2008 / 2009

RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

Laboratoire de génétique et amélioration des plantes, Département de Biologie, Faculté

des sciences,

Université d'Oran, Es-Senia

Mémoire

Présenté pour l'obtention du titre de Magister

Mention : Amélioration des plantes

Par : Mr SAADA Ahmed

Identification cytogénétique d'espèces annuelles

du genre Medicago par les techniques de

coloration au Feulgen et au Giemsa

Membres de jury

Président : Pr. AOUES.A Professeur, université d'Oran.

Rapporteur : Pr. FYAD LAMECHE F/Z Professeur, université d'Oran.

Examinateurs : Pr. SLIMANI. M Professeur, université d'Oran

Dr. ISSOLAH. R Maitre de recherches, l'INRAA (Alger)

Dr. MESLI, F Maitre de conférences université d'Oran.

REMERCIEMENTS

Tout d'abord je tiens à exprimer mes profonds remerciements au Pr FYAD LAMECHE F/Z

de m'avoir accueilli dans son laboratoire, pour son encadrement scientifique, pour la confiance

qu'elle m'a donnée durant ces années, pour sa participation active dans mon travail et

surtout pour tous les à-côtés qui rendent la vie de Thésard encore plus agréable.

Un grand merci au Pr AOUES A d'avoir accepté de présider le Jury.

Je suis très reconnaissant au Dr ISSOLAH R, pour ses conseils et d'avoir accepté de

participer à ce jury.

Je tiens aussi à remercier Pr SLIMANI M et Dr MESLI TALEB BENDIAB F d'avoir accepté de

faire partie de ce jury.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à LACHEHEB F, pour ses aides précieuses dès

les premiers instants, pour sa gentillesse et sa disponibilité, qui, tout au long de ce travail

m'a apporté et servi et m'a consacré de nombreuses discussions sur le sujet, merci beaucoup

Fairouz.

Que le Pr KARAM N, trouve ici l'expression de ma profonde reconnaissance, pour ses accueils

chaleureux qu’il m'a réservés dans son laboratoire pour faire mes observations.

microscopiques.

Un super grand merci au Pr TOUHAMI H qui m'a bien accueilli dans son laboratoire ou j'ai

réalisé mon premier stage en cytogénétique. Ce fut une expérience enrichissante autant sur le

plan scientifique qu’humain.

Merci aussi à Mr YAHIA N, Mr ABD EREZZAK L et Mr SAADALLAH M pour leurs conseils et

encouragements.

Je voudrais encore remercier Mr CHAHROUR F et Mme CHAHROUR S d'avoir été à

mes cotés durant mon cursus d'études surtout pour leur gentillesse.

Je suis très reconnaissant à mon ami et collègue Mr MEDDAH M A, qui m'a beaucoup aidé

afin de réaliser mon projet.

Un grand merci également à mon collègue Mr BAKHTI N pour l'utilisation de son Appareil Photo.

RESUME

La cytogénétique de part sa nature investigatrice participe d'une manière importante

aux études de taxonomie et de phylogénie. Les techniques classiques qui permettent une vision

morphologique de la cellule en métaphase ont rendu possible le dénombrement des

chromosomes et l'établissement des caryotypes. L'apparition par la suite des techniques de

marquage chromosomiques ouvre de nouvelles et larges perspectives et leur application a permis

de dépasser l'approche cytologique classique et d'apporter des précisions et des réponses à des

problèmes d'ordre systématique et évolutif à tous les niveaux taxonomiques.

Notre étude a porté sur 9 espèces annuelles du genre Medicago d’origine différentes

fournies par I.C.A.R.D.A et une espèce locale récoltée dans la région de Tizi-Ouzou. Dans un

premier lieu, les 9 espèces ont été traitées par le protocole de Feulgen afin de déterminer le

nombre chromosomique et d'établir leurs caryotypes respectifs, en suite nous avons exploré

les chromosomes de l’espèce d’origine locale à l'aide de la technique de banding C pour discuter

sur l'emplacement et la quantité d'hétérochromatine constitutive. Nos résultats concordent avec

ceux obtenus par plusieurs auteurs et confirment que les espèces étudiées présentent un

nombre chromosomique diploïde (2n =14 ou 16). Concernant la technique de bandes C, l'espèce

étudiée montre un polymorphisme au niveau des bandes hétérochromatiques localisées sur ses

chromosomes.

Mots clés ; Medicago, cytogénétique, caryotype, bandes C, chromosome.

1

SOMMAIRE

INTRODUCTION .................................................................................................................................. 1

CHAPITRE I : GENERALIT~SUR LE GENRE MEDICAGO .................................................... 5

1. Historique et origine géographique du genre Medicago ............................................................ 5

2. Place du genre Medicago dans le règne végétal……………………………………………...6

2. 1. Caractères botaniques du genre Medicago………………………………………………………………….6

2. 2. Place dans la classification…………………………………………………………………………..7

2. 3. Biologie de la reproduction ………………………………………………………………………….7

3. Intérêts agronomique, économique et zootechnique du genre Medicago……………………….8

5. Diversité génétique et variabilité morphologique dans le genre Medicago ……………………11

6. Problèmes taxonomiques dans le genre Medicago ........................................................................... 13

7. Description de quelques espèces annuelles du genre Medicago .......................................................... 16

8. Amélioration dans le genre Medicago 23

CHAPITRE II : NOTIONS DE CYTOGENETIQUE

1. La mitose somatique ............................................................................................................................ 24

2. Quelques notions caryologiques ......................................................................................................... 24

2. 1. Les chromosomes ............................................................................................................................. 25

2. 2. L'état ploïdique du noyau ............................................................................................................... 27

3. Etude bibliographique sur les techniques de banding en cytogénétique .................................... 28

3. 1- Technique de bandes Q (ou technique de fluorescence) ................................................................ 29

3. 2- Les techniques de bandes par coloration au Giemsa ………………………………………………29

30 31

31

3.2.4. Les bandes N .................................................................................................................................. 32

3. 2. 5. Les bandes C ................................................................................................................................. 32

3. 3. Dénaturation, renaturation de l'ADN et bandes C ........................................................................... 33

a- Hypothèse privilégiant le rôle de l ADN répétitif ........................................................................ 33

b- Hypothèse privilégiant l'interaction ADN protéines .................................................................. 35

c -Hypothèse privilégiant une condensation différentielle de la chromatine : ............................. 36

3. 4. Les techniques qui colorent les organisateurs nucléolaires (NOR) : ............................................... 37

4. La cytogénétique moléculaire .............................................................................................................. 38

CHAPITRE III : CYTOGENETIQUE DU GENRE MEDICAGO .....................................

I. Données taxogénétiques sur le genre Medicago ................................................................................ 41

II. Polymorphisme hétérochromatique ................................................................................................. 42

III. Relations phylogénétiques entre les espèces du genre Medicago ................................................ 43

IV. Les bandes C dans le genre Medicago .............................................................................................. 45

V. Le chromosome B dans le genre Medicago ........................................................................................ 46

3. 2. 1 Les bandes G……………………………………………………………30

3. 2. 2. Les bandes R………………………………………………………………………….

3. 2.3 Les bandes T .......................................................................................................................

1

h. Coloration………………………………………………………………………. 55

B. 3. Etablissement de caryotypes…………………………………………………… 55

SOMMAIRE

CHAPITRE IV : MATERIEL ET METHODES A. Matériel……………………………………………………………………………….. 50 B. Méthodes………………………………………………………………………… 51 B. 1 Technique de Feulgen……………………………………………………….. 51

a. Germination………………………………………………………………….. 51

b. Prétraitement............................................................................................................ 51

c. Le stockage ...................................................................................................................... 51

d. L'hydrolyse ............................................................................................................................... 52

e. Macération enzymatique .................................................................................................... 52

f. La coloration ........................................................................................................ 52

g. Ecrasement, observation .................................................................... 52

B 2. Technique de bandes C ................................................................................................................ 54

d. L’hydrolyse ........................................................................................................................... 54 e. Ecrasement, délamellage, séchag54 f. Dénaturation …………………... 54

g. Renaturation ……………………………………………………………………. .54

CHAPITRE V : RESULTATS……………………………………………………………… 57

I. Technique de Feulgen …………………………………………………………………….. 57

I. 1. Dénombrement chromosomique et établissement de caryotypes ……………………… 57

I. 2. Morphologie des chromosomes………………………………………………………… 59

1. 3. Discussion......................................................................................................................................................

I. 4. Conclusion……………………………………………………………………………… 60

II. Les bandes C……………………………………………………………………………… 60

II. 1. Dénombrement chromosomique ………………………………………………………. 61

II. 2. Morphologie des chromosomes et analyse des bandes hétérochromatiques 61

.II. 3. Discussion ………………………………………………………………...63

II. 4. Conclusion……………………………………………………………………………… 64

III. Discussion générale……………………………………………………………………….64

IV. Conclusion générale et perspectives

BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………… .78

ANNEXE……………………………………………………………………………………. 86

1

Liste des tableaux

Tableau 1 : Valeurs des aliments en matières azotées et acides aminés (ABAFOUR, 1961).

