H HLA™ 96/7 C A CE C B CE RÉF. : M V 10 02/05/2018 · 0086 Prépare l'ADN à l'analyse par...

0086Préparel'ADNàl'analyseparséquençage

surleséquenceurIlluminaMiSeq

HOLOTYPEHLA™96/7–CONFIGURATIONAETCE

ETCONFIGURATIONBETCE(RÉF.:H32ETRÉF.:H34)

MODED'EMPLOIVERSION1002/05/2018

OmixonBiocomputingLimited

OmixonHolotype96/7–CONFIGURATION|ConfigurationAetCEetConfigurationBetCE|Moded'emploi,version10.RéservéàunusagediagnostiqueinvitroCopyright©2017,OmixonBiocomputingLtd.Confidentieletexclusif.

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TabledesmatièresINFORMATIONSSURLEFABRICANT...........................................................................................................8

EXPLICATIONDESSYMBOLES.....................................................................................................................8

HOLOTYPEHLA-96/7–CONFIGURATIONAETCE(RÉF.:H32)OUCONFIGURATIONBETCE(RÉF.:H34)–CONTENUDUKIT........................................................................................................................................9

COFFRETDECOMPOSANTSD'AMORCES.............................................................................................................................9COFFRETCOMPOSANTDEREACTIFSDEPREPARATIONDEBANQUES.........................................................................................9PLAQUED'ADAPTATEURSA96PUITS................................................................................................................................9CLASSEUREXCEL.........................................................................................................................................................10LOGICIEL–OMIXONHLATWIN....................................................................................................................................10

EXPEDITIONETSTOCKAGE........................................................................................................................10

AVERTISSEMENTSETMISESENGARDE.....................................................................................................11

LIMITATIONSCONNUESDESPRODUITS............................................................................................................................11

INFORMATIONSRELATIVESALASECURITE...............................................................................................11

PARAMETRESDEPERFORMANCE.............................................................................................................12

ASSISTANCETECHNIQUE..........................................................................................................................12

Assistancetéléphonique:.................................................................................................................................12

ÉQUIPEMENT,REACTIFSETFOURNITURES...............................................................................................13

RECOMMANDATIONSENMATIERED'EQUIPEMENTTECHNIQUE.............................................................................................13RECOMMANDATIONSENMATIEREDEREACTIFSASSOCIES....................................................................................................13

CapacitédukitderéactifsMiSeq.....................................................................................................................14FOURNITURESRECOMMANDEES....................................................................................................................................14

MENTIONLEGALE.....................................................................................................................................15

UTILISATIONPREVUE...............................................................................................................................15

NOTEIMPORTANTEAVANTUTILISATION.................................................................................................16

RECOMMANDATIONENMATIERED'ISOLATIONDEL'ADNGENOMIQUE.................................................................................16

PRINCIPEDELAMETHODE........................................................................................................................17

RESUMEDESETAPES................................................................................................................................18

GLOSSAIRE/DEFINITIONS..........................................................................................................................19

ÉTAPE1–PREPARATIONDUMELANGEDEREFERENCEPOURL'AMPLIFICATIONHLA...............................20

LISTEDESREACTIFS.....................................................................................................................................................20PROTOCOLE...............................................................................................................................................................20

Mélangederéférence:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1..............................................................................21Mélangederéférence:HLA-DQB1Set3..........................................................................................................21

ÉTAPE2–AMPLIFICATIONDESHLADECLASSEIETII...............................................................................22


MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1...................................22MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-DQB1Set3...............................................................23AmplificationdeclasseI(HLA-A,BetC)..........................................................................................................23


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AmplificationdeclasseII(HLA-DRB1,DPB1,DQA1etDQB1)..........................................................................23Taillesattenduesdesamplicons.......................................................................................................................24

ÉTAPE3–QUANTIFICATIONETNORMALISATIONDESAMPLICONS(AL'AIDED'UNFLUOROMETREDEPLAQUE)...................................................................................................................................................25


Regroupementdesamplicons..........................................................................................................................27PurificationdesproduitsdePCRavecExoSAP-ITExpress................................................................................27

ÉTAPE4–PREPARATIONDESBANQUES...................................................................................................28


Mélangederéférencedefragmentation.........................................................................................................29Programmedefragmentation.........................................................................................................................29Mélangederéférencederéparationdesextrémités.......................................................................................30Programmederéparationdesextrémités.......................................................................................................30Mélangederéférencedeligation....................................................................................................................31Programmedeligation....................................................................................................................................31Regroupementetpurificationdesbanques.....................................................................................................32

ÉTAPE5–SELECTIONDELATAILLEDESFRAGMENTSDELABANQUE.......................................................34


ÉTAPE6–QUANTIFICATIONDELABANQUEAUMOYENDEL'APPAREILQPCR.........................................35


Mélanged'amorcesqPCR................................................................................................................................35MélangederéférenceqPCR.............................................................................................................................36

ÉTAPE7–SEQUENÇAGESURLESYSTEMEILLUMINAMISEQ.....................................................................38

LISTEDESREACTIFS.....................................................................................................................................................38CapacitédukitderéactifsMiSeq.....................................................................................................................38

PROTOCOLE...............................................................................................................................................................38

ÉTAPE8–ANALYSEDESDONNEESDESEQUENÇAGEHLA.........................................................................40

PROTOCOLEAUTOMATISE.............................................................................................................................................40Paramétrageetconfigurationinformatique....................................................................................................40Protocoleparanalyse.......................................................................................................................................40

PROTOCOLEMANUELSERVEUR......................................................................................................................................40Paramétrageetconfigurationinformatique....................................................................................................40Protocoleparanalyse.......................................................................................................................................40

PROTOCOLEMANUELBUREAU......................................................................................................................................41Paramétrageetconfigurationinformatique....................................................................................................41Protocoleparanalyse.......................................................................................................................................41

FIGURESSUPPLEMENTAIRES....................................................................................................................42

EXEMPLESDEPLAQUESD'AMPLICONS,D'AMPLIFICATION,DEDILUTION,DEQUANTIFICATIONDESAMPLICONS(POURUNLOCUSINDIVIDUEL)ETDEREACTIONS.......................................................................................................................................42EXEMPLEDEPLAQUEDEQUANTIFICATIONDESETALONS.....................................................................................................42EXEMPLEDEPLAQUEQPCRDEQUANTIFICATIONDESBANQUESKAPA..................................................................................43


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ANNEXE1:SELECTEURAUTOMATISEPIPPINPREP...................................................................................44

PROGRAMMATIONDUPIPPINPREP................................................................................................................................44UTILISATIONDUSELECTEURAUTOMATISEPIPPINPREP.......................................................................................................44

ANNEXE2:QUANTIFICATIONDESAMPLICONSAUMOYEND'UNAPPAREILQPCR...................................47


ANNEXE3:QUANTIFICATIOND'UNEBANQUEUTILISANTUNMARQUEURCOULEURFLUORESCENTDSDNAINTERCALAIRE..........................................................................................................................................49



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Historiquedudocument–Notesetmisesàjourimportantes

Version Date Auteur Résumédesmodifications Autorisépar

Dated’emission

V1 05/12/2015 Robert

PollockPremièreversion,ébauche Gergely

Tölgyesi05/12/2015

V2 18/01/2016 RobertPollock

Deuxièmeébauche,correctionsmineures GergelyTölgyesi

18/01/2016


Troisièmeébauche,miseàjourdel'explicationdessymboles,miseàjourdelarecommandationdescyclesdecongélation/décongélation,miseàjourdel'utilisationprévue

GergelyTölgyesi

10/02/2016


Quatrièmeébauche,miseàjourduchapitrerelatifauxconsignesdesécurité

GergelyTölgyesi

26/02/2016


Cinquièmeversion,recommandationalternativerelativeàl'analysequantitativedesamplicons

EfiMelista 05/04/2016

V6 09/04/2016 EfiMelista

Changementmineurdelaformulationde«EnzymeLR-PCR»pour«Taqpolymérase»suiteàlamodificationdeladocumentationdeQiagen

GergelyTölgyesi

09/04/2016

V7 23/04/2016 EfiMelista

MiseàjourdeladéclarationDQB1Set1etSet2

GergelyTölgyesi

23/04/2016

V8 30/05/2016 GergelyTölgyesi

MiseàjourdesindicateursdeperformanceMiseàjourdesvolumesderéactifsdepréparationdesbanquesMiseàjourdesconfigurationsdeproduitpourlesplaquesd'adaptateursindexésA2/A3/A4


V9 21/08/2017 GergelyTölgyesi

96/7–ConfigurationB,ajoutdelaconfigurationdeplaqued'adaptateursindexés



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V10 14/12/2017 TündeVágó

Retraitde«DQB»desadditifsDQB,vérificationdugelaprèsquelaPCRdelongueportéesoitrenduefacultative,simplificationdel'analysequantitativedesamplicons,changementduvolumederegroupementparéchantillondansleskitsde11locus,remplacementdeExoSAP-ITparExoSAP-ITExpress,utilisationdeQubitpourlaquantificationdesbanques,mélanged'amorcesDQB1sets1et2remplacéparDQB1set3,diminutiondutempsderéactionderéparationfinale,diminutiondutempsderéactiondeligation,miseàjourdelaméthodedequantificationdesbanques,fiched'échantillonsuppriméedesannexes



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Clausedenon-responsabilité

Omixonamistoutenœuvrepours'assurerdel'exactitudeduprésentmoded'emploi.Omixondécline toute responsabilité en cas d'inexactitudes ou d'omissions qu'il pourrait contenir. Lesinformationsfourniesdanscemoded'emploisontsujettesàmodificationsanspréavis.Omixonn'assumeaucune responsabilité vis-à-vis de toute inexactitudeque leprésentmoded'emploipourraitinclure.

Omixonseréserveledroitd'apporterdesaméliorationsàcemoded'emploiet/ouauxproduitsquiysontdécrits,àtoutmomentetsanspréavis.

Dans le cas où vous trouveriez dans cemanuel des informations incorrectes, trompeuses ouincomplètes, vos commentaires et suggestions seront les bienvenus. Veuillez nous les faireparveniràl'[email protected].


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InformationssurlefabricantRaisonsociale:OmixonBiocomputingLtd

Adressedevisite:Fehérváriút50-52/6

Ville:Budapest

Codepostal:H-1117

Pays:Hongrie

Explicationdessymboles

Numérodelot

Numéroderéférence

Consulterlemoded'emploi

ContientdesréactifspourunnombreNdetests

Fabricantlégal.Ladatejointeapposéeàcôtédecesymboleestladatedefabrication.

