reacuteveacuteleacute de fortes

irreacutegulariteacutes dans le recrutement (Lumingas et GuiIlou sous presse)

- (2) Pointe de lArmorique situeacutee agrave lembouchure de lAulne ougrave la preacutesence de lIle Ronde

concentre les courants de mareacutee dans un chenal eacutetroit qui amplifie leur vitesse Gusquagrave 3

noeuds) Linfluence estuarienne y est encore ressentie le seacutediment est heacuteteacuterogegravene composeacute de

sable coquillier grossier et de deacutebris de maeumlrl la profonegraveeur peut atteindre jusquagrave 20 m au

milieu du chenal

- (3) Anse du DelIee zone rocheuse situeacutee dans le goulet de Brest directement sous

influence oceacuteanique Lhydrodynamisme est assez fort (gt2 noeuds en vives eaux) favorable au

deacuteveloppement dune couverture algale importante La zone de preacutelegravevement se situe sur une

pointe rocheuse appeleacutee pointe du Diable agrave labri des effets de lagglomeacuteration voisine agrave une

profondeur maximale de 10 m

- (4) Archipel des Gleacutenan en Baie de Concarneau Bretagne-Sud agrave leacutecart de toute

pollution anthropique et ougrave la population doursins connaicirct un large essor (Guillou et Michel

1993) et fait lobjet dune pecirccherie artisanale Cette derniegravere station sera consideacutereacutee comme site

de reacutefeacuterence

8

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

SOMMAmE

CADRE DU STAGE p4

1 INTRODUCTION p6

II MATERIEL ET METHODE

1deg - Lespegravece p7

2deg - Le milieu p7

3deg - Echantillonnage p10

Indices physiologiques p 10

Feacutecondations in vitro p 10

4deg - Meacutethodes p 10

Indices physiologiques p10

Tests de feacutecondation pU

Geacuteneacutetique des population p12

5deg -Traitement des donneacutees p 15

IDRESULTATS

1deg - Indices physiologiques p 19

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire p 20

3deg - Geacuteneacutetique des populations p 24

IV DISCUSSION p26

V CONCLUSION p32

VI BIBLIOGRAPHIE p 33

3

CADRE DU STAGE

Ce stage sinscrit dans le programme Ameacutelioration de la qualiteacute des eaux sauvegarde et

restauration de leacutecosystegraveme marin en rade de Brest meneacute par la Communauteacute Urbaine de

Brest dans le cadre dun contrat de baie qui fait lobjet de conventions deacutetudes avec diffeacuterents

organismes de recherche (cf extraits de la circulaire ministeacuterielle du 1305191 preacutesenteacutee en

annexe) Loriginaliteacute du programme reacuteside dans sa pluridisciplinariteacute il integravegre aussi bien le

domaine continental que le domaine marin et associe disciplines scientifiques socioshy

eacuteconomiques et juridiques il vise dune maniegravere geacuteneacuterale agrave preacuteciser les meacutecanismes de

deacutegradation de leacutecosystegraveme de la rade en examinant parmi les processus connus en biologie

marine fondamentale lesquels sappliquent agrave cette zone particuliegravere et agrave mettre en place les

reacuteseaux dobservation et les outils de suivi de la qualiteacute du milieu gracircce auxquels il devrait ecirctre

possible de quantifier cette qualiteacute et preacutevoir ses conseacutequences sur les ressources halieutiques

Les reacutesultats du programme deacutetudes sont soumis au Comiteacute Scientifique du contrat de baie

et preacutesenteacutes ensuite agrave un Comiteacute dExpertise Scientifique International puis agrave un Comiteacute Pilote

pour deacutecision opeacuterationnelle

Le contrat rade de Brest doit aboutir agrave la mise au point de meacutethodes de lutte approprieacutees

contre les polluants et la fourniture aux deacutecideurs politiques et administratifs dun outil daide agrave

la deacutecision

Le stage sest deacuterouleacute dune part dans lUniteacute de Recherche Associeacutee au CNRS D 1513 agrave la

Faculteacute des Sciences de Brest~ et dautre part au laboratoire deacutecotoxicologie du centre

IFREMER de Brest dont les organisations sont preacutesenteacutees ci-apregraves Lobjectif de cette

coopeacuteration dans le programme deacutetude se situe dans la surveillance et lappreacuteciation de la

qualiteacute du milieu par lobservation dindicateurs biologiques de pollution Son but est deacutevaluer

la situation preacutesente de la rade et permettre un suivi de limpact des actions de deacutepollution

4

ORGANISATION DES STRUCTURES DACCUEIL

URA CNRS D1513

Uniteacute de recherche associeacutee au CNRS

Flux de matiegravere et reacuteponses du vivant

(Chef P TREGUER)

Biogeacuteochimie Physique Ecologie benthique

(P TREGUER) (M GLEMAREC)

resp stage M GUILLOU (eacutecologie des eacutechinodermes)

Biologie marine

(M LE PENNEC) resp stage D MORAGA

(geacuteneacutetique des populations)

Geacutenotoxiciteacute

des polluants

(F GALGANI)

IFREMER Direction de lEmironnement ~

et de lAmeacutenagement Littoral )

( Laboratoire dEcototicoJogie

(directeur F GALGAl)

~--------~

Etudes ponctuelles Transfert Tests qualiteacute deau de surveillance - action des pesticidessurveillance 1

1

(EHIS)biologiquei 1(F GALGAl-H) (T BURGEOT) - test tnverteacutebreacutes

(F Qulv70U resp stage)

(F TOLLARASTEL)

5

Il INTRODUCTION

Les oursins sont reconnus pour ecirctre tregraves sensibles aux modifications des conditions

environnementales Leur plasticiteacute face aux conditions du milieu et leur mode de vie en font de

bons indicateurs biologiques de pollution marine (Augier 1987a Kobayashi 1971) Dailleurs

depuis plus dune vingtaine danneacutees gamegravetes embryons et larves doursins constituent un

mateacuteriel de base dans les domaines de la pharmacologie toxicologie ou eacutecotoxicologie

(Hagstrom amp Lonning 1974 Bougis 1981 Dinnel et al 1987 Pagano amp Romafia 1991)

Leur sensibiliteacute aux conditions du milieu se manifeste par des perturbations du cycle de

reproduction des baisses de feacuteconditeacute ou des troubles du deacuteveloppement larvaire et les effets

observeacutes en zones perturbeacutees sur les populations doursins ont eacuteteacute souvent deacutecrits (Harmelin et

al 1981 Delmas amp Reacutegis 1984)

Dautre part les biologistes de lobservatoire marin de Roscoff (Nord-Finistegravere) utilisant

reacuteguliegraverement des oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis (Lamarck) preacuteleveacutes en rade de

Brest sur le site de la pointe de lArmorique ont signaleacute depuis 1985 des anomalies du

deacuteveloppement cellulaire Suite agrave ces observations des travaux preacuteliminaires ont mis en

eacutevidence sur ce mecircme site des perturbations du deacuteveloppement de la population et un faible

taux de croissance des individus (Chevallier 1993)

Ces indications ont motiveacute le choix de Sphaerechimls granularis tregraves commun dans la rade

et dont la biologie est par ailleurs bien connue (Fenaux 1972 Semroud amp Senoussi 1989

Guillou amp Michel 1993) comme bioindicateur de la qualiteacute du milieu dans le cadre du

Programme deacutetudes pluridisciplinaire de la rade de Brest Leacutetude porte sur trois stations de la

rade distribueacutees le long dun gradient de pollution et une quatriegraveme dans larchipel des Gleacutenan

(Bretagne Sud) exempt de pollution anthropique et choisi comme site de reacutefeacuterence

Lobservation consiste agrave suivre leacutevolution dindices physiologiques (Indice Gonadique et

Indice de Reacutepleacutetion) reacuteveacutelateurs de la condition des inampidus et agrave effectuer des feacutecondations

in vitro en vue de mesurer le taux de reacuteussite de stade pluteus obtenu pour chaque site de

maniegravere agrave mettre en eacutevidence une eacuteventuelle deacutegradation de lenvironnement

Par ailleurs lestimation de linfluence des conditions emironnementales saccompagne dune

eacutetude de geacuteneacutetique inspireacutee des meacutethodes employeacutees sur dautres inverteacutebreacutes marins (faune

6

profonde et intertidale) pour mesurer les adaptations geacuteneacutetiques de ces animaux vis agrave vs des

contraintes eacutecologiques (Siebenaller 1978 Bristow amp Vadas 1991) Ce travail vise agrave eacutevaluer

la variabiliteacute geacuteneacutetique preacutesenteacutee par S granularis dans les populations des deux stations les

plus exposeacutees qu~ quoique voisines geacuteographiquement ont montreacute des diffeacuterences

morphologiques et deacutemographiques tregraves marqueacutees (Lumingas amp Guillou sous presse) Cette

partie a eacutegalement pour but de mesurer le degreacutes de diffeacuterenciation existant entre ces deux

populations pour apporter une explication geacuteneacutetique agrave ces observations

A terme ce travail tend agrave mieux connaicirctre les reacuteponses de lespegravece et agrave estimer leacutetat de

pollution de la rade sur les sites choisis en diagnostiquant si possible les agents responsables

des deacuteregraveglements observeacutes

il 1MATERIEL ET METHODES

1deg - Lespegravece

Sphaerechinus granularis (Echinodermata Echinoidea Toxopneustidae) est une espegravece

comestible de grande taille pouvant atteindre 14 cm commune dans lheacutemisphegravere Nord sur les

cocirctes de lAtlantique-Est depuis la Manche occidentale jusquau Golfe de Guineacutee (Koehler

1921) ainsi quen Meacutediterraneacutee (Tortonese 1965) Sa reacutepartition verticale seacutetend de la zone

intertidale jusquagrave 130 m (Cherbonnier 1958) sur divers substrats en fonction des classes dacircge

et des preacutefeacuterences alimentaires (Guillou amp Michel 199) En rade de Brest les plus f011es

populations se rencontrent essentiellement sur les fonds seacutedimentaires grossiers recouverts de

maeumlrl vivant (Lithothamnium corallinoiumldes Crouan)

2deg - Le milieu

La rade de Brest est une vaste eacutetendue deau de plus de 150 km2 qui communique avec la

mer dIroise par un goulet de 18 km de large et de 20 m de profondeur Elle reccediloit les apports

de deux riviegraveres principales au Nord-Est lElorn (6m3 s de deacutebit moyen) au Sud-Est lAulne

(24m3s de deacutebit moyen) Les bassins versants de la rade repreacutesentent pregraves de 2800 km2 qui

sont essentiellement consacreacutes agrave lagriculture

7

Il est possible pour simplifier de subdiviser la rade elle-mecircme en trois zones un bassin

Nord tout dabord agrave lembouchure de lElorn ougrave se concentrent les activiteacutes portuaires de

Brest ensuite un bassin Sud recevant les eaux de lAulne moins urbaniseacute et mieux proteacutegeacute de

linfluence portuaire mais plus exposeacute aux effluents agricoles enfin une zone de meacutelange

formant un tourbillon dans la partie centrale de la rade allant des alentours de la presquicircle de

Quelem jusque dans le goulet

Le choix des sites sest porteacute sur quatre zones propices au deacuteveloppement de S gramllaris

dont trois dans la rade la derniegravere dans les icircles Gleacutenan en fonction de leurs diffeacuterentes

caracteacuteristiques La situation geacuteographique de chaque station se trouve illustreacutee en figure 1

- (1) Pointe Marloux situeacutee dans le bassin Nord proche de la zone portuaire dans une

zone de calme relatif laquo1 noeud en vives eaux) Le fond est constitueacute de maeumlrl pur la

profondeur est faible (5 m) Une eacutetude de la dynamique des populations a reacuteveacuteleacute de fortes

irreacutegulariteacutes dans le recrutement (Lumingas et GuiIlou sous presse)

- (2) Pointe de lArmorique situeacutee agrave lembouchure de lAulne ougrave la preacutesence de lIle Ronde

concentre les courants de mareacutee dans un chenal eacutetroit qui amplifie leur vitesse Gusquagrave 3

noeuds) Linfluence estuarienne y est encore ressentie le seacutediment est heacuteteacuterogegravene composeacute de

sable coquillier grossier et de deacutebris de maeumlrl la profonegraveeur peut atteindre jusquagrave 20 m au

milieu du chenal

- (3) Anse du DelIee zone rocheuse situeacutee dans le goulet de Brest directement sous

influence oceacuteanique Lhydrodynamisme est assez fort (gt2 noeuds en vives eaux) favorable au

deacuteveloppement dune couverture algale importante La zone de preacutelegravevement se situe sur une

pointe rocheuse appeleacutee pointe du Diable agrave labri des effets de lagglomeacuteration voisine agrave une

profondeur maximale de 10 m

- (4) Archipel des Gleacutenan en Baie de Concarneau Bretagne-Sud agrave leacutecart de toute

pollution anthropique et ougrave la population doursins connaicirct un large essor (Guillou et Michel

1993) et fait lobjet dune pecirccherie artisanale Cette derniegravere station sera consideacutereacutee comme site

de reacutefeacuterence

8

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

CADRE DU STAGE

Ce stage sinscrit dans le programme Ameacutelioration de la qualiteacute des eaux sauvegarde et

restauration de leacutecosystegraveme marin en rade de Brest meneacute par la Communauteacute Urbaine de

Brest dans le cadre dun contrat de baie qui fait lobjet de conventions deacutetudes avec diffeacuterents

organismes de recherche (cf extraits de la circulaire ministeacuterielle du 1305191 preacutesenteacutee en

annexe) Loriginaliteacute du programme reacuteside dans sa pluridisciplinariteacute il integravegre aussi bien le

domaine continental que le domaine marin et associe disciplines scientifiques socioshy

eacuteconomiques et juridiques il vise dune maniegravere geacuteneacuterale agrave preacuteciser les meacutecanismes de

deacutegradation de leacutecosystegraveme de la rade en examinant parmi les processus connus en biologie

marine fondamentale lesquels sappliquent agrave cette zone particuliegravere et agrave mettre en place les

reacuteseaux dobservation et les outils de suivi de la qualiteacute du milieu gracircce auxquels il devrait ecirctre

possible de quantifier cette qualiteacute et preacutevoir ses conseacutequences sur les ressources halieutiques

Les reacutesultats du programme deacutetudes sont soumis au Comiteacute Scientifique du contrat de baie

et preacutesenteacutes ensuite agrave un Comiteacute dExpertise Scientifique International puis agrave un Comiteacute Pilote

pour deacutecision opeacuterationnelle

Le contrat rade de Brest doit aboutir agrave la mise au point de meacutethodes de lutte approprieacutees

contre les polluants et la fourniture aux deacutecideurs politiques et administratifs dun outil daide agrave

la deacutecision

Le stage sest deacuterouleacute dune part dans lUniteacute de Recherche Associeacutee au CNRS D 1513 agrave la

Faculteacute des Sciences de Brest~ et dautre part au laboratoire deacutecotoxicologie du centre

IFREMER de Brest dont les organisations sont preacutesenteacutees ci-apregraves Lobjectif de cette

coopeacuteration dans le programme deacutetude se situe dans la surveillance et lappreacuteciation de la

qualiteacute du milieu par lobservation dindicateurs biologiques de pollution Son but est deacutevaluer

la situation preacutesente de la rade et permettre un suivi de limpact des actions de deacutepollution

4

ORGANISATION DES STRUCTURES DACCUEIL

URA CNRS D1513

Uniteacute de recherche associeacutee au CNRS

Flux de matiegravere et reacuteponses du vivant

(Chef P TREGUER)

Biogeacuteochimie Physique Ecologie benthique

(P TREGUER) (M GLEMAREC)

resp stage M GUILLOU (eacutecologie des eacutechinodermes)

Biologie marine

(M LE PENNEC) resp stage D MORAGA

(geacuteneacutetique des populations)

Geacutenotoxiciteacute

des polluants

(F GALGANI)

IFREMER Direction de lEmironnement ~

et de lAmeacutenagement Littoral )

( Laboratoire dEcototicoJogie

(directeur F GALGAl)

~--------~

Etudes ponctuelles Transfert Tests qualiteacute deau de surveillance - action des pesticidessurveillance 1

1

(EHIS)biologiquei 1(F GALGAl-H) (T BURGEOT) - test tnverteacutebreacutes

(F Qulv70U resp stage)

(F TOLLARASTEL)

5

Il INTRODUCTION

Les oursins sont reconnus pour ecirctre tregraves sensibles aux modifications des conditions

environnementales Leur plasticiteacute face aux conditions du milieu et leur mode de vie en font de

bons indicateurs biologiques de pollution marine (Augier 1987a Kobayashi 1971) Dailleurs

depuis plus dune vingtaine danneacutees gamegravetes embryons et larves doursins constituent un

mateacuteriel de base dans les domaines de la pharmacologie toxicologie ou eacutecotoxicologie

(Hagstrom amp Lonning 1974 Bougis 1981 Dinnel et al 1987 Pagano amp Romafia 1991)

Leur sensibiliteacute aux conditions du milieu se manifeste par des perturbations du cycle de

reproduction des baisses de feacuteconditeacute ou des troubles du deacuteveloppement larvaire et les effets

observeacutes en zones perturbeacutees sur les populations doursins ont eacuteteacute souvent deacutecrits (Harmelin et

al 1981 Delmas amp Reacutegis 1984)

Dautre part les biologistes de lobservatoire marin de Roscoff (Nord-Finistegravere) utilisant

reacuteguliegraverement des oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis (Lamarck) preacuteleveacutes en rade de

Brest sur le site de la pointe de lArmorique ont signaleacute depuis 1985 des anomalies du

deacuteveloppement cellulaire Suite agrave ces observations des travaux preacuteliminaires ont mis en

eacutevidence sur ce mecircme site des perturbations du deacuteveloppement de la population et un faible

taux de croissance des individus (Chevallier 1993)

Ces indications ont motiveacute le choix de Sphaerechimls granularis tregraves commun dans la rade

et dont la biologie est par ailleurs bien connue (Fenaux 1972 Semroud amp Senoussi 1989

Guillou amp Michel 1993) comme bioindicateur de la qualiteacute du milieu dans le cadre du

Programme deacutetudes pluridisciplinaire de la rade de Brest Leacutetude porte sur trois stations de la

rade distribueacutees le long dun gradient de pollution et une quatriegraveme dans larchipel des Gleacutenan

(Bretagne Sud) exempt de pollution anthropique et choisi comme site de reacutefeacuterence

Lobservation consiste agrave suivre leacutevolution dindices physiologiques (Indice Gonadique et

Indice de Reacutepleacutetion) reacuteveacutelateurs de la condition des inampidus et agrave effectuer des feacutecondations

in vitro en vue de mesurer le taux de reacuteussite de stade pluteus obtenu pour chaque site de

maniegravere agrave mettre en eacutevidence une eacuteventuelle deacutegradation de lenvironnement

Par ailleurs lestimation de linfluence des conditions emironnementales saccompagne dune

eacutetude de geacuteneacutetique inspireacutee des meacutethodes employeacutees sur dautres inverteacutebreacutes marins (faune

6

profonde et intertidale) pour mesurer les adaptations geacuteneacutetiques de ces animaux vis agrave vs des

contraintes eacutecologiques (Siebenaller 1978 Bristow amp Vadas 1991) Ce travail vise agrave eacutevaluer

la variabiliteacute geacuteneacutetique preacutesenteacutee par S granularis dans les populations des deux stations les

plus exposeacutees qu~ quoique voisines geacuteographiquement ont montreacute des diffeacuterences

morphologiques et deacutemographiques tregraves marqueacutees (Lumingas amp Guillou sous presse) Cette

partie a eacutegalement pour but de mesurer le degreacutes de diffeacuterenciation existant entre ces deux

populations pour apporter une explication geacuteneacutetique agrave ces observations

A terme ce travail tend agrave mieux connaicirctre les reacuteponses de lespegravece et agrave estimer leacutetat de

pollution de la rade sur les sites choisis en diagnostiquant si possible les agents responsables

des deacuteregraveglements observeacutes

il 1MATERIEL ET METHODES

1deg - Lespegravece

Sphaerechinus granularis (Echinodermata Echinoidea Toxopneustidae) est une espegravece

comestible de grande taille pouvant atteindre 14 cm commune dans lheacutemisphegravere Nord sur les

cocirctes de lAtlantique-Est depuis la Manche occidentale jusquau Golfe de Guineacutee (Koehler

1921) ainsi quen Meacutediterraneacutee (Tortonese 1965) Sa reacutepartition verticale seacutetend de la zone

intertidale jusquagrave 130 m (Cherbonnier 1958) sur divers substrats en fonction des classes dacircge

et des preacutefeacuterences alimentaires (Guillou amp Michel 199) En rade de Brest les plus f011es

populations se rencontrent essentiellement sur les fonds seacutedimentaires grossiers recouverts de

maeumlrl vivant (Lithothamnium corallinoiumldes Crouan)

2deg - Le milieu

La rade de Brest est une vaste eacutetendue deau de plus de 150 km2 qui communique avec la

mer dIroise par un goulet de 18 km de large et de 20 m de profondeur Elle reccediloit les apports

de deux riviegraveres principales au Nord-Est lElorn (6m3 s de deacutebit moyen) au Sud-Est lAulne

(24m3s de deacutebit moyen) Les bassins versants de la rade repreacutesentent pregraves de 2800 km2 qui

sont essentiellement consacreacutes agrave lagriculture

7

Il est possible pour simplifier de subdiviser la rade elle-mecircme en trois zones un bassin

Nord tout dabord agrave lembouchure de lElorn ougrave se concentrent les activiteacutes portuaires de

Brest ensuite un bassin Sud recevant les eaux de lAulne moins urbaniseacute et mieux proteacutegeacute de

linfluence portuaire mais plus exposeacute aux effluents agricoles enfin une zone de meacutelange

formant un tourbillon dans la partie centrale de la rade allant des alentours de la presquicircle de

Quelem jusque dans le goulet

Le choix des sites sest porteacute sur quatre zones propices au deacuteveloppement de S gramllaris

dont trois dans la rade la derniegravere dans les icircles Gleacutenan en fonction de leurs diffeacuterentes

caracteacuteristiques La situation geacuteographique de chaque station se trouve illustreacutee en figure 1

- (1) Pointe Marloux situeacutee dans le bassin Nord proche de la zone portuaire dans une

zone de calme relatif laquo1 noeud en vives eaux) Le fond est constitueacute de maeumlrl pur la

profondeur est faible (5 m) Une eacutetude de la dynamique des populations a reacuteveacuteleacute de fortes

irreacutegulariteacutes dans le recrutement (Lumingas et GuiIlou sous presse)