Tableau 2 : Azote fixé par an et par hectare chez certaines cultures de légumineuses (Burns

et Hardy, 1975 ; citées par Bekki, 1983).

Tableau 3 : les minéraux et les oligo-éléments que contient la luzerne.

Tableau 4 : Code des techniques de marquage chromosomique (Paris Conférence l971,

supplément, 1975).

Tableau 5 : Hybridations interspécifiques réalisées dans le genre Medicago entre espèces

annuelles (d'après Quitus et Bauchan (1988)

Tableau 6 : les différentes espèces annuelles du genre Medicago étudiées.

1

Liste des figures

Figure 1 : Plante de Medicago polymorpha. 5

Figure 2 : Schéma d'un chromosome. 27

Figure 3 : Principe de la technique 'Fish. 40

Figure 4 : Plaques métaphasiques obtenues par la technique de Feulgen sur les espèces : 67

M. rotata (4199), M. rotata (726) et M. rotata (726).

Figure 5 : Plaques métaphasiques obtenues par la technique de Feulgen sur les espèces 68

MM laciniata (674), MM radiata (4198) et MM noeana (2608).

Figure 6 : Plaques métaphasiques obtenues par la technique de Feulgen sur les espèces : 69

M. rigidula (725), M. truncatula (673), MM orbicularis (736) et M. intertexta

(3084).

Figure 7 : Plaques métaphasiques obtenues par la technique de Feulgen sur l'espèce : 0

M. polymorpha (3032, 3907 et 3930).

Figure 8 : Caryotype de M noeana. 71

Figure 9 : Caryotype de M.radiata (4198). 72

Figure 10 : Caryotype de M.orbicularis (736). 73

Figure 11 : Caryotype de M. rotata (726) 74

Figure 12 : Caryotype de M. polymorpha (3930). 75

Figure 13 : Caryotype de M. rotala (726). 76

1

Figure 14 : Caryotype de M. ciliaris. (Banding C). 77

Introduction

La cytogénétique fait le lien entre la cytologie et la génétique. Les premiers travaux chez

les végétaux ont débuté au cours de la seconde moitié du 19èm siècle mais c’est surtout à

partir de 1920 que la cytogénétique s’est développée et son importance n’a cessé de croître

par la suite.

C’est d’abord une science d’investigation. Elle a pris une part active à la

compréhension des mécanismes héréditaires et du monde végétal dans sa diversité

(taxonomie, phylogénie). La cytogénétique est une des nombreuses disciplines sur lesquelles

s’appuie l’amélioration des plantes. Elle se situe avant tout en amont de la sélection. Elle

participe à :

- la connaissance du matériel végétal utilisé : nombre de chromosomes, (polyploïdie,

allo ploïdie...).

- l'établissement de cartes génétiques grâce à la production et l'étude d'aneuploïdes

(lignées monosomiques, télosomiques, lignées d'addition...).

- l'exploitation de la variabilité intraspécifique, interspécifique ou induite.

L'expérience montre que les outils de la cytogénétique sont indispensables à une

exploitation rationnelle des hybrides interspécifiques. Par ailleurs, la cytogénétique a trouvé

un nouveau domaine d'application dans l'étude et l'utilisation des produits issus « de culture in

vitro » (hybrides somatiques, variants somaclonaux...).

La cytogénétique peut être impliquée au niveau même de la création variétale en

participant à l'explication et la résolution de problèmes ponctuels rencontrés par les

sélectionneurs : instabilité, stérilité...

En Cytogénétique, un important effort de développement, a été consentit, ces dernières

années pour l’améliorer. Des laboratoires spécialisés, ont élaboré des techniques permettant

une résolution poussée de l’analyse cytogénétique : on peut citer les techniques de bandes

simples et celles de super banding qui sont utilisées en clinique ainsi que dans le domaine de

1

l’amélioration des plantes.

Les études caryologiques jouent un rôle prépondérant dans les recherches

biosystématiques en vue de la compréhension des relations phylogénétiques et des processus

de spécialisation ( Stebbins, 1971 ; Grant, 1986). Mais, leur développement est étroitement lié

à l’évolution des techniques de marquages des chromosomes.

Les techniques classiques, qui permettent une vision morphologique de la cellule en

métaphase, ont rendu possible le dénombrement des chromosomes et l’établissement des

caryotypes (Darlington et La Cour, 1940).

Cependant l’utilisation de ces techniques est limitée par la complexité de leurs

protocoles d’application, la nécessité de les adapter à chaque espèce et le faible taux de la

répétitivité q’elles présentent, quelquefois, pour un même taxon. Autant de causes d’erreurs

dans le comptage des chromosomes et la composition des caryotypes ( Sybenga, 1959).

Après avoir épuisé les possibilités des techniques classiques, les chercheurs se

retrouvèrent dans une impasse. Ils n’en sortiront qu’a la fin des années 60, avec l’apparition

des techniques de bandes qui leur ouvrirent de nouvelles et larges perspectives. Ce sont les

techniques de fluorescence (utilisant les fluorochromes) et les techniques de bandes (utilisant

le mélange Giemsa), qui induisent une coloration différentielle des chromosomes. Chaque

modèle de bandes produit un marquage spécifique et constant sur un même chromosome et

révèle, de surcroît, la nature du matériel chromosomique induisant ce marquage.

Chez les végétaux, l’application des techniques de bandes a permis de dépasser

l’approche cytologique classique et d’apporter des précisions et des réponses à des problèmes

d’ordre systématique et évolutif à tous les niveaux taxonomiques (Bennett, 1984 ; Fukuda,

1984).

Des résultats positifs ont été obtenus, grâce aux techniques de bandes, dans les créneaux

suivants :

- la recherche de microdifférenciations permettant une identification plus sure des

chromosomes ;

- la mise en évidence des anomalies structurales ;

- la connaissance de la structure profonde du chromosome, afin de mieux connaître la

disposition et le rôle des différentes molécules le constituant (ADN, histones, protéines

acides, etc.…) et de progresser dans le déchiffrage du code (sans doute universel) qui

commande l’élaboration, la conservation et la transmission de l’information génétique.

Ceci a permis de préciser certains problèmes liés à :

- la détermination des liens phylogénétiques entre les espèces ;

1

- l’étude des variations génétiques en rapport avec la spéciation.

Le genre Medicago, légumineuse de la famille des Fabacées, constitue un groupe

taxonomique largement distribué dont les centres de diversification recouvrent le pourtour

méditerranéen et l’Eurasie. Il comporte un grand nombre d’espèces annuelles et pérennes

depuis fort longtemps comme d’excellents fourrages.

Le genre Medicago regroupe une centaine d’espèces dont une vingtaine, typiquement

méditerranéennes.

Parmi les 20 espèces recensées en Afrique du Nord, 16 sont largement distribuées en

Algérie dans des étages bioclimatiques variés. Elles présentent un important potentiel

agropastoral notamment dans les zones steppiques arides ou semi-arides. Comme

légumineuses, leur intérêt agronomique est connu depuis longtemps.

Parmi d’autres avantages que présentent les espèces de Medicago, on peut citer

l’amélioration de fertilité des sols grâce à leur association symbiotique avec Rhizobium

meliloti, bactérie fixatrice d’azote atmosphérique.

Le genre Medicago a fait l’objet de nombreuses études systématiques, basées

essentiellement sur la morphologie de la gousse et de la feuille.

Les analyses caryologiques des espèces du genre Medicago ont également retenue

l’attention de nombreux auteurs afin de préciser la position systématique et phylogénétique de

certains taxons (Lesins et Gilles, 1972). Hossain et bauchan (1998) sont les premiers qui ont

pu vérifier l’existence de chromosomes B dans le genre Medicago (aneuploïdie, 2n = 17). Les

mêmes auteurs ont déterminé en 2001 la distribution de l’hétérochromatine constitutive dans

le genre Medicago par les techniques de bandes C.

Sur une étude cytogénétique et moléculaire (RFLP) de quelques luzernes annuelles

Mariani et al (1996), estiment les distances génétiques et le degré de parenté avec les formes

tétraploïdes.

Par ailleurs, certains auteurs se sont intéressés au rôle joué par la variation enzymatique

et notent ainsi, chez les espèces annuelles du genre Medicago, qu’il est difficile de procéder à

la délimitation des espèces (Ibn Tattou, 1982).

Pour ce qui est de l’Algérie les travaux concernant les Medicago sont peu nombreux. Ils

se limitent à des préoccupations d’ordre écologique et sur la répartition biogéographique des

espèces (Abdelgherfi, 1978).

L’objet de notre étude consiste à :

1. – Préciser et améliorer certaines étapes de la technique de coloration classique

1

(Feulgen), sur quelques populations d’espèces annuelles du genre Medicago de

différentes origines et de déterminer la variabilité génétique de ces espèces.

2. _ Mettre au point la technique de bandes C sur les mêmes espèces.

Dans un premier temps, nous avons procédé à un dénombrement chromosomique des

espèces, puis dans un deuxième temps, nous avons établi des caryotypes afin de discuter sur

le nombre et la morphologie des chromosomes de chaque espèce ainsi que la quantité et

l’emplacement de l’hétérochromatine constitutive chez ces espèces.