Températuredestockagerecommandée

Datedepéremption

Dispositifmédicalpourdiagnosticinvitro

ContientuncomposantderemplacementComposantderemplacement


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HolotypeHLA-96/7–ConfigurationAetCE(RÉF.:H32)ouConfigurationBetCE(RÉF.:H34)–Contenudukit

Coffretdecomposantsd'amorcesLe composant d'amorces fournit des solutions spécifiques d'amorce prêtes à l'emploi pourl'amplificationcibléedelaPCRàlongueportéedesgènesHLAA,B,C,DPB1,DQA1etDQB1,etDRB1. De plus, il contient également deux types d'additifs de la PCR (Amplificateur 1 etAmplificateur2).

Mélanged'amorces N°DERÉF. Rxns Vol./tube Nbredetubes CodecouleurHLA-A P012 96 220μl 1 JauneHLA-B P022 96 220μl 1 RougeHLA-C P032 96 220μl 1 OrangeHLA-DRB1 P042 96 220μl 1 VertHLA-DQB1(Set3) P122 96 220μl 1 BleuHLA-DQA1 P072 96 220μl 1 BrunHLA-DPB1 P082 96 220μl 1 MauveAmplificateur1 E01 96 1100μl 1 TransparentAmplificateur2 E02 96 300μl 1 Transparent

CoffretComposantderéactifsdepréparationdebanquesLe coffret de composants de préparation de banques contient les réactifs permettant lapréparationdebanques(fragmentation,réparationetadénylationdesextrémitésdesampliconsetligationdesséquencesd'adaptateursindexés)depuislesampliconsHLA.

Réactif N°DERÉF. Rxns Vol./tube Nbredetubes CodecouleurEnzymedefragmentation(A) R11 96 278μl 1 JauneTampondefragmentation(B) R21 96 278μl 1 RougeEnzymederéparationdesextrémités(C)

R31 96 162μl 1 Vert

Tamponderéparationdesextrémités(D)

R41 96 324μl 1 Orange

Enzymedeligation(E) R51 96 324μl 1 BleuTampondeligation(F) R61 96 1800μl 2 Noir

Plaqued'adaptateursà96puitsLecomposantPlaqued'adaptateursindexésà96puitscontientdesadaptateursNGSindexésprêtsàl'emploi(oligonucléotidesd'ADNdoublebrin)ensolutionde5µl,pourlagénérationdebanquesNGS individuelles. La plaque d'adaptateurs indexés à 96 puits contient un nombre suffisant


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d'adaptateursindexéspourlagénérationde96banquesNGSindividuellesetpourl'identificationdeséchantillonsenaval.

Versiondukit Réactif N°DERÉF. Rxns Vol./puits Nbrede

plaquesH32 Plaqued'adaptateursA(i1-96) N1 96 5μl 1H34 Plaqued'adaptateursB(i97-192) N2 96 5μl 1

ClasseurExcelUnclasseurExcelestfourniafindeprendreenchargelescalculs,lesagencementsdeplaqueetlatenuedesdossiersduprotocoleHolotypeHLA96/7,lacréationdesfichesd'échantillonMiSeqet plus encore. Si vous n'en possédez pas un exemplaire, veuillez [email protected].

Logiciel–OmixonHLATwinContactez [email protected] pour obtenir les crédits Omixon HLA Twin associés à votreacquisitiondukitHolotypeHLA96/7.

Noteimportante:Utilisez les trois composantsdukitOmixonHolotypeHLA96/7et le logicielOmixonHLATwinconjointement afin de constituer un flux de travail d'utilisation diagnostique in vitro. Veuillezconsulter le chapitre consacré aux avertissements et mises en garde associés aux limitationsd'utilisationdesproduits.

Lescomposantsderemplacementsontdisponiblessurdemandeexpressedesutilisateurs.VeuilleznoterquelesremplacementssontfournisparOmixonpourdescoffretsdecomposants,etnonpourdesflaconsindividuels.Pourplusd'informations,[email protected].

ExpéditionetstockageLesproduitssontexpédiéssurdescryopacksdansdesemballagesenStyrofoametdoiventêtrestockésà-20°Cdèsleurarrivée.Veuillezvaliderleprocessusdecontrôleetdesurveillancedetempératuredevoscongélateursetleréviserrégulièrement.

Leskitsnonouvertssontstablesjusqu'àleurdatedepéremption(indiquéesurl'étiquettedukit)lorsqu'ilssontstockésà-20°C.

Unefoisleproduitouvert,ilestrecommandéderespecterunmaximumde4(quatre)cyclesdecongélation/décongélationafindegarantir la stabilitéduproduit. Leskitsouvertssontstablesjusqu'à3moislorsqu'ilssontstockésà-20°C.


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AvertissementsetmisesengardeLimitationsd'utilisationdesproduitsAfindebénéficierdesmeilleuresperformances,veuillezappliquerlefluxdetravaildukitHolotypeHLA96/7etlelogicielOmixonHLATwinlorsdutypageHLAparNGSaveclesmatériaux,réactifsetéquipementrecommandésauchapitre«Équipementetréactifs».

L'utilisationdematériauxautresqueceuxspécifiésauchapitre«Équipementetréactifs»doitêtrevérifiéeetvalidéeparl'utilisateur.

Neprocédezpasàlareconstitutionouàladilutiondesréactifsdansdesvolumesautresqueceuxindiquésdans leprésentmoded'emploi.N'utilisezpasunvolumedesréactifs inférieuràceluiindiquédansleprésentmoded'emploi.Lenon-respectdeces indicationspeutconduireàdeserreursdeperformance.

Omixonnesauraitfourniruneassistanceencasdeproblèmesrésultantdunon-respectdesétapesduprotocoledécritesdansleprésentmoded'emploi.

N'utilisezpas leproduitencasdedommagevisibledesescomposants(flaconscassés,plaquerompue,capuchonsdesserrés,etc.).

LimitationsconnuesdesproduitsVeuillez vous référer au document intitulé Product Known Limitations Guide (Guide deslimitations connuesdesproduits) afinde connaître les limitationset ambiguïtés logiciellesduproduitHolotypeHLA.Ceguideestdistribuéconjointementaumoded'emploimaissetrouveégalementsurlesiteWebOmixonsousMyHolotype/SupportetServices/HLATwinInstructionsforUse,ouestdisponiblesursimpledemandeàl'[email protected].

InformationsrelativesàlasécuritéAvant de commencer, veuillez lire les paragraphes « Informations relatives à la sécurité » et«Notes importantes » concernant les réactifs ou les kits indiqués au chapitre « Équipement,réactifsetfournitures».

Lorsquevousemployezdesproduitschimiques,portezuneblousedelaboratoireadéquate,desgants jetables et des lunettesde sécurité. Pourplusd'informations, veuillez consulter les FDS(Fichesdedonnéesde sécurité) appropriéesmisesàdispositionpar le fournisseurduproduitconcerné.

Un descriptif des composants chimiques des réactifs est fourni dans les FDS du kit HolotypeHLA96/7,disponiblessursimpledemande.

Procédezàl'éliminationdescomposantsduproduitentantquedéchetsmédicauxgénéraux.


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ParamètresdeperformancePrincipauxparamètresdeperformanceétablisconformémentàlavalidationduproduit.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Sensibilité 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Spécificité 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%

Précision 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Exactitude 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%

Reproductibilité 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%

Répétabilité 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

AssistancetechniquePouruneassistancegénéralerelativeàceprotocole,[email protected].

Assistancetéléphonique:États-Unis|+1(617)5000790Europe|+36(70)5748001Autrespays|+1(617)5000790


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Équipement,réactifsetfournitures

Recommandationsenmatièred'équipementtechnique§ Thermocycleurauformat96puits§ Fluoromètredeplaque(outoutinstrumentcapablededétecterlafluorescencedesplaques

auformat96puits,utilisableaveclesystèmePromegaQuantiFluordsDNA)§ SélecteurautomatiséPippinPrep(RÉF.PIP0001)ouBluePippin(RÉF.BLU0001)deSAGE

Science§ InstrumentqPCRpourplaquesauformat96ou384puits§ FluoromètreQubit(RÉF.Q33216)deThermoFisherScientific(facultatif)§ SéquenceurIlluminaMiSeq(RÉF.SY-410-1003)§ Ordinateuren64bitsavecauminimum4cœurset16GodeRAM§ Supportsdestockagededonnéesàlongterme(approximativement2Todedonnéespar

séquenceurMiSeqetparan)

Recommandationsenmatièrederéactifsassociés§ KitsLongRangePCRdeQiagen(RÉF.206401,206402ou206403)

§ Chaqueéchantillonrequiert3,2μldeTaqpolymérase.§ LekitLongRangePCR(20)RÉF.206401contient8μldeTaqpolymérase.§ LekitLongRangePCR(100)RÉF.206402contient40μldeTaqpolymérase.§ LekitLongRangePCR(250)RÉF.206403contient100μldeTaqpolymérase.

§ ExoSAP-ITdeAffymetrix(RÉF.75001-200,75001-1ML,75001-4X-1MLou75001-10ML)§ Chaqueéchantillongroupérequiert4μld'enzymeExoSAP-IT.§ LeréactifRÉF.75001-200contient200μld'enzymeExoSAP-ITExpress.§ LeréactifRÉF.75001-1-MLcontient1mld'enzymeExoSAP-ITExpress.§ LeréactifRÉF.75001-4X-1MLcontient4mld'enzymeExoSAP-ITExpress.§ LeréactifRÉF.75001-10MLcontient10mld'enzymeExoSAP-ITExpress.

§ KitLibraryQuantification–Illumina/UniversaldeKAPABiosystems(RÉF.KK4824)§ KitdetestQubitdsDNABRAssay(RÉF.Q32850ouQ32853)(facultatif)

§ LekitRÉF.Q32850contient100tests.§ LekitRÉF.Q32853contient500tests.

§ SystèmeQuantiFluordsDNAdePromega(RÉF.E2670)§ KitdebillesAgencourtAMPureXPbeadsdeBeckmanCoulter (RÉF.A63880,A63881ou

A63882)§ ChaqueexécutionHolotypeHLArequiertunmaximumde900μldebillesAMpureXP.§ LekitRÉF.A63880contient5mldebillesAMPureXP.§ LekitRÉF.A63881contient60mldebillesAMPureXP.§ LekitRÉF.A63882contient450mldebillesAMPureXP.

