Génomique fonctionnelle appliquée chezl’organisme modèle Drosophila melanogaster

Melano : noir / Gaster: estomac, ventre

(0,5mm)

(2mm)

1day

1day

1day

2 days

5 days

-Mâles et femelles facile à distinguer (dimorphisme sexuel )

- Cycle de vie court 10 jours à 25°C20 jours à 18°C

- Développement externe - Tissus transparents

-Fécondité 40 œufs/femelle/jour

-Développement bien caractérisé (4,5mm)

Développement - Organogenèse - Comportement chez la Drosophile sont des processuscomplexes :

Cerveau sophistiquéSystème moteur , système sensorielComportements complexes Capacité de mémoire et d’ apprentissage

Confocal image of a whole mount adult brainimmunolabelled with anti-nc82 which recognises the Bruchpilotprotein that is specifically enriched in active zones of synapticterminals. This allows the visualisation of cortical areas in the flybrain, including optic lobes (OL), antennal lobes (AL), superiorprotocerebrum (SP), lateral protocerebrum (LP), mushroombodies (MB), deuterocerebrum (D), and subesophageal ganglion (SG). CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, 2010, Vol. 9, No. 4

Drosophila flight control labneural control of behaviorneuromotor flight control pathways

Swiss Federal Institute of Technology (ETH) and University of Zürich (UZH) at the Institute of Neuroinformatics(INI) and the Institute of Robotics and Intelligent systems (IRIS).

Développement –Organogenèse – Comportement chez la Drosophile sont des processus complexes :-Système trachéal (système respiratoire, développement bronches /bronchioles),

-Glandes de la lymphe (Réponse immunitaire cellulaire )-Système cardiaque -Hémolymphe (équivalent du sang ; système circulatoire ouvert) -Corps gras (équivalent du foie: métabolisme des lipides / analogue tissu adipeux:

stockage des lipides)-Tubules de Malpighi : (the fly kidney : organe sécrétoire; sécrétion des fluides…..)

Larval tracheae

Drosophile : Modèle d’étude de nombreux processus biologiques ……

Migration cellulaire/polarité cellulaireDynamique membranaire / traffic - transit intracellulaireCycle cellulaireProlifération /croissance cellulaire

Étude gènes impliqués dans des pathologies humaines modèle d’étude des néoplasies depuis de nombreuses années /suppresseur de tumeurs

- Elevage et Entretien des stocks en laboratoire simple et peu onéreux

- Pas de stockage à long terme : pas de possibilité de congélation d’embryons

- Durée de vie : Varie entre 40 et 120 jours

Fonction du régime alimentaire et du stress (comme les vertébrés).Plus le régime est strict ( farine de maïs/cornmeal) plus la durée de vie est allongée.

Augmenter les carbohydrates et cholestérol (15% sucre/levure) diminue la durée de vie.

- ~1500 laboratoires de recherche- De nombreuses Bases de Données :

1992 : FlyBase project funded by NIH .1993 : Birth of FlyBase : a database for drosophila genetics and molecular biology

Michael Ashburner-Rachel Drysdale - The Flybase consortium : Harvard University (USA), University of Cambridge (UK), Indiana University (USA), and the University of New Mexico (USA).

-Séquence du génome de 12 autres espèces (2007):Drosophila Comparative Genome Sequencing and Analysis Consortium

Caractérisation des éléments fonctionnels,de leur signature évolutivede leur changements phylogenétiques

57%44%33%ndfraction transcrite non traduite

~100952fréquence moyenne des gènes codant des protéines(par kpb)

1,4%18%27%68%fraction transcrite et traduite = fraction codante

3.00018010013taille physique (Mb) du génome haploïde (n)

234616Nombre de chromosome (n)

1451502181.450taille moyenne des exons (pb)

~3.300487267500taille moyenne des introns (pb)

8,74,65,51,04nombre moyen d'exons par gène

2711.341,4taille des gènes (kpb)

~25.000(22726 )

13.60019.1006.200nombre de gènes codant protéines

HommeDrosophileD. melanogaster

Nématode C.elegans

LevureS. cerevisiae

Caractéristiques de 4 génomes eucaryotes :

Génome haploide : 4 Chromosomes ( 3 autosomes + X ou Y)180Mb dont 120Mb d’ euchromatineSéquencé 14,000 gènes ( 2000- Berkeley Drosophila Genome Project (BDGP), Craig Venter and Applied Biosystems, Inc ,European Drosophila Genome Project (EDGP)).