1

Le genre Medicago, légumineuse de la famille des Fabacées, constitue un groupe

taxonomique largement distribué dont les centres de diversification recouvrent le pourtour

méditerranéen et l’Eurasie. Il comporte un grand nombre d’espèces annuelles et pérennes

depuis fort longtemps comme d’excellents fourrages.

Figure 1 : Plante de Medicago polymorpha

1. Historique et origine géographique du genre Medicago

Selon Fournier (1961), le terme "Medicago", vient du mot latin "Medica" ou « herbes

de médic », il fut modifié par Dalechamps en 1587, et devient : Medicago. Le nom américain

donné à la luzerne "alfalfa" proviendrait de l'Arabe. On retrouve d'ailleurs l'appellation alfalfa

en Espagnol et en Italien. La culture de la luzerne, comme le cite Raymond et Glandard

(1952), remonterait à plus de 9000 ans, elle est connue des Perses, des Grecs et des Romains,

et sa région d'origine serait la Transcaucasie. En partant de là, une série de types se sont

formés dans les régions d'Asie Mineure, et du Moyen Orient, ainsi que dans l'Asie Centrale.

Au XVIème siècle, à partir du Midi de la France, et de la Bourgogne, la luzerne commence à

s'étendre vers le Nord et pénétrer en Rhénanie.

Prosperi et all (1995), signalent les aires d’origine de toutes les espèces du genre

comme étant « le croissant fertile » recouvrant les pays ou régions actuelles de Turquie,

d’Iran, d’Irak, du Sud du Caucase et du pourtour méditerranéen.

1

7. Description de quelques espèces annuelles du genre Medicago

De nombreux travaux portant sur des analyses morphologiques des espèces du genre

Medicago ont été réalisés.

Heyn (1963) dans la classification des espèces de la section Spirocarpos énumère

certains caractères morphologiques comme la taille et la pubescence des folioles, la forme des

stipules, la taille de certaines pièces florales, le nombre de fleurs par inflorescence,

l’orientation du jeune fruit dans le calice qui permettent dans certaines limites d’établir des

différences interspécifiques.

L’importance de certains caractères floraux a été mise en évidence par Small (1981).

La micromorphologie des épidermes foliaires étudiés par Damerval (1983) semble n’être

d’aucune valeur systématique, mais le caractère développement hétéroblastique peut susciter

certaines hypothèses phylogéniques.

L’étude biosystématique réalisée par Ibn Tatou (1981) sur 15 populations de 9

espèces de Medicago utilise plusieurs caractères morphologiques qualitatifs et quantitatifs.

L’auteur conclut que les caractères végétatifs notamment la pilosité, la forme des folioles et

des stipules ne permettent pas une discrimination entre les espèces et peuvent conduire au

plus à des groupes d’espèces, par contre les caractères se rattachant à la partie reproductrice :

vernation, ornementation, forme et taille de la gousse, nombre de spires par gousse, caractères

de la graine, inflorescence restent les seuls valables pour une discrimination sure aux niveaux

spécifiques et interspécifiques.

Pour Heyn (1963) les caractères les plus significatifs dans la distinction des variétés

sont essentiellement ceux se rattachant au compte tenu de ces résultats.

La description sommaire de quelques espèces annuelles du genre Medicago en limitant

à certains caractères (SAHBANE, 2006) est comme suit :

M. secundiflora Dur

C’est une espèce de la section Lupularia à 2n = 16 chromosomes. Elle possède une

tige couchée ou redressée de 5 à 30 cm de long avec des feuilles imparipennées à 3 folioles

ovales elliptiques. C’est une plante recouverte de poils blanchâtres, qui a 3 à 10 fleurs

jaunes de 2 à 25 mm de long possèdent 10 étamines, 9 d’entre elles sont soudées et une libre

(diadelphe). La période de floraison est de mars à mai, le fruit est une gousse non articulée

1

1. La mitose somatique

C’est un processus de division ou une cellule se divise en deux cellules filles,

génétiquement et morphologiquement identiques entre elles d’une part et à la cellule mère

d’une autre part.

Classiquement, le processus dynamique de la mitose est divisé en quatre phases : la

prophase, la métaphase, l’anaphase et la télophase.

Selon Berkaloff et al (1981) :

Le stade prophase est caractérisé par un gros noyau dépourvu de nucléole. A l’intérieur

du noyau se trouvent de très longs filaments qui vont devenir de plus en plus courts. Ce

raccourcissement est du à la spiralisation, qui se traduit par l’individualisation des

chromosomes.

Le stade de métaphase est caractérisé par la disposition médiane des chromosomes ou

ces derniers sont bien visibles et ils atteignent leur condensation maximale.

A ce moment, les deux chromatides de chaque élément sont nettement séparées l’une de

l’autre, mais restent toujours reliées toutes les deux au centromère qui, lui, n’est pas encore

clivé. C’est par le centromère que chaque élément s’accroche aux fibres fusoriales.

L’anaphase se manifeste par la séparation et l’attirance des chromatides sœurs vers les

pôles opposés de la cellule.

Le stade télophase est caractérisé par la despiralisation des chromosomes fils. Ils

deviennent de plus en plus fins et longs et finissent par ne plus être reconnaissables.

L’enveloppe nucléaire commence à se constituer.

2. Quelques notions caryologiques

Constituant principal du noyau cellulaire, caractéristique de l’interphase, la chromatine

renferme au moins 4 types de molécules : de l’ADN (20 à 25 %), des protéines basiques ou

histones (30 à 40 %), des protéines acides (10 à 25 %), de l’ARN (5 %), etc.…

1

I. Données taxogénétiques sur le genre Medicago

Le genre Medicago a fait l’objet de nombreuses recherches cytogénétiques, basées

essentiellement sur les analyses caryologiques afin de préciser la position systématique et

phylogénétique de certains taxons (Lesins et Gillies, 1970).

Mais les données caryologiques sont insuffisantes et les relations phylogénétiques entre

les espèces subsistent. Pourtant, il ressort de ces études au moins quatre nombres

chromosomiques : 2n = 2x = 14, 16, 32 et 48 ; deux nombre de base x = 7, x = 8 et trois

niveaux de ploïdies : diploïdes, tétraploïdes, et héxaploïdes (Bauchan et al, 1984 ; Mariani et

al, 1991).

Le nombre chromosomique le plus commun entre les espèces annuelles du genre

Medicago est 2n = 2x = 16. Cependant, il existe des espèces diploïdes qui ont le nombre

chromosomique 2n= 14 et seule M. murex qui a à la fois 2n = 14 et 2n = 16.

Le nombre chromosomique 2n = 14 est le résultat d’un réarrangement des chromosomes

faisant suite à l’union de deux chromosomes ou l’un des deux chromosomes est dépourvu du

centromère Lesins et all (1970).

D’après Lesins et Lesins (1979) il existe trois espèces avec le nombre chromosomique

2n = 14, il s’agit de M. polymorpha, M. praecox et M. rididula et elles sont probablement

dérivées de la même manière que M. murex, vu leur possession exceptionnelle d’un

chromosome long qui est le résultat d’une fusion de deux chromosomes.

M. constricta, une autre espèce également à 2n = 14, mais ne possède pas des

chromosomes longs, elle est venue suite à un réarrangement secondaire des chromosomes.

Il existe uniquement deux espèces annuelles tétraploïdes, il s’agit de : M. rugosa et

M. scutellata. Les deux espèces ont le nombre chromosomique 2n = 30 et 2n = 32.

M. scutellata possède deux paires de chromosomes avec des régions organisatrices

nucléolaires (NOR), tandis que M.rugosa présente uniquement une paire de chromosome avec

des régions organisatrices (NOR).

Les deux espèces sont dérivées d’hybridation entre des espèces à 2n = 14 et 2n = 16.

En général, il est difficile de distinguer les chromosomes homologues chez le genre

Medicago et de voir les différences de prétraitement et les méthodes de préparation des

chromosomes Lesins and Lesins (1972 et 1979).

1

En effet, les chromosomes du genre Medicago sont très petits et similaires (2.3 - 5 µ)

dans les métaphases mitotiques, par conséquent, il est difficile de réaliser un caryotype en

l’absence des techniques de Banding.

II. Polymorphisme hétérochromatique

Pour étudier un complexe d’espèces comme celui du Medicago, il faut être capable de

reconnaitre les différentes populations, notamment au niveau chromosomique. Les méthodes

cytogénétiques permettent déjà de déterminer la ploïdie du matériel ainsi que le nombre

chromosomique de base.

L’hétérochromatine constitutive est mise en évidence par la coloration différentielle au

Giemsa ou le C Banding. Cette méthode permet l’identification précise des chromosomes et

elle est utilisée spécifiquement dans le but de préciser la structure d’un variant de satellite

multiple ou géant, ou de mettre en évidence une translocation.