§ Cassettedegelà1,5%d'agarose,sanscolorantavecétaloninterne(MarqueurK/R2),pourle sélecteur automatisé Pippin Prep/Blue Pippin (RÉF. CDF1510 pour le Pippin Prep etRÉF.BDF1510pourleBluePippin)

§ Éthanoldequalitémoléculaire(alcoolanhydre)


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§ Eaudequalitémoléculaire(exemptedeDNaseetRNase)§ Hydroxydedesodium§ TamponTE1×(pH8,0)§ KitderéactifsMiSeqdeIllumina

CapacitédukitderéactifsMiSeq

KitderéactifsIlluminaMiSeq

TempsHeures

Échantillons96/7

Std500Cycle(MS-102-2003)

~39 96


~24 96

Micro300Cycle(MS-103-1002)

~19 28

Nano500Cycle(MS-103-1003)

~28 12


~17 6

Fournituresrecommandées§ Tubesdemicrocentrifugationde1,5ml§ Tubesdemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml§ Tubes de microcentrifugation à liaison faible de 2,0 ml (tubes Eppendorf DNA LoBind

RÉF.022431048recommandés)§ Tubes à paroi mince de 0,5 ml pour appareil Qubit (tubes à essai Qubit RÉF. Q32856

recommandés)§ Pipettesàvolumeréglable(capacitéde1,0à1000μl)§ Pipettesàvolumeréglableà8canaux(capacitéde1,0à100μl)§ Plaquesà96puitscompatiblesaveclethermocycleur§ Plaquesoptiquesà96puitscompatiblesaveclefluoromètredeplaque§ Plaquesà96puitscompatiblesavecl'appareilqPCR§ Filmdescellagepourplaqued'usagegénéral§ Filmdescellagepourplaquecompatibleaveclethermocycleur(testépourlaPCRàlongue

portée)§ Filmdescellagepourplaqueoptiquecompatibleavecl'appareilqPCR(facultatif)§ Supportmagnétiquecompatibleaveclestubesdemicrocentrifugationde2ml§ Portoirsderefroidissement96puits(2pièces)§ Tubesconiquesde50ml§ Réservoirsde50ml


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MentionlégaleLemode d'emploi du produit HolotypeHLA 96/7 et son contenu sont la propriété d'OmixonBiocomputing Limited («Omixon»),et sont conçusaux finsdu seulusagecontractuelde sesclientsencequiconcerneleoulesproduit(s)décrit(s)danscedocumentetànulleautrefin.Leprésent document et son contenu ne seront pas utilisés ni distribués à toute autre fin niautrement communiqués, divulgués ou reproduits par quelque moyen que ce soit sans leconsentement écrit préalable d'Omixon. Par le présent document, Omixon n'accorde aucunelicenceenvertudesesbrevet,marquedecommerce,droitd'auteuroudroitsditsde«commonlaw»nidroitssimilairesdetoutetiercepartie.

LelogicielOmixonHLATwin(«logiciel»)estutilisésouslicenceparleclientdanslesconditionsgénéralesdeventedéfiniesdansleCLUFd'OmixonHLATwin(www.omixon.com/hla-twin-eula/).Sivousn'acceptezpaslesprésentesconditionsgénéralesdevente,Omixonnevousaccordepasdelicencedulogiciel,etvousnedevezpasutiliserouinstallerlelogiciel.

Lesinstructionscontenuesdanscedocumentdoiventêtrestrictementetexplicitementsuiviesparunpersonnelqualifiéetdûmentforméafind'assurerl'utilisationsûreetappropriéeduoudesproduit(s)décrit(s)auxprésentes.Lalectureetlabonnecompréhensionducontenudecedocument dans son intégralité préalablement à l'utilisation de ce ou ces produit(s) sontincontournables.

TOUT MANQUEMENT À LA LECTURE INTÉGRALE ET AU STRICT SUIVI DE LA TOTALITÉ DESINSTRUCTIONSCONTENUESDANSLEPRÉSENTDOCUMENTPEUTCONDUIREÀDESDOMMAGESMATÉRIELSDU/DESPRODUIT(S),ÀDESDOMMAGESCORPORELSAUXPERSONNES,NOTAMMENTAUXUTILISATEURSETAUTRESTIERS,AINSIQU'ÀDESDOMMAGESMATÉRIELSÀLAPROPRIÉTÉD'AUTRUI.

OMIXONN'ASSUMEAUCUNERESPONSABILITÉDÉCOULANTDE L'USAGE INAPPROPRIÉDUOUDES PRODUIT(S) DÉCRIT(S) AUX PRÉSENTES (Y COMPRIS LES PIÈCES OU LE LOGICIEL DUDITPRODUIT)OUDETOUTUSAGEDUOUDESDIT(S)PRODUIT(S)HORSDUCHAMPD'APPLICATIONDESLICENCESOUAUTORISATIONSÉCRITESEXPRESSESACCORDÉESPAROMIXONENRELATIONAVECL'ACQUISITIONDETEL(S)PRODUIT(S)PARLECLIENT.

RÉSERVÉÀUNUSAGEDIAGNOSTIQUEINVITRO©2017OmixonBiocomputingLtd.Tousdroitsréservés.

UtilisationprévueLeproduitHolotypeHLA96/7–ConfigurationAetCEetConfigurationBetCE(ci-aprèsnommé«HolotypeHLA»)estunecombinaisonderéactifspourtestdiagnostiqueinvitroetdulogicield'analyse de données (Omixon HLA Twin™). Il est conçu pour permettre l'identification et ladéfinitiondesHLA(humanleukocyteantigens,antigènesdesleucocyteshumains)declasseIetIIdans le cadre d'un typage HLA utilisant la plateforme Illumina® MiSeq Next Generation


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Sequencing.LeproduitHolotypeHLAfournitdesinformationssurl'histocompatibilitédeslociHLAdeclasseI(A,BetC)etdeclasseII(DPB1,DQA1,DQB1etDRB1)enutilisantl'ADNgénomiquehumain.

LelogicielOmixonHLATwin™inclusdansleproduitHolotypeHLAestconçupourl'interprétationetlacorrélationdesdonnéesdeséquençagegénéréessurlesystèmeIllumina®MiSeqavecpourrésultatuntypageHLAauniveaudesallèlesenuneseulepassedehauteprécision,dotéd'untrèsfaibletauxd'ambiguïtéàunniveaude2décimales.

LeproduitHolotypeHLAestconçupourunusagediagnostiqueinvitroparunpersonnelmédicalprofessionnel,telquedestechniciensdelaboratoireetdesmédecins,dûmentformésautypageHLAdansdeslaboratoiresdediagnosticagréésEFIouASHIoupossédantlacapacitérequisepourtravaillerconformémentauxspécificationsEFIouASHI.

Noteimportanteavantutilisation

Recommandationenmatièred'isolationdel'ADNgénomiqueL'ADNgénomiquehumaindoitêtrepréparéàl'aidedekitsdepréparationdel'ADNcorrectementtestés,disponiblesdanslecommerce,afind'assurerlaconstancedelapréparation.Quellequesoit l'approche, la déterminationprécisede la concentration et de la pureté est requisepourassurerunesolideperformancedutest.

L'ADNdoitêtreexemptdecontaminants(p.ex.alcool,sels,détergents,formaldéhydeethéparine)qui pourraient compromettre l'amplification, la préparation des banques et les étapes deséquençageàunstadeultérieur.Lesangnedoitpasêtreprélevédansdestubeshéparinés,etdeséchantillons sanguins prélevés chez des patients traités sous héparine, de même que deséchantillonslipémiquesouhémolysésnedoiventpasêtreutilisés.

L'ADN génomique préparé peut être utilisé immédiatement s'il a été préparé dans de l'eauexemptedenucléase,oustocképourdespériodesprolongéesàunetempératurede-20oCoumoins.Nousrecommandonsl'utilisationd'eaupourlapréparationdel'ADNgénomiquecarl'EDTAcontenu dans le tampon TE peut inhiber les réactions de la PCR à longue portée. Lesdécongélationsrépétéesdoiventêtreévitéespourréduirelesrisquesdedégradation.

Uneconcentrationde20à30ng/µldel'ADNestfortementrecommandéepourobtenirunintrantde100à150ngd'ADNgénomiqueparamplificationdePCR.Nous recommandons fortementd'utiliseruneméthodedequantificationbaséesurlafluorescencepourdéterminerlaconcentrationdugADN.

Unrapportd'absorptiondesvaleurs260nm/280nmet260nm/230nmde1,7à2estfortementrecommandé.

Pour l'amplification de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 et HLA-DQB1,0,8à1,2µgd'ADNgénomiqueestrequis.


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PrincipedelaméthodePendant de nombreuses années, la communauté HLA a travaillé au développement d'uneméthodequi identifierait avecprécision lepolymorphismeextensifdesgènesHLAetde leursproduitsgéniques.L'avènementdelaPCR,combinéeàd'autrestechnologies(séquençageSanger,SSOP,SSP,Luminex),afourniuneformuleaméliorantsensiblementladétectiondupolymorphismeHLAmaisplusieurslimitationssubsistaientnéanmoins,quicontinuaientd'entravernotrecapacitéàcaractériserlesgènesHLAdemanièreexhaustive.Lestechnologiesdéveloppéescesdernièresannées, globalement appelées NGS (Next Generation Sequencing, Séquençage de nouvellegénération),ontouvertdenouvellesopportunitésquipermettentlacaractérisationcomplètedesgènesHLAdefaçonhaploïde.LeNGSpossèdedeuxcaractéristiquesdistinctes,lapremièreétantleséquençageclonaldesfragmentsd'ADNetlaseconde,undébitextrêmementélevé.LeNGSdonnelacapacitédephaserlespolymorphismesetdoncd'éliminertouteslesambiguïtés,etdefourniruntypageHLAàdesniveauxde3à4décimalessansrecouriràdestestsdecontrôle.Parconséquent,ilapporteunesolutionpotentiellementcomplèteàlaproblématiquedutypageHLA.Leprotocoledécriticibénéficiedecettetechnologieetcombinel'amplificationdelaPCRàlongueportéedesgènesHLAavecleséquençagesurlaplateformeIlluminaMiSeq.Plusspécifiquement,lesgènesHLAA,B,C,DQA1etDQB1sontamplifiéssurlatotalitédeleurlongueurdecodage,ycomprislesélémentsdesrégionsnontraduitesdesextrémités5’et3’,tandisqueleDRB1estamplifiédel'intron1àl'intron4etqueleDPB1estamplifiédel'intron1àlarégionnontraduite3’.Lesampliconssontensuitetraitésselonlaprocéduresuivante:

1. Fragmentationdesampliconsàune tailleappropriéepour le séquençage sur laplateformeIllumina.

2. Réparationetadénylationdesextrémitésdesampliconsfragmentés.

3. Ligationdesséquencesd'adaptateursutiliséesdurant leprocessussur leséquenceurMiSeqpourcapturer,amplifieretséquencerl'ADN.Lesadaptateursincluentégalementunindexquiestunecourteséquence,univoquedechaqueadaptateur,permettantd'identifierlesoriginesdelabanque(échantillon/locus).