- (2) Pointe de lArmorique situeacutee agrave lembouchure de lAulne ougrave la preacutesence de lIle Ronde

concentre les courants de mareacutee dans un chenal eacutetroit qui amplifie leur vitesse Gusquagrave 3

noeuds) Linfluence estuarienne y est encore ressentie le seacutediment est heacuteteacuterogegravene composeacute de

sable coquillier grossier et de deacutebris de maeumlrl la profonegraveeur peut atteindre jusquagrave 20 m au

milieu du chenal

- (3) Anse du DelIee zone rocheuse situeacutee dans le goulet de Brest directement sous

influence oceacuteanique Lhydrodynamisme est assez fort (gt2 noeuds en vives eaux) favorable au

deacuteveloppement dune couverture algale importante La zone de preacutelegravevement se situe sur une

pointe rocheuse appeleacutee pointe du Diable agrave labri des effets de lagglomeacuteration voisine agrave une

profondeur maximale de 10 m

- (4) Archipel des Gleacutenan en Baie de Concarneau Bretagne-Sud agrave leacutecart de toute

pollution anthropique et ougrave la population doursins connaicirct un large essor (Guillou et Michel

1993) et fait lobjet dune pecirccherie artisanale Cette derniegravere station sera consideacutereacutee comme site

de reacutefeacuterence

8

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

ORGANISATION DES STRUCTURES DACCUEIL

URA CNRS D1513

Uniteacute de recherche associeacutee au CNRS

Flux de matiegravere et reacuteponses du vivant

(Chef P TREGUER)

Biogeacuteochimie Physique Ecologie benthique

(P TREGUER) (M GLEMAREC)

resp stage M GUILLOU (eacutecologie des eacutechinodermes)

Biologie marine

(M LE PENNEC) resp stage D MORAGA

(geacuteneacutetique des populations)

Geacutenotoxiciteacute

des polluants

(F GALGANI)

IFREMER Direction de lEmironnement ~

et de lAmeacutenagement Littoral )

( Laboratoire dEcototicoJogie

(directeur F GALGAl)

~--------~

Etudes ponctuelles Transfert Tests qualiteacute deau de surveillance - action des pesticidessurveillance 1

1

(EHIS)biologiquei 1(F GALGAl-H) (T BURGEOT) - test tnverteacutebreacutes

(F Qulv70U resp stage)

(F TOLLARASTEL)

5

Il INTRODUCTION

Les oursins sont reconnus pour ecirctre tregraves sensibles aux modifications des conditions

environnementales Leur plasticiteacute face aux conditions du milieu et leur mode de vie en font de

bons indicateurs biologiques de pollution marine (Augier 1987a Kobayashi 1971) Dailleurs

depuis plus dune vingtaine danneacutees gamegravetes embryons et larves doursins constituent un

mateacuteriel de base dans les domaines de la pharmacologie toxicologie ou eacutecotoxicologie

(Hagstrom amp Lonning 1974 Bougis 1981 Dinnel et al 1987 Pagano amp Romafia 1991)

Leur sensibiliteacute aux conditions du milieu se manifeste par des perturbations du cycle de

reproduction des baisses de feacuteconditeacute ou des troubles du deacuteveloppement larvaire et les effets

observeacutes en zones perturbeacutees sur les populations doursins ont eacuteteacute souvent deacutecrits (Harmelin et

al 1981 Delmas amp Reacutegis 1984)

Dautre part les biologistes de lobservatoire marin de Roscoff (Nord-Finistegravere) utilisant

reacuteguliegraverement des oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis (Lamarck) preacuteleveacutes en rade de

Brest sur le site de la pointe de lArmorique ont signaleacute depuis 1985 des anomalies du

deacuteveloppement cellulaire Suite agrave ces observations des travaux preacuteliminaires ont mis en

eacutevidence sur ce mecircme site des perturbations du deacuteveloppement de la population et un faible

taux de croissance des individus (Chevallier 1993)

Ces indications ont motiveacute le choix de Sphaerechimls granularis tregraves commun dans la rade

et dont la biologie est par ailleurs bien connue (Fenaux 1972 Semroud amp Senoussi 1989

Guillou amp Michel 1993) comme bioindicateur de la qualiteacute du milieu dans le cadre du

Programme deacutetudes pluridisciplinaire de la rade de Brest Leacutetude porte sur trois stations de la

rade distribueacutees le long dun gradient de pollution et une quatriegraveme dans larchipel des Gleacutenan

(Bretagne Sud) exempt de pollution anthropique et choisi comme site de reacutefeacuterence

Lobservation consiste agrave suivre leacutevolution dindices physiologiques (Indice Gonadique et

Indice de Reacutepleacutetion) reacuteveacutelateurs de la condition des inampidus et agrave effectuer des feacutecondations

in vitro en vue de mesurer le taux de reacuteussite de stade pluteus obtenu pour chaque site de

maniegravere agrave mettre en eacutevidence une eacuteventuelle deacutegradation de lenvironnement

Par ailleurs lestimation de linfluence des conditions emironnementales saccompagne dune

eacutetude de geacuteneacutetique inspireacutee des meacutethodes employeacutees sur dautres inverteacutebreacutes marins (faune

6

profonde et intertidale) pour mesurer les adaptations geacuteneacutetiques de ces animaux vis agrave vs des

contraintes eacutecologiques (Siebenaller 1978 Bristow amp Vadas 1991) Ce travail vise agrave eacutevaluer

la variabiliteacute geacuteneacutetique preacutesenteacutee par S granularis dans les populations des deux stations les

plus exposeacutees qu~ quoique voisines geacuteographiquement ont montreacute des diffeacuterences

morphologiques et deacutemographiques tregraves marqueacutees (Lumingas amp Guillou sous presse) Cette

partie a eacutegalement pour but de mesurer le degreacutes de diffeacuterenciation existant entre ces deux

populations pour apporter une explication geacuteneacutetique agrave ces observations

A terme ce travail tend agrave mieux connaicirctre les reacuteponses de lespegravece et agrave estimer leacutetat de

pollution de la rade sur les sites choisis en diagnostiquant si possible les agents responsables

des deacuteregraveglements observeacutes

il 1MATERIEL ET METHODES

1deg - Lespegravece

Sphaerechinus granularis (Echinodermata Echinoidea Toxopneustidae) est une espegravece

comestible de grande taille pouvant atteindre 14 cm commune dans lheacutemisphegravere Nord sur les

cocirctes de lAtlantique-Est depuis la Manche occidentale jusquau Golfe de Guineacutee (Koehler

1921) ainsi quen Meacutediterraneacutee (Tortonese 1965) Sa reacutepartition verticale seacutetend de la zone

intertidale jusquagrave 130 m (Cherbonnier 1958) sur divers substrats en fonction des classes dacircge

et des preacutefeacuterences alimentaires (Guillou amp Michel 199) En rade de Brest les plus f011es

populations se rencontrent essentiellement sur les fonds seacutedimentaires grossiers recouverts de

maeumlrl vivant (Lithothamnium corallinoiumldes Crouan)

2deg - Le milieu

La rade de Brest est une vaste eacutetendue deau de plus de 150 km2 qui communique avec la

mer dIroise par un goulet de 18 km de large et de 20 m de profondeur Elle reccediloit les apports

de deux riviegraveres principales au Nord-Est lElorn (6m3 s de deacutebit moyen) au Sud-Est lAulne

(24m3s de deacutebit moyen) Les bassins versants de la rade repreacutesentent pregraves de 2800 km2 qui

sont essentiellement consacreacutes agrave lagriculture

7

Il est possible pour simplifier de subdiviser la rade elle-mecircme en trois zones un bassin

Nord tout dabord agrave lembouchure de lElorn ougrave se concentrent les activiteacutes portuaires de

Brest ensuite un bassin Sud recevant les eaux de lAulne moins urbaniseacute et mieux proteacutegeacute de

linfluence portuaire mais plus exposeacute aux effluents agricoles enfin une zone de meacutelange

formant un tourbillon dans la partie centrale de la rade allant des alentours de la presquicircle de

Quelem jusque dans le goulet

Le choix des sites sest porteacute sur quatre zones propices au deacuteveloppement de S gramllaris

dont trois dans la rade la derniegravere dans les icircles Gleacutenan en fonction de leurs diffeacuterentes

caracteacuteristiques La situation geacuteographique de chaque station se trouve illustreacutee en figure 1

- (1) Pointe Marloux situeacutee dans le bassin Nord proche de la zone portuaire dans une

zone de calme relatif laquo1 noeud en vives eaux) Le fond est constitueacute de maeumlrl pur la

profondeur est faible (5 m) Une eacutetude de la dynamique des populations a reacuteveacuteleacute de fortes

irreacutegulariteacutes dans le recrutement (Lumingas et GuiIlou sous presse)

- (2) Pointe de lArmorique situeacutee agrave lembouchure de lAulne ougrave la preacutesence de lIle Ronde

concentre les courants de mareacutee dans un chenal eacutetroit qui amplifie leur vitesse Gusquagrave 3

noeuds) Linfluence estuarienne y est encore ressentie le seacutediment est heacuteteacuterogegravene composeacute de

sable coquillier grossier et de deacutebris de maeumlrl la profonegraveeur peut atteindre jusquagrave 20 m au

milieu du chenal

- (3) Anse du DelIee zone rocheuse situeacutee dans le goulet de Brest directement sous

influence oceacuteanique Lhydrodynamisme est assez fort (gt2 noeuds en vives eaux) favorable au

deacuteveloppement dune couverture algale importante La zone de preacutelegravevement se situe sur une

pointe rocheuse appeleacutee pointe du Diable agrave labri des effets de lagglomeacuteration voisine agrave une

profondeur maximale de 10 m

- (4) Archipel des Gleacutenan en Baie de Concarneau Bretagne-Sud agrave leacutecart de toute

pollution anthropique et ougrave la population doursins connaicirct un large essor (Guillou et Michel

1993) et fait lobjet dune pecirccherie artisanale Cette derniegravere station sera consideacutereacutee comme site

de reacutefeacuterence

8

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

Il INTRODUCTION

Les oursins sont reconnus pour ecirctre tregraves sensibles aux modifications des conditions

environnementales Leur plasticiteacute face aux conditions du milieu et leur mode de vie en font de

bons indicateurs biologiques de pollution marine (Augier 1987a Kobayashi 1971) Dailleurs

depuis plus dune vingtaine danneacutees gamegravetes embryons et larves doursins constituent un

mateacuteriel de base dans les domaines de la pharmacologie toxicologie ou eacutecotoxicologie

(Hagstrom amp Lonning 1974 Bougis 1981 Dinnel et al 1987 Pagano amp Romafia 1991)

Leur sensibiliteacute aux conditions du milieu se manifeste par des perturbations du cycle de

reproduction des baisses de feacuteconditeacute ou des troubles du deacuteveloppement larvaire et les effets

observeacutes en zones perturbeacutees sur les populations doursins ont eacuteteacute souvent deacutecrits (Harmelin et

al 1981 Delmas amp Reacutegis 1984)

Dautre part les biologistes de lobservatoire marin de Roscoff (Nord-Finistegravere) utilisant

reacuteguliegraverement des oursins de lespegravece Sphaerechinus granularis (Lamarck) preacuteleveacutes en rade de

Brest sur le site de la pointe de lArmorique ont signaleacute depuis 1985 des anomalies du

deacuteveloppement cellulaire Suite agrave ces observations des travaux preacuteliminaires ont mis en

eacutevidence sur ce mecircme site des perturbations du deacuteveloppement de la population et un faible

taux de croissance des individus (Chevallier 1993)

Ces indications ont motiveacute le choix de Sphaerechimls granularis tregraves commun dans la rade

et dont la biologie est par ailleurs bien connue (Fenaux 1972 Semroud amp Senoussi 1989

Guillou amp Michel 1993) comme bioindicateur de la qualiteacute du milieu dans le cadre du

Programme deacutetudes pluridisciplinaire de la rade de Brest Leacutetude porte sur trois stations de la

rade distribueacutees le long dun gradient de pollution et une quatriegraveme dans larchipel des Gleacutenan

(Bretagne Sud) exempt de pollution anthropique et choisi comme site de reacutefeacuterence

Lobservation consiste agrave suivre leacutevolution dindices physiologiques (Indice Gonadique et

Indice de Reacutepleacutetion) reacuteveacutelateurs de la condition des inampidus et agrave effectuer des feacutecondations

in vitro en vue de mesurer le taux de reacuteussite de stade pluteus obtenu pour chaque site de

maniegravere agrave mettre en eacutevidence une eacuteventuelle deacutegradation de lenvironnement

Par ailleurs lestimation de linfluence des conditions emironnementales saccompagne dune

eacutetude de geacuteneacutetique inspireacutee des meacutethodes employeacutees sur dautres inverteacutebreacutes marins (faune

6

profonde et intertidale) pour mesurer les adaptations geacuteneacutetiques de ces animaux vis agrave vs des

contraintes eacutecologiques (Siebenaller 1978 Bristow amp Vadas 1991) Ce travail vise agrave eacutevaluer

la variabiliteacute geacuteneacutetique preacutesenteacutee par S granularis dans les populations des deux stations les

plus exposeacutees qu~ quoique voisines geacuteographiquement ont montreacute des diffeacuterences

morphologiques et deacutemographiques tregraves marqueacutees (Lumingas amp Guillou sous presse) Cette

partie a eacutegalement pour but de mesurer le degreacutes de diffeacuterenciation existant entre ces deux

populations pour apporter une explication geacuteneacutetique agrave ces observations

A terme ce travail tend agrave mieux connaicirctre les reacuteponses de lespegravece et agrave estimer leacutetat de

pollution de la rade sur les sites choisis en diagnostiquant si possible les agents responsables

des deacuteregraveglements observeacutes

il 1MATERIEL ET METHODES

1deg - Lespegravece

Sphaerechinus granularis (Echinodermata Echinoidea Toxopneustidae) est une espegravece

comestible de grande taille pouvant atteindre 14 cm commune dans lheacutemisphegravere Nord sur les

cocirctes de lAtlantique-Est depuis la Manche occidentale jusquau Golfe de Guineacutee (Koehler

1921) ainsi quen Meacutediterraneacutee (Tortonese 1965) Sa reacutepartition verticale seacutetend de la zone

intertidale jusquagrave 130 m (Cherbonnier 1958) sur divers substrats en fonction des classes dacircge

et des preacutefeacuterences alimentaires (Guillou amp Michel 199) En rade de Brest les plus f011es

populations se rencontrent essentiellement sur les fonds seacutedimentaires grossiers recouverts de

maeumlrl vivant (Lithothamnium corallinoiumldes Crouan)

2deg - Le milieu

La rade de Brest est une vaste eacutetendue deau de plus de 150 km2 qui communique avec la

mer dIroise par un goulet de 18 km de large et de 20 m de profondeur Elle reccediloit les apports

de deux riviegraveres principales au Nord-Est lElorn (6m3 s de deacutebit moyen) au Sud-Est lAulne

(24m3s de deacutebit moyen) Les bassins versants de la rade repreacutesentent pregraves de 2800 km2 qui

sont essentiellement consacreacutes agrave lagriculture

7

Il est possible pour simplifier de subdiviser la rade elle-mecircme en trois zones un bassin

Nord tout dabord agrave lembouchure de lElorn ougrave se concentrent les activiteacutes portuaires de

Brest ensuite un bassin Sud recevant les eaux de lAulne moins urbaniseacute et mieux proteacutegeacute de

linfluence portuaire mais plus exposeacute aux effluents agricoles enfin une zone de meacutelange

formant un tourbillon dans la partie centrale de la rade allant des alentours de la presquicircle de

Quelem jusque dans le goulet

Le choix des sites sest porteacute sur quatre zones propices au deacuteveloppement de S gramllaris

dont trois dans la rade la derniegravere dans les icircles Gleacutenan en fonction de leurs diffeacuterentes

caracteacuteristiques La situation geacuteographique de chaque station se trouve illustreacutee en figure 1

- (1) Pointe Marloux situeacutee dans le bassin Nord proche de la zone portuaire dans une

zone de calme relatif laquo1 noeud en vives eaux) Le fond est constitueacute de maeumlrl pur la

profondeur est faible (5 m) Une eacutetude de la dynamique des populations a reacuteveacuteleacute de fortes

irreacutegulariteacutes dans le recrutement (Lumingas et GuiIlou sous presse)

- (2) Pointe de lArmorique situeacutee agrave lembouchure de lAulne ougrave la preacutesence de lIle Ronde

concentre les courants de mareacutee dans un chenal eacutetroit qui amplifie leur vitesse Gusquagrave 3

noeuds) Linfluence estuarienne y est encore ressentie le seacutediment est heacuteteacuterogegravene composeacute de

sable coquillier grossier et de deacutebris de maeumlrl la profonegraveeur peut atteindre jusquagrave 20 m au

milieu du chenal

- (3) Anse du DelIee zone rocheuse situeacutee dans le goulet de Brest directement sous

influence oceacuteanique Lhydrodynamisme est assez fort (gt2 noeuds en vives eaux) favorable au

deacuteveloppement dune couverture algale importante La zone de preacutelegravevement se situe sur une

pointe rocheuse appeleacutee pointe du Diable agrave labri des effets de lagglomeacuteration voisine agrave une

profondeur maximale de 10 m

- (4) Archipel des Gleacutenan en Baie de Concarneau Bretagne-Sud agrave leacutecart de toute

pollution anthropique et ougrave la population doursins connaicirct un large essor (Guillou et Michel

1993) et fait lobjet dune pecirccherie artisanale Cette derniegravere station sera consideacutereacutee comme site

de reacutefeacuterence

8

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

profonde et intertidale) pour mesurer les adaptations geacuteneacutetiques de ces animaux vis agrave vs des

contraintes eacutecologiques (Siebenaller 1978 Bristow amp Vadas 1991) Ce travail vise agrave eacutevaluer

la variabiliteacute geacuteneacutetique preacutesenteacutee par S granularis dans les populations des deux stations les

plus exposeacutees qu~ quoique voisines geacuteographiquement ont montreacute des diffeacuterences

morphologiques et deacutemographiques tregraves marqueacutees (Lumingas amp Guillou sous presse) Cette

partie a eacutegalement pour but de mesurer le degreacutes de diffeacuterenciation existant entre ces deux

populations pour apporter une explication geacuteneacutetique agrave ces observations

A terme ce travail tend agrave mieux connaicirctre les reacuteponses de lespegravece et agrave estimer leacutetat de

pollution de la rade sur les sites choisis en diagnostiquant si possible les agents responsables

des deacuteregraveglements observeacutes

il 1MATERIEL ET METHODES

1deg - Lespegravece

Sphaerechinus granularis (Echinodermata Echinoidea Toxopneustidae) est une espegravece

comestible de grande taille pouvant atteindre 14 cm commune dans lheacutemisphegravere Nord sur les

cocirctes de lAtlantique-Est depuis la Manche occidentale jusquau Golfe de Guineacutee (Koehler

1921) ainsi quen Meacutediterraneacutee (Tortonese 1965) Sa reacutepartition verticale seacutetend de la zone

intertidale jusquagrave 130 m (Cherbonnier 1958) sur divers substrats en fonction des classes dacircge

et des preacutefeacuterences alimentaires (Guillou amp Michel 199) En rade de Brest les plus f011es

populations se rencontrent essentiellement sur les fonds seacutedimentaires grossiers recouverts de

maeumlrl vivant (Lithothamnium corallinoiumldes Crouan)

2deg - Le milieu

La rade de Brest est une vaste eacutetendue deau de plus de 150 km2 qui communique avec la

mer dIroise par un goulet de 18 km de large et de 20 m de profondeur Elle reccediloit les apports

de deux riviegraveres principales au Nord-Est lElorn (6m3 s de deacutebit moyen) au Sud-Est lAulne

(24m3s de deacutebit moyen) Les bassins versants de la rade repreacutesentent pregraves de 2800 km2 qui

sont essentiellement consacreacutes agrave lagriculture

7

Il est possible pour simplifier de subdiviser la rade elle-mecircme en trois zones un bassin

Nord tout dabord agrave lembouchure de lElorn ougrave se concentrent les activiteacutes portuaires de

Brest ensuite un bassin Sud recevant les eaux de lAulne moins urbaniseacute et mieux proteacutegeacute de

linfluence portuaire mais plus exposeacute aux effluents agricoles enfin une zone de meacutelange

formant un tourbillon dans la partie centrale de la rade allant des alentours de la presquicircle de

Quelem jusque dans le goulet

Le choix des sites sest porteacute sur quatre zones propices au deacuteveloppement de S gramllaris

dont trois dans la rade la derniegravere dans les icircles Gleacutenan en fonction de leurs diffeacuterentes

caracteacuteristiques La situation geacuteographique de chaque station se trouve illustreacutee en figure 1

- (1) Pointe Marloux situeacutee dans le bassin Nord proche de la zone portuaire dans une

zone de calme relatif laquo1 noeud en vives eaux) Le fond est constitueacute de maeumlrl pur la

profondeur est faible (5 m) Une eacutetude de la dynamique des populations a reacuteveacuteleacute de fortes

irreacutegulariteacutes dans le recrutement (Lumingas et GuiIlou sous presse)

- (2) Pointe de lArmorique situeacutee agrave lembouchure de lAulne ougrave la preacutesence de lIle Ronde

concentre les courants de mareacutee dans un chenal eacutetroit qui amplifie leur vitesse Gusquagrave 3

noeuds) Linfluence estuarienne y est encore ressentie le seacutediment est heacuteteacuterogegravene composeacute de

sable coquillier grossier et de deacutebris de maeumlrl la profonegraveeur peut atteindre jusquagrave 20 m au

milieu du chenal

- (3) Anse du DelIee zone rocheuse situeacutee dans le goulet de Brest directement sous

influence oceacuteanique Lhydrodynamisme est assez fort (gt2 noeuds en vives eaux) favorable au

deacuteveloppement dune couverture algale importante La zone de preacutelegravevement se situe sur une

pointe rocheuse appeleacutee pointe du Diable agrave labri des effets de lagglomeacuteration voisine agrave une

profondeur maximale de 10 m

- (4) Archipel des Gleacutenan en Baie de Concarneau Bretagne-Sud agrave leacutecart de toute

pollution anthropique et ougrave la population doursins connaicirct un large essor (Guillou et Michel

1993) et fait lobjet dune pecirccherie artisanale Cette derniegravere station sera consideacutereacutee comme site

de reacutefeacuterence

8

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

Il est possible pour simplifier de subdiviser la rade elle-mecircme en trois zones un bassin

Nord tout dabord agrave lembouchure de lElorn ougrave se concentrent les activiteacutes portuaires de

Brest ensuite un bassin Sud recevant les eaux de lAulne moins urbaniseacute et mieux proteacutegeacute de

linfluence portuaire mais plus exposeacute aux effluents agricoles enfin une zone de meacutelange

formant un tourbillon dans la partie centrale de la rade allant des alentours de la presquicircle de