C’est ainsi que chez le mais, des nodosités hétérochromatiques ont été mises en

évidence, elles ont permis la caractérisation d’un certain nombre de races et apporté des

informations intéressantes sur l’évolution au sein du groupe mais (MC Clintock, 1981).

La coloration différentielle met en évidence des zones intensément colorées par rapport

au reste du chromosome. Ces zones correspondent à l’hétérochromatine constitutive dont le

rôle reste mal connu. Elle représente la partie du chromosome non active en ce qui concerne

la transcription de l’ADN.

La présence de l’hétérochromatine dans le génome pose un certain nombre de problèmes

dans la mesure où cette partie est non codante, cependant, on pense qu’elle joue divers rôles

dans la structuration du chromosome, dans les recombinaisons génétiques intra et

interchromosomiques, dans la régulation des gènes des régions euchromatiques voisines ainsi

que dans la cytodifférenciation.

Centaines hypothèses ont été formulées quant à son rôle dans la protection des zones

vitales du génome ou dans la structuration de l’organisation chromosomique en mitose et en

méiose (centromère, télomère, maintien de d’appariement des homologues en méiose).

D’autres hypothèses lui confèrent un rôle dans l’évolution du génome, notamment par la

création de nouveaux loci pourvus de nouvelles fonctions.

L’hétérochromatine est constituée essentiellement d’ADN répétitif contenant plusieurs

séquences de nucléotides, elle est considérée comme une partie du génome qui « bouge »

1

beaucoup : amplification rapide, siège d’insertion de transposants, zones renfermant des

points de cassure.

III. Relations phylogénétiques entre les espèces du genre Medicago

Des croisements sont réalisés pour délimiter les unités taxonomiques ou les proximités

phylogénétiques. L’aptitude des espèces à se croiser les unes avec les autres est peut être le

meilleur indicateur de leur relation phylogénétique. Ces expériences indiquent l’existence de

liaisons phylogénétiques importantes entre les parents croisés, si l’hybride est viable ; il s’agit

de la même espèce mais probablement de populations très différentes. Par contre si l’hybride

n’est pas viable, les deux espèces peuvent être considérées comme différentes avec toutefois

peut-être une distance génétique assez faible qui expliquerait leur forte ressemblance

morphologique.

Plusieurs expériences d’hybridation impliquant des espèces annuelles de Medicago ont

été ainsi réalisées (Lesins et al, 1971 ; Lesins 1972 ; Singh et Lesins, 1972 ; Lesins et Singh,

1973 ; Lesins et Lesins, 1979 ; Lesins et al, 1980) cités par FYAD F/Z (1999).

L’hybridation entre M.rotata et M.blancheana se produit fréquemment dans la nature.

Ceci est démontré par le fait que les hybrides entre ces deux espèces ont été décrits comme

des sous-espèces. Des croisements entre M.truncatula et M.littoralis sont possibles avec un

bon appariement des chromosomes chez l’hybride. Cependant quand M.littoralis est utilisée

comme parent maternel résultant du croisement est déficient en chlorophylle et certaines

plantes sont des chimères. Le croisement réciproque produit des plantes hybrides avec un

feuillage vert normal et des caractères morphologiques intermédiaires entre les parents.

M.tornata peut-être hybridée avec M.littoralis mais les hybrides produits sont déficients

en chlorophylle. D’autre part, M.tornata est plus distante de M.littoralis que ne l’est

M.truncatula à en juger par la présence de chromosomes transloqués. Les hybrides entre

M.turbinata avec M.tronata sont également déficients en chlorophylle.

L’hybridation est réussie entre M.tribunata avec M.truncatula seulement quand

M.truncatula est utilisée comme parent maternel Lesins et al (1980). Les hybrides sont stériles

avec un feuillage vert plus clair que celui des deux parents. La fertilité est trouvée quand le

nombre chromosomique de l’hybride est doublé. L’absence de ségrégation, chez les hybrides

pour différents caractères y compris les isoenzymes, l’appariement préférentiel des

chromosomes, indique que les deux espèces possèdent des génomes différents.

1

L’hybride entre M.laciniata et M.sauvagei, deux espèces des Leptospirae, est déficient en

chlorophylle. Ces deux espèces sont très proches l’une de l’autre comme le montre la

formation de bivalents normaux chez leurs hybrides.

M.intertexta, M.ciliaris et M.muricoleptis peuvent s’entre croiser. M.muricoleptis est plus

distante de M.intertexta que ne l’est M.ciliaris à en juger par la fertilité pollinique réduite et

l’appariement des chromosomes observés chez les hybrides entre M.muricoleptis et soit

M.intertexta ou M. ciliaris. D’ailleurs, certains ne considèrent que M.ciliaris comme une

sous-espèce de M.intertexta.

Mariani et al (1996) ont entrepris une étude cytogénétique et moléculaire sur

M.scutellata, M.rugosa et les espèces diploïdes ayant 2n=16 et 2n=14 qui semblent leur être

les plus étroitement apparentées.

L’analyse caryologique a permis d’établir que certaines des espèces diploïdes

examinées, sont plus similaires que les autres, à la fois à M.rugosa et à M.scutellata (c’est le

cas de M.intertexta, M.rotata et M.polymorpha) ou du moins à l’une ou l’autre de ces deux

espèces (comme M.doliata, et M.murex). L’analyse RFLP a identifié les quatre espèces ayant

le plus d’affinité génétique avec les deux espèces à 30 chromosomes ; ce sont M.intertexta et

M.muricoleptis (2n=16) d’une part et M.polymorpha et M.murex (2n=14) d’autre part.

Ces résultats semblent indiquer la possibilité d’identifier, parmi ces quatre espèces, les

ancêtres de M.scutellata et de M.rugosa. Ces deux espèces tétraploïdes de la section des

Rotatae pourraient dériver d’espèces provenant soit de la section des Pachyspirae (M.murex

et M.doliata), soit de la section des Leptospirae (M.polymorpha), soit de la section des

Intertextae.

Lesins et al (1982) cité par Mc Coy et Bingham (1988) ont réalisé le seul et unique

hybride entre espèce pérenne et annuelle (M.scutellata et M.sativa). Le nombre

chromosomique de l’hybride est instable, variant de 30 à 64 chromosomes dans les cellules

des pointes de racine. Les tiges primaires sont héxaploides (2n=48) et les secondaires sont

tétraploïdes (2n=32), résultats inattendus puisque M.scutellata possède 30 chromosomes.

L’hybride est à la fois male stérile et femelle stérile. Il est de type pérenne avec des fleurs

pourpres comme le parent M.sativa. L’hybride est vivace et intermédiaire pour la plus part des

caractéristiques morphologiques.

Les résultats de ces expériences d’hybridation semblent indiquer que les distances

génétiques entre espèces sont très variables dans une même section et d’une section à l’autre,

par exemple dans la section des Intertextae les hybrides sont facilement obtenus et les espèces

1

sont proches alors que dans la section des Rotatae, de Leptospirae et des Pachyspirae en

moyenne deux espèces s’entrecroisent aisément avec formation de bivalents normaux tandis

que le reste des espèces est nettement plus distant.

Tableau 5 : Hybridations interspécifiques réalisées dans le genre Medicago (d’après Quiros et

Bauchan (1988)

Hybrides interspécifiques entre espèces

annuelles

Hybrides interspécifiques entre

espèces annuelles et perennes

M.rotata x M.blancheana (et réciproquement) M. sativa x M. scutellata

M.truncatula x M.littoralis (et réciproquement)

M.tronata x M.littoralis (et réciproquement)

M.soleirolii x M.tronata

M.tribinata x M.truncatula (et réciproquement)

M.sauvagei x Mlaciniata (et réciproquement)

M.ciliaris x M.intertexta

M.muricoleptis x M intertextae

M.muricoleptis x M.ciliaris

IV. Les bandes C dans le genre Medicago

A l’issue des travaux qui ont été fait sur les techniques de marquage chromosomique par

différents chercheurs, ils ont pu trouver des réponses aux deux questions essentielles qui se

posaient :

-Quelles zones de structure chromosomique réagissent à la coloration au Giemsa ? Ce

sont les zones des centromères, les constructions secondaires et les satellites.

-Quelle est la nature du matériel chromosomique intégrant ce colorant ? C’est

l’hétérochromatine constitutive et l’ADN satellite qu’elle renferme.

La technique de coloration des bandes C au Giemsa a été utilisée afin de déterminer la

quantité et l’emplacement d’hétérochromatine constitutive chez les plantes.

Cette technique repose sur deux phénomènes : la dénaturation et la renaturation de l’ADN

chromosomique.

1

Lors de la dénaturation, les deux filaments de l’ADN chromosomique se dissocient par

rupture des liaisons hydrogènes qui les relient par leurs bases. Ce sont les deux liaisons AT

qui se dissolvent les premières sous l’effet de l’agent dénaturant ; si la dénaturation se

prolonge, les deux liaisons GC cèdent à leur tour.

La renaturation fait intervenir les propriétés physico-chimiques de l’ADN. Les zones

chromosomiques constituées d’ADN répétitif (qui est riche en bases AT et localisé dans

l’hétérochromatine constitutive) se réassocient avant les zones d’ADN à séquences uniques

(ou zones euchromatiques). La dénaturation et la renaturation sont deux étapes essentielles de

la technique de bandes C.