Aprèsmiseencommundesbanquesindexées,sélectiondestaillesetquantification,l'échantillonest chargé sur le séquenceur MiSeq pour séquençage. L'ensemble du processus prend de3à5jours,enfonctiondelasélectiondelacellulededébitsurlaplateformeIllumina.Unrésumédesétapesduprotocoleestillustrédanslediagrammeci-dessous:


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Résumédesétapes


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Glossaire/Définitions§ Plaqued'amplicons–AutrenompourPlaqued'amplification§ Plaquedequantificationd'amplicons–Plaqueà96puitscompatibleaveclefluoromètrede

plaqueoùlesampliconsdiluéssontquantifiés§ Plaqued'amplification–PlaquedePCRà96puitsutiliséepouramplifierlelociHLA§ Banque finale – Banque qui inclut toutes les banques d'échantillons prêtes à être

séquencéesenuneseuleexécutionduséquenceurMiSeq§ Plaquederéactions–Plaquesurlaquelleontlieulesréactionsséquentiellesdefragmentation,

réparationdesextrémitésetligationdesadaptateursindexésàlabanqued'échantillons§ Plaque de réactifs – Plaque utilisée pour aliquoter les différents réactifs servant à la

préparationdesbanques§ Banqued'échantillons–Banquepréparéeencombinant(regroupant)tousleslociHLAd'un

échantillondonné§ Plaqued'amplicons regroupés–Plaquecontenantunebanqued'échantillons (tous locis

combinés)parpuits§ Plaquedequantificationd'étalons–Plaqueà96puitscompatibleaveclefluoromètrede

plaqueoùlesétalonsd'ADNsontplacésenvuedelaquantificationdesamplicons


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Étape1–Préparationdumélangederéférencepourl'amplificationHLADurée:~1heure45minutesL'objectifdecetteétapeestdepréparerdesmélangesderéférencepar locus,afind'amplifierchaquelocusHLAcibléindividuellement.LeslociamplifiésparceprotocolesontHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1etHLA-DQB1.

Remarque:Lesmélangesderéférencepréparésàcetteétapeincluenttouslesréactifsnécessairesàl'amplification,exceptéleTaqpolymérase.

ListedesréactifsArticle Stockage Fournipar

Mélanged'amorcesHLA-A -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-B -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-C -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DRB1 -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DPB1 -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DQA1 -20°C OmixonMélanged'amorcesHLA-DQB1(Set3) -20°C OmixonAmplificateur1 -20°C OmixonAmplificateur2 -20°C OmixonTamponpourPCRdelongueportée(10×) -20°C QiagendNTP(10mMchacun) -20°C QiagenH2Odequalitémoléculaire -20°C Qiagen

Protocole1.1 –Sortirtouslesmélangesd'amorces,lesamplificateurs1et2,lesdNTPetletamponpour

PCR à longue portée (10×) de leur lieu de stockage et les décongeler à températureambiante.

1.2 –Préparerlacombinaisond'amplificateurs:ajouter132μld'amplificateur2dansletubed'amplificateur1.Remplacer l'étiquetteAmplificateur1paruneétiquetteAmplificateurcombiné.

1.3 –Préparerunmélangederéférencepourchaquemélanged'amorcesconformémentauxtableauxci-dessous:


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Mélangederéférence:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1

Réactif Volume/échantillon/locus

Volume/96échantillons/locus

Mélanged'amorces 2μl 204μlTamponpourPCRdelongueportée(10×) 2,5μl 255μlMélangedNTP(10mMchacun) 1,25μl 127,5μlH2Odequalitémoléculaire 13,85μl 1412,7μlVolumetotal 19,6μl 1999,2μl

Mélangederéférence:HLA-DQB1Set3



Mélanged'amorces 2μl 204μlTamponpourPCRdelongueportée(10×) 2,5μl 255μlMélangedNTP(10mMchacun) 1,25μl 127,5μlAmplificateurcombiné 5,6μL 571,2μlH2Odequalitémoléculaire 7,85μl 800,7μlVolumetotal 19,2μl 1958,4μl

1.1 –Mélangerauvortexchaquemélangederéférenceetlescentrifugerpendant1seconde.Lesplacersurdelaglace.

1.2 –DiluertouslesADNgénomiquesàuneconcentrationde30ng/μl(volumeminimal:45μl).

Remarque:LeHolotypeHLAcontientsuffisammentderéactifspour96réactionsetunvolumesupplémentairepourtenircomptedespertesduesaupipetageetauxéchecsd'amplification.


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Étape2–AmplificationdesHLAdeclasseIetIIDurée:~7heures50minutesL'objectifdel'étape2estd'amplifierleslociHLA.Lesconditionsd’amplificationdesHLAdeclasseIetIIontétéoptimiséesàl'aidededeuxprogrammesdePCRdistincts.UnefoislesréactionsdelaPCRterminées,l’amplificationestvérifiéeparélectrophorèsesurgeld’agarose(facultatif).

Conseilrapide:l'électrophorèsesurgeld’agarose(étape2.5),bienquerecommandée,n'estpasrequisepourparfaitementexécuterleprotocoleHolotypeHLA.Lorsquelesampliconssontquantifiés (Étape3), touteconcentrationsupérieureà50ng/µlestconsidéréecommeuneamplificationréussie.L'électrophorèsesurgeld’agaroseestuneétape importantedecontrôlede laqualitéetnedoitpasêtre ignoréeparunutilisateur qui n'aurait pas une expérience suffisante du protocole Holotype HLAentier.


MélangederéférenceHLA-A -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-B -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-C -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DRB1 -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DPB1 -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DQA1 -20°C Étape1MélangederéférenceHLA-DQB1(Set3) -20°C Étape1Taqpolymérase -20°C QiagengADN 4°C UtilisateurH2Odequalitémoléculaire 20°C Utilisateur

Protocole2.1 –SortirleTaqpolymérasedesonlieudestockage,lecentrifugerbrièvement,puisl'ajouter

à chaquemélange de référence conformément aux tableaux ci-dessous, en rinçant lespointesdepipettesoigneusementàchaquepipetage:

MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1



Mélangederéférencedel'étape1 19,6μl 1999,2μlTaqpolymérase 0,4μl 40,8μlTotal 20μl 2040μl


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MélangederéférencechargédeTaqpolymérase:HLA-DQB1Set3



Mélangederéférencedel'étape1 19,2μl 1958,4μlTaqpolymérase 0,8μl 81,6μlTotal 20μl 2040μl

2.2 –Mélangerauvortexpuiscentrifugerbrièvementtouslesmélangesderéférencechargésen Taq polymérase. Aliquoter 20 μl de chaque mélange de référence chargé en TaqpolymérasedansdespuitsséparésdeplaquesdePCRà96puits.

Remarque:LesamplificationsdeclasseIetIIontétéoptimiséesàl'aidededeuxprogrammesdePCRdistincts.Parconséquent,lesmélangesderéférencedeclasseIetIInedoiventpasêtreplacésdanslamêmeplaque.

2.3 –Ajouter5μldechaqueéchantillond'ADNgénomiquediluédanslespuitscorrespondantsdesplaquespréparéesàl’étapeprécédente.Mélangerparpipetage.Scellerlespuitsavecdu film de scellage thermique et inspecter visuellement chaque puits. Centrifugerbrièvementtouteslesplaquesd’amplification.

2.4 –Placerlesplaquesd’amplificationdansdesthermocycleursetexécuterlesprogrammesd’amplificationdeclasseIetIIconformémentauxtableauxci-dessous:

AmplificationdeclasseI(HLA-A,BetC)

Nombredecycles Température Temps1 95°C 3minutes 95°C 15secondes

35 65°C 30secondes 68°C 5minutes1 68°C 10minutes1 4°C ∞

AmplificationdeclasseII(HLA-DRB1,DPB1,DQA1etDQB1)

Nombredecycles Température Temps1 95°C 3minutes 93°C 15secondes

35 60°C 30secondes 68°C 9minutes1 68°C 10minutes1 4°C ∞


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Remarque:Laréussitedel’amplificationpeutêtrevérifiéeenexécutant2μldechaqueampliconsurdugeld’agaroseà2%standard,à250Vpendant30minutes.(Facultatif)

TaillesattenduesdesampliconsLocusHLA Tailleattenduedesamplicons(kb)

HLA-A,BetC ~3HLA-DRB1 ~4,3HLA-DPB1 ~6,7HLA-DQA1 ~6

HLA-DQB(Set3) ~6,6

Point d'arrêt sans altération. Les amplicons peuvent être stockés sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.


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Étape3–Quantificationetnormalisationdesamplicons(àl'aided'unfluoromètredeplaque)Durée:~1heure50minutesLaquantificationetlanormalisationdesampliconssontrecommandéesafind'assureruneentréeprécisedans l'étapedepréparationdebanque(facultatif).LaconcentrationdesampliconsestmesuréeaveclesystèmeQuantiFluordsDNAquicontientunmarqueurfluorescentsefixantsurl’ADNetunétalonADNpermettantunequantificationprécisedepetitesquantitésd’ADNdoublebrin.(dsADN).Seréféreràl’annexe2pourdesinstructionsdequantificationdesampliconssurunappareilqPCR.

Conseilrapide:laquantificationdesamplicons,bienquerecommandée,n'estpasrequisepourparfaitementexécuterleprotocoleHolotypeHLA.Lanormalisationdes amplicons ne requiert pas une mesure précise de la concentration desamplicons. En guise d'alternative, une estimation de la concentration desampliconsfondéesurl'expérienceouuneélectrophorèsesurgeld’agarosepeutêtre utilisée. La quantification des amplicons ne doit pas être ignorée par unutilisateur qui n'aurait pas une solide expérience du protocole Holotype HLAentier.