Quelem jusque dans le goulet

Le choix des sites sest porteacute sur quatre zones propices au deacuteveloppement de S gramllaris

dont trois dans la rade la derniegravere dans les icircles Gleacutenan en fonction de leurs diffeacuterentes

caracteacuteristiques La situation geacuteographique de chaque station se trouve illustreacutee en figure 1

- (1) Pointe Marloux situeacutee dans le bassin Nord proche de la zone portuaire dans une

zone de calme relatif laquo1 noeud en vives eaux) Le fond est constitueacute de maeumlrl pur la

profondeur est faible (5 m) Une eacutetude de la dynamique des populations a reacuteveacuteleacute de fortes

irreacutegulariteacutes dans le recrutement (Lumingas et GuiIlou sous presse)

- (2) Pointe de lArmorique situeacutee agrave lembouchure de lAulne ougrave la preacutesence de lIle Ronde

concentre les courants de mareacutee dans un chenal eacutetroit qui amplifie leur vitesse Gusquagrave 3

noeuds) Linfluence estuarienne y est encore ressentie le seacutediment est heacuteteacuterogegravene composeacute de

sable coquillier grossier et de deacutebris de maeumlrl la profonegraveeur peut atteindre jusquagrave 20 m au

milieu du chenal

- (3) Anse du DelIee zone rocheuse situeacutee dans le goulet de Brest directement sous

influence oceacuteanique Lhydrodynamisme est assez fort (gt2 noeuds en vives eaux) favorable au

deacuteveloppement dune couverture algale importante La zone de preacutelegravevement se situe sur une

pointe rocheuse appeleacutee pointe du Diable agrave labri des effets de lagglomeacuteration voisine agrave une

profondeur maximale de 10 m

- (4) Archipel des Gleacutenan en Baie de Concarneau Bretagne-Sud agrave leacutecart de toute

pollution anthropique et ougrave la population doursins connaicirct un large essor (Guillou et Michel

1993) et fait lobjet dune pecirccherie artisanale Cette derniegravere station sera consideacutereacutee comme site

de reacutefeacuterence

8

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

Fig 1 Preacutesentation de la rade de Brest

o

BREST

Rade de Brest

5km

Ile Q Ronde

Presqujle de Plougastel

Chenal de lAulne

r-f1

~r ltgt r Brest

~ ~RETAGNE

0- ~~ t-~

(Glenan) ~

9

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

3deg - Echantillonnage

Indices physiologiques

La reacutecolte seffectue par dragage ou en plongeacutee selon raccessibiliteacute agrave la cocircte par bateau

La drague utiliseacutee est large dun megravetre eacutequipeacutee dun filet de 2 cm de maille La dureacutee des traits

de drague est denviron 5 minutes Le mateacuteriel est ensuite fixeacute dans lalcool agrave 70 0 Le calcul

des indices neacutecessite un eacutechantillonnage mensuel commenceacute sur certaines zones depuis

deacutecembre 1993 puis prolongeacute dans cette eacutetude jusquau mois de juillet 1994 Pour chaque

mois un eacutechantillon de 30 individus dune classe de taille standard de 80middot90 mm est preacuteleacuteveacute

Feacutecondations

La reacutecolte des oursins seffectue en employant les mecircmes techniques que preacuteceacutedemment

Toutefois les animaux sont maintenus vivants et agrave labri des eacutecarts de tempeacuterature en les

conservant agrave bord dans un circuit deau de mer et en eacutevitant le deacuteclenchement dune ponte

Chaque eacutechantillon comporte une quarantaine dindividus de taille variable de faccedilon agrave pouvoir

disposer dun choix satisfaisant danimaux matures et dun sex-ratio eacutequilibreacute Deux

preacutelegravevements par site sont reacutealiseacutes entre mai et juin durant la peacuteriode de reproduction

4deg - Meacutethodes

Calcul des indices physiologiques

Le cycle de reproduction est eacutetudieacute par lintermeacutediaire de lindice gonadique (1 G) qui

est le rapport entre leacutetat des gonades et le poids corporel Leacutevolution dans le temps de ce

paramegravetre permet de mesurer leffort de reproduction et de situer la peacuteriode de la ponte La

relation employeacutee est la suivante

LG==Poids secs gonades x 106 Dtest3

Lindice utiliseacute fait intervenir le poids sec de gonades et le diamegravetre du test (Dt est) en

raison dune part de la bonne correacutelation entre taille et poids du test dautre part des fortes

variations engendreacutees par lutilisation de volumes ou de poids humides (Gonor 1972)

Lindice de Reacutepleacutetion du tube digestif (IR) correspond au rapport du poids de lintestin et de

son contenu sur le poids du corps Ce paramegravetre reflegravete lintensiteacute de leffort de collecte de

nourriture

10

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

La relation est donneacutee par Neacutedeacutelec (1983)

IR = Poids sec intestin x 106 1Dtest3

Les variations de ce paramegravetre permettent de suivre leacutetat des besoins trophiques des

individus et complegravetent les renseignements apporteacutes par lindice gonadique Les oursins sont

mesureacutes au mm pregraves ouverts sur la face orale agrave raide dun marteau puis disseacutequeacutes Les

gonades et les intestins sont preacuteleveacutees et seacutecheacutes agrave leacutetuve agrave 60degC pendant 48 agrave 72 h selon leacutetat

de maturiteacute En peacuteriode de maturation des gonades des eacutemissions accidentelles de produits

sexuels sont quelquefois provoqueacutees par la fixation dans lalcoo~ ces produits doivent ecirctre pris

en compte dans les mesures dindices gonadiques Pour obtenir des reacutesultats comparables sur

tous les sites les indices sont calculeacutes sur des eacutechantillons moyens appartenant agrave la mecircme

classe de taille (80~90 mm)

Tests defeacutecondations

Les animaux reacutecolteacutes sont maintenus vivants en aquarium dans un circuit deau de mer en

salle thermostateacutee (15degC) Les eXPeacuteriences doivent ecirctre effectueacutees dans les 24 h en raison du

stress occasionneacute par le ramassage Les bioessais sont reacutealiseacutes en eau de reacutefeacuterence provenant

de leacutecloserie IFREMER dArgenton reconnue de bonne qualiteacute filtreacutee sur cartouches

Sartorius de OA5 lm de porositeacute Pour chaque manipulation dix individus macircles et di

femelles sont seacuteleacutectionneacutes de maniegravere agrave reacutealiser deux seacuteries de tests en parallegravele chaque macircle

eacutetant testeacute par le meacutelange des dix femelles et chaque femelle par lensemble des di macircles soit

vingt essais par station reacutepeacuteteacutes agrave deux reprises entre mai et juin Les individus sont ouverts aux

ciseaux en zone eacutequatoriale et disseacutequeacutes afin de preacutelever les gonades Les gonades macircles sont

conserveacutees au sec pour eacute-1ter lactivation du sperme (lexceacutedent aqueux est eacutelimineacute agrave laide

dune poire) et maintenues au reacutefrigeacuterateur jusquagrave leur emploi Les gonades femelles sont

conserveacutees en eau de mer pour garder intacts les ovocytes elles sont ensuite tamiseacutees sur soies

de 200 lm pour eacuteliminer les deacutebris dovaires Les gonades macircles sont tamiseacutees sur soies de

60 lm pour reacutecupeacuterer le sperme propre Les ovocjtes sont laveacutes par seacutedimentation et dilution

les ovocytes immatures et les deacutebris de gonades eacutetant agrave chaque fois eacutelimineacutes Pour chaque

femelle la concentration est ameneacutee agrave 1500 ovocytesml par dilutions successIcircves dans un

11

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

temps le pool de dix femelles est constitueacute avec la mecircme densiteacute Apregraves tamisage du sperme

des dix individus macircles un pool est aussi reacutealiseacute avec une microgoutte de chaque filtrat

Chaque essai se deacuteroule dans des pots en polystyregravene steacuteriles dans lesquels agrave 30 ml deau filtreacutee

sont inoculeacutes 1 ml de solution dovocytes et 05 ml de sperme dilueacute (2 gouttes de sperme sec

dans 100 ml) Les ovocytes feacutecondeacutes sont alors mis en incubation dans une armoire

thermostateacutee agrave 155degC soit 20degC agrave 25degC de plus que la tempeacuterature du milieu naturel ceci

dans le but deacuteviter les effets neacutefastes pour le deacuteveloppement des larves dun eacutecart de

tempeacuterature trop eacuteleveacute Un scheacutema du protocole expeacuterimental est preacutesenteacute en annexe I

Lobservation du taux de reacuteussite de feacutecondation seffectue une heure trente apregraves le

meacutelange des gamegravetes

Le comptage des diffeacuterentes cateacutegories de larves est reacutealisable apregraves 5 jours dincubation

Les observations des larves reposent sur 5 critegraveres deacutefinissant chacun un type de larves

diffeacuterent (Pagano et al 1989)

N pluteus normal ayant suivi un deacuteveloppement convenable

R plut eus retardeacute ou inhibeacute dont la taille natteint pas la moitieacute de la normale

Pl pluteus pathologique preacutesentant des malformations du squelette

etou du tube digestif

P2 embryons dont le deacuteveloppement siest arrecircteacute agrave diffeacuterents stades

(morula blastula gastrula ou prisma)

M larye ou embryon mon

Lexamen de la qualiteacute des larves obtenues sur chaque site mesure laptitude des animaux

preacuteleveacutes sur cette zone agrave produire des larves viables en eau de mer de reacutefeacuterence traduisant

ainsi limpact de lenvironnement sur la qualiteacute des gamegravetes

Geacuteneacutetique des populations

Les recherches en geacuteneacutetique meneacutees ces derniegraveres anneacutees sont orienteacutees vers une connaissance

approfondie des meacutecanismes adaptatifs des populations danimaux marins notamment par

leacutetude des isoenzymes impliqueacutes dans divers processus meacutetaboliques Ains~ ladaptation de la

population agrave son environnement est deacuteceleacutee par la variabiliteacute des gegravenes enzymatiques Lanalyse

12

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

PLANCHE 1 Deacuteveloppement larvaire de Sphaerechinus granularis

- lt shy0

-

shy

embryon (P2) pluteus retardeacute (R)

pluteus pathologique (Pl) pluteus normal (N)

13

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

des structures geacuteneacutetiques a volontairement eacuteteacute reacuteduit agrave deux stations (Marloux et Armorique)

en raison dune part du deacutelai imparti agrave cette eacutetude et dautre part dune eacutetude comparative de

populations deacutejagrave effectueacutees sur ces deux sites (Lumingas amp Guillou sous presse) Dans cette

eacutetude a eacuteteacute analyseacute le polymorphisme l enzymatique des deux populations mesureacute par

eacutelectrophoregravese sur gel damidon En effet cette technique reposant sur le caractegravere amphotegravere

des proteacuteines elle permet de deacuteceler les variations de charges nettes des sous-uniteacutes

constituant le systegraveme enzymatique eacutetudieacute de sorte que les substitutions entre acides amineacutes

dans la structure primaire de la proteacuteine sont rendues visibles Ces substitutions eacutetant issues de

mutations sur les codons dau moins un nucleacuteotide de lADN (Ayala 1982) il sagit donc bien

lagrave dun reflet du patrimoine geacuteneacutetique Cependant toutes les mutations de triplet ne sont pas

deacutecelables en raison de la redondance du code geacuteneacutetique de mecircme que les substitutions

dacides amineacutes qui ne modifient pas la charge nette de la proteacuteine Cest pourquoi lon

considegravere que les deux tiers des mutations ne sont pas deacutetecteacutees (Ne~ 1972) Dune maniegravere

geacuteneacuterale la variabiliteacute geacuteneacutetique des organismes se trouve donc sous-estimeacutee

Les oursins rameneacutes frais au laboratoire sont aussitocirct disseacutequeacutes et des eacutechantillons de

diffeacuterents organes (muscle gonades appareil digestif) sont preacuteleveacutes sur chaque indhidu et

placeacutes seacutepareacutement dans un cocircne dEppendorf annoteacute et conserveacute au congeacutelateur (-70degC) Un

lot de 40 individus par site est ainsi preacutepareacute Les eacutechantillons sont ensuite broyeacutes agrave volume eacutegal

dans une solution de tampon de-traction (TRIS 00 lM + NADP 1 + EDTA) ajusteacutee agrave

pH 68 puis centrifugeacutes agrave 10000 g pendant 15 minutes agrave FC Les eacutechantillons sont placeacutes dans

des gels agrave 11 damidon en impreacutegnant de petites bandes de papier Whattman TM n)3

introduits perpendiculairement au gel apregraves avoir deacuteposeacute au preacutealable quelques gouttes de bleu

de bromopheacutenol pour visualiser le front de migration Les gels sont refroidis durant toute la

dureacutee de la migration par un systegraveme de plaques de refroidissement placeacutees au dessus et en

dessous du moule La migration est anodique Un scheacutema du montage est figureacute en annexe Il

La composition des tampons deacutelectrophoregravese et les reacutesolutions obtenues sont donneacutees en

annexe III Les eacutechantillons peacutenegravetrent dans le gel pendant une preacute-eacutelectrophoregravese de 10

minutes agrave 100 V Lorsque la migration est commenceacutee le gel est soumis agrave un champ eacutelectrique

Ipolymorphisme existence simultaneacutee dallS une population de plusieurs gegravenes pour le mecircme locus

14

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

constant de 80 mA pendant 4 agrave 5 heures La seacuteparation des geacutenotypes des diffeacuterents systegravemes

enzymatiques est reacuteveacuteleacutee par des colorations speacutecifiques regroupeacutees par Pasteur et al (1987)

et adapteacutees de Shaw et Prasad (1970) Les solutions utiliseacutees pour la reacuteveacutelation des

eacuteleacutectrophoreacutegrammes sont deacutecrites en annexe IV Linterpreacutetation des reacutesultats neacutecessite la

connaissance de la structure quaternaire (le nombre de sous-uniteacutes) de lenzyme qui

conditionne le nombre de taches observables chez les heacuteteacuterozygotes correspondant aux

diffeacuterentes combinaisons possibles entre les sous-uniteacutes sous lhypothegravese que les loci soient

autosomaux2 et les allegraveles codominants3 Quand un systegraveme enzymatique possegravede plusieurs

loci ces derniers sont numeacuteroteacutes de 1 agrave n suivant leur vitesse de migration en commenccedilant par

le plus rapide Les allegraveles5 sont codeacutes en fonction de leur distance (mesureacutee en mm) par rapport

agrave lallegravele le plus freacutequent noteacute 100 qui sert de reacutefeacuterence

5deg - Traitement des donneacutees

Les reacutesultats des tests deacutecotoxicologie sur les larves doursins sont traiteacutes statistiquement

par analyse de variance agrave lm critegravere de classification qui permet de veacuterifier en un seul test si les

diffeacuterences observeacutees au niveau des moyennes dun ensemble deacutechantillons sont imputables

aux fluctuations deacutechantillonnage ou non Cette meacutethode analyse les sources de variation de

lensemble des donneacutes elle sous-entend leacutegaliteacute des variances et la normaliteacute des populations

dorigine Le respect des conditions dapplication est controcircleacute au moyen dun test de Bartlett

Les tests statistiques sont reacutealiseacutes agrave laide du logiciel STATGRAPHICS (Statistical Graphies

Corp Rockville Maryland USA) Les comparaisons inter-sites sont effectueacutees avec un seuil

de confiance de 95

Les donneacutees de geacuteneacutetique sont traiteacutees par le logiciel BIOSYS-l (Swofford et Selander

1981) qui calcule les freacutequences alleacuteliques et donne les eacutecarts par rapport agrave leacutequilibre dHardyshy

Weinberg dans la population consideacutereacutee Les freacutequences alleacuteliques sont calculeacutees agrave partir des

2autosome chromosome preacutesent en double dans les cenules diploiumldes agravees deux sexes Jcodominams allegraveles exprimeacutes de maniegravere semblable dans un geacutenOtype heacuteteacuterozygote 410cus portion de chromosome correspondam agrave un gegravene 5allegravele lune des expressions alternatives dun gegravene (lOCus)

15

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

effectifs directement observeacutes sur les zymogrammes Pour un locus posseacutedant k allegraveles et un

eacutechantillon de N individus la freacutequence du iegraveme allegravele est donneacutee par la formule 1shy

(2Nii +iNij) HXi =__---L-_

2N

Nuuml nombre dhomozygotes observeacutes pour lallegravele ~

Nij nombre dheacuteteacuterozygotes observeacutes pour lallegravele i

Les freacutequences geacutenotypiques sont recalculeacutees sous lhypothegravese de la loi dHardy-Weinberg

qui postule que les freacutequences alleacuteliques restent constantes dune geacuteneacuteration agrave lautre en

labsence de mutation seacutelection et de migration (dans le cas dune espegravece diploiumlde en

panmixie6) Etant donneacutee la faible taille des eacutechantillons les freacutequences geacutenotypiques attendues

par cette loi sont calculeacutees par la formule de Levene (1949) N = Nxi (2Nx i -1)

2N-l _ 4N2 XiXjN - -----shy

lJ 2N-l

Nuuml freacutequence geacutenotypique homozygote

Nij freacutequence geacutenotypique heacuteteacuterozygote7 ayec IkNij=l (pour k allegraveles)

Le test de conformiteacute des freacutequences geacutenorypiques calculeacutees avec les reacutesultats observeacutes fait

intervenir un X2 Certains effectifs geacutenotypiques eacutetant compris entre 5 et 10 le test utiliseacute est

celui du conigeacute de Yates j(~12 (1 Obil - At) _ 1~)2

y= w shyC i=1 Atif

Le nombre de degreacute de liberteacute est eacutegal agrave m-k m eacutetant le nombre de geacutenotypes et k le

nombre dallegraveles

Les eacutechantillons eacutetant de faible taille les loci multi-alleacuteliques ont eacuteteacute analyseacutes en regroupant

les geacutenotypes en trois classes la classe des geacutenotypes homozygotes posseacutedant lallegravele Je plus

freacutequent la classe des heacuteteacuterozygotes posseacutedant lallegravele le plus freacutequent et la classe regroupant

les autres geacutenotypes Comme dans le cas des loci di-alleacuteliques le test du X2 est agrave 1 degreacute de

6panmixie individus qui se croisent au hasard agrave limeacuterieur ct une population pour laqudle leacutequilibre de la loi dHardy-Weinberg est respecteacutee (degraveme) heacuteteacuterozygote individu qui possegravede deux allegraveles distincts aux locus homologues des chromosomes parents dun organisme diploiumlde

16

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

liberteacute lorsque toutes les classes ont un effectif supeacuterieur agrave cinq Dans le cas dun locus dishy

alleacutelique si lun des effectifs est infeacuterieur agrave 5 la probabiliteacute exacte p est calculeacutee suivant le test

de Fisher utiliseacute dans le tableau de contingence 2X2 (VithayasaIuml 1973)

Les descripteurs de variabiliteacute geacuteneacutetique des populations sont donneacutes par les relations

suivantes

a) - pourcentage de loci polymorphes8 P95 = 100x(npn)

avec n == nombre de loci eacutechantillonneacutes et ni nombre de loci polymorphes un locus est

polymorphe lorsque la freacutequence de lallegravele le plus rare est supeacuterieure agrave 005

b) - lheacuteteacuterozygotie correspond agrave la freacutequence moyenne dheacuteteacuterozygotes dans la

population on distingue lheacuteteacuterozygotie obseIVeacutee (ho) et celle attendue dapregraves la loi dHardy-

Weinberg (he)

1=1

Xuuml eacutetant la freacutequence obseIVeacutee du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele contenu dans le locus Ir

h == 1- x~ e iJ

=

x eacutetant la freacutequence attendue du geacutenotype homozygote du iegraveme allegravele

Pour les eacutechantillons de petite taille lutilisation de lindice non biaiseacute (Levene 1949) est

neacutecessaire Le calcul de lheacuteteacuterozygotie attendue seffectue de la faccedilon suivante k

2N(1- LX) he(nb) == __---i-=-=l~_

(2N -1)

ougrave N est le nombre dindividus eacutechantillonneacutes

sur lensemble des loci on effectue la moyenne

=1

c) - lindice de fixation de Wright (FIS) ou de Selander (D) permettent deacutevaluer le

deacuteficit ou lexcegraves dheacuteteacuterozygotes Pour le iegraveme locus ils sont deacutefinis par

8polymorphe un g~ne es dit polymorphe lorsquil preacute~me au moins deux eacutetats distinctS dun caractegravere donneacute

li

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

Les deux indices se comportent de faccedilon opposeacutee une valeur positive de D correspond agrave

excegraves dheacuteteacuterozygotes et une valeur neacutegatIcircve agrave un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes

La diffeacuterentiation geacuteneacutetique des populations est appreacutecieacutee par le calcul dun indice de

fixation moyen FST (Wright 1965) deacutefini de la maniegravere suivante

I-FIT = (I-FIS)middot(I-FST)

ougrave FIT et FIS sont les indices de fixation respectivement des individus agrave la population totale et

agrave ces sous-populations

Les indices de fixation du iegraveme allegravele sont deacutefinis dapregraves Nei (1977) par

~Sj =(~ - P)(Pi - p)

Fm = (~ - p2i)(Pi _ p2j)

avec Pi=Sn wiXuuml Pi=Sn wixi ougrave wi repreacutesente le poids accordeacute agrave chaque sous populations

Les indices de fixation calculeacutes pour le jeme locus agrave k allegraveles sont donneacutes par k

Lx j (1- Xj)~Sj ~Sj =-=--------

Lx j (1- Xi) i=1

k

LX (1- xJFm

LxC1- x) 1-1

Lhypothegravese nulle Ho que la valeur du F ST seacutecarte significativement de zeacutero est testeacutee par

X2=2NFST pour n-1 degreacute de liberteacute (Workman et Niswander 1970) ougrave n est le nombre de

18

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

10

sous populations et N le nombre total dindividus eacutechantillonneacutes La variance autour de la

moyenne par preacutelegravevement est deacutetermineacutee par la meacutethode du jacknife (Weir et Cockerham

1984) Elle permet de tester la significativiteacute de la valeur moyenne agrave laide dun test-t

Le nombre dindividus migrants entre populations peuvent ecirctre estimeacutes par la relation

Nm = (_1__ 1)4 FST (Wright 1965)

avec N =nombre dindividus fertiles dans la population

m = taux de migration

III RESULTATS

- Indices Physiologiques

Lexamen des indices gonadiques fait apparaicirctre de fortes dispariteacutes entre stations (fig 2a)