Bauchan et Hossain (1997) sont les premiers qui ont signalé des bandes C

hétérochromatiques constitutives chez les plantes diploïdes de Medicago sativa ssp.falcata, ils

ont montré des bandes localisées uniquement au niveau des centromères et des régions

organisatrices nucléolaires NOR des chromosomes satellites SAT. Des observations similaires

ont été trouvées avec le banding N sur le genre Medicago (Bauchan et Hossain, 1998).

Cependant, les auteurs ont observé chez certaines accessions la présence de bandes C

d’hétérochromatine constitutive aux extrémités télomériques des chromosomes.

Les bandes C peuvent être également régies par des conditions extérieures du milieu.

Cette constatation sur la quantité d’hétérochromatine en rapport avec le milieu extérieur a déjà

été rapportée par Lespinasse et al. (1992).

V. Le chromosome B dans le genre Medicago

Les chromosomes B sont présents dans très nombreuses espèces animales et végétales

(Jones et Rees, 1982) et ils sont différents des chromosomes A (chromosomes normaux). Ces

chromosomes ont été décrits la première fois par Pantulu (1960). La présence de

chromosomes surnuméraires (les chromosomes B) totalement ou partiellement

hétérochromatiques selon les espèces et facilement détectables par simple examen

cytologique.

C’était la première fois en 1998, dans l’histoire de la cytogénétique du genre Medicago,

que M. A Hossain et G. R. Bauchan ont pu vérifier l’existence de chromosomes B dans le

genre Medicago (aneuploïdie, 2n = 17), mais l’origine de ces chromosomes est inconnue.

Les chromosomes B sont nommés les chromosomes surnuméraires ou les extra-

chromosomes, typiquement ils ont peu d’effet sur le phénotype d’un individu (Jones et Hoben

1

(2008), ils sont présents dans 15% des espèces eucaryotes Maria Teruel et al (2009) et leur

nombre varie d’une espèce à l’autre de zero à plusieurs Jonathan (2007).

Des études de biologie moléculaire ont montré que la majorité des chromosomes B

contient l’ADN répétitif, en outre l’ADN ribosomique, l’ADN centromérique et télomérique,

ainsi que les transposant qui sont fréquemment présents chez les chromosomes surnuméraires

Camatchou (2005).

Les chromosomes B ont particulièrement les caractéristiques suivantes :

- Ils sont toujours plus petits que les chromosomes A et généralement, ils sont

hétérochromatiques.

- Les chromosomes B ne sont pas indispensables à l’espèce qui les possède.

- Ils n’ont pas d’influence sur la viabilité de l’organisme.

- Ils varient entre les cellules, tissus, individus et populations.

- Ils ne présentent pas d’homologie avec les chromosomes A

- Ils affectent le comportement mitotique par élimination de distribution préférentielle

(Reiger et all. 1991).

- Ils augmentent le taux de crossing-over et les fréquences de recombinaison.

- Ils causent l’augmentation des chromosomes impairs (l’infertilité).

On voit donc tout intérêt qu’il y a à s’intéresser à cette partie du génome qui, bien que

non codante, joue vraisemblablement un role important dans la régulation de l’expression du

génome tout entier : chez Scilla automnalis (Ruiz – Rejion et al., 1980 ; Oliver et al., 1982)

une corrélation est mise en évidence entre la présence des chromosomes B et une bande

supplémentaire dans le profil enzymatique de l’estérase E1 : leurs analyses montrent que le

gène en cause est situé sur le chromosome A (et non sur le B) et que c’est seulement son

expression qui est régulée par la présence des chromosomes B.

D’aprés (Puretas et al, 1988), les chromosomes B se comportent en « égoïste » et

n’apparaissent que lorsque cela les avantage, ces observations illustrent bien les deux théories

qui existent quant au rôle de l’hétérochromatine dans un génome (Jones, 1985 ; Shaw et

Hewitt, 1990).

Il a été mis en évidence que les télomères terminaux des chromosomes

hétérochromatiques, sont indispensables au maintien de la structure et au fonctionnement de

ces chromosomes, que ce soit chez l’homme, la drosophile ou le Mais, Moyzis (1991).

1

A. Matériel

Notre travail a porté sur dix espèces annuelles du genre Medicago et une espèce algérienne

d’origine, dont les gousses ont été récoltées à Tizi-Ouzou, il s’agit de (M. ciliaris).

Les semences de ces dix espèces nous ont été fournies par l’I C A R D A), et sont de

différentes origines, (tableau 6).

Tableau 6 : Différentes espèces annuelles du genre Medicago étudiées.

Ecotypes Nom des espèces Origine des

collecteurs

Origine des espèces

IFMA 0673 M. truncatula

truncatula

ICA/SAD/MAJ JOR

IFMA 0726 M. rotata ICA/SAD/MAJ JOR

IFMA 4199 M. rotata ICA/IBPGR/US SYR

IFMA 3032 M. polymorpha

brevispina

ICA/GTZ/INRA MAR

IFMA 3930 M. polymorpha ICARDA SYR

IFMA 3938 M. polymorpha

vulgaris

ICARDA SYR

IFMA 4198 M. radiata ICA/IBPGR/US SYR

IFMA 0674 M. laciniata laciniata ICA/SAD/MAJ JOR

IFMA 3084 M. intertexta ICA/GTZ/INRA MAR

IFMA 0725 M. regidula agrestis ICA/SAD/MAJ JOR

IFMA 0736 M. orbicularis

marginata

ICA/SAD/MAJ JOR

IFMA 2608 M. noena ICARDA SYR

IFMA 4193 M. noena ICA/IBPGR/US SUR

1

B. Méthodes

Nous avons utilisé deux techniques d’analyse des chromosomes, une technique de

coloration classique (technique de Feulgen), et la technique de bandes C. Ces deux techniques

se révélant particulièrement bien adaptées à l’étude des chromosomes végétaux, elles ont pour

objectif la réalisation de préparations chromosomiques qui permettent de dénombrer les

chromosomes et d’étudier leur morphologie pour l’établissement de caryotypes ou pour la

mise en évidence de modifications chromosomiques (délétions, réarrangements,..).

Les deux méthodes que nous détaillerons sont celles qui ont donné les meilleurs résultats.

B. 1 Technique de Feulgen :

Comme technique de coloration classique, nous avons utilisé la technique de Feulgen,

basée sur la propriété du réactif de Schiff de colorer l’ADN chromosomique en rouge violet.

Pour la mise en œuvre, nous avons choisi le protocole suivant :

a- Germination :

Les graines de Medicago scarifiées et ensemencées (dans des boites de Pétri

tapissées de papier filtre et humidifiées à l’eau distillée sont tout d’abord soumises à une

prégermination à 4°C pendant 48 heures, puis elles sont mises dans l’étuve pour une

germination de 40 heures jusqu’à l’obtention de racines de 1 à 1.5 cm de longueur.

b- Prétraitement :

Cette opération vise un triple objectif : bloquer les chromosomes au stade

métaphase, les contracter et les libérer de leur fuseau achromatique.

Selon les auteurs, les agents de prétraitement les plus utilisés sont la colchicine,

l’α-bromonaphtalène en solution et le froid.

Pour notre part, nous avons immergé les racines dans une solution saturée

l’ α-bromonaphtalène pendant 4 heures dans l’étuve.

c. Le stockage :

Les racines sont conservées dans l’éthanol 70% après avoir effectué deux rinçages

dans l’éthanol 95%, pendant 5 minutes chacun.

1

Le matériel peut être conservé pendant plusieurs mois dans l’éthanol, certains

fixateurs comme le Carnoy I peuvent également servir de solution de stockage.

d. Hydrolyse :

Cette étape est généralement nécessaire pour obtenir ultérieurement un bon étalement

de cellules et de chromosomes entre lame et lamelle. L’agent le plus fréquemment

utilisé pour le ramollissement des tissus est l’acide chlorhydrique (Hcl 1N) ou l’acide

acétique 45%. Son action peut être associée à celle d’enzymes. L’hydrolyse dissout les

sels pectiques de la lamelle moyenne et permet l’éclaircissage de cytoplasme. En outre,

l’acide chlorhydrique libère les groupements aldéhydes sur les molécules de sucres de

l’ADN par destruction des liaisons (N-glucosidiques) entre les bases puriques et le

désoxyribose.

Après quelques essais, nous avons obtenu ce résultat en plongeant les racines dans

l’acide chlorhydrique (Hcl 1N) pendant 12 minutes à la température de 60° C.

e. Macération enzymatique :

Cette opération facilite l’étalement, elle agit en détruisant la paroi pectocellulosique

des cellules et favorise leur séparation.

Les racines sont macérées à l’obscurité dans une solution de pectinase pendant 45

minutes.

f. La coloration :

Le réactif de Schiff préparé à partir de la fuchsine basique est le colorant le plus

utilisé. Il se fixe sur les groupements aldéhydiques libérés lors de l’hydrolyse pour

donner une coloration rouge aux chromosomes. Fréquemment, cette technique de

coloration est dite technique de Feulgen car elle a été décrite pour la première fois par

Feulgen (1926).