Plaqued'amplificationdeclasseI 4°C Étape2Plaqued'amplificationdeclasseII 4°C Étape2ÉtalonADNLambda(100ng/μl) 4°C PromegaMarqueurcouleurQuantiFluordsDNA(200×) 4°C PromegaTamponTE20×(pH7,5) 4°C PromegaH2Odequalitémoléculaire 20à25°C UtilisateurExoSAP-iTExpress -20°C Affymetrix


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Protocole3.1 – Préparer des étalons d’ADNpar dilution sérielle de l’étalonADN LambdaQuantiFluor

(100ng/μl)fournidanslekitQuantiFlor,conformémentautableaudedilutionci-dessous:

Libellédutube ADNutilisé Volumed'ADN(μl)

VolumeTE1x(μl) Conc.finale(ng/μl)

Étalon1 ADNLambda 7,5μl 492,5μl 1,5ng/μlÉtalon2 Étalon1 250μl 250μl 0,75ng/μlÉtalon3 Étalon2 250μl 250μl 0,38ng/μlÉtalon4 Étalon3 250μl 250μl 0,19ng/μlÉtalon5 Étalon4 250μl 250μl 0,09ng/μlÉtalon6 Étalon5 250μl 250μl 0,05ng/μlVierge Vierge 0μl 250μl 0ng/μl

3.2 –Préparerlesplaquesdequantificationdesamplicons(voirlesfiguressupplémentaires).Aliquoter99μldetamponTE1xTEdanslespuitsd'uneplaqueoptiqueà96puitspourlenombretotald'ampliconsàquantifier.

3.3 –Ajouter1μldesampliconsdespuitscorrespondantsdesplaquesd'amplificationdanslespuitsindividuelsdesplaquesdequantificationdesamplicons.Mélangerparpipetage.

3.4 –Préparerunesolutiondetravailaveclemarqueurcouleur1×QuantiFluorDyeselonlaformulesuivante:0,5μldemarqueurcouleurQuantiFluorDye(200X)+99,5μldetamponTE 1×. Préparer une quantité suffisante de solution de travail demarqueur couleur 1×QuantiFluorDyedesortequechaqueéchantillon(totalitédeséchantillonsdanslesplaquesd'amplification)etchaqueétalon(14autotal)reçoiveunaliquotede100μl.

3.5 –Prépareruneplaquedequantificationdesétalonsetdesplaquesdequantificationdesamplicons.Aliquoter100μldesolutiondetravaildemarqueurcouleur1×QuantiFluorDyedans les puits de la plaque optique à 96 puits, qui sera la plaque de quantification desétalons,etdesplaquesdequantificationdesampliconspréparéesàl'étape3.2.

3.6 – Utiliser les étalons préparés ci-dessus et ajouter 100 μl de chaque étalon, en doubleexemplaire,danslespuitsindividuelsdelaplaquedequantificationdesétalons(14puitsautotal).Mélangerparpipetage.

3.7 –Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

3.8 –Effectuerunpassagedelaplaquedequantificationdesétalonsdanslefluoromètre,suivid'unpassagedesplaquesdequantificationd’amplicons.

3.9 – Calculer la concentration de l'ADN dans les plaques de quantification d’amplicons enutilisantlesdonnéesdeRFU(Relativefluorescenceunits,Unitésdefluorescencerelative)généréesparlefluoromètredeplaque.Pouruneassistanceenmatièredecalculs,seréféreràl'ongletDilutionduclasseurExcelfourni.

3.10 –Diluerl’ADNdanslesplaquesd’amplificationavecdel’eaudequalitémoléculairepourquelaconcentrationfinaledel’ADNsoitde67ng/μlenviron.


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§ Silaconcentrationdel'ADNestégaleousupérieureà150ng/μl,ajouter25μld'eau.§ Silaconcentrationdel'ADNestcompriseentre100et150ng/μl,ajouter10μld'eau.§ Silaconcentrationdel'ADNestinférieureà100ng/µl,nepasajouterd'eau.

Regroupementdesamplicons3.11 – Regrouper tous les loci de chaque échantillon dans une seule plaque d'amplicons

regroupés. Combiner les volumes indiqués de chaque locus comme dans le tableau ci-dessouspourobtenirunvolumefinalde35µl:

LocusHLA VolumeregroupéA 5μlB 5μlC 5μl

DRB1 5μlDPB1 5μlDQA1 5μl

DQB1Set3 5μl

3.12 –Ajouter4μld'ExoSAP-iTExpressdanschaquebanqued'échantillons.Rincerlespointesdepipette après chaque pipetage. Sceller la plaque avec du film de scellage thermique etcentrifugerbrièvement.

3.13 –Placerlaplaqued'ampliconsregroupésdansunthermocycleuretexécuterleprogrammesuivant:

PurificationdesproduitsdePCRavecExoSAP-ITExpress

Nombredecycles Température Temps1 37°C 4minutes1 80°C 1minute1 4°C ∞

Point d'arrêt sans altération. Les amplicons peuvent être stockés sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.


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Étape4–PréparationdesbanquesDurée:~3heuresAu cours de cette étape, les amplicons regroupés sont préparés pour le séquençage sur leséquenceur IlluminaMiSeq.Lesampliconssont fragmentésparune réactionenzymatique, lesextrémitéssontréparéesetadénylatées,etlesadaptateursindexéssontligaturésauxextrémités.Unemiseencommundesbanquesestensuiteeffectuée,suivied'unseulnettoyageetd'uneétapedeconcentrationàl'aidedebillesAMPureXP.

Remarque :Omixon recommandedes volumes plus importants que nécessairepour96échantillonscarbonnombred'enzymesetdetamponssontvisqueux,cequipeutentraîneruneperteexcessivelorsdupipetage.


Plaqued'ampliconsregroupés 4°C Étape3Enzymedefragmentation(A) -20°C OmixonTampondefragmentation(B) -20°C OmixonEnzymederéparationdesextrémités(C) -20°C OmixonTamponderéparationdesextrémités(D) -20°C OmixonEnzymedeligation(E) -20°C OmixonTampondeligation(F) -20°C OmixonPlaqued'adaptateurs -20°C OmixonBillesAMPureXP 4°C BeckmanCoulterÉthanolà80%(fraîchementpréparé) 20à25°C UtilisateurH2Odequalitémoléculaire 20à25°C Utilisateur

Protocole4.1 –Mettreenmarchelethermocycleur.Vérifierquelecouverclechauffantestencoursde

chauffe.

Remarque:Veilleràmélangervigoureusementauvortexl’enzymedefragmentation(A)avantutilisation.

4.2 – Préparer le mélange de référence de fragmentation conformément au tableau ci-dessous:


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Mélangederéférencedefragmentation

Réactif Volumeparbanque(μl)

Volumesrecommandéspour96banques(µl) Codecouleur

Enzymedefragmentation(A) 2μl 220,8μl JauneTampondefragmentation(B) 2μl 220,8μl RougeVolumetotal 4μl 441,6μl

4.3 –Prépareruneplaquederéactifs:placerunenouvelleplaquepourPCRà96puitssurunportoirderefroidissementdePCRetaliquoterunequantitéégaledemélangederéférencedefragmentationdanschaquepuitsd'uneseulecolonne.

Remarque:Laréactiondefragmentationaétéconçuedesortequel’ADNobtenusoitdelatailleidéalepourleséquençagesurlesystèmeIlluminaMiSeq.Ilestimportantdemaintenirlesréactifsaufraisjusqu’audémarragedelaréactiondanslethermocycleurafind'éviterune fragmentationexcessive. Il est recommandéd’utiliserdespipettesmulticanalpourminimiserlerisquedefragmentationexcessive.

4.4 –Centrifugerlaplaqued'ampliconsregroupéspendant10secondes,puisplacez-lasurdelaglaceouuncryopack.

4.5 –Prépareruneplaquederéactions:placerunenouvelleplaquedePCRà96puitssurunportoirderefroidissementdePCR.

4.6 –Ajouter4μldemélangederéférencedefragmentationdelaplaquederéactifsdanslespuitsdelaplaquederéactions,correspondantauxéchantillonsdelaplaqued'ampliconsregroupés.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.

4.7 –Transférer16μldechaqueamplicondelaplaqued'ampliconsregroupésdanslespuitscorrespondantsdelaplaquederéactionsàl'aided'unepipettemulticanal.Mélangerparpipetage.

4.8 –Scellerlaplaquederéactionsavecdufilmdescellagethermiqueetcentrifugerpendant10secondes.

4.9 –Incuberlaplaquederéactionsdansunthermocycleuravecleprogrammesuivant:

Programmedefragmentation

Nombredecycles Température Temps1 37°C 10minutes1 70°C 15minutes1 4°C ∞

Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.


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4.10 –Préparerlemélangederéférencederéparationdesextrémitésconformémentautableauci-dessous:

Mélangederéférencederéparationdesextrémités

Réactif Volumeparbanque(μl)

Volumesrecommandéspour96banques(µl)

Codecouleur

H2Odequalitémoléculaire 1,25μl 139,2μl Enzymederéparationdesextrémités(C) 1,25μl 139,2μl VertTamponderéparationdesextrémités(D) 2,5μl 278,4μl OrangeVolumetotal 5μl μl

4.11 –Aliquoterunequantitéégaledemélangederéférencedansuneseulecolonnevidedelaplaquederéactifs.

4.12 – Centrifuger la plaque de réactions (contenant les échantillons fragmentés) pendant10 secondes. Ajouter 5 μl demélange de référence de réparation des extrémités de laplaquederéactifsdanschaquepuitsdelaplaquederéactions.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.Mélangerparpipetage.


4.14 –Incuberlaplaquederéactionsdansunthermocycleuravecleprogrammesuivant:

Programmederéparationdesextrémités


Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.

4.15 –Sortir laplaqued'adaptateurs indexésdeson lieudestockageet la laisserdécongeleràtempératureambianteaprèsledémarrageduprogrammederéparationdesextrémitésdans le thermocycleur. Lorsque la plaque d'aptateurs est à température ambiante, lacentrifugerpendant3minutesà3000tr/min.

4.16 –Retirerdélicatementlefilmdescellagedelaplaqued'adaptateurs.Aprèsleretraitdufilmdescellage,nepasagiterlaplaqued'adaptateursafind’évitertoutrisquedecontaminationcroisée.

4.17 –Transférerlevolumecompletdechaquepuitsdepuislaplaquederéactions(25μl)verslespuitscorrespondantsdelaplaqued'adaptateurs.