Comparaison des protéomes prédits de 4 eucaryotes:

Phylogeny of eukaryotes. From Lykidis Progress in Lipid Research 2007, Volume 46, Pages 171-199 .

Comparaison des protéomes eucaryotes prédits :

-20% des protéines de drosophile ont un orthologue putatif chez le nématode et la levureprocessus communs aux eucaryotes: réplication, transcription, traduction, division cellulaire…

- 35% des gènes de drosophile ont un orthologue putatif chez le nématodeDéveloppement des organismes pluricellulaires : Interactions cellule- cellule / cellule substrat, Protéines à homéodomaines, Molécules d ’adhérence cellulaire…...

certaines familles de protéines sont présentes seulement chez la drosophile: Protéines impliquées dans la réponse immunitaire, Protéines spécifiques (ex : cuticule), Protéines transmembranaires de fonctions inconnues

- >50% des protéines de drosophile ont un orthologue putatif chez l’hommeHaut degré de conservation des voies biologiques fondamentales

Les différences physiologiques entre homme et drosophile sont reflétées par l’absence de gènes codant des produits spécifiques; par exemple: hémoglobines (thalassémies) ,réarrangement des gènes d’immunoglobuline (système immunitaire acquis)

Très schématiquement: Au cours de l’évolution, le génome humain a subit deux duplications successive d’un génome élémentaire non redondant

Génome de la Drosophile est représentatif de ce génome élémentaire

2000 The Berkeley Drosophila Genome Project (BDGP):

Sur 289 gènes humains extraits de la base de données

OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) et codant des

produits impliqués dans des pathologies humaines ,

plus de 60% (177/289) ont des homologues évidents

chez la drosophile.

‘The fly is an extremely useful model system for studying genesassociated with disease in humans.’

-289 human proteins used as queries to search a database consisting of the sum total of gene products (38,860) found in the complete genomes of fly, worm, and yeast.

-BLASTP searchesTBLASTN searches to control for potential frameshift errors in the Drosophila genome sequence. Only two cases were manually corrected.

-Results are scaled according to various levels of statistical significance, Reflect the level of confidence in either evolutionary homology or functional similarity.

« + » : likely functional equivalent of the human protein (biological evidence; publications screen)« - » unable to identify a likely functional equivalent of the human protein.

< < <no or weak sequence similarityE values >1 X 10–6

highest degree of sequence conservation.E values < 1 x 10-100

BDGP

BDGP

Extension of this analysis to all the disease loci present in OMIM Database

-Analysis updated on the public website http://superfly.ucsd.edu/homophila/

Génétique classique vs génétique inverse

Phénotype

Gène

Génétique ClassiqueMutagenèse au hasard

Cribles à l’échelle du génome1980 Nüsslein –Volhard et Wieschaus : Contrôle génétique du développement embryonnaire

Génétique InverseMutagenèse dirigée

Cribles de perte (Inactivation) ou de gain (expression ectopique) de fonction de l’ensemble des gènes du génome

Outil Élément PSystème UAS GAL4

La drosophile est utilisée comme organisme modèle dans des études à l’échelle du génome depuis le début du XX ème siècle

Génétique sophistiquée et puissanteBatterie de mutantsGénétiquement modifiable – production de lignée transgéniques

Induction de mutations paragents chimiques (EMS) : mutations ponctuelles

agents physiques ( rayons X, rayons γ) :cassures chromosomiques (délétion/inversions)

éléments transposables (élément P modifié)

recombinaison homologue: mutation dirigée

Crible génétiques –Crible de modificateurs second sites (suppresseur/enhancer)

RNA interference : dsDNA specific to a target gene

Michael boutros et al. Genome-Wide RNAi Analysis of Growth and Viability in Drosophila Cells.Science 2004 : 303, 832

RNAinterference: sequence specific double strand DNA (dsDNA) complementary to a target gene

dsRNA is cell autonomous in drosophila:- designed against 91% of known Drosophila gene- generated from a transgene containing an PCR product able to produce by in vitro transcription an inverted repeat sequence that can form double strand hairpins

Utilisation d ’un élément transposable (élément P) modifié , pour introduirede façon stable et héritable un transgène dans le génome.