Les racines sont immergées dans le réactif de Schiff pendant 60 min à température

ambiante et à l’obscurité.

g. Ecrasement, observation :

La majorité des techniques présentées concernent les mitoses dans les méristèmes

racinaires. Dans ce cas, la zone méristématique hydrolysée et colorée est isolée, déposée sur

1

une lame dans une goutte d'eau acétique ou de carmin acétique et écrasée entre lame et

lamelle pour assurer la dissociation des cellules.

Cette dissociation est plus difficile si les tissus ont été préalablement stockés dans

l'alcool pendant une longue durée et si la quantité de tissu déposé est importante. Il faut éviter

un écrasement trop violent car il y a risque d'éclatement des cellules et donc l'observation de

cellules incomplètes.

Puis, afin d'assurer un bon étalement des chromosomes, un léger chauffage de la lame

est conseillé avant d'exercer une pression uniforme homogène à l’aide du pousse sur la

lamelle.

Après, les lames sont observées au microscope photonique à un fort grossissement, le

plus souvent, les combinaisons (Oculaire × Objectif) donnent des grossissements compris

entre 1000 et 1600 et les meilleures préparations sont lutées avec du vernis à ongles et

conservées au réfrigérateur.

Les plaques métaphasiques sont photographiées avant ou pendant leur conservation.

B 2. Technique de bandes C :

Basée sur le principe de dénaturation- renaturation de l’ADN et coloration au Giemsa,

cette technique permet, comparativement aux techniques de coloration classiques, une analyse

différentielle, et donc plus détaillée, des chromosomes. Elle met en évidence, sous forme de

bandes colorées, certaines zones spécifiques du chromosome, caractérisant l’hétérochromatine

constitutive, et localisées dans les régions centromériques, télémétriques et intercalaires.

L’obtention de bandes C sur un matériel chromosomique donné nécessite un protocole

d’application adapté, autant que possible, à l’espèce étudiée. Nous avons employé le protocole

de Jahier (1992).

Les principales étapes de ce protocole sont :

a. La germination ;

b. b. le prétraitement ;

c. c. la fixation ;

d. d. l’hydrolyse ;

e. l’écrasement, délamellage, séchage ;

f. la dénaturation ;

g. la renaturation ;

1

h. la coloration.

Les trois premières étapes (germination, prétraitement et fixation) sont exécutées de la

même façon que pour la technique de Feulgen. Les racines sont ensuite rincées à l’eau

distillée et utilisées pour les étapes suivantes.

d. Hydrolyse : Cette opération a pour but la séparation de l’ADN des protéines

basiques ou histones.

En général, on utilise de l’acide chlorhydrique 1 normal ou l’acide acétique à 45%.

Mais la réussite de cette opération nécessite une adaptation précise des concentrations de

l’acide, de la température et de la durée du traitement au matériel à hydrolyser.

Pour notre part, nous avons utilisé de l’acide acétique à 45%, pendant 10 minutes, à

température de 60°C.

Rinçage à l’eau distillée pour stopper l’hydrolyse.

e. Ecrasement, délamellage, séchage : Après prélèvement des pointes racinaires, et

leur écrasement entre lame et lamelle dans une goûte d’acide acétique à 45%, nous avons

procédé au délamellage (décollement de la lamelle dans de l’azote liquide), et au séchage des

lames, à température ambiante.

Le séchage est assez souvent négligé par certains opérateurs, mais plusieurs auteurs ont

montré que plus la durée de séchage du matériel cromosomique est longue, meilleure est la

qualité tinctoriale des bandes obtenues.

f. Dénaturation : Opération capitale dans le protocole d’application de la technique de

bandes C, dont l’objectif est la séparation des deux brins complémentaires d’ADN.

L’agent dénaturant utilisé pour les chromosomes végétaux est l’hydroxyde de baryum

(Ba (OH)2). La aussi, les trois paramètres : concentration, température et durée d’action,

varient selon le matériel végétal utilisé.

Tout excès entraîne la destruction des chromosomes.

Il semblerait qu’une faible concentration de Ba (OH)2, alliée à une durée d’action

prolongée, donne de meilleurs résultats.

Nous avons utilisé une solution de Ba (OH)2, à température ambiante, pendant 10

minutes.

Les lames ensuite sont rincées à l’eau distillée afin d’éliminer toute trace d’hydroxyde

de Baryum.

1

g. Renaturation : Elle permet de réassocier les deux brins d’ADN dissociés au cours

de la précédente opération.

La renaturation se fait dans une solution de citrate salin (2× SSC), à une température

moyenne de 60 °C pendant 60 à 90 minutes. Le PH doit se rapprocher de la neutralité.

Ce sont les mêmes paramètres que nous avons utilisé : Solution de 2× SSC, à 60,

pendant 60 minutes.

h. Coloration : C’est l’Ultime étape de la technique de bandes C. Elle a pour but de

faire apparaître le résultat final, c'est-à-dire des bandes C le long des chromosomes. Elle

s’effectue dans une solution- tampon de Giemsa à PH = 6,7, avec les durées d’action allant de

5 minutes à 12 heures.

La concentration de Giemsa habituellement utilisée est de 3%. Nos lames ont été

colorées dans une solution de Giemsa à 3%, à température ambiante, pendant 15 à 30

minutes.

Après les lames sont rincées à l’eau distillée, puis séchées à température ambiante, et

observées au microscope.

B. 3. Etablissement des caryotypes :

Le nombre de chromosomes est normalement constant au sein d’une même espèce et la

morphologie de chaque paire chromosomique est caractéristique, mais ce nombre peut varier

à l’intérieur d’un groupe (tribu, famille ou genre) et même au sein d’une espèce (Essad,

1957).

Il est possible d’obtenir par cellule un caryotype, représenté sous forme de dessin ou de

photographie de chaque paire chromosomique.

L’ensemble de ces caryotypes permet d’établir une « carte d’identité chromosomique »

ou caryogramme ou idiogramme, représentation schématique du génome haploïde. Elle peut

être recherchée :

- pour des raisons d’ordre taxonomique correspondant alors à l’acquisition d’un nouveau

critère de classification,

- pour l’analyse de lignées d’addition ou de substitution, de mono ou de polysomie,

- pour l’étude des remaniements chromosomiques.

Pour notre cas, on n’a pas établi les idiogrammes, en raison du manque du matériel.

1

L’identification des chromosomes en prophase de méiose est possible chez quelques

rares espèces (mais, tomate). Cependant, c’est d’une façon générale lors de la métaphase de

mitose, que l’observation est la plus aisée.

Trois critères permettent de distinguer les chromosomes métaphasiques afin d’établir un

caryotype c'est-à-dire la classification et l’apparition phénotypique des chromosomes :

1- la longueur de chaque chromosome.

2- La position de la constriction primaire (centromérique).

3- L’existence et la localisation de constrictions secondaires correspondant généralement

à des organisateurs nucléolaires. Leur position fréquemment distale sur un bras

chromosomique détermine l’existence de satellites.

Pour notre cas, les caryotypes sont réalisés à l’aide du logiciel PHOTOSHOP 7.0.

1

RESULTATS

I. Technique de Feulgen

I. 1. Dénombrement chromosomique et établissement de caryotypes

Ce travail s’insère dans le cadre d’un programme de recherche du laboratoire de

Génétique et Amélioration des plantes à l’Université d’Oran. Les observations portent sur 09

espèces annuelles du genre Medicago et les plaques métaphasiques sont présentés dans les

figures suivantes (Figure 4, 5, 6 et 7).

En effet, le genre Medicago pose des problèmes d’ordre technique en raison de la petite

taille des chromosomes.

Plusieurs études caryologiques ont été faites sur le genre Medicago afin de mettre en

évidence la grande variation de caryotype des différents taxons.

Yen et al (1979) ont montré des variations dans le nombre chromomique de 2n =36 à 2n

= 51 alors que le niveau tétraploïde 2 = 4x = 32 a été observé par Falistocco et al (1996).

Nous avons essayé d’établir le nombre chromosomique pour chaque espèce. Les

dénombrements chromosomiques qui ont été effectué sur une quinzaine de plaques

métaphasiques mentionnent deux niveaux de ploïdie : x = 7 et x = 8, la présence de deux

nombres chromosomiques a été discutée par Abdelguerfi et al (1989).

Lesins et Lesins (1979) suggèrent que le nombre : x = 7 dériverait de x = 8, ce qui

confirme que les deux génomes auraient un ancêtre commun.

Martinez et Parker (1995) estiment que « le dénombrement chromosomique » jouerait

un rôle important dans l’évaluation de la biodiversité et de sa conservation.

Les résultats de nos observations concordent avec ceux obtenus par les auteurs et

confirment que M. truncatula, M. orbicularis, M. intertexta, M. rotata, M. noeana, M.

radiata et M. laciniata possèdent un nombre chromosomique 2n = 16. Seules les espèces M.

polymorpha et M. rigidula ont 2n = 14 chromosomes.