Tout dabord le site de lArmorique se distingue par des valeurs tregraves faibles traduisant un

niveau de deacuteveloppement des gonades tregraves reacuteduit ne permettant pas de discerner une peacuteriode

de ponte Le site du DelIee preacutesente un deacuteveloppement des gonades moyen comparable au

teacutemoin (Gleacutenan) mais le pic de deacuteveloppement de printemps nest pas observeacutee bien que la

chute de lindice agrave partir du mois de mai permette dy deacuteceler une ponte La population de

MarIoux preacutesente une eacutevolution assez semblable agrave celle des Gleacutenan avec toutefois des valeurs

nettement plus eacuteleveacutees et deux peacuteriodes de chute dindice Uanvier-mars avril-juin)

Lanalyse des indices de reacutepleacutetion (fig2b) montre un comportement radicalement diffeacuterent

entre les oursins de la rade et ceux des Gleacutenan En effet alors que sur le site teacutemoin on observe

un maximum en hiver et une forte chute de lindice de reacutepleacutetion jusquen avril-ma~ soit un mois

avant la ponte le comportement alimentaire des oursins des sites de la rade semble beaucoup

plus anarchique sur le site de MarIoux les indices de reacutepleacutetion restent eacuteleveacutes mecircme en peacuteriode

de ponte et sur les deux autres sites les valeurs hivernales sont singuliegraverement faibles De

maniegravere geacuteneacuterale les indices de reacutepleacutetion des stations de la rade sont plus stables au cours de la

peacuteriode eacutetudieacutee et plus eacuteleveacutes pendant le printemps et leacuteteacute que sur le site de reacutefeacuterence des

Gleacutenan Ceci semble traduire un besoin eacutenergeacutetique plus constant agrave correacuteler avec la nature du

substrat et la disponibiliteacute des ressources trophiques (Comely amp Ansel 1989)

19

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

Fig 2 Evolution des indices phvsiologigues de Splzaerecltinus granularis UG et IR)

Indices Gonadiques

Mariaux

+ Armorique

-Q-- DeUee

- -r- - Gleacutenan

Fig2a

Indices de Reacutepleacutetion

25

1 tfi~__ plusmnl~middotmiddotmiddotmiddotmiddott~~-~-~

5 - -- - - ~~~~-TT-~ j ~----+-- ~~ l ~-middot-rgtfmiddotltmiddot J 1 shy

n------~ -t o 1 shy

o J FM AM J J

bullbull -tl- bullbullbull Marlou~

1

1 -+- Armorique 1

~ Dellee

- - - Gleacutenan l

Fig2b

2deg - Feacutecondation et deacuteveloppement larvaire

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur le tableau l et les graphes preacutesenteacutes en figure 3 ougrave sont

pris en compte les moyennes de lensemble des expeacuteriences Les taux de feacutecondations moyens

sont eacuteleveacutes sur tous les sites (gt91) On note cependant une reacuteussite des feacutecondations (F)

leacutegegraverement meilleure pour le site des Gleacutenan (fig3a) sans pour autant que les diffeacuterences

soient statistiquement significatiyes sauf pour le site de MarIoux ougrave les valeurs sont

significatrvement infeacuterieures au site de reacutefeacuterence (seuil de confiance 95)

20

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

Les taux de pluteus normaux (N) obtenus pour les sites de lArmorique et de Marloux sont

significativement infeacuterieurs au site des Gleacutenan choisi comme reacutefeacuterence (respectivement 689

et 812 contre 869 auxiles Gleacutenan cf fig3d)

Le site de lArmorique se distingue des trois autres populations par un taux de blocage au

stade embryonnaire (P2=118) et de pluteus retardeacutes (R=143 fig3e) significativement

plus eacuteleveacutes de plus les tests sur les individus macircles montrent sur cette cateacutegorie des reacutesultats

statistiquement plus eacuteleveacutes que pour les femelles (t=249068 n=38 0=0005)

Le site de Marloux preacutesente un taux dembryons intermeacutediaire entre celui trouveacute agrave la pointe

de lArmorique et celui des Gleacutenan (58 fig3b) Le taux de mortaliteacute (M) y est

significativement supeacuterieur agrave toutes les autres stations (24 contre 08 agrave 12 fig3f)

En revanche aucune diffeacuterence statistique nIa eacuteteacute rencontreacutee en comparant les sites du

Dellec et des Gleacutenan agrave quelque stade de deacuteveloppement que ce soit bien que les reacutesultats

soient geacuteneacuteralement infeacuterieurs pour le site de la rade

Les pluteus pathologiques (Pl) sont du mecircme ordre de grandeur dans tous les sites (37)

et ne permettent pas deacutetablir de comparaison (fig3e)

TABLEAU 1 COllPARAISON DES RESUlJTATS DES TESTS DE FECONDATION

N() P2 ()1

i F() R() 1 Pl () M() 1rmoriq ue Macircles 922plusmn64 13+16689plusmnU5 82plusmn80178plusmn10S 1 38plusmn16

1

Femelles 93Oplusmn45 688plusmn166 108plusmn70 39+16 153plusmn177 L2plusmnL3 11

689plusmn145 Il8plusmnl43Total 1 922plusmn64 143plusmn9A 38plusmn22 12plusmn20 2larloux Macircles 800plusmn42 79plusmn34 41plusmn27928plusmn37 5 1plusmn3 1 28+8

Femelles 91Oplusmn94 824plusmn84 1 59plusmn3 1 33plusmn14 65plusmn61 L9plusmn22 69plusmn36 37plusmn21 58plusmn5O 24plusmn5Total 919+74 812plusmn69

27plusmn27Deliee Macircles 81plusmn3ocirc 33plusmn15 O9plusmnLO925plusmn57 i 850plusmn59 96plusmn56 1 45+16 27plusmn32Femelles l2plusmn24928plusmn61

1 82Oplusmn9O 27plusmn29 10plusmn18Total 89plusmn4iuml 39plusmn22926plusmn58 835plusmn771 1

27plusmn23 O6plusmnO777plusmn50 38plusmn23Gleacutenan Macircles 851plusmn69949plusmn45 - l+ 1)~_J_ 1 34plusmnl7 14plusmn13Femelles LOplusmn14887plusmn72943plusmn44

21plusmn2O 1 O8plusmn1l869+72 1 66+51 1 i 36plusmn2OTotal 946+44

mise en eacutevidence dune diffeacuterence significative entre ies reacutesultats des deux sexes

21

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

_________________ _

Fig 3 Preacutesentation graphique des reacutesultats des tests eacutecotoxicologigues

Taux de feacutecondation (F)

100

1 1 6 iuml 1 1

agrave~J 9 1

0

1

1~1 l i 1

80_

751 1

Armorique Marioux Deliee Gleacutenan

Fig 3a taux de feacutecondation observeacutes pour chaque station

Embrvons (P2) 00

1 1

11

15

10 T 5 shy

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig 3b taux de blocage embryonnaire obseneacutes pour chaque station

Pluteus retardeacutes CR)

25CO

20CO

15CO o

10CO

5CO 1 9 i

OCO

Armorique Martoux Jallee Gleacutenan

Fig 3c taux de pluteus retardeacutes obsenes sur chaque statlon

22

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

__________________ _

Pluteus nomlaut (N)

100 T iuml ccedil 2751 iuml 2 l Q

l501 1

T251

1

0 Armorique Marloux Deliee Gleacutenan

Fig3d taux de pluteus normaux observeacutes sur chaque station

Pluteus pathologiques (Pl)

8

161

i T shy1l iuml

1 11 14 -

I r-

tJiuml t 1

1 2 1 1

omiddot Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3e [mLC de plweus pathologiques observeacutes sur chaque station

Tault de mortaliteacute on

500

400

300 l

200

1

100 J J j J

000

Armorique Mariaux Deliee Gleacutenan

Fig 3 taux mortaliteacute observeacutes pour chaque station

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

30 - Geacuteneacutetique des populations

Les reacutesultats sont rassembleacutes sur les tableaux n02 et 3 Sur les Il loci eacutetudieacutes on remarque

que la population de lArmorique seacutecarte significativement de leacutequilibre de Hardy-Weinberg

pour 5 loci (PGM-l et 2 IDH-l PGD-l GPI-1) alors que lon observe seulement 2 cas pour

le site de MarIoux TI est agrave noter que dans chaque cas les indices de fLation de la population

de lArmorique sont plus eacuteleveacutes que ceux de MarIoux traduisant une deacuteviation plus

importante Cette observation est correacuteleacutee par une heacuteteacuterozygotie en moyenne plus eacuteleveacutee agrave

MarIoux quagrave lArmorique (0207plusmnO057 contre 0180plusmnO052) Le pourcentage de loci

polymorphes (seuil 95) est de 6364 agrave MarIoux contre 4545 agrave lArmorique

Lindicateur de diffeacuterenciation geacuteneacutetique moyen calculeacute selon la meacutethode de Weir et

Cockerham est faible (FST=00059plusmnO0048) et ne montre pas de diffeacuterence significative Dans

ces conditions lestimation du nombre dindividus eacutechangeacutes par geacuteneacuteration donne une valeur

eacuteleveacutee (Nm=42 12plusmn23 Il)

TABLEAU 2

RESUltΠDES F-STATISTIQUES

Locus FIS FIT FST

PGM-1 0381 0384 0004 PGM-2 0359 0360 0001 IDH-l 0226 0233 0010 PGD-l 0351 0352 0002 MDH-1 -0013 -0009 0005 MDH-2 -0026 -0013 0013 GPI-1 0346 0352 0012 ME-1 0252 0253 0001 ME-2 -0034 -0030 0005

MT-1 -0051 -0040 0012 MT-2 0137 0137 0000

Moy 0273 0276 0006

24

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

TABLEAU 3

STRUCTURE GENETIQUE DE DEUX POPULATIONS DE Sgranillaris SUR UNE BASE DE 11 LOCI

Pointe de Marloux Pointe de lArmorigue 1

1 1

Locus allegravele freacuteq Ho He D Het freacuteq Ho He D Het

PGM-l 105 0013 2 1987 0006 0050 - 1 2924 -0658 0073

100 0975 0962

95 0013 0038

PGM-2 110 0025 15 22l77 -0324 0554 - 12 20468 -0414 0512

105 0262 0287

100 0613 0637

95 0087 0075

90 0013 shyIDH-l 105 0081 7 8260 -0153 0223 0015 3 4761 -0370 0140

100 0amp78 0926

95 0041 0059

PGD-l 110 0025 15 19392 -0227 0485 0038 9 18063 -0502 0452

107 0013 shy105 0213 0250

100 0688 0700

95 0050 0013

90 0013 shyltIDH-l 105 - 1 1000 0000 0025 0013 1 1000 0000 0025

100 0988 0988 95 0013 shy

MOH-2 110 - 0 - - - 0025 2 1975 0013 0 049

100 1000 0975

GPI-I 110 0112 Il 14620 -0148 0366 0175 6 11696 -0487 0292

105 0075 shy100 0788 0325

100 0850 0863

95 0025 -ltŒ-1 105 0050 2 3843 -0480 0096 0038 3 2924 0026 0073

100 0950 0962

rv1E-2 105 0013 3 2949 0017 0074 0038 3 2924 0026 0073

100 0962 0962

95 0025 -MT-1 105 0038 6 5734 0046 0143 0025 2 1975 0013 0049

100 0925 0975

95 0038 -MT-2 105 0150 10 10329 -0032 0258 0138 7 9608 -0271 0240 1

Heacuteteacutero~gotIcirce moyenne par locus (non biaiseacutee O207iO057 HeacuteteacuterozygOlIcirclt moyenne par locus (non biaiseacutee == O180iO05 Nombre moyen dallegraveles par locus = 309iO44 Nombre moyen dallegraveles par locus 236iO20 Pourcentage de loci polmorphes (criteacutere 95) == 6364 Po=uge de loci polymorphes (criteacutere 95) =4545

locus preacutesent8llt un deacuteficit en heacuteteacutero~gOles significltl lttest de 1 p$O05)

1

IV 1DISCUSSION

TI ressort de cette eacutetude une convergence des reacutesultats qui reacutevegravele la singulariteacute de la

population de la pointe de lArmorique En effet le cycle de reproduction y est agrave leacutevidence

perturbeacute les valeurs dindice gonadique sont extregravemement faibles et la ponte non deacutecelable Le

taux dingestion est faible Les tests de deacuteveloppement larvaire preacutesentent des anomalies

(blocage aux stades embryonnaires et retard des pluteus) et lanalyse geacuteneacutetique y reacutevegravele pour

pregraves de 50 des loci une deacuteficience en heacuteteacuterozygotes traduisant lagrave une baisse de variabiliteacute

geacuteneacutetique et une deacuteviation par rapport aux conditions dHardYMWeinberg9

Le site voisin de la pointe MarIoux semble beaucoup moins affecteacute le cycle de reproduction

sy deacuteroule tout agrave fait normalement (IG plus eacuteleveacutes que sur le site de reacutefeacuterence) et leacutequilibre

panmictique y est geacuteneacuteralement mieux respecteacute Cependant les tests eacutecotoxicologiques y

deacutecegravelent quelques indices de perturbation les taux de feacutecondations y sont infeacuterieurs au teacutemoin

les embryons preacutesentent quelques blocages et les taux de mortaliteacute des larves sont

statistiquement plus eacuteleveacutes

Les reacutesultats concernant le site du Deliec nindiquent p as de diffeacuterences remarquables par

rapport au site de reacutefeacuterence La peacuteriode de ponte y survient avec un leacuteger deacutecalage sans doute

agrave mettre agrave lactif dune diffeacuterence dans les conditions de tempeacuterature etou de deacuteveloppement

de blooms phytop1anctoniques certains auteurs faisant concorder le deacuteclenchement de la ponte

avec labondance de nourriture disponible pour les larves (Himmelman 1978)

Le comportement des indices de reacutepleacutetion des populations de la rade de Brest savegravere tregraves

distinct de celui de la population de reacutefeacuterence ce qui peut traduire une strateacutegie adaptative

diffeacuterente ou une couverture des besoins eacutenergeacutetiques insuffisante chez les populations de la

rade Cette observation meacuterite notre attention puisque dans le cas de la station de MarIoux le

substrat est semblable agrave celui du site teacutemoin et ne peut expliquer le maintien de lindice de

reacutepleacutetion agrave des niveaux eacuteleveacutes pendant la peacuteriode de reproduction

On peut deacuteduire de ces constatations une distinction entre les populations du fond de la

rade et la station du Deliee situeacutee dans le goulet qui semble a priori exempte de deacutegradation

9Hardy-Weinberg (loi de) loi dheacutereacutediteacute ougrave la preacutesence des gegravenes demeure constante de geacuteneacuteration en geacuteneacuteration en labsence de seacutelection de mutation daccouplements dirigeacutes ou daccidents deacutechantillonnage

26

Les deux populations du bassin Nord subissent agrave leacutevidence linfluence de facteurs

environnementaux qui perturbent leur deacuteveloppement Ces pheacutenomegravenes sont provoqueacutes par

diverses causes dorigine naturelle tout dabord auxquelles viennent sajouter les facteurs

anthropiques

Une certaine hieacuterarchisation dans leacutetat de deacutegradation des sites est agrave prendre en compte En

effet des deux zones perturbeacutees la pointe de lArmorique est celle ougrave les effets se font le plus

durement ressentir

Ces deux stations diffegraverent de par le substrat le reacutegime hydrodynamique et lintensiteacute de

linfluence estuarienne La nature du substrat agrave MarIoux est la mecircme que sur le site de

reacutefeacuterence des Gleacutenan il sagit de fonds meubles composeacutes de maeumlrl vivant recouvert

deacutepiphytes synonymes de ressources trophiques abondantes et disponibles toute lanneacutee ce qui

explique les indices gonadiques eacuteleveacutes observeacutes pour ces deux sites A MarIoux

lhydrodynamisme est calme favorable au deacuteveloppement dune veacutegeacutetation dense dalgues

macrophytes saisonniegraveres (Hily et al 1992) Cette couverture veacutegeacutetale est renforceacutee par

lenrichissement du milieu en sels nutritifs provenant du bassin versant de lElom agrave vocation

agricole (N03-=500 agrave lOOOkgj P043-=30 agrave 700kgj) Les concentrations dans cette zones

sont eacuteleveacutees et varient au cours de lanneacutee elles sont maximales lhiver (N03-=28-51 mgl

P043-=O67-137mgl NH4+=41-37mgl) La preacutesence de ces algues contribue agrave augmenter

et agrave diversifier les ressources trophiques disponibles elle favorise le deacuteveloppement dune faune

diversifieacutee de brouteurs

Sur le site de la pointe de lArmorique par contre le substrat est rocheux et les courants

forts Le couvert veacutegeacutetal y est au contraire clairsemeacute et composeacute dalgues essentiellement

saisonniegraveres La population de lArmorique se trouve donc dans des conditions de ressources

trophiques moins facilement accessibles et plus limiteacutees comme latteste le deacuteveloppement plus

important de lorgane masticateur (par effet compensateur) signaleacute lors dune eacutetude compareacutee

de ces deux populations (Lumingas amp Guillou SOIIS presse) Lanalyse des indices

physiologiques doit se faire en consideacuterant que le degreacute de prospeacuteriteacute dune population reacutesulte

dun compromis entre la nature et labondance des ressources trophiques dune part et dautre

part de leacutenergie que lanimal doit deacutepenser pour collecter digeacuterer et assimiler cette nourriture

27

(Reacutegis 1979) Les deux populations eacutetant au deacutepart placeacutees dans des conditions ineacutegales

lapparition de facteurs exteacuterieurs ne pourrait quamplifier cette diffeacuterence au deacutetriment de la

plus deacutefavoriseacutee

Lexamen comparatif des courbes deacutevolution de tempeacuterature entre le Dellec et la pointe de

lArmorique (stations fixes de mesures hydrologiques) montre un eacutecart de 05 agrave 1degC en faveur

de la partie la plus reculeacutee de la rade (cf Annexe V) En tenant compte de la profondeur on

peut en deacuteduire pour le site de Marloux ougrave la profondeur est faible un eacutecart de tempeacuterature

denviron + l5degC par rapport au Dellec Cette particulariteacute pourrait expliquer la preacutecociteacute de la

maturiteacute remarqueacutee chez la population de Marloux Plusieurs interpreacutetations peuvent expliquer

la chute de lindice gonadique observeacutee en mars interruption dans le deacuteveloppement des

gonades provoqueacutee par les preacutecipitations hivernales (Cochran amp Engelmann 1975 Starr et al

1993) une mobilisation des reacutesenles dues aux conditions climatiques (Guillou amp MicheL

1993) ou au contraire une gameacutetogeacutenegravese preacutecoce comme le laisse supposer la forte valeur de

lindice gonadique en janvier

Les tests de feacutecondation eacutetant reacutealiseacutes dans une eau de reacutefeacuterence les causes de perturbation

du deacuteveloppement larvaire sont intrinsegraveques aux gamegravetes il peut sagir soit de la qualiteacute du

vitellus soit dalteacuterations geacuteneacutetiques soit de laccumulation dans les gonades dun agent

contaminant preacutesent dans le mileu Gamegravetes et embryons doursins sont sensibles agrave un large

eacuteventail de facteurs physiques (tempeacuterature pH saliniteacute etc ) et chimiques (meacutetaux

pesticides PCBs hydrocarbures etc ) ils conviennent eacutegalement pour tester les effluents en

meacutelange (Kobayashi 1971 Dinnel et al 1981 Pagano et al 1987 Lassus et al 1991) ce qui

rend plus difficile la recherche des agents responsables des anomalies observeacutees

On peut tout de mecircme mentionner les fortes teneurs en meacutetaux lourds preacutesents dans toute la

partie Est de la rade (mine de plomb argentifegravere situeacutee agrave Huelgoat) Des mesures reacutecentes de

meacutetaux dans les seacutediments agrave proximiteacute de la pointe de lArmorique font eacutetat des concentrations

suivantes Cu=253 ppm Pb=230 ppm Zn=160 ppm (Troadec corn pers) Les oursins en

tant quorganismes infeacuteodeacutes au seacutediment et participant agrave leur bioturbation sont directement

exposeacutes agrave ce type de contamination Plusieurs eacutetudes in situ font eacutetat de laccumulation de

28

meacutetaux par les oursms notamment dans les gonades et lintestin (Augier et al 1987b

Albanedo et al 1990)

Les tests de toxiciteacute des meacutetaux lourds sur les larves de diffeacuterentes espegraveces doursins ont fait

lobjet de nombreux travaux et les effets de ces polluants sur la feacutecondation et le

deacuteveloppement des larves sont assez bien connus (Kobayashi 1984 Dinnel et al 1989) A

faibles doses les ions meacutetalliques peuvent exercer une action positive caracteacuterisant le

pheacutenomegravene d hormegravese observeacute par Stebbing (1981) sur des colonies dhydrozoaires Une

action semblable est rapporteacutee par Young au niveau du pouvoir fertilisant des spermatozoiumldes

doursins pour des concentrations en divers ions meacutetalliques allant de 10-5 agrave 10-6M (Young amp

Nelson 1974) Cependant il sagit de pheacutenomegravenes marginaux et la tendance geacuteneacuterale de ces

eacuteleacutements se manifeste bien eacutevidemment par un effet toxique Le cuivre le zinc le cadmium

provoquent agrave des seuils diffeacuterents des dommages sur les gamegravetes et leur descendance en

alteacuterant soit la croissance des larves soit la diffeacuterenciation squelettique des pluteus (Bougis

1961 1965 Khristoforova et al 1984 Pagano et al 1982 Hesllnga 1976) Les diffeacuterents

stades larvaires preacutesentent des sensibiliteacutes diffeacuterentes les travaux de Kobayashl (1980)

montrent une plus forte sensibiliteacute des spermatozoiumldes et des larves au stade gastmla ce qui

coincide avec les blocages embryonnaires observeacutes agrave ce stade sur le site de lAlmorique La

preacutesence de meacutetaux dans les gonades pourraient donc logiquement expliquer les reacutesultats

obtenus De plus de fortes preacutesomptions pegravesent sur les rejets de mateacuteriel provenant du service

pyrotechnique de la Marine Nationale sur la pointe de lArmorique

Les reacutesultats dune toute reacutecente analyse effectueacutee par le Laboratoire Municipal de Brest

(aoucirct 94) sur des gonades doursins provenant des trois stations de la rade confirme cette

hypothegravese (cf Annexe VI) Le site de lArmorique se distingue par des teneurs nettement plus

eacuteleveacutees en fer zinc plomb et en cadmium (Fe=263 ppm Zn=356 ppm Pb=075 ppm Cd=076

ppm cest agrave dire selon les meacutetaux entre 2 agrave 5 fois plus que dans les autres stations) Dans

lensemble une certaine contamination meacutetallique peut ecirctre remarqueacutee dont lorigine se situe

dans le trafflc maritime les rejets domestiques et portuaires et les peintures anti-foullng Les

fortes concentrations en zinc proviennent des toitures de lagglomeacuteration brestoise Les

nombreux eacutelevages porcins de la reacutegion peuvent aussi contribuer agrave la pollution en cuivre par