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Remarque : Si la totalité de la plaqued'adaptateurs ne sera PASutilisée, il estpossibled’utiliseruniquementlenombrenécessaired'adaptateurs.Couperlefilmde scellage de la plaque entre les puits à utiliser et les puits à garder. Retirerdélicatementlefilmdescellagedelaplaqued'adaptateurs,laissantlefilmenplaceau-dessusdespuitsàgarder.

a. Transférer25μldechaqueéchantillondelaplaquederéactionsversunpuitsnon utilisé de la plaque d'adaptateurs, en mélangeant bien à l’aide d’unepipette.

b. Transférerlatotalitédechaqueéchantillondelaplaqued'adaptateursverslepuitsoriginaldelaplaquederéactions.

c. Sceller de nouveau la plaque d'adaptateurs et la remettre au congélateur(-20°C).Utiliserlaplaquederéactionsaulieudelaplaqued'adaptateurspourlesétapesrestantesdécritesdanslemanuel.

4.18 – Préparer lemélange de référence de ligation. Préparer suffisamment demélange deréférencedeligationpourchaqueéchantillon.

Mélangederéférencedeligation

Réactif Volume(μl) Volumesrecommandéspour96banques(µl) Codecouleur

Enzymedeligation(E) 2,5μl 252,5μl BleuTampondeligation(F) 30μl 3030μl NoirVolumetotal 32,5 3282,5μl

4.19 –Aliquoterlemélangederéférencedeligationdans3colonnesinutiliséesdelaplaquedesréactifs.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.

4.20 –Ajouter32,5μldemélangederéférencedeligationdanschaquepuitsdelaplaquederéactions.Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanal.Mélangerparpipetage.


4.22 –Incuberlaplaquederéactionsdanslethermocycleuravecleprogrammesuivant:

Programmedeligation



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Pointd'arrêtsansaltération.Lesbanquespeuventêtrestockéessansrisqued'altérationà4°Cjusqu'aulendemainouà-20°Cpouruneduréeprolongée.

Regroupementetpurificationdesbanques4.23 –LaisserlesbillesAMPureXPatteindrelatempératureambiante.Veilleràcequ'ellessoient

homogènes(dénuéesd'amasoudegrappes).Préparer5mld'éthanolà80%fraîchementpréparé(4mlEtOH+1mlH2O).

4.24 –Créerlabanqueencombinantunaliquotedechaqueampliconregroupé(unebanqueparéchantillonspécifique)dansunseultubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede2,0ml.

I. Pour16échantillonsouplus–Calculerlaquantitédechaquebanqued'échantillonsàmettreencommunpourobteniruneseulebanqued'unvolumetotalde900μl.Diviser900µlparlenombredebanquesd'échantillons.Lerésultatestlevolumedel'aliquoteàpréleverde chaquebanqued'échantillonset àpipeterdans labanquefinale.

II. Pourmoinsde16échantillons–Transférer60μldechaquebanqued'échantillonsdansunebanque.

4.25 –Ajouter900μldebillesAMPureXPdansletubedelabanque.Mélangervigoureusementauvortex,puiscentrifugerbrièvement.Veilleràcequelesbillesneseséparentpas.Laisserincuberlabanquependant10minutesàtempératureambiante.

Remarque :Si le volumede la banque finale est inférieur à 900μl, ajouter unvolumeéquivalentdebillesAMPureXP.Lerapportentrelabanquefinaleetlesbillesdoitêtrede1:1.

4.26 –Placerletubedelabanquefinalesurlesupportmagnétiqueetlaisserincuberpendant10minutes.

4.27 –Touten laissant le tubesur lesupportmagnétique, retirerdélicatementetéliminer lesurnageantdutubedelabanque,sanstoucherlesbilles.

4.28 –Toutenlaissantletubesurlesupportmagnétique,ajouter1,5à2mld'éthanolà80%fraîchement préparé dans le tube de la banque. Le volume d’éthanol ajouté doit êtresuffisantpourrecouvrirlesbilles.

Remarque:Appliquerl’éthanolsurlecôtédutubedénuédebilles.

4.29 – Laisser incuber la banque à température ambiante pendant 30 secondes, puis retirerdélicatementlesurnageantetl'éliminer.

4.30 –Répéterlesétapes4.28et4.29.

4.31 –Centrifugerrapidementletubedelabanque,puisleremettresurlesupportmagnétiqueenlelaissantouvert.Retirerl’éthanolrésiduelàl’aided’unepipettesanstoucherlesbilles.


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Remarque:S'assurerqueleculotdebillesnecontientpasd’éthanolrésiduel.Ilpeuts'avérernécessairedefairepivoterletubesurlesupportmagnétiquepourenleverl’éthanolsansperturberleculotdebilles.

4.32 –Laisser sécher lesbillesà l’air librependant5à8minutessur le supportmagnétique,jusqu’àcequeleculotdebillessoitsec.

4.33 –Retirerletubedelabanquedusupportmagnétiqueetéluerlabanqueenversant31μld’eaudequalitémoléculaire.Lapointedelapipettenedoitpastoucherlesbillescarcelles-cirisqueraientd’yadhérer.

4.34 –Mélangerlabanqueauvortexpourremettrelesbillesensuspension.Siquelquesgouttesrestentsurlesparoislatérales,centrifugerbrièvement.Veilleràcequelesbillesrestentensuspension.

4.35 –Incuberlabanqueàtempératureambiantependant2minutes.

4.36 –Placerletubedelabanquesurlesupportmagnétiquependant2minutes.

4.37 –Collecterlabanque:toutenmaintenantlabanquefinaledanslesupportmagnétique,collecter31μldusurnageantdansunnouveautubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.

Pointd'arrêtsansaltération.Lesbanquespeuventêtrestockéessansrisqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.


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Étape5–SélectiondelatailledesfragmentsdelabanqueDurée:~1heureL'étape5consisteàutiliserlabanquecollectéeàl'étape4poureffectuerunesélectiondetailledes fragments qu'elle contient à l'aide du sélecteur automatisé Pippin Prep. Le Pippin Prepsélectionneautomatiquementuneplagedetaillesdesfragmentsd'ADNetprocèdeàleurélutiondansunechambredecollecte.Remarque:UnsélecteurautomatiséBluePippinpeutêtreutiliséàlaplaceduPippinPrep.Seréféreràl'annexe1pourdesinstructionsd’utilisationdusélecteurautomatiséPippinPrep.


Cassettedegeld'agaroseà1,5%,sanscolorant 20à25°C SageScienceMélangedemarqueur/solutiondechargePippin(libelléK) 4°C SageScienceBanqueregroupée 4°C Étape4

Remarque:LePippinPreputilisedumarqueurK,tandisqueleBluePippinutilisedumarqueurR2.

Protocole5.1 –LaisserlasolutiondechargedemarqueurKatteindrelatempératureambiante.

5.2 –Combiner31μlduregroupementavec10μldesolutiondechargedemarqueurK.

5.3 –Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

5.4 –ConfigurerlePippinPreppourunecollectedesfragmentsd'ADNcomprisentre650et1300pb.Chargerl'échantillonde40µlsurleportd'accèsdeséchantillonsetl'exécuter.Letempsd'exécutionestde45à50minutes.

5.5 –Collectertoutlecontenu(approximativement40μl)danslachambredecollecteduPippinPrepetletransférerdansunnouveautubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.Lecontenuestlabanquedetaillessélectionnées.

Pointd'arrêtsansaltération.Lesbanquespeuventêtrestockéessansrisqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.


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Étape6–Quantificationdelabanqueaumoyendel'appareilqPCRDurée:~1heure15minutesIlestnécessairedequantifierlabanquedetaillessélectionnéesafind’obtenirunrésultatoptimalsur leséquenceur IlluminaMiSeq.L'appareilqPCRpermetd’enmesurer laconcentrationavecprécision.Pourmesurerlaconcentrationdelabanque,vouspouvezégalementutiliserlekitQubitdsDNABRetunfluoromètreQubit.Poursuivreceprotocole,consultezl'annexe3.


Prémélanged'amorcesIllumina10× -20°C KAPABiosystemsMélangederéférenceKAPASYBRFASTqPCR2× -20°C KAPABiosystemsStd1(20,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0,20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0,02pM) -20°C KAPABiosystemsÉtalonsADNIllumina -20°C KAPABiosystemsH2Odequalitémoléculaire 20à25°C UtilisateurTamponTE1×(pH8,0) 20à25°C UtilisateurBanquedetaillessélectionnées 4°C Étape5

Protocole1 –Préparerlemélanged'amorcesqPCRàl'aideduprémélanged'amorcesIllumina10×etdu

mélangederéférenceKAPASYBRFASTqPCR2×:

Remarque:LesréactifsdukitKAPASYBRFASTqPCR(mélangederéférenceqPCR,prémélange d'amorces et solutions ROX) sont combinés lors de la premièreutilisation du kit. Ce combiné est stable pendant unminimumde 30 cycles decongélation/décongélation.SuivezladocumentationKAPApourdéterminersi lasolutionROXestrecommandéepourvotreappareildeqPCR.

Mélanged'amorcesqPCR

Réactif Volume(ml)Prémélanged'amorcesIllumina10× 1mlMélangederéférenceKAPASYBRFASTqPCR2× 5mlVolumetotal 6ml


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2 –PréparerlemélangederéférenceqPCR.

MélangederéférenceqPCR

Réactif Volume(μl)Mélanged'amorcesqPCR 228μlH2Odequalitémoléculaire 76μlVolumetotal 304μl

3 –Préparerunedilutionsérielledelabanquedetaillessélectionnées.

a. Préparerunedilutionà1:1000enajoutant1μldebanquedetaillessélectionnéesà999μldetamponTE1×(pH8,0),enrinçantsoigneusementlapointedelapipette.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

b. Préparerunedilutionà1:2000enajoutant100μldeladilutionà1:1000à100μldetamponTE1×(pH8,0).Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

4 –PrépareruneplaquedequantificationqPCRdansunenouvelleplaquePCRcompatibleavecvotresystèmeqPCR.

5 –Aliquoter16μldumélangederéférenceqPCRentripleexemplairepourlesétalons1à4,ladilutionà1:1000etladilutionà1:2000(voirlesfigurescomplémentaires).

6 –Aliquoter4μldesétalons1à4,ladilutionà1:1000etladilutionà1:2000danslespuitscorrespondants.

7 – Couvrir hermétiquement la plaque de quantification qPCR et la centrifuger pendant10secondes.

Remarque : Éviter la formation de bulles dans les puits de la plaque dequantificationqPCR.Lecaséchéant,centrifugercommenécessairepouréliminerlesbulles.