1

M. polymorpha est décrite comme étant une espèce diploïde à 2n = 14 (Lesins et

Lesins, (1979), Abdelguerfi (1978), Quiros et Bauchan (1988), Mariani et Falistocco (1990).

Un seul cas d’aneuploïdie (2n = 17) a été rencontré chez l’espèce M .noeana et cela a été

vérifié sur plusieurs plaques métaphasiques. Il semblerait que le chromosome 17 est le

chromosome B (chromosome surnuméraire) dont la description est détaillée par plusieurs

auteurs. La présence du chromosome B dans le genre Medicago été déjà vérifié par Hossain et

Bauchan (1998).

Les caryotypes des espèces étudiées ont été établis à l’aide d’un logiciel de traitement

d’image (Photoshop 07) et ils sont présentés dans les figures (8, 9, 10, 11, 12 et 13).

M. polymorpha 3930 :

L’analyse caryologique de M. polymorpha 3930 montre que l’espèce est diploïde

(2n = 14 ou 16). Son caryotype est de type symétrique, les quatre premières paires de

chromosomes sont métacentriques, les paires deux chromosomiques (5 et 6) sont

submétacentriques et la dernière paire (8) est acrocentrique. (Figure 7).

M. rotata 726 :

L’étude caryologique de M. rotata 726 montre que l’espèce M. rotata est diploïde

avec 2n = 16. Dans la même espèce, nous avons rencontré un seul cas d’aneuploïdie

(2n = 17) répété plusieurs fois, nous avons supposé que le 17ème

chromosome est le

chromosome surnuméraire (B).

Nous avons observé deux paires de chromosomes métacentriques (1 et 3), une paire

chromosomique (2) submétacentrique et cinq paires de chromosomes acrocentriques

(4, 5, 6, 7 et 8) et le chromosome 17 est le chromosome le plus petit et il est également

acrocentrique. (Figure 4).

M. noeana

Le caryotype (figure 5) montre que l’espèce M. noeana est diploïde à 2n = 16

chromosomes, trois paires de chromosomes sont métacentriques (1, 5 et 6), trois autres

paires chromosomiques (3, 4, et 5) sont submétacentriques et les deux dernières paires

chromosomiques sont acrocentriques (7 et 8).

1

M. radiata :

L’étude caryologique de M. radiata montre que cette espèce possède un caryotype

diploïde à 2n = 16. On observé six paires de chromosomes métacentriques (1, 5, 6 et 7),

trois paires de chromosomes submétacentriques (2, 3 et 4) et la dernière paire de

chromosomes (8) est acrocentrique. (Figure 5).

M. orbicularis 736 :

Le caryotype de (figure 7) montre que l’espèce M. orbicularis 736 présente 16

chromosomes qui sont pour la plupart métacentriques, cinq paires de chromosomes

métacentriques (1, 2, 3, 4, et 5), deux paires de chromosomes submétacentriques (6 et 7)

et la dérnière paire de chromosomes (8) est acrocentrique.

I. 2. Morphologie des chromosomes

Comme il a été signalé avant, en comparaison avec d’autre type de plantes, les espèces de

Medicago présentent des chromosomes de taille réduite. On peut remarquer quelques

différences sur les plaques métaphasiques obtenues dans le type et la taille des chromosomes.

Les espèces M. laciniata et M. orbicularis ont des chromosomes plus ou moins

similaires et plus longs par rapport aux autres espèces, alors que les espèces M. truncatula, M.

intertexta et M. regidula et M. radiata possèdent également des chromosomes de type et de

taille similaire et intermédiaire en les comparant avec les autres espèces (voir les figures 1, 2,

3 et 4)

De plus, au sein de la même espèce, des variations morphologiques des chromosomes sont

évidentes ; par exemple chez les chromosomes de M. polymorpha (3907), il existe des

métaphases ou nous avons observé des chromosomes plus petits par rapport aux autres

espèces, et d’autres métaphases qui présentent des chromosomes intermédiaires, il s’agit de

M. polymorpha (3032 et 3930).

1

I. 3. Discussion

Les espèces annuelles du genre Medicago sont diploïdes avec un même nombre

chromosomique de 2n = 16 à l’exception de quelques espèces, comme M.polymorpha et

M. rigidula avec 2n = 14 chromosomes, il n’y a pas de polymorphisme interspécifique du

nombre chromosomique, par conséquent, les espèces annuelles de Medicago forment donc un

groupe homogène tant en ce qui concerne le niveau de ploïdie, qu’en ce qui concerne le

nombre chromosomique de base.

Mariani (1996) trouve que M. polymorpha possède le nombre chromosomique 2n = 14,

alors que nous avons observé des métaphases avec 2n = 16 chez quelques populations

(Poly 3930, Poly 3032), et chez d’autre populations de la même espèce (Poly 3907) des

métaphases à 2n = 14 chromosomes.

La connaissance des observations faites par Meriani (1996) laisse supposer que peut-être

les deux formes coexistent dans cette espèce, d’autant plus que cette espèce est considérée

comme étant très polymorphe.

I. 4. Conclusion

Les études chromosomiques chez les espèces diploïdes mentionnent deux nombres

chromosomiques de base : x = 7 et x = 8. Le nombre de base x = 7 est uniquement dénombré

chez M. polymorpha et M. regidula

Nous pouvons conclure que le groupe des espèces annuelles du genre Medicago est

constitué presque exclusivement de diploïdes avec un même nombre de chromosomes 2n =

16, il n’y a pas de polymorphisme interspécifique du nombre chromosomique. Les espèces

annuelles forment donc un groupe homogène du point de vue de la ploïdie et du nombre

chromosomique de base.

1

II. Les bandes C

II. 1. Dénombrement chromosomique et établissement de caryotype

L’utilisation de la technique de bandes C nous a permis d’obtenir des résultats

satisfaisants sur une espèce annuelle du genre Medicago d’origine locale.

Nous avons répété plusieurs fois le protocole expérimental en modifiant certains

paramètres (durée et/ou température d’hydrolyse, durée et/ou température de dénaturation et

renaturation, durée de coloration, etc.), nous sommes arrivé à obtenir quelques observations

de métaphases d’une espèce M. ciliaris (d’origine locale dont les gousses ont été récoltées à

Tizi-Ouzou).

Le nombre chromosomique rencontré chez cette espèce est 2n = 16 chromosomes, c’est le

même nombre signalé dans la littérature.

Le caryotype (figure I) montre que l’espèce M. ciliaris est diploïde avec 2n = 16

chromosomes, la plupart des chromosomes sont métacentriques à l’exception de la dernière

paire (8) qui présente des chromosomes acrocentriques.

II. 2. Morphologie des chromosomes et analyse des bandes hétéro chromatiques

Le genre Medicago présente en général des chromosomes assez courts, raison pour

laquelle il est difficile d’obtenir des métaphases avec la technique de bandes C.

L’espèce M. ciliaris a montré des chromosomes de taille plus ou moins importante par

rapport à ceux rencontrés chez les espèces précédentes.

Dans la majorité des cellules, nous avons observé trois types de bandes (Figure I) :

Des bandes centromériques, des bandes intercalaires et des bandes télomériques.

Après l’observation de plusieurs plaques métaphasiques, les bandes hétérochromatiques

ont été méthodiquement positionnées sur les chromosomes.

La distribution de ces bandes sur les différents chromosomes ( figure 14), est comme suit :

Paire 1 : Les deux chromosomes (1 et 2) sont les plus longs dans cette espèce et sont

métacentriques. Comme bandes typiques, cette paire présente une bande

1

centromérique assez large et fortement colorée et deux bandes télomériques

fortement colorées sur chacun des deux chromosomes.

Paire 2 : cette paire présente deux chromosomes submétacentrique et montre trois

bandes typiques pour chaque chromosome : deux bandes télomériques fortement

colorées et une bande centromérique fortement colorée.

Paire 3 : elle montre deux chromosomes submétacentriques, une bande

centromérique large et fortement colorée sur le chromosome 5 et deux bandes

télomériques larges et fortement colorées sur les chromosomes, représentent les

bandes typiques de cette paire

Paire 4 : les chromosomes de cette paire sont métacentriques, le chromosome 7

présente deux bandes télomériques, une large fortement colorée et une autre fine et

faiblement colorée, le chromosome 8 présente également deux bandes télomériques

une large et fortement colorée et l’autre fine et fortement colorée et un bande

centromérique fine et faiblement colorée.

Paire 5 : elle présente des chromosomes acrocentriques, le chromosome 9 présente

uniquement une seule bande télomérique large et fortement colorée, par contre le

chromosome 10, présente deux bandes télomériques, une large et fortement colorée

et l’autre fine et faiblement colorée. Cette paire diffère des paires précédentes par

l’absence de bandes centromériques.

Paire 6 : les chromosomes de cette paire sont métacentriques, elle ne présente

également que des bandes télomériques, deux bandes centromériques larges et

fortement colorées pour chacun des deux chromosomes ont été observées.