29

lalimentation fournie aux arumaux Cependant la forte contamination locale du site de

lArmorique en fer zinc plomb et cadmium ne peut avoir quune origine ponctuelle qui

confirme les soupccedilons pesant sur les activiteacutes militaires dans ce secteur Compareacutes aux chiffres

trouveacutes dans la litteacuterature les reacutesultats sont coheacuterents Augier et al(1987b) lors dune eacutetude

sur Paracentrotus ividus en baie de Port-Cros avance des concentrations dans les gonades

comparables (Cd=O52 agrave 231 ppm Cu=167 agrave 542 ppm Pb=O33 agrave 117 ppm) mais des

teneurs en mercure sensiblement plus faibles (Hg=003 agrave 004 ppm) Chez une autre espegravece

(Echinometra mathaei) les travaux dAlbanedo et al(1990) indiquent dans une station tregraves

pollueacutee du port de la Havane des concentrations eacuteleveacutees en meacutetaux Fe=l08 ppm Cu=473

ppm Zn=267 ppm chiffres qui sauf pour le cuivre restent infeacuterieurs aux mesures obselveacutees agrave

la pointe de lArmorique Ces auteurs montrent une accumulation des meacutetaux lourds

relativement importante dans les diffeacuterents organes des oursins notamment au niveau du tube

digestif (cas du plomb et du cuivre) il serait inteacuteressant de connaicirctre eacutegalement les doses dans

les autres parties de lorganisme Cette accumulation preacutesentant des fluctuations saisonniegraveres

lieacutees au meacutetabolisme de lanimal un suivi plus reacutegulier des concentrations en meacutetaux devrait

ecirctre envisageacute

Cependant les meacutetaux peuvent ne pas ecirctre les seuls agents agrave mettre en cause Les pesticides

et les hydrocarbures sont eacutegalement susceptibles de pouvoir provoquer des anomalies (cf

Annexe VU) Les PCBs employeacutes dans de nombreux secteurs industriels bien que quelquefois

signaleacutes dans les seacutediments de la zone portuaire agrave des taux importants (PCBs=183

ppbMarchand 1985) semblent agrave eacutecarter En effet Trieff et al (1 988) bien quil mette en

eacutevidence un effet spermiotoxique signale labsence daccumulation de ce type de produits dans

les organismes ce qui preacutesente comme impossible toute influence des PCBs dans les conditions

ougrave les expeacuteriences ont eacuteteacute meneacutees

La preacutesence dans le bassin Nord de rejets de deux stations deacutepuration situeacutees en amont de

la Penfeld exerce aussi une influence sur la qualiteacute bacteacuteriologique des eaux de ce secteur

Leurs apports sont estimeacutes agrave 1014CFIh Dautre part le ruisseau du Relecq Kerhuon situeacute pregraves

de lestuaire de lElom amegravene quant agrave lui jusquagrave 1012CFIh en hiver (source DDE rapport

Saunier eau et environnement) Ces chiffres peuvent apporter une explication aux mortaliteacute

30

des lalVes obselVeacutees pour le site de Marloux des bacteacuteries pathogegravenes preacutesentes dans les

gonades peuvent secirctre deacuteveloppeacutees pendant la peacuteriode dincubation

Les reacutesultats de lanalyse geacuteneacutetique trahissent un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes important sur le

site de la pointe de lAnnorique Ce deacuteficit freacutequemment rencontreacute chez les mollusques

bivalves (Buroker 1983~ Singh amp Green 1984) et dautres inverteacutebreacutes marins (Murphy et al

1975 Day amp Bayne 1988) peut avoir plusieurs significations il sagit soit de la preacutesence

dallegraveles silencieux (1) soit dun pheacutenomegravene dinbreeding (2) soit dM effet Wahlund (3) ou

encore du reacutesultat de la pression de seacutelection exerceacutee par les facteurs eacutenonceacutes plus haut (4)

(1) Lhypothegravese de la preacutesence dallegraveles nuls lo est peu probable eacutetant donneacute le nombre de

loci preacutesentant un excegraves dhomozygotes

(2) Le pheacutenomegravene dautofeacutecondation nest pas agrave eacutecarter car des cas dhermaphrodisme

certes peu freacutequents ont deacutejagrave eacuteteacute rapporteacutes sur ce mecircme site (Neefs 1952) Leacuteventualiteacute que

les gegravenes impliqueacutes ne soient pas porteacutes par des chromosomes autosomaux na pas eacuteteacute veacuterifieacutee

(3) Les conditions dhydrodynamisme sexerccedilant sur cette zone peuvent ecirctre invoqueacutees pour

venir conforter la thegravese dun effet Wahlund (conseacutequence dun eacutechantillonnage effectueacute sur

deux sous-eacutechantillons dun mecircme site se comportant comme des populations Mendelliennes

seacutepareacutees)

(4) Une seacutelection exerceacutee par les conditions du milieu reste le)plication la plus probable

Cette influence des facteurs environnementaux comme la preacutesence de meacutetaux mentionneacutee

preacuteceacutedemment sexerce pendant la vie lalVaire peacutelagique mais surtout durant la phase critique

de la meacutetamorphose et les eacutetapes qui suivent le recrutement La meacutetamorphose chez les oursins

sulVient apregraves une peacuteriode variable de vie lalVaire pouvant durer selon les espegraveces et les

conditions entre 5 et 22 semaines (Strathmann 1987) ce qui expose les larves agrave de nombreux

aleacuteas Certains auteurs eacutevoquent limportance du recrutement comme facteur dheacuteteacuterogeacuteneacuteiteacute

geacuteneacutetique entre populations (Watts et al 1990) Or une eacutetude comparative des populations

des deux sites concerneacutes a montreacute une forte irreacutegulariteacute du recrutement dans la population de

Marloux par rapport agrave celle de la pointe de lAnnorique (Lumingas amp Guillou sous presse)

Ces auteurs imputent ce pheacutenomegravene au spectaculaire deacuteveloppement dalgues qui apparaicirct

IOallegravele nul (ou silencieux) est dit dun allegravele qui ne sexprime pas sur le gel

31

chaque anneacutee sur ce site agrave la faveur des apports fluviaux en eacuteleacutements nutritifs Dune part il

inhiberait laction attractive du maeumlrl dautre part la deacutecomposition de ces veacutegeacutetaux agrave

lautomne provoquerait la mortaliteacute des recrues en reacuteduisant la couche superficielle du seacutediment

et entraicircnerait le deacuteveloppement dun film bacteacuterien empecircchant 1a fixation des post~larves Le

site de la pointe de lArmorique semble au contraire avoir des recrutements reacuteguliers

Les groupes de recrues connaissent donc des destins diffeacuterents sur les deux sites ce qui

pourrait expliquer les diffeacuterences dheacuteteacuterozygotie observeacutees

Pour confirmer cette hypothegravese il conviendrait de comparer des eacutechantillons plus grands

dindividus de mecircme agravege correspondant agrave une peacuteriode ougrave le recrutement a eacuteteacute bon sur les deux

sites voire mecircme de comparer directement les geacutenotypes des jeunes individus recruteacutes dans les

deux sites Dautre part la comparaison du site de la pointe de lArmorique avec celui du

Dellec pourrait fournir des indications importantes pour confirmer lhypothegravese de lexistence

dune pression de seacutelection

V 1CONCLUSION

Leacutetude des phases de reproduction et deacuteveloppement larvaire des populations doursins de

la Rade de Brest met en eacutevidence des troubles fonctionnels chez les populations du bassin

Nord proches de la zone portuaire en particulier sur le site de la pointe de lArmorique qui

contraste avec les bons reacutesultats obtenus pour le site du Dellec sous influence oceacuteanique La

convergence des donneacutees de geacuteneacutetique avec les reacutesultats observeacutes confirme la validiteacute de la

meacutethode utiliseacutee et renforce la fiabiliteacute de Sgranularis comme bioindicateur

Les causes de ces deacuteregraveglements sont sans doute multiples aussi ce travail meacuterite-t-il un suivi

agrave plus long terme Leacuterude des diffeacuterents paramegravetres influenccedilant les conditions de vie des

oursins de la pointe de lArmorique (tempeacuterarure saliniteacute seacutedimentologie biomasse matiegravere

organique ) ainsi que des essais de transplantations in situ dindividus sains devraient

permettre de mieux preacuteciser les facteurs responsables de ces perturbations

Quant aux premiers reacutesultats danalyses des teneurs en meacutetaux lourds du Laboratoire

Municipal ils devraient ecirctre eacutetendus agrave dautres parties du corps (test intestin) et effectueacutes sur

un cycle annuel y compris sur le site des Gleacutenan

32

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38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

Les deux populations du bassin Nord subissent agrave leacutevidence linfluence de facteurs

environnementaux qui perturbent leur deacuteveloppement Ces pheacutenomegravenes sont provoqueacutes par

diverses causes dorigine naturelle tout dabord auxquelles viennent sajouter les facteurs

anthropiques

Une certaine hieacuterarchisation dans leacutetat de deacutegradation des sites est agrave prendre en compte En

effet des deux zones perturbeacutees la pointe de lArmorique est celle ougrave les effets se font le plus

durement ressentir

Ces deux stations diffegraverent de par le substrat le reacutegime hydrodynamique et lintensiteacute de

linfluence estuarienne La nature du substrat agrave MarIoux est la mecircme que sur le site de

reacutefeacuterence des Gleacutenan il sagit de fonds meubles composeacutes de maeumlrl vivant recouvert

deacutepiphytes synonymes de ressources trophiques abondantes et disponibles toute lanneacutee ce qui

explique les indices gonadiques eacuteleveacutes observeacutes pour ces deux sites A MarIoux

lhydrodynamisme est calme favorable au deacuteveloppement dune veacutegeacutetation dense dalgues

macrophytes saisonniegraveres (Hily et al 1992) Cette couverture veacutegeacutetale est renforceacutee par

lenrichissement du milieu en sels nutritifs provenant du bassin versant de lElom agrave vocation

agricole (N03-=500 agrave lOOOkgj P043-=30 agrave 700kgj) Les concentrations dans cette zones

sont eacuteleveacutees et varient au cours de lanneacutee elles sont maximales lhiver (N03-=28-51 mgl

P043-=O67-137mgl NH4+=41-37mgl) La preacutesence de ces algues contribue agrave augmenter

et agrave diversifier les ressources trophiques disponibles elle favorise le deacuteveloppement dune faune

diversifieacutee de brouteurs

Sur le site de la pointe de lArmorique par contre le substrat est rocheux et les courants

forts Le couvert veacutegeacutetal y est au contraire clairsemeacute et composeacute dalgues essentiellement

saisonniegraveres La population de lArmorique se trouve donc dans des conditions de ressources

trophiques moins facilement accessibles et plus limiteacutees comme latteste le deacuteveloppement plus

important de lorgane masticateur (par effet compensateur) signaleacute lors dune eacutetude compareacutee

de ces deux populations (Lumingas amp Guillou SOIIS presse) Lanalyse des indices

physiologiques doit se faire en consideacuterant que le degreacute de prospeacuteriteacute dune population reacutesulte

dun compromis entre la nature et labondance des ressources trophiques dune part et dautre

part de leacutenergie que lanimal doit deacutepenser pour collecter digeacuterer et assimiler cette nourriture

27

(Reacutegis 1979) Les deux populations eacutetant au deacutepart placeacutees dans des conditions ineacutegales

lapparition de facteurs exteacuterieurs ne pourrait quamplifier cette diffeacuterence au deacutetriment de la

plus deacutefavoriseacutee

Lexamen comparatif des courbes deacutevolution de tempeacuterature entre le Dellec et la pointe de

lArmorique (stations fixes de mesures hydrologiques) montre un eacutecart de 05 agrave 1degC en faveur

de la partie la plus reculeacutee de la rade (cf Annexe V) En tenant compte de la profondeur on

peut en deacuteduire pour le site de Marloux ougrave la profondeur est faible un eacutecart de tempeacuterature

denviron + l5degC par rapport au Dellec Cette particulariteacute pourrait expliquer la preacutecociteacute de la

maturiteacute remarqueacutee chez la population de Marloux Plusieurs interpreacutetations peuvent expliquer

la chute de lindice gonadique observeacutee en mars interruption dans le deacuteveloppement des

gonades provoqueacutee par les preacutecipitations hivernales (Cochran amp Engelmann 1975 Starr et al

1993) une mobilisation des reacutesenles dues aux conditions climatiques (Guillou amp MicheL

1993) ou au contraire une gameacutetogeacutenegravese preacutecoce comme le laisse supposer la forte valeur de

lindice gonadique en janvier

Les tests de feacutecondation eacutetant reacutealiseacutes dans une eau de reacutefeacuterence les causes de perturbation

du deacuteveloppement larvaire sont intrinsegraveques aux gamegravetes il peut sagir soit de la qualiteacute du

vitellus soit dalteacuterations geacuteneacutetiques soit de laccumulation dans les gonades dun agent

contaminant preacutesent dans le mileu Gamegravetes et embryons doursins sont sensibles agrave un large

eacuteventail de facteurs physiques (tempeacuterature pH saliniteacute etc ) et chimiques (meacutetaux

pesticides PCBs hydrocarbures etc ) ils conviennent eacutegalement pour tester les effluents en

meacutelange (Kobayashi 1971 Dinnel et al 1981 Pagano et al 1987 Lassus et al 1991) ce qui

rend plus difficile la recherche des agents responsables des anomalies observeacutees

On peut tout de mecircme mentionner les fortes teneurs en meacutetaux lourds preacutesents dans toute la

partie Est de la rade (mine de plomb argentifegravere situeacutee agrave Huelgoat) Des mesures reacutecentes de

meacutetaux dans les seacutediments agrave proximiteacute de la pointe de lArmorique font eacutetat des concentrations

suivantes Cu=253 ppm Pb=230 ppm Zn=160 ppm (Troadec corn pers) Les oursins en

tant quorganismes infeacuteodeacutes au seacutediment et participant agrave leur bioturbation sont directement

exposeacutes agrave ce type de contamination Plusieurs eacutetudes in situ font eacutetat de laccumulation de

28

meacutetaux par les oursms notamment dans les gonades et lintestin (Augier et al 1987b

Albanedo et al 1990)

Les tests de toxiciteacute des meacutetaux lourds sur les larves de diffeacuterentes espegraveces doursins ont fait

lobjet de nombreux travaux et les effets de ces polluants sur la feacutecondation et le

deacuteveloppement des larves sont assez bien connus (Kobayashi 1984 Dinnel et al 1989) A

faibles doses les ions meacutetalliques peuvent exercer une action positive caracteacuterisant le

pheacutenomegravene d hormegravese observeacute par Stebbing (1981) sur des colonies dhydrozoaires Une

action semblable est rapporteacutee par Young au niveau du pouvoir fertilisant des spermatozoiumldes

doursins pour des concentrations en divers ions meacutetalliques allant de 10-5 agrave 10-6M (Young amp

Nelson 1974) Cependant il sagit de pheacutenomegravenes marginaux et la tendance geacuteneacuterale de ces

eacuteleacutements se manifeste bien eacutevidemment par un effet toxique Le cuivre le zinc le cadmium

provoquent agrave des seuils diffeacuterents des dommages sur les gamegravetes et leur descendance en

alteacuterant soit la croissance des larves soit la diffeacuterenciation squelettique des pluteus (Bougis

1961 1965 Khristoforova et al 1984 Pagano et al 1982 Hesllnga 1976) Les diffeacuterents

stades larvaires preacutesentent des sensibiliteacutes diffeacuterentes les travaux de Kobayashl (1980)

montrent une plus forte sensibiliteacute des spermatozoiumldes et des larves au stade gastmla ce qui

coincide avec les blocages embryonnaires observeacutes agrave ce stade sur le site de lAlmorique La

preacutesence de meacutetaux dans les gonades pourraient donc logiquement expliquer les reacutesultats

obtenus De plus de fortes preacutesomptions pegravesent sur les rejets de mateacuteriel provenant du service

pyrotechnique de la Marine Nationale sur la pointe de lArmorique

Les reacutesultats dune toute reacutecente analyse effectueacutee par le Laboratoire Municipal de Brest

(aoucirct 94) sur des gonades doursins provenant des trois stations de la rade confirme cette

hypothegravese (cf Annexe VI) Le site de lArmorique se distingue par des teneurs nettement plus

eacuteleveacutees en fer zinc plomb et en cadmium (Fe=263 ppm Zn=356 ppm Pb=075 ppm Cd=076

ppm cest agrave dire selon les meacutetaux entre 2 agrave 5 fois plus que dans les autres stations) Dans

lensemble une certaine contamination meacutetallique peut ecirctre remarqueacutee dont lorigine se situe

dans le trafflc maritime les rejets domestiques et portuaires et les peintures anti-foullng Les

fortes concentrations en zinc proviennent des toitures de lagglomeacuteration brestoise Les

nombreux eacutelevages porcins de la reacutegion peuvent aussi contribuer agrave la pollution en cuivre par

29

lalimentation fournie aux arumaux Cependant la forte contamination locale du site de

lArmorique en fer zinc plomb et cadmium ne peut avoir quune origine ponctuelle qui

confirme les soupccedilons pesant sur les activiteacutes militaires dans ce secteur Compareacutes aux chiffres

trouveacutes dans la litteacuterature les reacutesultats sont coheacuterents Augier et al(1987b) lors dune eacutetude

sur Paracentrotus ividus en baie de Port-Cros avance des concentrations dans les gonades

comparables (Cd=O52 agrave 231 ppm Cu=167 agrave 542 ppm Pb=O33 agrave 117 ppm) mais des

teneurs en mercure sensiblement plus faibles (Hg=003 agrave 004 ppm) Chez une autre espegravece

(Echinometra mathaei) les travaux dAlbanedo et al(1990) indiquent dans une station tregraves

pollueacutee du port de la Havane des concentrations eacuteleveacutees en meacutetaux Fe=l08 ppm Cu=473

ppm Zn=267 ppm chiffres qui sauf pour le cuivre restent infeacuterieurs aux mesures obselveacutees agrave

la pointe de lArmorique Ces auteurs montrent une accumulation des meacutetaux lourds

relativement importante dans les diffeacuterents organes des oursins notamment au niveau du tube

digestif (cas du plomb et du cuivre) il serait inteacuteressant de connaicirctre eacutegalement les doses dans

les autres parties de lorganisme Cette accumulation preacutesentant des fluctuations saisonniegraveres

lieacutees au meacutetabolisme de lanimal un suivi plus reacutegulier des concentrations en meacutetaux devrait

ecirctre envisageacute

Cependant les meacutetaux peuvent ne pas ecirctre les seuls agents agrave mettre en cause Les pesticides

et les hydrocarbures sont eacutegalement susceptibles de pouvoir provoquer des anomalies (cf

Annexe VU) Les PCBs employeacutes dans de nombreux secteurs industriels bien que quelquefois

signaleacutes dans les seacutediments de la zone portuaire agrave des taux importants (PCBs=183

ppbMarchand 1985) semblent agrave eacutecarter En effet Trieff et al (1 988) bien quil mette en

eacutevidence un effet spermiotoxique signale labsence daccumulation de ce type de produits dans

les organismes ce qui preacutesente comme impossible toute influence des PCBs dans les conditions

ougrave les expeacuteriences ont eacuteteacute meneacutees

La preacutesence dans le bassin Nord de rejets de deux stations deacutepuration situeacutees en amont de

la Penfeld exerce aussi une influence sur la qualiteacute bacteacuteriologique des eaux de ce secteur

Leurs apports sont estimeacutes agrave 1014CFIh Dautre part le ruisseau du Relecq Kerhuon situeacute pregraves

de lestuaire de lElom amegravene quant agrave lui jusquagrave 1012CFIh en hiver (source DDE rapport

Saunier eau et environnement) Ces chiffres peuvent apporter une explication aux mortaliteacute

30

des lalVes obselVeacutees pour le site de Marloux des bacteacuteries pathogegravenes preacutesentes dans les

gonades peuvent secirctre deacuteveloppeacutees pendant la peacuteriode dincubation

Les reacutesultats de lanalyse geacuteneacutetique trahissent un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes important sur le

site de la pointe de lAnnorique Ce deacuteficit freacutequemment rencontreacute chez les mollusques

bivalves (Buroker 1983~ Singh amp Green 1984) et dautres inverteacutebreacutes marins (Murphy et al

1975 Day amp Bayne 1988) peut avoir plusieurs significations il sagit soit de la preacutesence

dallegraveles silencieux (1) soit dun pheacutenomegravene dinbreeding (2) soit dM effet Wahlund (3) ou

encore du reacutesultat de la pression de seacutelection exerceacutee par les facteurs eacutenonceacutes plus haut (4)

(1) Lhypothegravese de la preacutesence dallegraveles nuls lo est peu probable eacutetant donneacute le nombre de

loci preacutesentant un excegraves dhomozygotes

(2) Le pheacutenomegravene dautofeacutecondation nest pas agrave eacutecarter car des cas dhermaphrodisme

certes peu freacutequents ont deacutejagrave eacuteteacute rapporteacutes sur ce mecircme site (Neefs 1952) Leacuteventualiteacute que

les gegravenes impliqueacutes ne soient pas porteacutes par des chromosomes autosomaux na pas eacuteteacute veacuterifieacutee

(3) Les conditions dhydrodynamisme sexerccedilant sur cette zone peuvent ecirctre invoqueacutees pour

venir conforter la thegravese dun effet Wahlund (conseacutequence dun eacutechantillonnage effectueacute sur

deux sous-eacutechantillons dun mecircme site se comportant comme des populations Mendelliennes

seacutepareacutees)

(4) Une seacutelection exerceacutee par les conditions du milieu reste le)plication la plus probable

Cette influence des facteurs environnementaux comme la preacutesence de meacutetaux mentionneacutee

preacuteceacutedemment sexerce pendant la vie lalVaire peacutelagique mais surtout durant la phase critique

de la meacutetamorphose et les eacutetapes qui suivent le recrutement La meacutetamorphose chez les oursins

sulVient apregraves une peacuteriode variable de vie lalVaire pouvant durer selon les espegraveces et les

conditions entre 5 et 22 semaines (Strathmann 1987) ce qui expose les larves agrave de nombreux

aleacuteas Certains auteurs eacutevoquent limportance du recrutement comme facteur dheacuteteacuterogeacuteneacuteiteacute

geacuteneacutetique entre populations (Watts et al 1990) Or une eacutetude comparative des populations

des deux sites concerneacutes a montreacute une forte irreacutegulariteacute du recrutement dans la population de