Promoteur minimum transposaseGène X

Origine de réplicationGène de résistance (i.e. AmpR)

Pieds (5’et 3’) de l’élément P

Gène marqueur de la transgénèse: mini w

TRANSGENESE

cDNA X miniwhite Plasmid sequences

Clonage des séquences d’ADN adjacentes

Drosophila transgenesis. white+ transgeneDNA (red) is injected into generation zero Drosophila embryos (G0) of less than 1 hour old, which have been obtained from a parental (P) generation. The early developmental stages of Drosophila embryos are characterized by rapid nuclear divisions that occur without accompanying cell divisions, creating a syncytium. Prior to cellularization, pole cells (black) bud off at the posterior end. For germ line transmission to occur, the transgenic DNA must be taken up into the pole cells that are fated to become germ cells. Transgenic DNA integrated into a pole cell (red pole cell) can be transmitted from one generation (G0) to the next (G1 progeny). The resulting integration events are identified using an appropriate marker, such as as white+. When used in a mutant white– strain, this transgene marks transgenic flies by giving them a darker eye color.From Transgenesis upgrades for Drosophila melanogasterKoen J. T. Venken and Hugo J. Bellen Development 134, 3571-3584 (2007)

Transposase gene+

Germ cell precursors

P[lacZ] enhancer trap element

P[Gal4] enhancer trap system – use the bipartite UAS-GAL4 sytem

Flyview, A Drosophila Image Databasehttp://flyview.uni-muenster.de/3700 pictures from 796 enhancer-trap lines and 61 GAL4 lines

GAIN OF FUNCTION UAS - cDNA LOSS OF FUNCTION UAS - dsRNA

(different space and time)

Système UAS GAL4

BIPARTITE SYSTEM GAL4 - UAS:

ANALYSING GENE FUNCTION USING:

Ectopic expression : important way to obtain functional data considering that up to 60% of Drosophila genes will have no loss-of-function phenotype

(1) induce a cell fate change (2) induce altered cell fates in neighboring cells(3) alter the cell’s physiology …..

-ectopic gene expression sufficient for cell identity? -mode of action autonomous or nonautonomous? -determination of signaling pathway of a given cell or tissue

Gene knockdown : determine if a gene is necessary for a given fate/process

Analyse de la fonction de gènes humainsdans le système modèle drosophile

Exemple:

Gènes humains impliqués dans des maladies neurodégénératives

Number of common features characterized human neurodegenerative diseases:

-Late–onset and progressive neurodegeneration

-Dysfunction and loss of specific neurons in the brain

-Formation of abnormal protein aggregates

intranuclear inclusions : Huntington’s disease and related polyglutamine

disorders

cytoplasmic inclusions : neurofibrillary tangle of Alzheimer’s disease ,

Lewy body of Parkinson’s disease.

extracellular : amyloid plaque of Alzheimer’s disease

HD Huntington’s DiseaseDRPLA Dentatobulbar Muscular AtrophySCA Spinocerebellar Ataxia (also known as MJD : Machado Joseph Disease), SCA 17 .SBMA Spinobulbar Muscular (also known as Kennedy disease)

At least nine human neurodegenerative diseases known as polyglutamine (polyQ) diseaseshas been defined as CAG repeat expansion within the ORF of the respective genes

Maladie de Machado-Joseph ou Ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3)

Dégénérescence spinocérébelleuse (moelle épinière et cervelet)

Apparaît entre 50 et 70 ans

Trouble du cerveau qui se généralise et s'accompagne de

-difficulté à parler et à émettre des sons (dysarthrie) -paralysie de la langue, des mâchoires, du larynx.

-voix trop grave ou trop aiguë, rauque et parfois complètement éteinte (aphonie).

-manque de coordination fine des mouvements volontaires (ataxie) de la démarche et des extrémités.

-anesthésie atteignant le toucher, la douleur.