8 –Définir lestriplesdilutionsà1:1000et1:2000commeéchantillonsciblés,etdéfinir lesétalons(points:4,concentrationinitiale:20pM,dilution:1:10).Exécuterleprogrammesuivantsurl'appareilqPCRdefaçonàdéterminerlaconcentrationenADNdelabanquedetaillessélectionnées:

Nombredecycles Température Temps1 95°C 5minutes25

(pasdecourbedefluidité)95°C 30secondes60°C 90secondes(acquisitiondesdonnées)

9 –PourconvertirlerésultatqPCRdeconcentrationdepMànM,entrerlesrésultatsdelamoyenne quantitative des deux réplicats de banque dans l'onglet du classeur Omixonintitulé«Quantificationdesbanques».


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10 – À partir des volumes indiqués dans le classeur, diluer 10 μl de la banque de taillessélectionnéesàuneconcentrationde2nMavecdel'eaustériledansunnouveautubedemicrocentrifugationà liaison faiblede1,5ml.Stocker labanquede tailles sélectionnéesrestanteà-20°C.

Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.Encasdestockageàlongterme,unenouvellequantificationestrecommandéeavantutilisationsurleséquenceurMiSeq.


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Étape7–SéquençagesurlesystèmeIlluminaMiSeqDurée:~24à40heuresLesystèmeIlluminaMiSeqestuninstrumentautomatisédeNGSquipeutséquencerlabanquede tailles sélectionnées préparée au cours des étapes précédentes. Un démultiplexage deséchantillonsindexésesteffectuéautomatiquementautermedel'exécutionduséquençage.

Conseil rapide : vous pouvez utiliser un contrôle PhiX à 1 % comme contrôlesupplémentairedelaréactiondeséquençage.Pouruncomplémentd'informationsurlecontrôlePhiX,consultezladocumentationIllumina.


Cassettederéactif -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaCellulededébitMiSeq 4°C IlluminaBanqueà2nM 4°C Étape6NaOH1Nou2N 20à25°C UtilisateurH2Odequalitémoléculaire 20à25°C Utilisateur

CapacitédukitderéactifsMiSeq

KitderéactifsIlluminaMiSeq

TempsHeures

Échantillons96/7


~39 96


~24 96

Micro300Cycle(MS-103-1002)

~19 28


~28 12


~17 6

Protocole7.1 –PréparerleséquenceurMiSeqconformémentauxprotocolesstandardsIllumina.


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7.2 –Préparerunebanquedénaturéeà1nM:Combiner10μldeNaOHà0,2Nfraîchementpréparéavec10μldebanquedetaillessélectionnéesdiluéeà2nMdansunnouveautubede microcentrifugation à liaison faible de 1,5 ml. Mélanger au vortex et centrifugerbrièvement. Incuber cette banque dénaturée à 1 nM à température ambiante pendant5minutes.

7.3 –Préparerunebanquedénaturéeà20pM:Ajouter980µldeHT1réfrigéréaux20µldelabanquedénaturéeà1nM.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

7.4 –Préparerunebanquedénaturéeà9pM:Ajouter550µldeHT1réfrigéréet450µldelabanquedénaturéeà20pMdansunnouveautubedemicrocentrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

7.5 –Transférer600μldelabanquedénaturéeà9pMdansleréservoirdeséchantillonsdechargedelacassettederéactifsMiSeq.

Conseilrapide:ilestsuggéréd'utiliserleclasseurfournipourcréerlafiched'échantillonrequiseparlesystèmeMiSeq.


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Étape8–AnalysedesdonnéesdeséquençageHLALeséquenceurIlluminaMiSeqvatraiterlabanqueregroupéeà9pMetgénérerdesdonnéesdeséquençagesouslaformedefichiers.fastq.Veuillez-vousréféreraumanuelHLATwinpouruneassistance à l'installation correcte du logiciel HLA Twin et des informations en matièred'interprétation de l'analyse du génotypage de vos données de séquençage. Pour lamise enœuvreduprotocoleautomatiséetpourtoutproblèmerelatifàl'installationouàl'analysedesdonnées,[email protected].

Protocoleautomatisé

Paramétrageetconfigurationinformatique1. InstallezlelogicielHLATwinServersurleserveur.

§ Installez le logiciel HLA Twin Client sur un ordinateur client (plusieurs clients HLA Twinpeuventseconnecterauserveur).

§ Contactez l'assistance Omixon ([email protected]) pour obtenir des instructionsd'installationpersonnaliséedel'automatisation.

Protocoleparanalyse1. LancerlelogicielHLATwinClientetseconnecter.

2. Lesdonnéesontdéjàététraitéesousontencoursdetraitement.Examinerlesrésultatsàl'aidedusystèmeTrafficLightdansHLATwin.

3. Exporterlesrésultatsdugénotypageet/oulesséquencesconsensus,selonlesbesoins.

ProtocolemanuelServeur

Paramétrageetconfigurationinformatique§ InstallezlelogicielHLATwinServersurleserveur.§ InstallerlelogicielHLATwinClientsurunordinateurclient.

Protocoleparanalyse§ LancerlelogicielHLATwinClientetseconnecter.§ Sélectionner les donnéesMiSeq au format fastq ou fastq.gz et démarrer l'exécution du

typageHolotypeHLA.§ UnefoisletypageHolotypeHLAterminé,examinerlesrésultatsàl'aidedusystèmeTraffic

LightdansHLATwin.§ Exporterlesrésultatsdugénotypageet/oulesséquencesconsensus,selonlesbesoins.


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ProtocolemanuelBureau

Paramétrageetconfigurationinformatique§ InstallerlelogicielHLATwinDesktop.

Protocoleparanalyse6 LancerlelogicielHLATwinetseconnecter.

7 Sélectionner les donnéesMiSeq au format fastq ou fastq.gz et démarrer l'exécution dutypageHolotypeHLA.

8 UnefoisletypageHolotypeHLAterminé,examinerlesrésultatsàl'aidedusystèmeTrafficLightdansHLATwin.

9 Exporterlesrésultatsdugénotypageet/oulesséquencesconsensus,selonlesbesoins.


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Figuressupplémentaires

Exemples de plaques d'amplicons, d'amplification, de dilution, dequantificationdesamplicons(pourunlocusindividuel)etderéactions

Exempledeplaquedequantificationdesétalons


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ExempledeplaqueqPCRdequantificationdesbanquesKAPA


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Annexe1:SélecteurautomatiséPippinPrep

ProgrammationduPippinPrep1. Cliquez sur l'onglet Protocol Editor (Éditeur de protocole), puis sur le bouton « New »

(Nouveau).

2. Cliquezsurl'icônededossierenregardduchampCassetteetsélectionnez«1.5%DFMarkerK » (Marqueur K 1,5 % sans colorant) pour le Pippin Prep ou « 1.5%DF Marker R2 »(MarqueurR21,5%sanscolorant)pourleBluePippin.

3. Danslabandequevousprogrammez:

a. Mettezensurbrillancelechamp«Range»(Plage).b. Réglez«RefLane» (Bandede référence)pourétablirunecorrespondanceavec le

numérodelabandedanslaquellevoustravaillez.c. Réglezlechamp«Start*»(Début)sur650.d. Réglezlechamp«End*»(Fin)sur1300.

4. DanslechampReferenceLane(Bandederéférence),sélectionnezlabandedanslaquellevoustravaillez.

5. Cliquezsurlebouton«SaveAs»(Enregistrersous)etnommezvotreprogramme.

UtilisationdusélecteurautomatiséPippinPrep1. MettezenmarchelePippinPrepenappuyantsurleboutond'alimentationàl'arrièrede

l'appareil.

2. InspectezvisuellementlePippinPrep.Vérifiezqueles5témoinslumineuxDELsontallumésetquel'intérieurdel'appareilestpropreetsec.

3. CliquezsurlelogoSageSciencesituéaucoininférieurdroitdel'écran.Lafenêtrequis'ouvrevouspermetdesaisirunmotdepasse.Lemotdepassed'usinepardéfautest«pips».

4. Cliquezsurl'ongletFactorySetup(Paramétraged'usine)etvérifiezquelavaleurBase-to-Threshold(BaseàSeuil)estrégléesur0,02.

5. Placezl'outild'étalonnageàl'intérieurduPippinPrep,enveillantàcequelabandefoncéesoitorientéeverslebasetplacéeau-dessusdestémoinslumineuxDEL.

6. Dansl'ongletMain(Principal),cliquezsurlebouton«Calibration»(Étalonnage).

7. DanslafenêtreCalibration(Étalonnage),vérifiezquelechamp«TargetIpHmA»(mApHCibleI)estréglésur0,80(0,60surleBluePippin),puisappuyezsurlebouton«Calibrate»(Étalonner).

8. Accédez à l'onglet Protocols (Protocoles). Cliquez sur le bouton « Load » (Charger) etsélectionnezleprogrammeHolotypeHLAainsiquelabandequevousallezutiliser.Vérifiezlespointssuivants:

a. Labandeadéquateestactivée.


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b. Letémoindesélectiond'unlargespectreestactivé.c. Labandederéférenceestlamêmequelabandequiseraexécutée.

9. Accédezàl'ongletMain(Principal).Vérifiezlespointssuivants:

a. Leprogrammequevousavezchargéestceluiquiestsélectionné.b. La bande de référence appropriée est sélectionnée et c'est aussi la bande dans

laquellel'échantillonseraexécuté.

10. Inspectez la cassette. Avant d'enlever le film de scellage des puits, vérifiez la présenceéventuelledebullesderrière l'accèsde lachambred'élution.Lecaséchéant, tapotezetbalancezlégèrementlacassetteentrevosmainspouréliminerlesbulles.

11. Placezlacassette,puitstoujoursscellés,àl'intérieurduPippinPrep.

12. Retirezdélicatementlefilmdescellage,enprenantsoindeleretirerdepuislecôtéinutilisédelacassette(bande5)verslecôtéutilisé(bande1).Veillezàévitertouteéclaboussuredeliquideunefoislefilmretirépouréviteruneéventuellecontamination.

13. Retirezlevolumeentierdetamponduportd'accèsàlachambred'élutiondelabandequevousallezutiliseretajoutez40µldetampond'électrophorèsefraisdansceportd'accès.

14. Recouvrezlesportsd'accèsd'unefinebandedescellage.

15. Touslesréservoirspleinsàmoinsdes3/4deleurvolumedoiventêtrecomplétésavecdutampond'électrophorèse.Néanmoins, lespuitsnedoiventpasdéborder ! Leniveaudutampondoitjusteatteindreleplastiquedupuitspournepasdéborderlorsduglissementducouvercle.Complétezletampondepuislespuitsinutilisés(bande5)verslespuitsutilisés(bande1).