Marloux par rapport agrave celle de la pointe de lAnnorique (Lumingas amp Guillou sous presse)

Ces auteurs imputent ce pheacutenomegravene au spectaculaire deacuteveloppement dalgues qui apparaicirct

IOallegravele nul (ou silencieux) est dit dun allegravele qui ne sexprime pas sur le gel

31

chaque anneacutee sur ce site agrave la faveur des apports fluviaux en eacuteleacutements nutritifs Dune part il

inhiberait laction attractive du maeumlrl dautre part la deacutecomposition de ces veacutegeacutetaux agrave

lautomne provoquerait la mortaliteacute des recrues en reacuteduisant la couche superficielle du seacutediment

et entraicircnerait le deacuteveloppement dun film bacteacuterien empecircchant 1a fixation des post~larves Le

site de la pointe de lArmorique semble au contraire avoir des recrutements reacuteguliers

Les groupes de recrues connaissent donc des destins diffeacuterents sur les deux sites ce qui

pourrait expliquer les diffeacuterences dheacuteteacuterozygotie observeacutees

Pour confirmer cette hypothegravese il conviendrait de comparer des eacutechantillons plus grands

dindividus de mecircme agravege correspondant agrave une peacuteriode ougrave le recrutement a eacuteteacute bon sur les deux

sites voire mecircme de comparer directement les geacutenotypes des jeunes individus recruteacutes dans les

deux sites Dautre part la comparaison du site de la pointe de lArmorique avec celui du

Dellec pourrait fournir des indications importantes pour confirmer lhypothegravese de lexistence

dune pression de seacutelection

V 1CONCLUSION

Leacutetude des phases de reproduction et deacuteveloppement larvaire des populations doursins de

la Rade de Brest met en eacutevidence des troubles fonctionnels chez les populations du bassin

Nord proches de la zone portuaire en particulier sur le site de la pointe de lArmorique qui

contraste avec les bons reacutesultats obtenus pour le site du Dellec sous influence oceacuteanique La

convergence des donneacutees de geacuteneacutetique avec les reacutesultats observeacutes confirme la validiteacute de la

meacutethode utiliseacutee et renforce la fiabiliteacute de Sgranularis comme bioindicateur

Les causes de ces deacuteregraveglements sont sans doute multiples aussi ce travail meacuterite-t-il un suivi

agrave plus long terme Leacuterude des diffeacuterents paramegravetres influenccedilant les conditions de vie des

oursins de la pointe de lArmorique (tempeacuterarure saliniteacute seacutedimentologie biomasse matiegravere

organique ) ainsi que des essais de transplantations in situ dindividus sains devraient

permettre de mieux preacuteciser les facteurs responsables de ces perturbations

Quant aux premiers reacutesultats danalyses des teneurs en meacutetaux lourds du Laboratoire

Municipal ils devraient ecirctre eacutetendus agrave dautres parties du corps (test intestin) et effectueacutes sur

un cycle annuel y compris sur le site des Gleacutenan

32

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Italla

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GIORDANO G RAMANUJAM S v LIVINGSTONE D R PAGANO G (1988)

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7 57-64

37

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YOUNG L NELSON L (1974) The effects of heavy metals ions on the motility of sea

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38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

(Reacutegis 1979) Les deux populations eacutetant au deacutepart placeacutees dans des conditions ineacutegales

lapparition de facteurs exteacuterieurs ne pourrait quamplifier cette diffeacuterence au deacutetriment de la

plus deacutefavoriseacutee

Lexamen comparatif des courbes deacutevolution de tempeacuterature entre le Dellec et la pointe de

lArmorique (stations fixes de mesures hydrologiques) montre un eacutecart de 05 agrave 1degC en faveur

de la partie la plus reculeacutee de la rade (cf Annexe V) En tenant compte de la profondeur on

peut en deacuteduire pour le site de Marloux ougrave la profondeur est faible un eacutecart de tempeacuterature

denviron + l5degC par rapport au Dellec Cette particulariteacute pourrait expliquer la preacutecociteacute de la

maturiteacute remarqueacutee chez la population de Marloux Plusieurs interpreacutetations peuvent expliquer

la chute de lindice gonadique observeacutee en mars interruption dans le deacuteveloppement des

gonades provoqueacutee par les preacutecipitations hivernales (Cochran amp Engelmann 1975 Starr et al

1993) une mobilisation des reacutesenles dues aux conditions climatiques (Guillou amp MicheL

1993) ou au contraire une gameacutetogeacutenegravese preacutecoce comme le laisse supposer la forte valeur de

lindice gonadique en janvier

Les tests de feacutecondation eacutetant reacutealiseacutes dans une eau de reacutefeacuterence les causes de perturbation

du deacuteveloppement larvaire sont intrinsegraveques aux gamegravetes il peut sagir soit de la qualiteacute du

vitellus soit dalteacuterations geacuteneacutetiques soit de laccumulation dans les gonades dun agent

contaminant preacutesent dans le mileu Gamegravetes et embryons doursins sont sensibles agrave un large

eacuteventail de facteurs physiques (tempeacuterature pH saliniteacute etc ) et chimiques (meacutetaux

pesticides PCBs hydrocarbures etc ) ils conviennent eacutegalement pour tester les effluents en

meacutelange (Kobayashi 1971 Dinnel et al 1981 Pagano et al 1987 Lassus et al 1991) ce qui

rend plus difficile la recherche des agents responsables des anomalies observeacutees

On peut tout de mecircme mentionner les fortes teneurs en meacutetaux lourds preacutesents dans toute la

partie Est de la rade (mine de plomb argentifegravere situeacutee agrave Huelgoat) Des mesures reacutecentes de

meacutetaux dans les seacutediments agrave proximiteacute de la pointe de lArmorique font eacutetat des concentrations

suivantes Cu=253 ppm Pb=230 ppm Zn=160 ppm (Troadec corn pers) Les oursins en

tant quorganismes infeacuteodeacutes au seacutediment et participant agrave leur bioturbation sont directement

exposeacutes agrave ce type de contamination Plusieurs eacutetudes in situ font eacutetat de laccumulation de

28

meacutetaux par les oursms notamment dans les gonades et lintestin (Augier et al 1987b

Albanedo et al 1990)

Les tests de toxiciteacute des meacutetaux lourds sur les larves de diffeacuterentes espegraveces doursins ont fait

lobjet de nombreux travaux et les effets de ces polluants sur la feacutecondation et le

deacuteveloppement des larves sont assez bien connus (Kobayashi 1984 Dinnel et al 1989) A

faibles doses les ions meacutetalliques peuvent exercer une action positive caracteacuterisant le

pheacutenomegravene d hormegravese observeacute par Stebbing (1981) sur des colonies dhydrozoaires Une

action semblable est rapporteacutee par Young au niveau du pouvoir fertilisant des spermatozoiumldes

doursins pour des concentrations en divers ions meacutetalliques allant de 10-5 agrave 10-6M (Young amp

Nelson 1974) Cependant il sagit de pheacutenomegravenes marginaux et la tendance geacuteneacuterale de ces

eacuteleacutements se manifeste bien eacutevidemment par un effet toxique Le cuivre le zinc le cadmium

provoquent agrave des seuils diffeacuterents des dommages sur les gamegravetes et leur descendance en

alteacuterant soit la croissance des larves soit la diffeacuterenciation squelettique des pluteus (Bougis

1961 1965 Khristoforova et al 1984 Pagano et al 1982 Hesllnga 1976) Les diffeacuterents

stades larvaires preacutesentent des sensibiliteacutes diffeacuterentes les travaux de Kobayashl (1980)

montrent une plus forte sensibiliteacute des spermatozoiumldes et des larves au stade gastmla ce qui

coincide avec les blocages embryonnaires observeacutes agrave ce stade sur le site de lAlmorique La

preacutesence de meacutetaux dans les gonades pourraient donc logiquement expliquer les reacutesultats

obtenus De plus de fortes preacutesomptions pegravesent sur les rejets de mateacuteriel provenant du service

pyrotechnique de la Marine Nationale sur la pointe de lArmorique

Les reacutesultats dune toute reacutecente analyse effectueacutee par le Laboratoire Municipal de Brest

(aoucirct 94) sur des gonades doursins provenant des trois stations de la rade confirme cette

hypothegravese (cf Annexe VI) Le site de lArmorique se distingue par des teneurs nettement plus

eacuteleveacutees en fer zinc plomb et en cadmium (Fe=263 ppm Zn=356 ppm Pb=075 ppm Cd=076

ppm cest agrave dire selon les meacutetaux entre 2 agrave 5 fois plus que dans les autres stations) Dans

lensemble une certaine contamination meacutetallique peut ecirctre remarqueacutee dont lorigine se situe

dans le trafflc maritime les rejets domestiques et portuaires et les peintures anti-foullng Les

fortes concentrations en zinc proviennent des toitures de lagglomeacuteration brestoise Les

nombreux eacutelevages porcins de la reacutegion peuvent aussi contribuer agrave la pollution en cuivre par

29

lalimentation fournie aux arumaux Cependant la forte contamination locale du site de

lArmorique en fer zinc plomb et cadmium ne peut avoir quune origine ponctuelle qui

confirme les soupccedilons pesant sur les activiteacutes militaires dans ce secteur Compareacutes aux chiffres

trouveacutes dans la litteacuterature les reacutesultats sont coheacuterents Augier et al(1987b) lors dune eacutetude

sur Paracentrotus ividus en baie de Port-Cros avance des concentrations dans les gonades

comparables (Cd=O52 agrave 231 ppm Cu=167 agrave 542 ppm Pb=O33 agrave 117 ppm) mais des

teneurs en mercure sensiblement plus faibles (Hg=003 agrave 004 ppm) Chez une autre espegravece

(Echinometra mathaei) les travaux dAlbanedo et al(1990) indiquent dans une station tregraves

pollueacutee du port de la Havane des concentrations eacuteleveacutees en meacutetaux Fe=l08 ppm Cu=473

ppm Zn=267 ppm chiffres qui sauf pour le cuivre restent infeacuterieurs aux mesures obselveacutees agrave

la pointe de lArmorique Ces auteurs montrent une accumulation des meacutetaux lourds

relativement importante dans les diffeacuterents organes des oursins notamment au niveau du tube

digestif (cas du plomb et du cuivre) il serait inteacuteressant de connaicirctre eacutegalement les doses dans

les autres parties de lorganisme Cette accumulation preacutesentant des fluctuations saisonniegraveres

lieacutees au meacutetabolisme de lanimal un suivi plus reacutegulier des concentrations en meacutetaux devrait

ecirctre envisageacute

Cependant les meacutetaux peuvent ne pas ecirctre les seuls agents agrave mettre en cause Les pesticides

et les hydrocarbures sont eacutegalement susceptibles de pouvoir provoquer des anomalies (cf

Annexe VU) Les PCBs employeacutes dans de nombreux secteurs industriels bien que quelquefois

signaleacutes dans les seacutediments de la zone portuaire agrave des taux importants (PCBs=183

ppbMarchand 1985) semblent agrave eacutecarter En effet Trieff et al (1 988) bien quil mette en

eacutevidence un effet spermiotoxique signale labsence daccumulation de ce type de produits dans

les organismes ce qui preacutesente comme impossible toute influence des PCBs dans les conditions

ougrave les expeacuteriences ont eacuteteacute meneacutees

La preacutesence dans le bassin Nord de rejets de deux stations deacutepuration situeacutees en amont de

la Penfeld exerce aussi une influence sur la qualiteacute bacteacuteriologique des eaux de ce secteur

Leurs apports sont estimeacutes agrave 1014CFIh Dautre part le ruisseau du Relecq Kerhuon situeacute pregraves

de lestuaire de lElom amegravene quant agrave lui jusquagrave 1012CFIh en hiver (source DDE rapport

Saunier eau et environnement) Ces chiffres peuvent apporter une explication aux mortaliteacute

30

des lalVes obselVeacutees pour le site de Marloux des bacteacuteries pathogegravenes preacutesentes dans les

gonades peuvent secirctre deacuteveloppeacutees pendant la peacuteriode dincubation

Les reacutesultats de lanalyse geacuteneacutetique trahissent un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes important sur le

site de la pointe de lAnnorique Ce deacuteficit freacutequemment rencontreacute chez les mollusques

bivalves (Buroker 1983~ Singh amp Green 1984) et dautres inverteacutebreacutes marins (Murphy et al

1975 Day amp Bayne 1988) peut avoir plusieurs significations il sagit soit de la preacutesence

dallegraveles silencieux (1) soit dun pheacutenomegravene dinbreeding (2) soit dM effet Wahlund (3) ou

encore du reacutesultat de la pression de seacutelection exerceacutee par les facteurs eacutenonceacutes plus haut (4)

(1) Lhypothegravese de la preacutesence dallegraveles nuls lo est peu probable eacutetant donneacute le nombre de

loci preacutesentant un excegraves dhomozygotes

(2) Le pheacutenomegravene dautofeacutecondation nest pas agrave eacutecarter car des cas dhermaphrodisme

certes peu freacutequents ont deacutejagrave eacuteteacute rapporteacutes sur ce mecircme site (Neefs 1952) Leacuteventualiteacute que

les gegravenes impliqueacutes ne soient pas porteacutes par des chromosomes autosomaux na pas eacuteteacute veacuterifieacutee

(3) Les conditions dhydrodynamisme sexerccedilant sur cette zone peuvent ecirctre invoqueacutees pour

venir conforter la thegravese dun effet Wahlund (conseacutequence dun eacutechantillonnage effectueacute sur

deux sous-eacutechantillons dun mecircme site se comportant comme des populations Mendelliennes

seacutepareacutees)

(4) Une seacutelection exerceacutee par les conditions du milieu reste le)plication la plus probable

Cette influence des facteurs environnementaux comme la preacutesence de meacutetaux mentionneacutee

preacuteceacutedemment sexerce pendant la vie lalVaire peacutelagique mais surtout durant la phase critique

de la meacutetamorphose et les eacutetapes qui suivent le recrutement La meacutetamorphose chez les oursins

sulVient apregraves une peacuteriode variable de vie lalVaire pouvant durer selon les espegraveces et les

conditions entre 5 et 22 semaines (Strathmann 1987) ce qui expose les larves agrave de nombreux

aleacuteas Certains auteurs eacutevoquent limportance du recrutement comme facteur dheacuteteacuterogeacuteneacuteiteacute

geacuteneacutetique entre populations (Watts et al 1990) Or une eacutetude comparative des populations

des deux sites concerneacutes a montreacute une forte irreacutegulariteacute du recrutement dans la population de

Marloux par rapport agrave celle de la pointe de lAnnorique (Lumingas amp Guillou sous presse)

Ces auteurs imputent ce pheacutenomegravene au spectaculaire deacuteveloppement dalgues qui apparaicirct

IOallegravele nul (ou silencieux) est dit dun allegravele qui ne sexprime pas sur le gel

31

chaque anneacutee sur ce site agrave la faveur des apports fluviaux en eacuteleacutements nutritifs Dune part il

inhiberait laction attractive du maeumlrl dautre part la deacutecomposition de ces veacutegeacutetaux agrave

lautomne provoquerait la mortaliteacute des recrues en reacuteduisant la couche superficielle du seacutediment

et entraicircnerait le deacuteveloppement dun film bacteacuterien empecircchant 1a fixation des post~larves Le

site de la pointe de lArmorique semble au contraire avoir des recrutements reacuteguliers

Les groupes de recrues connaissent donc des destins diffeacuterents sur les deux sites ce qui

pourrait expliquer les diffeacuterences dheacuteteacuterozygotie observeacutees

Pour confirmer cette hypothegravese il conviendrait de comparer des eacutechantillons plus grands

dindividus de mecircme agravege correspondant agrave une peacuteriode ougrave le recrutement a eacuteteacute bon sur les deux

sites voire mecircme de comparer directement les geacutenotypes des jeunes individus recruteacutes dans les

deux sites Dautre part la comparaison du site de la pointe de lArmorique avec celui du

Dellec pourrait fournir des indications importantes pour confirmer lhypothegravese de lexistence

dune pression de seacutelection

V 1CONCLUSION

Leacutetude des phases de reproduction et deacuteveloppement larvaire des populations doursins de

la Rade de Brest met en eacutevidence des troubles fonctionnels chez les populations du bassin

Nord proches de la zone portuaire en particulier sur le site de la pointe de lArmorique qui

contraste avec les bons reacutesultats obtenus pour le site du Dellec sous influence oceacuteanique La

convergence des donneacutees de geacuteneacutetique avec les reacutesultats observeacutes confirme la validiteacute de la

meacutethode utiliseacutee et renforce la fiabiliteacute de Sgranularis comme bioindicateur

Les causes de ces deacuteregraveglements sont sans doute multiples aussi ce travail meacuterite-t-il un suivi

agrave plus long terme Leacuterude des diffeacuterents paramegravetres influenccedilant les conditions de vie des

oursins de la pointe de lArmorique (tempeacuterarure saliniteacute seacutedimentologie biomasse matiegravere

organique ) ainsi que des essais de transplantations in situ dindividus sains devraient

permettre de mieux preacuteciser les facteurs responsables de ces perturbations

Quant aux premiers reacutesultats danalyses des teneurs en meacutetaux lourds du Laboratoire

Municipal ils devraient ecirctre eacutetendus agrave dautres parties du corps (test intestin) et effectueacutes sur

un cycle annuel y compris sur le site des Gleacutenan

32

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38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

meacutetaux par les oursms notamment dans les gonades et lintestin (Augier et al 1987b

Albanedo et al 1990)

Les tests de toxiciteacute des meacutetaux lourds sur les larves de diffeacuterentes espegraveces doursins ont fait

lobjet de nombreux travaux et les effets de ces polluants sur la feacutecondation et le

deacuteveloppement des larves sont assez bien connus (Kobayashi 1984 Dinnel et al 1989) A

faibles doses les ions meacutetalliques peuvent exercer une action positive caracteacuterisant le

pheacutenomegravene d hormegravese observeacute par Stebbing (1981) sur des colonies dhydrozoaires Une

action semblable est rapporteacutee par Young au niveau du pouvoir fertilisant des spermatozoiumldes

doursins pour des concentrations en divers ions meacutetalliques allant de 10-5 agrave 10-6M (Young amp

Nelson 1974) Cependant il sagit de pheacutenomegravenes marginaux et la tendance geacuteneacuterale de ces

eacuteleacutements se manifeste bien eacutevidemment par un effet toxique Le cuivre le zinc le cadmium

provoquent agrave des seuils diffeacuterents des dommages sur les gamegravetes et leur descendance en

alteacuterant soit la croissance des larves soit la diffeacuterenciation squelettique des pluteus (Bougis

1961 1965 Khristoforova et al 1984 Pagano et al 1982 Hesllnga 1976) Les diffeacuterents

stades larvaires preacutesentent des sensibiliteacutes diffeacuterentes les travaux de Kobayashl (1980)

montrent une plus forte sensibiliteacute des spermatozoiumldes et des larves au stade gastmla ce qui

coincide avec les blocages embryonnaires observeacutes agrave ce stade sur le site de lAlmorique La

preacutesence de meacutetaux dans les gonades pourraient donc logiquement expliquer les reacutesultats

obtenus De plus de fortes preacutesomptions pegravesent sur les rejets de mateacuteriel provenant du service

pyrotechnique de la Marine Nationale sur la pointe de lArmorique

Les reacutesultats dune toute reacutecente analyse effectueacutee par le Laboratoire Municipal de Brest

(aoucirct 94) sur des gonades doursins provenant des trois stations de la rade confirme cette

hypothegravese (cf Annexe VI) Le site de lArmorique se distingue par des teneurs nettement plus

eacuteleveacutees en fer zinc plomb et en cadmium (Fe=263 ppm Zn=356 ppm Pb=075 ppm Cd=076

ppm cest agrave dire selon les meacutetaux entre 2 agrave 5 fois plus que dans les autres stations) Dans

lensemble une certaine contamination meacutetallique peut ecirctre remarqueacutee dont lorigine se situe

dans le trafflc maritime les rejets domestiques et portuaires et les peintures anti-foullng Les

fortes concentrations en zinc proviennent des toitures de lagglomeacuteration brestoise Les

nombreux eacutelevages porcins de la reacutegion peuvent aussi contribuer agrave la pollution en cuivre par

29

lalimentation fournie aux arumaux Cependant la forte contamination locale du site de

lArmorique en fer zinc plomb et cadmium ne peut avoir quune origine ponctuelle qui

confirme les soupccedilons pesant sur les activiteacutes militaires dans ce secteur Compareacutes aux chiffres

trouveacutes dans la litteacuterature les reacutesultats sont coheacuterents Augier et al(1987b) lors dune eacutetude

sur Paracentrotus ividus en baie de Port-Cros avance des concentrations dans les gonades

comparables (Cd=O52 agrave 231 ppm Cu=167 agrave 542 ppm Pb=O33 agrave 117 ppm) mais des

teneurs en mercure sensiblement plus faibles (Hg=003 agrave 004 ppm) Chez une autre espegravece

(Echinometra mathaei) les travaux dAlbanedo et al(1990) indiquent dans une station tregraves

pollueacutee du port de la Havane des concentrations eacuteleveacutees en meacutetaux Fe=l08 ppm Cu=473

ppm Zn=267 ppm chiffres qui sauf pour le cuivre restent infeacuterieurs aux mesures obselveacutees agrave

la pointe de lArmorique Ces auteurs montrent une accumulation des meacutetaux lourds

relativement importante dans les diffeacuterents organes des oursins notamment au niveau du tube

digestif (cas du plomb et du cuivre) il serait inteacuteressant de connaicirctre eacutegalement les doses dans

les autres parties de lorganisme Cette accumulation preacutesentant des fluctuations saisonniegraveres

lieacutees au meacutetabolisme de lanimal un suivi plus reacutegulier des concentrations en meacutetaux devrait

ecirctre envisageacute

Cependant les meacutetaux peuvent ne pas ecirctre les seuls agents agrave mettre en cause Les pesticides

et les hydrocarbures sont eacutegalement susceptibles de pouvoir provoquer des anomalies (cf

Annexe VU) Les PCBs employeacutes dans de nombreux secteurs industriels bien que quelquefois

signaleacutes dans les seacutediments de la zone portuaire agrave des taux importants (PCBs=183

ppbMarchand 1985) semblent agrave eacutecarter En effet Trieff et al (1 988) bien quil mette en

eacutevidence un effet spermiotoxique signale labsence daccumulation de ce type de produits dans

les organismes ce qui preacutesente comme impossible toute influence des PCBs dans les conditions

ougrave les expeacuteriences ont eacuteteacute meneacutees

La preacutesence dans le bassin Nord de rejets de deux stations deacutepuration situeacutees en amont de

la Penfeld exerce aussi une influence sur la qualiteacute bacteacuteriologique des eaux de ce secteur