Paire 7 : elle présente des chromosomes métacentriques, le chromosome 13 présente

deux bandes télomériques larges et fortement colorées et le chromosome 14 présente

aussi deux bandes télomériques mais fines et faiblement colorées.

1

Paire 8 : cette paire présente deux chromosomes les plus petits chez cette espèce, ce

sont des chromosomes acrocentriques sur lesquels on a observé une seule bande

télomérique une fine et faiblement colorée sur chromosome 15 et l’autre large et

fortement colorée sur le chromosome 16.

II. 3. Discussion :

Le banding est l’étude de profil de distribution de l’hétérochromatine qui montre une

grande variabilité de la distribution de l’hétérochromatine constitutive.

Bauchan et Hossain (1997) sont les premiers à avoir signalé des bandes C

hétérochromatiques constitutives chez les plantes diploïdes de Medicago sativa ssp.falcata.

Les bandes sombres observées chez M. ciliaris correspondent à la quantité et

l’emplacement d’hétérochromatine constitutive dans les régions télomériques et

centromériques des chromosomes.

En revanche, nous n’avons pas observé des bandes intercalaires sur les chromosomes

de cette espèce.

Chez les diploïdes, Linde (1989) estime le nombre de bandes entre 5 et 13 bandes par

chromosome, pour les tétraploïdes, en moyenne 5 à 8 bandes par chromosome. Cette

différence notée au sein du nombre de bandes peut s’expliquer par le degré de condensation

de la chromatine.

Lespinasse et al. (1992), signalent que les bandes C peuvent être gouvernées par les

conditions de milieu. L’environnement de l’origine des populations peut avoir une influence

sur la distribution de l’hétérochromatine constitutive (Issolah, 2006), Siljak- Yokovlev et al

(1982) ont signalé que les taxons riches en hétérochromatine sont ceux vivant à des altitudes

élevées.

Siljak- Yakovlev (2000), considère l’hétérochromatine comme étant un marqueur de

différenciation entre les espèces.

Des différences minimes dans l’emplacement, le nombre et l’intensité de coloration des

bandes permettent de faire une comparaison entre les espèces.

Des nombreux auteurs ont appliqué la technique de bandes C sur plusieurs variétés

d’Hordeum vulgare, provenant de différents pays, et ils ont signalé la grande similitude

existant entre les caryotypes de ces variétés, ce qui rend parfois leur distinction difficile.

1

Ainsi, Vosa (1976) affirme que la quantité et l’emplacement de l’hétérochromatine

varient très peu à l’intérieur de l’espèce.

II. 4. Conclusion

L’espèce M. ciliaris étudiée présente des bandes télomériques et des bandes

centromériques, autrement dit, l’hétérochromatine constitutive de cette espèce est fortement

localisée dans les régions télomériques et centromériques des chromosomes, ce qui

correspond aux schémas classiques d’application des bandes C.

III. Discussion générale

La variation des paramètres des protocoles expérimentaux des deux techniques utilisées

nous a permis de constater que certains de ces paramètres sont nettement plus efficaces que

d’autres sur les chromosomes des 10 espèces étudiées.

Pour la technique de coloration classique, le meilleur protocole d’application serait à

base d’ α- bromonaphtalène, d’alcool acétique, d’acide chlorhydrique normal, de pectinase,

soulignons que l’étape de macération à la pectinase qui est peu utilisée, s’est révélée efficace

pour obtenir un bon étalement des chromosomes.

La technique de bandes C (Jahier, 1991) a permis d’obtenir, sur une espèce des

chromosomes bien étalés, avec un nombre relativement réduit de bandes colorées.

La variation des paramètres de deux étapes, le prétraitement (utilisant l’α-

bromonaphtalène) et la coloration (réduction de la durée), ont amélioré un peu les résultats.

Des auteurs dont Jackson et Nguyen, (1988), qui ont travaillé sur Triticum, ont constaté

que l’apparition de bandes C peut être ralentie par la réaction du Ba(OH)2 avec le CO2 de

l’air.

D’autres dont Vosa (1976) notent que l’ordre d’apparition des bandes C dépend de la

durée de l’hydrolyse : longue, elle favorise les bandes centromérique, courte, elle induit des

bandes intercalaires et télomériques.

Vosa (1976) signale, pour sa part, que ces deux dernières bandes peuvent être plus

aisément observées entre la fin de la prophase et le début de la métaphase, lorsque les

chromosomes sont très condensés.

1

Il ressort des résultats que nous avons obtenu avec la technique de coloration classique et

la technique de bandes C que, les espèces annuelles du genre Medicago étudiées présentent

des caractéristiques qu’on retrouve chez tous les auteurs : entre autre, le nombre de

chromosomes

(14 et 16), leur symétrie et leur richesse en hétérochromatine constitutive.

La seule différence importante révélée entre nos résultats et ceux d’autres auteurs

concerne la présence de deux nombres chromosomiques (14 et 16) chez la même espèce M.

polymorpha ainsi que la rencontre d’aneuploïdie (2n = 17) chez M. rotata.

Remarquons, enfin, que si la technique de bandes C a révélée chez Medicago, une

richesse relative en hétérochromatine constitutive, matérialisée par un marquage dont la

distribution répond au modèle typique de bandes C, il n’en est pas de même chez toutes les

plantes. Chez Ormithogalum par exemple, Azzioui (1990) signale l’existence d’une faible

quantité d’hétérochromatine, qu’il attribue à des translocations ou à des délétions.

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Ce travail a mis en application deux techniques de coloration. La première technique,

de coloration classique, a été réalisée selon la méthode dite « Feulgen » ; la seconde, la

coloration différentielle au Giemsa, met en évidence des bandes spécifiques à chaque

chromosome. Ces techniques ont été appliquées sur 10 espèces du genre Medicago.

Nous avons pu établir, peu à peu, un protocole pour les 10 espèces.

Ainsi, les nombres chromosomiques et les caryotypes de quelques espèces, ou les

chromosomes sont bien dispersés ont été déterminés (toutes les espèces étudiées sont

diploïdes à 2n = 14 et 16).

L’application de la technique de coloration différentielle sur ces espèces n’a donné des

résultats que sur une seule espèce M. ciliaris (d’origine locale). C’est un premier résultat

prometteur du fait même de la complexité des étapes du protocole expérimental, en particulier

l’étape importante de dénaturation- renaturation.

La technique de bandes C nous a permis de démontrer l’emplacement et la quantité

d’hétérochromatine constitutive présente chez l’espèce M. ciliaris. L’hétérochromatine

constitutive est fortement localisée dans les régions télomériques et centromériques et

totalement absente dans les régions intercalaires des chromosomes de cette espèce.

1

Il est évident que les techniques de bandes C représentent un instrument privilégié en

cytogénétique des plantes et sont destinées à jouer un rôle déterminant dans les recherches sur

la structure intime de chromosome.

Pour ce faire, il est impératif qu’elles évoluent afin d’atteindre une précision accrue,

notamment dans l’identification des petits chromosomes, qu’on retrouve chez des espèces

végétales.

Une voie dans ce sens a été tracée depuis quelque temps, par l’initiative de plusieurs

chercheurs d’utiliser ces techniques sur des chromosomes en prophase en en anaphase,

révélant ainsi trois fois plus de bandes que sur les chromosomes métaphasiques.

Nos perspectives de travail sont de trois ordres :

Appliquer les techniques de bandes R, N et Q sur les différentes espèces de Medicago

afin d’étudier le profil hetérochromatique chez ces espèces.

Utiliser les techniques de cytogénétique moléculaire (FISH et GISH) pour déterminer

la localisation des familles de rDNA sur les chromosomes des espèces de Medicago et

la caractérisation de leur caryotype.

Utiliser les techniques de biologie moléculaire pour caractériser les chromosomes B

dans l’optique d’obtenir certaines données quant à leur origine et fabriquer des lignées

isogéniques de Medicago uniquement par la présence de chromosomes B, cela nous

permettra d’apporter de nouveaux éléments relatifs à la place des chromosomes B

dans le génome.

1

Figure 5 : Plaques métaphasiques obtenues par la technique de Feulgen.

a) et b) M. laciniata (674) à 2n = 16. c) M. radiata (4198) à 2n = 16. d) M. noeana (2608) à

2n = 16.

a b

c

C

c

d

1

Figure 4 : Plaques métaphasiques obtenues par la technique de Feulgen. a) M. rotata (4199) à

2n = 16. b) M. rotata (726) à 2n = 16. c) et d) M. rotata (726) à 2n = 17 (avec présence du

chromosome B).

a b

c d

1

Figure 6 : Plaques métaphasiques obtenues par la technique de Feulgen. a) M. rigidula (725)

à 2n = 14. b) M. truncatula (673) à 2n = 16. c) et d) M. orbicularis (736) à 2n = 16. e) M.

intertexta (3084) à 2n = 16.

a b

c d

e

1

a b

1

Figure 7 : Plaques métaphasiques obtenues par la technique de Feulgen. a) et b) M.

polymorpha (3907) à 2n = 14. c) M. polymorpha (3032) à 2n = 16. d) M. polymorpha (3930)

à 2n = 16.

c d

1

1

1

1

1

1

1

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