16. Vérifiez que chacun des puits de charge (puits contenant de l'agarose) sont remplis detampond'électrophorèse.Letampondoitjusterecouvrirl'agaroseetprésenterunesurfaceparfaitementplane.

17. Fermez lentement lePippinPrep,enveillantàéviter toutcontactentre le tamponet lecouverclelorsquevousfermezl'appareil.

18. Effectuezletestdecontinuité.Ilarriveparfois, lorsquelescapteurssèchentlégèrement,queletestéchoueaupremieressai.Lecaséchéant,effectuezletestunesecondefois.Unefoisletestdecontinuitéterminé,ouvrezlentementlePippinPrep.Vérifiezquelecouvercledel'appareilnefaitpascoulerleliquidedanslacassette.

19. Mélangez la solution de charge demarqueur K au vortex et centrifugez-la brièvement.Ajoutez10µldecettesolutionaux~30μldelabanque.

20. Mélangezlabanqueauvortexetcentrifugez-labrièvement.

21. Retirez40µldetampondupuitsd'échantillonquevousallezutiliser.

22. Ajoutez~40μldelabanquechargéeenmarqueurKaupuitsd'échantillonquevousallezutiliser.

23. Marquezlabandequevousutilisezeninscrivantlesinitialesdutechnicienetladate.


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24. FermezlePippinPrepetcliquezsurlebouton«Start»(Démarrer).Vérifiezquelabandeappropriéeaétéactivée.L'exécutiondel'échantillondoitdurer45minutesenviron.

25. Une fois l'exécution terminée, ouvrez prudemment le Pippin Prep. Veillez à ce que lecouverclenefassepascoulerdeliquidedanslacassette.

26. Retirez la bande de scellage des ports d'accès à la chambre d'élution, en évitantsoigneusementtoutécoulementdeliquide.

27. Transférezlevolumeentierduportd'accèsàlachambred'élutiondansuntubeàliaisonfaiblede1,5ml.

28. Recouvrez tous lespuitsouvertsà l'aided'undouble filmdescellagedeplaque.Pensezàlaisserunelanguettedefilmducôtéinutilisé,cequifaciliteraleretraitdufilmdescellagedepuislecôtéinutiliséverslecôtéutilisé.

29. Placezlacassettescelléedanssapocheetmettez-ladecôté.

30. Prenezlacassettedelavageetremplissez-lad'eauMiliQ.RefermezdoucementlecouvercleduPippinPrep,enprenant soind'éviter toutécoulementde liquidedans lacassettedelavage.

32. LaissezlePippinPrepfermépendantplusieurssecondes.

33. Ensuite,ouvrez-leenprenantsoind'évitertoutécoulementdeliquidedanslacassettedelavage.

34. Retirezlacassettedelavage,videzsoncontenueneauetlaissez-lasécher.

35. Essuyeztoutetraced'eaudanslePippinPrepetfermezdoucementcedernier.

36. Sélectionnezlebouton«ShutDown»(Fermer)danslemenuPippinPrep.


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Annexe2:Quantificationdesampliconsaumoyend'unappareilqPCRDurée:1heure50minutes


TamponTE20×(pH7,5) 4°C PromegaÉtalonADNLambda(100ng/μl) 4°C Promega200×marqueurcouleurQuantiFluordsDNA 4°C PromegaH2Ostérile 20à25°C UtilisateurPlaque(s)d'amplificationdeclasseI 4°C Étape2Plaque(s)d'amplificationdeclasseII 4°C Étape2

Protocole1. Créerunedilutionsérielleenutilisantdestubesdemicrocentrifugationde1,5mletl'étalon

QuantiFluorLambdaDNA(100ng/μl).Appliquerlatablededilutionci-dessous:

Libellédutube ADNutilisé Volumed'ADN(μl) VolumeTE1x(μl) Conc.finale(ng/μl)Étalon1 ADNLambda 7,5μl 492,5μl 1,5ng/μlÉtalon2 Étalon1 250μl 250μl 0,75ng/μlÉtalon3 Étalon2 250μl 250μl 0,38ng/μlÉtalon4 Étalon3 250μl 250μl 0,19ng/μlÉtalon5 Étalon4 250μl 250μl 0,09ng/μlÉtalon6 Étalon5 250μl 250μl 0,05ng/μlStandard7,vierge Vierge 0μl 250μl 0ng/μl

2. Préparer les plaques de quantification des amplicons (voir les figures supplémentaires).Aliquoter49,5μldetamponTE1xdanslespuitsd'unenouvelleplaqueà96puitspourlenombretotald'ampliconsàquantifier.

3. Ajouter0,5μld'ampliconsdespuitscorrespondantsdesplaquesd'amplificationdanslespuitsindividuelsdesplaquesdequantificationdesamplicons.Mélangerparpipetage.

4. Préparer une solution de travail demarqueur couleur QuantiFluor 1× selon la formulesuivante :0,25μldemarqueurcouleurQuantiFluor (200X)+49,75μlde tamponTE1×.PréparerunequantitésuffisantedesolutiondetravaildemarqueurcouleurQuantiFluor1×desortequechaqueéchantillon(pourletotaldeséchantillonsdesplaquesd'amplification)etchaqueétalon(14autotal)reçoiveunaliquotede50µl.

5. Préparer une plaquede quantification des étalons et des plaques de quantification desamplicons.Aliquoter50μldesolutiondetravaildemarqueurcouleurQuantiFluor1×dans


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lespuitsdesplaquesoptiquesà96puitsselonleformatdelaplaquedequantificationdesétalonsetdesplaquesdequantificationdesamplicons(voirlesfiguressupplémentaires).

6. À partir des étalons préparés ci-dessus, ajouter 50 µl de chaque étalon, en doubleexemplaire,danslespuitsindividuelsdelaplaquedequantificationdesétalons(14puitsautotal).

7. Mélangerintégralementauvortexetcentrifugerbrièvement.

8. Placerchaqueplaquedequantificationuneparunedansl'appareildeqPCRetexécuterleprogrammesuivant:

Nombredecycles Température Temps1 25°C 10secondes 25°C 15secondes2 25°C 30secondes(acquisitiondesdonnées)

9. Calculerlaconcentrationdel'ADNdanslesplaquesdequantificationdesampliconsàpartirdesdonnéesbrutesdesunitésde fluorescence relative (RFU)généréespar l'appareildeqPCR.

10. Diluer l'ADN dans les plaques d'amplification avec de l'eau stérile de sorte que laconcentrationfinaledel'ADNsoitde67ng/µlenviron.

§ Silaconcentrationdel'ADNestégaleousupérieureà150ng/μl,ajouter25μld'eau.§ Silaconcentrationdel'ADNestcompriseentre100et150ng/μl,ajouter10μld'eau.§ Silaconcentrationdel'ADNestinférieureà100ng/μl:nepasajouterd'eau.


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Annexe3:Quantificationd'unebanqueutilisantunmarqueurcouleurfluorescentdsDNAintercalaireDurée:~15minutesLa concentration de la banque de tailles sélectionnées peut être mesurée avec précision enintercalantunmarqueurcouleurfluorescentdsDNAtelquelevertSYBRouunéquivalent.Leskitset instrumentsà cette findisponiblesdans le commerce incluent, sans toutefois s'y limiter, lefluoromètre Qubit de Thermo Fisher (qui utilise le kit de test Qubit Broad-Range dsDNA), lefluoromètreQantusdePromega(quiutiliselemarqueurcouleurfluorescentQuantifluordsDNA).LaméthodeQubitestdécriteicicarelleestlapluscommunémentutilisée.Sivousutilisezunautrekitetunautreinstrument,suivezlesinstructionshabituellesdufabricant.

Remarque:Cetteméthodedefluorométrieestunmoyenrapidemaisprécisdedéterminer la concentration de la banque de tailles sélectionnées finale. EllepermetdemesurerlatotalitédudsADNprésentdanslabanque.


KitdetestQubitdsDNABR températureambiante ThermoFisherÉtalonsQubitdsDNABR 4°C ThermoFisherBanquedetaillessélectionnées 4°C Étape5

Protocole6.1 –LaisserlesétalonsQubitatteindrelatempératureambiante.Préparerdestubesàessai

Qubit (500 μl, paroi mince) pour la banque en double exemplaire et les deux étalons.Mélangerauvortexetcentrifugerlesétalonsetlabanque.

6.2 –Ajouter995μldetamponet5μldemarqueurcouleurdansuntubedecentrifugationde1,5ml.Mélangerauvortexetcentrifugerbrièvement.

6.3 –Transférer190μldumélangederéactifsdanslestubesQubitdesdeuxétalons.Transférer198μldumélangederéactifsdanslestubesQubitdesdeuxexemplairesdelabanque.

6.4 – Ajouter 10 μl de l'étalon 1 dans le tube Qubit correspondant etmélanger au vortexpendant2secondes.Procéderdelamêmefaçonavecl'étalon2.

6.5 –Ajouter2μldelabanquedanslesdeuxtubesQubitcorrespondantsetmélangerauvortexpendant2secondes.

6.6 –IncuberlestubesQubitàtempératureambiantependant2minutes.

6.7 –Mettreenmarchel'appareilQubitetchoisirunprotocoleBR.


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6.8 –PlacerletubeQubitd'étalon1dansl'appareil,puisappuyersurGO.Procéderdelamêmefaçonavecl'étalon2.

6.9 –Placer letubedelabanquedansl'appareilQubit,puisappuyersurGO.Procéderdelamêmefaçonaveclesecondexemplaire.

6.10 –PourconvertirlerésultatQubitdeconcentrationdeng/μLànM,entrerlesrésultatsdeconcentrationmoyennedesdeuxexemplairesdebanquedansl'ongletduclasseurOmixonintitulé«Quantificationdesbanques».

6.11 –ÀpartirdesrésultatsdelamesureQubit,diluer10μldelabanquedetaillessélectionnéesà une concentration de 2 nM avec de l'eau stérile dans un nouveau tube de micro-centrifugationàliaisonfaiblede1,5ml.Stockerlabanquedetaillessélectionnéesrestanteà-20°C.

Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risqued'altérationà-20°Cpouruneduréeprolongée.Encasdestockageàlongterme,unenouvellequantificationestrecommandéeavantutilisationsurleséquenceurMiSeq.

H HLA™ 96/7 C A CE C B CE RÉF. : M V 10 02/05/2018 · 0086 Prépare l'ADN à l'analyse par...

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