Leurs apports sont estimeacutes agrave 1014CFIh Dautre part le ruisseau du Relecq Kerhuon situeacute pregraves

de lestuaire de lElom amegravene quant agrave lui jusquagrave 1012CFIh en hiver (source DDE rapport

Saunier eau et environnement) Ces chiffres peuvent apporter une explication aux mortaliteacute

30

des lalVes obselVeacutees pour le site de Marloux des bacteacuteries pathogegravenes preacutesentes dans les

gonades peuvent secirctre deacuteveloppeacutees pendant la peacuteriode dincubation

Les reacutesultats de lanalyse geacuteneacutetique trahissent un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes important sur le

site de la pointe de lAnnorique Ce deacuteficit freacutequemment rencontreacute chez les mollusques

bivalves (Buroker 1983~ Singh amp Green 1984) et dautres inverteacutebreacutes marins (Murphy et al

1975 Day amp Bayne 1988) peut avoir plusieurs significations il sagit soit de la preacutesence

dallegraveles silencieux (1) soit dun pheacutenomegravene dinbreeding (2) soit dM effet Wahlund (3) ou

encore du reacutesultat de la pression de seacutelection exerceacutee par les facteurs eacutenonceacutes plus haut (4)

(1) Lhypothegravese de la preacutesence dallegraveles nuls lo est peu probable eacutetant donneacute le nombre de

loci preacutesentant un excegraves dhomozygotes

(2) Le pheacutenomegravene dautofeacutecondation nest pas agrave eacutecarter car des cas dhermaphrodisme

certes peu freacutequents ont deacutejagrave eacuteteacute rapporteacutes sur ce mecircme site (Neefs 1952) Leacuteventualiteacute que

les gegravenes impliqueacutes ne soient pas porteacutes par des chromosomes autosomaux na pas eacuteteacute veacuterifieacutee

(3) Les conditions dhydrodynamisme sexerccedilant sur cette zone peuvent ecirctre invoqueacutees pour

venir conforter la thegravese dun effet Wahlund (conseacutequence dun eacutechantillonnage effectueacute sur

deux sous-eacutechantillons dun mecircme site se comportant comme des populations Mendelliennes

seacutepareacutees)

(4) Une seacutelection exerceacutee par les conditions du milieu reste le)plication la plus probable

Cette influence des facteurs environnementaux comme la preacutesence de meacutetaux mentionneacutee

preacuteceacutedemment sexerce pendant la vie lalVaire peacutelagique mais surtout durant la phase critique

de la meacutetamorphose et les eacutetapes qui suivent le recrutement La meacutetamorphose chez les oursins

sulVient apregraves une peacuteriode variable de vie lalVaire pouvant durer selon les espegraveces et les

conditions entre 5 et 22 semaines (Strathmann 1987) ce qui expose les larves agrave de nombreux

aleacuteas Certains auteurs eacutevoquent limportance du recrutement comme facteur dheacuteteacuterogeacuteneacuteiteacute

geacuteneacutetique entre populations (Watts et al 1990) Or une eacutetude comparative des populations

des deux sites concerneacutes a montreacute une forte irreacutegulariteacute du recrutement dans la population de

Marloux par rapport agrave celle de la pointe de lAnnorique (Lumingas amp Guillou sous presse)

Ces auteurs imputent ce pheacutenomegravene au spectaculaire deacuteveloppement dalgues qui apparaicirct

IOallegravele nul (ou silencieux) est dit dun allegravele qui ne sexprime pas sur le gel

31

chaque anneacutee sur ce site agrave la faveur des apports fluviaux en eacuteleacutements nutritifs Dune part il

inhiberait laction attractive du maeumlrl dautre part la deacutecomposition de ces veacutegeacutetaux agrave

lautomne provoquerait la mortaliteacute des recrues en reacuteduisant la couche superficielle du seacutediment

et entraicircnerait le deacuteveloppement dun film bacteacuterien empecircchant 1a fixation des post~larves Le

site de la pointe de lArmorique semble au contraire avoir des recrutements reacuteguliers

Les groupes de recrues connaissent donc des destins diffeacuterents sur les deux sites ce qui

pourrait expliquer les diffeacuterences dheacuteteacuterozygotie observeacutees

Pour confirmer cette hypothegravese il conviendrait de comparer des eacutechantillons plus grands

dindividus de mecircme agravege correspondant agrave une peacuteriode ougrave le recrutement a eacuteteacute bon sur les deux

sites voire mecircme de comparer directement les geacutenotypes des jeunes individus recruteacutes dans les

deux sites Dautre part la comparaison du site de la pointe de lArmorique avec celui du

Dellec pourrait fournir des indications importantes pour confirmer lhypothegravese de lexistence

dune pression de seacutelection

V 1CONCLUSION

Leacutetude des phases de reproduction et deacuteveloppement larvaire des populations doursins de

la Rade de Brest met en eacutevidence des troubles fonctionnels chez les populations du bassin

Nord proches de la zone portuaire en particulier sur le site de la pointe de lArmorique qui

contraste avec les bons reacutesultats obtenus pour le site du Dellec sous influence oceacuteanique La

convergence des donneacutees de geacuteneacutetique avec les reacutesultats observeacutes confirme la validiteacute de la

meacutethode utiliseacutee et renforce la fiabiliteacute de Sgranularis comme bioindicateur

Les causes de ces deacuteregraveglements sont sans doute multiples aussi ce travail meacuterite-t-il un suivi

agrave plus long terme Leacuterude des diffeacuterents paramegravetres influenccedilant les conditions de vie des

oursins de la pointe de lArmorique (tempeacuterarure saliniteacute seacutedimentologie biomasse matiegravere

organique ) ainsi que des essais de transplantations in situ dindividus sains devraient

permettre de mieux preacuteciser les facteurs responsables de ces perturbations

Quant aux premiers reacutesultats danalyses des teneurs en meacutetaux lourds du Laboratoire

Municipal ils devraient ecirctre eacutetendus agrave dautres parties du corps (test intestin) et effectueacutes sur

un cycle annuel y compris sur le site des Gleacutenan

32

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38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

lalimentation fournie aux arumaux Cependant la forte contamination locale du site de

lArmorique en fer zinc plomb et cadmium ne peut avoir quune origine ponctuelle qui

confirme les soupccedilons pesant sur les activiteacutes militaires dans ce secteur Compareacutes aux chiffres

trouveacutes dans la litteacuterature les reacutesultats sont coheacuterents Augier et al(1987b) lors dune eacutetude

sur Paracentrotus ividus en baie de Port-Cros avance des concentrations dans les gonades

comparables (Cd=O52 agrave 231 ppm Cu=167 agrave 542 ppm Pb=O33 agrave 117 ppm) mais des

teneurs en mercure sensiblement plus faibles (Hg=003 agrave 004 ppm) Chez une autre espegravece

(Echinometra mathaei) les travaux dAlbanedo et al(1990) indiquent dans une station tregraves

pollueacutee du port de la Havane des concentrations eacuteleveacutees en meacutetaux Fe=l08 ppm Cu=473

ppm Zn=267 ppm chiffres qui sauf pour le cuivre restent infeacuterieurs aux mesures obselveacutees agrave

la pointe de lArmorique Ces auteurs montrent une accumulation des meacutetaux lourds

relativement importante dans les diffeacuterents organes des oursins notamment au niveau du tube

digestif (cas du plomb et du cuivre) il serait inteacuteressant de connaicirctre eacutegalement les doses dans

les autres parties de lorganisme Cette accumulation preacutesentant des fluctuations saisonniegraveres

lieacutees au meacutetabolisme de lanimal un suivi plus reacutegulier des concentrations en meacutetaux devrait

ecirctre envisageacute

Cependant les meacutetaux peuvent ne pas ecirctre les seuls agents agrave mettre en cause Les pesticides

et les hydrocarbures sont eacutegalement susceptibles de pouvoir provoquer des anomalies (cf

Annexe VU) Les PCBs employeacutes dans de nombreux secteurs industriels bien que quelquefois

signaleacutes dans les seacutediments de la zone portuaire agrave des taux importants (PCBs=183

ppbMarchand 1985) semblent agrave eacutecarter En effet Trieff et al (1 988) bien quil mette en

eacutevidence un effet spermiotoxique signale labsence daccumulation de ce type de produits dans

les organismes ce qui preacutesente comme impossible toute influence des PCBs dans les conditions

ougrave les expeacuteriences ont eacuteteacute meneacutees

La preacutesence dans le bassin Nord de rejets de deux stations deacutepuration situeacutees en amont de

la Penfeld exerce aussi une influence sur la qualiteacute bacteacuteriologique des eaux de ce secteur

Leurs apports sont estimeacutes agrave 1014CFIh Dautre part le ruisseau du Relecq Kerhuon situeacute pregraves

de lestuaire de lElom amegravene quant agrave lui jusquagrave 1012CFIh en hiver (source DDE rapport

Saunier eau et environnement) Ces chiffres peuvent apporter une explication aux mortaliteacute

30

des lalVes obselVeacutees pour le site de Marloux des bacteacuteries pathogegravenes preacutesentes dans les

gonades peuvent secirctre deacuteveloppeacutees pendant la peacuteriode dincubation

Les reacutesultats de lanalyse geacuteneacutetique trahissent un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes important sur le

site de la pointe de lAnnorique Ce deacuteficit freacutequemment rencontreacute chez les mollusques

bivalves (Buroker 1983~ Singh amp Green 1984) et dautres inverteacutebreacutes marins (Murphy et al

1975 Day amp Bayne 1988) peut avoir plusieurs significations il sagit soit de la preacutesence

dallegraveles silencieux (1) soit dun pheacutenomegravene dinbreeding (2) soit dM effet Wahlund (3) ou

encore du reacutesultat de la pression de seacutelection exerceacutee par les facteurs eacutenonceacutes plus haut (4)

(1) Lhypothegravese de la preacutesence dallegraveles nuls lo est peu probable eacutetant donneacute le nombre de

loci preacutesentant un excegraves dhomozygotes

(2) Le pheacutenomegravene dautofeacutecondation nest pas agrave eacutecarter car des cas dhermaphrodisme

certes peu freacutequents ont deacutejagrave eacuteteacute rapporteacutes sur ce mecircme site (Neefs 1952) Leacuteventualiteacute que

les gegravenes impliqueacutes ne soient pas porteacutes par des chromosomes autosomaux na pas eacuteteacute veacuterifieacutee

(3) Les conditions dhydrodynamisme sexerccedilant sur cette zone peuvent ecirctre invoqueacutees pour

venir conforter la thegravese dun effet Wahlund (conseacutequence dun eacutechantillonnage effectueacute sur

deux sous-eacutechantillons dun mecircme site se comportant comme des populations Mendelliennes

seacutepareacutees)

(4) Une seacutelection exerceacutee par les conditions du milieu reste le)plication la plus probable

Cette influence des facteurs environnementaux comme la preacutesence de meacutetaux mentionneacutee

preacuteceacutedemment sexerce pendant la vie lalVaire peacutelagique mais surtout durant la phase critique

de la meacutetamorphose et les eacutetapes qui suivent le recrutement La meacutetamorphose chez les oursins

sulVient apregraves une peacuteriode variable de vie lalVaire pouvant durer selon les espegraveces et les

conditions entre 5 et 22 semaines (Strathmann 1987) ce qui expose les larves agrave de nombreux

aleacuteas Certains auteurs eacutevoquent limportance du recrutement comme facteur dheacuteteacuterogeacuteneacuteiteacute

geacuteneacutetique entre populations (Watts et al 1990) Or une eacutetude comparative des populations

des deux sites concerneacutes a montreacute une forte irreacutegulariteacute du recrutement dans la population de

Marloux par rapport agrave celle de la pointe de lAnnorique (Lumingas amp Guillou sous presse)

Ces auteurs imputent ce pheacutenomegravene au spectaculaire deacuteveloppement dalgues qui apparaicirct

IOallegravele nul (ou silencieux) est dit dun allegravele qui ne sexprime pas sur le gel

31

chaque anneacutee sur ce site agrave la faveur des apports fluviaux en eacuteleacutements nutritifs Dune part il

inhiberait laction attractive du maeumlrl dautre part la deacutecomposition de ces veacutegeacutetaux agrave

lautomne provoquerait la mortaliteacute des recrues en reacuteduisant la couche superficielle du seacutediment

et entraicircnerait le deacuteveloppement dun film bacteacuterien empecircchant 1a fixation des post~larves Le

site de la pointe de lArmorique semble au contraire avoir des recrutements reacuteguliers

Les groupes de recrues connaissent donc des destins diffeacuterents sur les deux sites ce qui

pourrait expliquer les diffeacuterences dheacuteteacuterozygotie observeacutees

Pour confirmer cette hypothegravese il conviendrait de comparer des eacutechantillons plus grands

dindividus de mecircme agravege correspondant agrave une peacuteriode ougrave le recrutement a eacuteteacute bon sur les deux

sites voire mecircme de comparer directement les geacutenotypes des jeunes individus recruteacutes dans les

deux sites Dautre part la comparaison du site de la pointe de lArmorique avec celui du

Dellec pourrait fournir des indications importantes pour confirmer lhypothegravese de lexistence

dune pression de seacutelection

V 1CONCLUSION

Leacutetude des phases de reproduction et deacuteveloppement larvaire des populations doursins de

la Rade de Brest met en eacutevidence des troubles fonctionnels chez les populations du bassin

Nord proches de la zone portuaire en particulier sur le site de la pointe de lArmorique qui

contraste avec les bons reacutesultats obtenus pour le site du Dellec sous influence oceacuteanique La

convergence des donneacutees de geacuteneacutetique avec les reacutesultats observeacutes confirme la validiteacute de la

meacutethode utiliseacutee et renforce la fiabiliteacute de Sgranularis comme bioindicateur

Les causes de ces deacuteregraveglements sont sans doute multiples aussi ce travail meacuterite-t-il un suivi

agrave plus long terme Leacuterude des diffeacuterents paramegravetres influenccedilant les conditions de vie des

oursins de la pointe de lArmorique (tempeacuterarure saliniteacute seacutedimentologie biomasse matiegravere

organique ) ainsi que des essais de transplantations in situ dindividus sains devraient

permettre de mieux preacuteciser les facteurs responsables de ces perturbations

Quant aux premiers reacutesultats danalyses des teneurs en meacutetaux lourds du Laboratoire

Municipal ils devraient ecirctre eacutetendus agrave dautres parties du corps (test intestin) et effectueacutes sur

un cycle annuel y compris sur le site des Gleacutenan

32

VI 1BffiLIOGRAPHIE

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38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

des lalVes obselVeacutees pour le site de Marloux des bacteacuteries pathogegravenes preacutesentes dans les

gonades peuvent secirctre deacuteveloppeacutees pendant la peacuteriode dincubation

Les reacutesultats de lanalyse geacuteneacutetique trahissent un deacuteficit en heacuteteacuterozygotes important sur le

site de la pointe de lAnnorique Ce deacuteficit freacutequemment rencontreacute chez les mollusques

bivalves (Buroker 1983~ Singh amp Green 1984) et dautres inverteacutebreacutes marins (Murphy et al

1975 Day amp Bayne 1988) peut avoir plusieurs significations il sagit soit de la preacutesence

dallegraveles silencieux (1) soit dun pheacutenomegravene dinbreeding (2) soit dM effet Wahlund (3) ou

encore du reacutesultat de la pression de seacutelection exerceacutee par les facteurs eacutenonceacutes plus haut (4)

(1) Lhypothegravese de la preacutesence dallegraveles nuls lo est peu probable eacutetant donneacute le nombre de

loci preacutesentant un excegraves dhomozygotes

(2) Le pheacutenomegravene dautofeacutecondation nest pas agrave eacutecarter car des cas dhermaphrodisme

certes peu freacutequents ont deacutejagrave eacuteteacute rapporteacutes sur ce mecircme site (Neefs 1952) Leacuteventualiteacute que

les gegravenes impliqueacutes ne soient pas porteacutes par des chromosomes autosomaux na pas eacuteteacute veacuterifieacutee

(3) Les conditions dhydrodynamisme sexerccedilant sur cette zone peuvent ecirctre invoqueacutees pour

venir conforter la thegravese dun effet Wahlund (conseacutequence dun eacutechantillonnage effectueacute sur

deux sous-eacutechantillons dun mecircme site se comportant comme des populations Mendelliennes

seacutepareacutees)

(4) Une seacutelection exerceacutee par les conditions du milieu reste le)plication la plus probable

Cette influence des facteurs environnementaux comme la preacutesence de meacutetaux mentionneacutee

preacuteceacutedemment sexerce pendant la vie lalVaire peacutelagique mais surtout durant la phase critique

de la meacutetamorphose et les eacutetapes qui suivent le recrutement La meacutetamorphose chez les oursins

sulVient apregraves une peacuteriode variable de vie lalVaire pouvant durer selon les espegraveces et les

conditions entre 5 et 22 semaines (Strathmann 1987) ce qui expose les larves agrave de nombreux

aleacuteas Certains auteurs eacutevoquent limportance du recrutement comme facteur dheacuteteacuterogeacuteneacuteiteacute

geacuteneacutetique entre populations (Watts et al 1990) Or une eacutetude comparative des populations

des deux sites concerneacutes a montreacute une forte irreacutegulariteacute du recrutement dans la population de

Marloux par rapport agrave celle de la pointe de lAnnorique (Lumingas amp Guillou sous presse)

Ces auteurs imputent ce pheacutenomegravene au spectaculaire deacuteveloppement dalgues qui apparaicirct

IOallegravele nul (ou silencieux) est dit dun allegravele qui ne sexprime pas sur le gel

31

chaque anneacutee sur ce site agrave la faveur des apports fluviaux en eacuteleacutements nutritifs Dune part il

inhiberait laction attractive du maeumlrl dautre part la deacutecomposition de ces veacutegeacutetaux agrave

lautomne provoquerait la mortaliteacute des recrues en reacuteduisant la couche superficielle du seacutediment

et entraicircnerait le deacuteveloppement dun film bacteacuterien empecircchant 1a fixation des post~larves Le

site de la pointe de lArmorique semble au contraire avoir des recrutements reacuteguliers

Les groupes de recrues connaissent donc des destins diffeacuterents sur les deux sites ce qui

pourrait expliquer les diffeacuterences dheacuteteacuterozygotie observeacutees

Pour confirmer cette hypothegravese il conviendrait de comparer des eacutechantillons plus grands

dindividus de mecircme agravege correspondant agrave une peacuteriode ougrave le recrutement a eacuteteacute bon sur les deux

sites voire mecircme de comparer directement les geacutenotypes des jeunes individus recruteacutes dans les

deux sites Dautre part la comparaison du site de la pointe de lArmorique avec celui du

Dellec pourrait fournir des indications importantes pour confirmer lhypothegravese de lexistence

dune pression de seacutelection

V 1CONCLUSION

Leacutetude des phases de reproduction et deacuteveloppement larvaire des populations doursins de

la Rade de Brest met en eacutevidence des troubles fonctionnels chez les populations du bassin

Nord proches de la zone portuaire en particulier sur le site de la pointe de lArmorique qui

contraste avec les bons reacutesultats obtenus pour le site du Dellec sous influence oceacuteanique La

convergence des donneacutees de geacuteneacutetique avec les reacutesultats observeacutes confirme la validiteacute de la

meacutethode utiliseacutee et renforce la fiabiliteacute de Sgranularis comme bioindicateur

Les causes de ces deacuteregraveglements sont sans doute multiples aussi ce travail meacuterite-t-il un suivi

agrave plus long terme Leacuterude des diffeacuterents paramegravetres influenccedilant les conditions de vie des

oursins de la pointe de lArmorique (tempeacuterarure saliniteacute seacutedimentologie biomasse matiegravere

organique ) ainsi que des essais de transplantations in situ dindividus sains devraient

permettre de mieux preacuteciser les facteurs responsables de ces perturbations

Quant aux premiers reacutesultats danalyses des teneurs en meacutetaux lourds du Laboratoire

Municipal ils devraient ecirctre eacutetendus agrave dautres parties du corps (test intestin) et effectueacutes sur

un cycle annuel y compris sur le site des Gleacutenan

32

VI 1BffiLIOGRAPHIE

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38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

chaque anneacutee sur ce site agrave la faveur des apports fluviaux en eacuteleacutements nutritifs Dune part il

inhiberait laction attractive du maeumlrl dautre part la deacutecomposition de ces veacutegeacutetaux agrave

lautomne provoquerait la mortaliteacute des recrues en reacuteduisant la couche superficielle du seacutediment

et entraicircnerait le deacuteveloppement dun film bacteacuterien empecircchant 1a fixation des post~larves Le

site de la pointe de lArmorique semble au contraire avoir des recrutements reacuteguliers

Les groupes de recrues connaissent donc des destins diffeacuterents sur les deux sites ce qui

pourrait expliquer les diffeacuterences dheacuteteacuterozygotie observeacutees

Pour confirmer cette hypothegravese il conviendrait de comparer des eacutechantillons plus grands

dindividus de mecircme agravege correspondant agrave une peacuteriode ougrave le recrutement a eacuteteacute bon sur les deux

sites voire mecircme de comparer directement les geacutenotypes des jeunes individus recruteacutes dans les

deux sites Dautre part la comparaison du site de la pointe de lArmorique avec celui du

Dellec pourrait fournir des indications importantes pour confirmer lhypothegravese de lexistence

dune pression de seacutelection

V 1CONCLUSION

Leacutetude des phases de reproduction et deacuteveloppement larvaire des populations doursins de

la Rade de Brest met en eacutevidence des troubles fonctionnels chez les populations du bassin

Nord proches de la zone portuaire en particulier sur le site de la pointe de lArmorique qui

contraste avec les bons reacutesultats obtenus pour le site du Dellec sous influence oceacuteanique La

convergence des donneacutees de geacuteneacutetique avec les reacutesultats observeacutes confirme la validiteacute de la

meacutethode utiliseacutee et renforce la fiabiliteacute de Sgranularis comme bioindicateur

Les causes de ces deacuteregraveglements sont sans doute multiples aussi ce travail meacuterite-t-il un suivi

agrave plus long terme Leacuterude des diffeacuterents paramegravetres influenccedilant les conditions de vie des

oursins de la pointe de lArmorique (tempeacuterarure saliniteacute seacutedimentologie biomasse matiegravere

organique ) ainsi que des essais de transplantations in situ dindividus sains devraient

permettre de mieux preacuteciser les facteurs responsables de ces perturbations

Quant aux premiers reacutesultats danalyses des teneurs en meacutetaux lourds du Laboratoire