-réflexes ostéotendineux sont faibles ou nuls

Expression de la protéinehumaine dans les précurseurs de l’aile ou de l’œil

de la drosophile adulteavec le système GAL4 UAS

disque:

labial

humeralclypeo-labral

d’oeil-antenne

première patte

deuxième pattetroisième patte

d’aile

d’haltère

génital

1

2

3

tête thorax dorsal

thoraxventral

arista

antenne

oeilocellus

pronotum

humerus

mésonotum

mésopleurum

ptéropleurum

scutellum

aile

métanotum

haltère

hypopleurum

sternopleurum

fémur

coxa

propleurum

probocis

palpus maxilaire

A B C D

Larve de 3ème stade disques imaginaux précurseurs de l’intégument adulte de la tête, du thorax dorsal et ventral ainsi que leurs appendices

Le disque imaginal précurseur des structures adultes

Ye & Forte, 1999. J.Cell. Biol. 146:1351

Expression dans les précurseurs de l’aile et observation chez l’adulte

Aile normale

Exemple de défauts

Scanning electron photomicrograph

Tangential section

The Drosophila compound eye is a complex neural tissue with precise cellular architecture. The adult eye is composed of 800 reiterated subunits called ommatidia.

-Expression d’une protéine normale (27 glutamines) et mutante (78 glutamines) dans les précurseurs de l’œil

-Phénotype adulte observé: Oeil rugueux , Défauts de pigmentation, Inclusions nucléaires

N.M Bonini, Parkinsonism and Related Disorders 7 (2000) 171-175)

ataxine 3 Maladie de Machado-Joseph (Ataxie spinale-cérébelleuse type 3)histone binding protein , ubiquitin protease domain

27 glutamines 78 glutamines

GMR-GAL4 UAS-Q27 UAS-Q78

Immunofluorescence sur disque imaginal œil : révélation Protéines MJDQ27 ou Q78

MJDQ27cytoplasmique MJD Q78 inclusions nucléaires

-Phénotype: Oeil rugueux , Défauts de pigmentation, Inclusions nucléaires

GMR-GAL4

GMR-GAL4UAS Q27

GMR-GAL4UAS Q78 (S)

Protéines MJDQ27 ou Q78Chromatine

Protéines MJDQ27 ou Q78Membrane nucléaire

Protéines MJDQ27 ou Q78 Chromatine

Crible de mutation second site : recherche de modificateur (interacteur)Exemple d’un crible gain de fonction

Induction dans le disque imaginal d’œil de l’expression de la protéine mutante ET d’une protéine endogène grâce à un élément transposable P modifié (élément EP).

Evaluation de l’effet de l’expression de la protéine endogène inconnue sur le phénotype obtenu par l’expression de la protéine mutante seule:

Identique a l’expression seule de la protéine mutante?Pas d’interaction

Moins fort? Interaction- l’expression du gène endogènesupprime l’effet de l’expression de la protéine mutanteSuppresseur

Plus fort?Interaction - l’expression du gène endogèneaugmente l’effet de l’expression de la protéine mutante Enhancer

La lignée cible ( target line) a inséré dans le génome un élément P appelé EP. L’élément EP contient des séquences UAS est inséré en amont d’un gène endogène .Il existe plus de 6000 « target lines » différentes.

Après croisement avec la lignée Patron (pattern line), on obtient une mouche possédant trois transgènes : les deux transgènes driver-Gal4 et UAS-cDNAx (codant la protéine d’intérêt comme par ex la protéine codant l’ataxine 3 avec 78 glutamine) et un transgène EP.

Dans cet individu, l’expression de la protéine GAL4 dans le tissus choisi peut ainsi diriger simultanément l’expression de la protéine d’intérêt et d’un gène endogène (UAS/ endogenous gene)

Driver –Gal4(ex: expression de Gal4 dans le disque imaginal d’œil grâce au driver « GMR »)

Immunofluorescence détection MJDQ 127

MJDQ 127chromatine

Phénotype corrigé par l’expression de l’élément EU3500 codant la protéine hsp70 (chaperone)

Verifié sur culture cellules humaines

Mais l’existence de l’homologue drosophile du gène humain n’est pas forcément requise….

Exemple: gène α-synucléine Maladie de Parkinson(N.M Bonini / Parkinsonism and related disorders 7 (2001) 171-175)

-Expression d’ α-synucléine sauvage et mutantes

- Phénotype : défaut de locomotion

Aggravation du phénotype avec l’âgePrésence de Corps de Lewy (neurones DOPA)

Expression d’un gène humain impliqué dans une maladie neurodégénérative et ne possédant pas d’homologue drosophile

dans le système nerveux de la mouche