Municipal ils devraient ecirctre eacutetendus agrave dautres parties du corps (test intestin) et effectueacutes sur

un cycle annuel y compris sur le site des Gleacutenan

32

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38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

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38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

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38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

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38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

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bathyal Gastropod Bathybembyx bairdii ftfarine Biology 47 265-275

SlNGH S M GREEN RH (1984) Excess of allozyme homozygosity in marine molluscs

and its possible significance Malacologia 25 (2) 569-581

STARR M HIMMELMAN 1 H THERRIAULT 1 C (1993) Environmental control of

green sea urchin Strongylocentrotus droebachiensis spawnlng in the St Lavvrence Estuary

Canadian Journal ofFislteries and Aquatic Sciences vol 50 (5) 894-901

STATISTICAL GRAPHICS CORPORATION (1993) Statistieal graphics system referenee

manua~ STATGRAPHICS Version 7 Rockville USA Manugistics Ine

STEBBlNG A (1981) Hormesis - Stimulation of colony growth in Campanulariajlexuosa

(Hydrozoa) by Copper Cadmium and other toxicants Aquat Toicol 1 227-238

STRATIIMANN M (1987) Reproduction and development of maline Invertebrate of the

Northem Pacifie Coast Univ of Washington Press 592 (16) 511-534

SWOFFORD D L SELANDER R B (1981) BIOSYS - 1 - a FORTRAN program for the

comprehensive analysis of electrophoresis data in population genetics and systematics Journal

ofHeredity 72 282-283

TORTONESE E (1965) Fauna dItalia vol VI Ecltinodermata ed Calderine Bolognia

Italla

TRIEFF N M CIPOLLARO M CORSALE G ESPOSITO A RAGUCCI E

GIORDANO G RAMANUJAM S v LIVINGSTONE D R PAGANO G (1988)

Aroc1or 1254 toxicity in sea urchin embryos and gametes Exp Oneol (Life Science Adv)

7 57-64

37

WATTS R 1 JOHNSON M S BLACK R (1990) Effects of recruitment on genetic

patchiness in the urchin Echinometra mathaei in Western Australia il1arine Biology 105

145-151

WEIR B S COCKERHAM C C (1984) Estimating F-statistics for the analysis of

population structure Evolution 38 (6) 1358-1370

WORKMAN P L NISWANDER J D (1970) Population studies on Southwestern indian

tribes II Local genetic differenciation in the Papago American journal of Human Genetics

2224-49

VRIGIIT S (1965) The interpretation of population structure by F-statistics with special

regard to system ofmating Evolution 19395-420

YOUNG L NELSON L (1974) The effects of heavy metals ions on the motility of sea

urchins spennatozoa Biol Bllll 147 236-246

38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

SEMROUD R SENOUSSI Y (1989) Donneacutees preacuteliminaires sur lindice de reacutepleacutetion

lindice gonadique et le sex ratio de Sphaerechinus granularis Vie marine HS 10 86-94

SHAW C R PRAS AD R (1970) Starch gel electrophoresis of Enzymes - a compilation of

recipes Bioehemical geneties 4 297-320

SIEBENALLER 1 F (1978) Genetic variation in deep sea invertebrate populations the

bathyal Gastropod Bathybembyx bairdii ftfarine Biology 47 265-275

SlNGH S M GREEN RH (1984) Excess of allozyme homozygosity in marine molluscs

and its possible significance Malacologia 25 (2) 569-581

STARR M HIMMELMAN 1 H THERRIAULT 1 C (1993) Environmental control of

green sea urchin Strongylocentrotus droebachiensis spawnlng in the St Lavvrence Estuary

Canadian Journal ofFislteries and Aquatic Sciences vol 50 (5) 894-901

STATISTICAL GRAPHICS CORPORATION (1993) Statistieal graphics system referenee

manua~ STATGRAPHICS Version 7 Rockville USA Manugistics Ine

STEBBlNG A (1981) Hormesis - Stimulation of colony growth in Campanulariajlexuosa

(Hydrozoa) by Copper Cadmium and other toxicants Aquat Toicol 1 227-238

STRATIIMANN M (1987) Reproduction and development of maline Invertebrate of the

Northem Pacifie Coast Univ of Washington Press 592 (16) 511-534

SWOFFORD D L SELANDER R B (1981) BIOSYS - 1 - a FORTRAN program for the

comprehensive analysis of electrophoresis data in population genetics and systematics Journal

ofHeredity 72 282-283

TORTONESE E (1965) Fauna dItalia vol VI Ecltinodermata ed Calderine Bolognia

Italla

TRIEFF N M CIPOLLARO M CORSALE G ESPOSITO A RAGUCCI E

GIORDANO G RAMANUJAM S v LIVINGSTONE D R PAGANO G (1988)

Aroc1or 1254 toxicity in sea urchin embryos and gametes Exp Oneol (Life Science Adv)

7 57-64

37

WATTS R 1 JOHNSON M S BLACK R (1990) Effects of recruitment on genetic

patchiness in the urchin Echinometra mathaei in Western Australia il1arine Biology 105

145-151

WEIR B S COCKERHAM C C (1984) Estimating F-statistics for the analysis of

population structure Evolution 38 (6) 1358-1370

WORKMAN P L NISWANDER J D (1970) Population studies on Southwestern indian

tribes II Local genetic differenciation in the Papago American journal of Human Genetics

2224-49

VRIGIIT S (1965) The interpretation of population structure by F-statistics with special

regard to system ofmating Evolution 19395-420

YOUNG L NELSON L (1974) The effects of heavy metals ions on the motility of sea

urchins spennatozoa Biol Bllll 147 236-246

38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

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~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

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(1)

)OllS

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(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

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tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

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01

00006

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Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

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002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

WATTS R 1 JOHNSON M S BLACK R (1990) Effects of recruitment on genetic

patchiness in the urchin Echinometra mathaei in Western Australia il1arine Biology 105

145-151

WEIR B S COCKERHAM C C (1984) Estimating F-statistics for the analysis of

population structure Evolution 38 (6) 1358-1370

WORKMAN P L NISWANDER J D (1970) Population studies on Southwestern indian

tribes II Local genetic differenciation in the Papago American journal of Human Genetics

2224-49

VRIGIIT S (1965) The interpretation of population structure by F-statistics with special

regard to system ofmating Evolution 19395-420

YOUNG L NELSON L (1974) The effects of heavy metals ions on the motility of sea

urchins spennatozoa Biol Bllll 147 236-246

38

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

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Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

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dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

ANNEXEI

SCHEIHA DU PROTOCOLE EXPERThlENTAL DES TESTS DE FECONDATION IN VITRO

oursin9 gonades

~ eau ae mer 1iltreacutee (045I-lm)

soies (200l-lm)

Dfiltration

eau de mer filtreacutee (045I-lm)

deacutecantation ovocytes

oursin ltJ ---+ gonades -

filtration soies (60~m) ~

D~

middot middot middot middot

30 ml bd

lavages et dilutions

1 1 1 1 1 1

bull bull bull bull bullbull ~

~~~ ~

env 1500 ovocytesml

m~ 1

env 50 ovocytesml

39

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

AtlNEXE II

ELECTROPHORESE

Installation des eacutechantillons

a coupe pratiqueacutee dans le gel b eacutechantillons

Montage du circuit

a tampon deacutelectrodes b eacuteponges c eacutelectrodes relieacutees au geacuteneacuterateur d ligne dinsertion des eacutechantillons

40

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

middotmiddot-middotmiddot~IImiddot middotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddot-middot --middotmiddot--shy - ------------_- ----------11 t-middot

10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

~ ~ ~ ~ 3 5 = 3 -~ shy

~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

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01

00006

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Chromo

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01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

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Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

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0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

ANNEXEIll

PREPARATION DES SOLUfIONS DELECTROPHORESE

Tampon Tris Citrate pH 8 (TC 8)

- Electrodes Tris (062M) 756 g

Ac citrique (014M) 300 g eau distilleacutee qsp 1 l

- Gel 30 ml de tampon eacutelectrodes dans 900 ml deau distilleacutee

ajuster agrave pH 8 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Tampon discontinu Tris Citrate pH 67 (TC 67)

- Electrodes pH 63 Tris (022M) 270 g

Ac citrique (008M) 180 g eau distilleacutee q sp 1 1

ajuster agrave pH 63 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM) - Gel pH 67

Tris (0008M) 097 g Ac citrique H20 (0003M) 063 g

eau distilleacutee qsp 1 1 ajuster agrave pH 67 avec du Tris (lM) ou de lacide citrique (lM)

Reacutesolution obtenue par systegraveme enzymatique

Muscle Tube Digestif Gonades Nbre Locus TCPH8 TC pH TC pH 8 1 TC pH li TC pH 8 1 TC pH dallegraveles

67 67 1 67

AAT-1 +

AAT-2 + 2

GPD-l IDH-1 + + + +

LAP-1

l1DH-1 ++ )

l1DH-2 +++ ++ 2 ME-l + 2 ME-2 + ++ 3

PGD-1 ++ + 6 PGI-1 +_

- ++ ++ 4

PGM-1 + + 3 PGM-2 +++ ++ 4

bull Faible ++ Bonne + Moyenne +++ Tregraves bonne

41

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

16 +--- ---------- --__--shy

15 --- -- ---- - --- middot - middot-middotmiddot-middotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot_-middot-middot -middotmiddotmiddotmiddot-middot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot middotTt~hl~ - ------ Ecirc 14 - - -- --------- ---middot---middot-middotmiddot-middot-middot-trrfo-r~~wbWljl~I~~~--------------t-------------iiiiJiI~i~L--_-----------------------8 12 YrljVWfAI--shy --shy - shy _-----------------------------

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10 ~~--shy --- ----_-- - -- - - ------------_-

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~ ~ = ~ ~ ~ 7 ~ 7 7 ~ ~ lt lt jf ~ r- ~ C t- C ~ oA C 0 0 0 0 ~ shy0 0 N

~

Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

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EltlU ltIll Ilwr (111]1)

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Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

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15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

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I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

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CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

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002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

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Zinc

6- 10 mg

35

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100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

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Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

ANNEXE IV

SOLUTIONS DE COLORATIONS

AAT (Aspartate-aminotransfeacuterase)

Tris A 80 ml AccxCeacutetoGlutarique 100 mg Ac Aspartique 200 mg Phosphate de pyridoxal 10 mg dissoudre veacuterifier que pH lt 74 (ajuster avec Tris LM) verser et incuber agrave 37degC pendant 15 min puis ajouter Fast Blue BB 100 mg

IDH (Isocitrate deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 70 ml Isocitrate (0 lM) 8 ml MnCl2 (025M) 06 ml MgC12 (OSM) 05 ml ajouter avant coloration Isocitrate (poudre) 10 mg NADP 1 2 ml PMS 1 ml NET 1 ml lvITT 05 ml

MDH (Malate Deacuteshydrogeacutenase)

Tris A 10 ml MgCl2 (OSM) 02 ml Ac Malique (2M) 3 ml NAD 1 15 ml puis ajouter avant coloration PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

6PGD (6Phosphogluconate Deacuteshydrogeacutenase)

TrisA 10 ml MgC12 (OSM) 15 ml 6Phosphogluconate 20 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 01 ml NET 02 ml tvm 02 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

GPI (Glucose-Phosphate Isomeacuterase)

Tris A 10 ml MgC12 (O5Ivi) 1 ml Fructose 6P 10 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml MTT 05 ml G6PDH 6~Ll ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

LAP (Leucine-aminopeptidase)

Tris-Malate 90 ml preacutechauffeacute agrave 30degC MnCl2 (01r1) 1 ml MgCl2 (05lvf) 1 ml Lleucilj3Naphthylamine 15 agrave 20 mg incubation 30 min agrave 37degC ajouter avant coloration Fast Gamet GBC 60 mg dilueacute dans quelques gouttes de Tris-Malate (manipuler ce produit avec des gants)

ME (Malice-Enzyme)

Tris A 10 ml MgCl2 (O5~1) 15 ml AcMalique (2tv1) 1 ml puis ajouter avant coloration NADP 1 01 ml PMS 03 ml NET 07 ml MTT 07 ml +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

PGM (phosphoglucoMutase)

Tris A 10 ml MgCl2 (05)11) 1 ml Glucose IP (+15 diP) 100 mg puis ajouter avant coloration NADP 1 05 ml PMS 05 ml NET 05 ml lvITT 05 ml G6PDH 6~1l ou 17u +Agar dans Tris A tiegravede 10 ml

42

9

----- - - - _----- - -

W~--shy

ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

17 T middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot_middotmiddotmiddotmiddot-middot-middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middot--middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot-middotmiddot--- - -- ----_--- -- - shy

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Tempeacutelllture il linterfue eau-seacutediment il la pointe de lAnnorique

11 ~ li ~ ~ ~ ~ ~ of j ~ ~ i ~ f N M ~ M ecirc ~ M

(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

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dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

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01

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Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

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er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

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O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

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0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

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Seacuteleacutenium

3

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02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

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100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

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fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

9

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ANNEXEV

Tempeacutelllture il linterface eaumiddotseacutediment au site du Dlilec

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(donneacutees LR-i CvRS D1513 Faculteacute des Sciences Brest)

43

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

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EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

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1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

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Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

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004

01 middot10

Plomb

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28-6 (huicirctre)

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O3-G

Seacuteleacutenium

3

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02-01

Zinc

6- 10 mg

35

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100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

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Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

ANNEXEVI

TENEURS EN QUELQUES METAUX LOURS DANS LES GONADES DOURSINS DE LA RADE DE BREST

1Armorique (n=7) lIurloux (n=8) Deliee (n=8) 1

Fer (Fe) mgfKg 2869plusmn141O 531plusmn438 410plusmn250 1

lt 02Plomb (Pb) mgfKg O75plusmnO24 026plusmnO18

Cuivre (Cu) mgfKg O76plusmnO33 030plusmnO Il 045plusmnO42

Cadmium (Cd) mgIKg 396plusmnO55464plusmn125 463+12

Zinc (Zn) mgfKg 3563plusmn2828 1811=1241 1528plusmn1506 i

1

Mercure (Hg) mgfKg 026plusmnO12 018plusmnO08 020plusmnO13 1

(donneacutees Laboratoire lvllmicipal de Brest 16 rue Alexandre Ribot - J928iuml BREST Cedex Ofi0894)

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

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adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

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15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

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100 Illoi

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025 15 (11111 l 1 IcircIl )

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VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

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Cuivre

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25 fi sont IllOrlel

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0003-001

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GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

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Seacuteleacutenium

3

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6- 10 mg

35

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122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

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Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

ANNEXE VII

Agents toxiques essayeacutes pour leur toxiciteacute sur le deacuteveloppement la reproduction

et pour leur toxiciteacute geacuteneacutetique sur les embryons et le sperme doursins

(dapregraves PAGAl~O et al 1987)

Classe d aogents___+-____Agent=-s____~r__---Reacute~feacuterences___--1

1 Agents Physiques Rayons X RUST AD 1959 Rayons r GIORDANO et al 1983 Lumiegravere visible PAUL et al 1970

SPECK et al 1980

II Agents chimiques A Inorganiques Arsenic PAGANO et al 1982a

Beacuteryllium GIORDAlIO et al 1983 Cadmium PAGANO et al 1982b Chrome PAGA1-iO et al 1983a Cuivre HESLINGA 1976

PAGANO et al 1986 Mercure KOBA YASHI 1980 Nickel GIORDANO et al 1982 Changements de pH PAGANO et al 1985a 1985b

CIPPOLARO et al 1986 DUBE et al 1985

Zinc GIORDANO et al 1983 PAGANO et al 1986

B 1 Organiques 1 - Polluants industriels Peacutetrole dispersants du peacutetrole HAGSTROM et LONNING 1976

Pesticides organochloreacutes FALK-PETERSEN1979 BRESCH-ARENDT 1977

Styregravene et deacuteriveacutes PAGANO et al 1978 Dipheacuteny1 dipheacutenyl ether PAGANO et al 1983b PCBs ADAMS 1983

PAGANO et al 1985c

2 - Canceacuterigegravenes Acridines BRACHET 1968 Benzo(a)pyregravenes DE ANGELIS et GIORDANO

1974 HOSE et al 1983

712 dimeacutethy1benz( a)anthracegravene DE ANGELIS et GIORDkIO 1974

TPA (phorbol ester) BRESCH--RENDT 1978 Urethane NAKASHIMA et ISHIKAWA

1978 3 - Composeacutes pharmaceutiques Agents antineacuteop1astiques REN1llLARD et al 1975

WANG et al 1977 Thalidomide HAGSTROM et LONNING 1973 Acide nalidixique CZ1TN etaI 1981 Povidone iodine ROZENKRANZ et al 1980

III Meacutelanges KOBAYASHl 1971 1984 KINAE et al 1981 OSHIDA et al 1981 DINNEL et al 1981

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

Ooso quotishydienne

Il eacutecossai ro fi lhomme

(ell IlIl)

Dose toxique

pOUf lIl(Hl li)] Il

(1)

)OllS

adIJ1ilUuml

dan~ 1es al ililUlllS

(1l1Uk~raquo

EltlU ltIll Ilwr (111]1)

AlrJucs (lilgkJ )

Mollusques (IlIUkg)

Cfuslncocircs (11111111)

Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

0002-0001

014-1

7 -120

15 17 (rwvolln)

25-75 (oOndill)

LI ore

100 Illoi

I(i

04-20

1 (moulu)

025 15 (11111 l 1 IcircIl )

020

tilJlcilU sont les plus

CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

f()i~5()1l

1 Molluoque

rshy1

01

00006

01 i-3

Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

000005

002 -1

er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

----_

O02G-O2

004

01 middot10

Plomb

moi

0000 03

05 9

28-6 (huicirctre)

~- ----shy01-23

(tHlllllnrl)

O3-G

Seacuteleacutenium

3

000009

02-01

Zinc

6- 10 mg

35

0001-001

il2-Hi)

100-1 GOO (lIl1illO)

122-18 1 (1Il1IrlllI)

02middot1 200 (llilrell~1 )

---------- ----shy

fi (JIIIIUIIIaS

Les doses admissibles dilfl~ les aliments sonl exprillleacutees en millilrammes par kilogramme daliment

Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

LES MEacuteTAUX LOURDS DES PRODUITS MAnlNS AUX CONSOMMATEURS

(Les v(Jlours m6us uang ce

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Mollusques (IlIUkg)

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Poissons (muka)

Arsenic

001 ~O 02 mg

III 70 1119 1 SOllt mOrlols

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25-75 (oOndill)

LI ore

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025 15 (11111 l 1 IcircIl )

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CildmIcircUIll

30 mu so1l1 toxiquuumls

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01

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Chromo

VI WO Ill) Cr ~()Ilt IIHHlelr

01

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er1llllent rellcontreacutees dlIls les publications ctuel

Cuivre

2 mg

25 fi sont IllOrlel

Poisson li

Mollusqull 110

0003-001

17-124

GO-900 (Iluitru)

20-90 (convoi)

l5-G (1 lion)

Mercure

Poisson jusqul 07

0000 03

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O3-G

Seacuteleacutenium

3

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6- 10 mg

35

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02middot1 200 (llilrell~1 )

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Les concclltrations daJis les produits rnHIcirclls sont (ouloS oxprilllUcircfS CIl lllilliJtallHllCS pM kilonriltlHlw do Illnliegravero segravecho

Chnque (ois qlll cela a ugravet possillln on il if)diqur~ entre p1fef)lhegravesos dnns qllJllc csplco nvait ocirctri trouveacutee ln plus (orte dosn

(1) [n CilS diumlnDntioll Cil IIlle scule (ois (SOllfce Rapport du Groupe Irleflilinisteacuterid des prohl~llIes de Pollution de la Mer 1(73)

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

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Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (

EXTRAITS DE lA CIRCUlAIRE DU 13 MAl 1991

Circulaire du Ministegravere de lEnvironnement creacuteant les contrats de baie

Les eaux inorales franccedilaises doivent se situer en permanence agrave un niveau de qualiteacute suffisant pour ne pas mettre en peacuteril les eacutecosystegravemes cocirctiers qui constituent un eacuteleacutement majeur du patrimoine eacutecologique national ()

Lapproche retenue rient compte de la diversiteacute et de la complexiteacute des situations rencontreacutees ie long des cocirctes franccedilaises Certains SeCIeurs son principalement affecteacutes par des pollutions chimiques (meacutetaux etou composeacutes organiques ( )

De plus les pheacutenoTregravenes regroupeacutes sous une mecircme appeiation (egraveystrophies marines par exemple) reacutesJltent r jait de meacutecanismes diffeacuterents dont les c1uses et les facteurs de maitrise dofent ecirctre deacutetermineacutes dans chaque cas particJpr afin decirctre certain de mettre en oeuvre au plus juste coucirct des remegravedes efficaces ( j

n apparaft au corraire que pour chaque secteur C littorc oi une action est neacutecessaire a soluor adeacutequate ne peut ecirctre trouveacutee cu au niveat loca~ en associant tous les resporsables co-erneacutes Un outil nouveau est proposeacute le Contrat de Baie dont linitiative peut br= prise par lEtat mais aussi par dautrs acteurs (collectiviteacutes locales cssociatiors rotamment) ()

Chaque Cartrat de 3aie doit correspondre agrave une uniteacute middot-orale rmogegravene ()

Puisque la lutte ccr-se la pollution des eaux littorales ne peut ecircrr= efficace que par la prise

en compte des apports de Jensemble du bassin versant le Contrat de Baie doit ecirctre eacutelaboreacute agrave ce niveau

Pour eacuteviter ces eacutecueils tout Contrat de Baie devra reposer sur une connaissance aussi preacutecise que possible

bull de lensemble des sources de poiJution affectant le secteur rejets coners (ponctuels ou diffus) apports par les cours deau immersions de deacuteblais de dragage etc

bull des meacutecanismes de transfert des pollutions au milieu marin

bull des caracteacuteristiques du milieu reacutecepteur (morphologie courants caracteacuteris-tiques hvdrochimiques et biologiques)

bull des USIlges agrave proteacuteger et des zones sensibles du point de vue eacutecologique

Puisque lameacutelioration de la qualiteacute des eaux dun secteur du littoral implique de deacutefinir un programme concernant lensemble du bassin versant la maicirctrise douvrage de leacutetude ne pourra en geacuteneacuteral ecirctre confieacutee qu acirc une collectiviteacute locale de niveau supra shycommunal ()

L finaii du Contrat de Baie est dinciter les divers panenaires concerneacutes en particuer es coliegrave-ivieacutes locales agrave deacutepasser le cadre des scheacutemas classiques dassainissement dans tcs les cas c des dispositions speacutecifiques doivent ecirctre prises pour restaurer la qualiteacute des eaux (