Faculté de chirurgie Dentaire Université Paris 5

Des glycosaminoglycannes à l’utilisation potentielle de

polysaccharides en thérapie tissulaire

Karim Senni

A

Matrice extracellulaireMatrice extracellulaire

Adhésion

ProliférationDifférentiation

Dégradation

SynthèseMigration

Mort

B

Cytokines, Facteurs de croissance, chémokines

Remodelage tissulaire

Synthèse

DégradationSynthèses macromoléculaires

Prolifération cellulaireDégradations macromoléculaires

Mort cellulaire

Synthèse

Dégradation

Remodelage pathologique

Fibroses, ex: chéloïdes

Synthèse

Dégradation

Parodontite

Ulcères chroniques cutanées

Remodelage pathologique

Inflammations chroniques Cicatrisations retardées

Thérapies tissulaires

Mobiliser au mieux les ressources in situ afin de parfaire la réparation voir la régénération tissulaire

Recrutement des phénotypes cellulaires les plus aptes

Aide à la reconstruction: matrice exogène, potentialisation des ressources tissulaires

Arrêt des processus dégénératifs

Agir sur les acteurs du remodelage tissulaire

Cellules résidentes: épithéliales, endothéliales, fibroblastes, ostéoblastes …

Cellules inflammatoires: Macrophages, lymphocytes, PMN

Agents de clivages: protéases (MMPs, sérine protéases…), glycosidases, radicaux libres…

Facteurs de croissances (FGF, TGF, cytokines (IL-1, TNF, IL-4), matrikines (endostatine, peptides de collagènes et d’élastine)

Matrice extracellulaire

Protéines fibreuses

Collagènes Elastine

Fibrillaires FACITs réseau MACITsFilaments perlés fibrilles d’ancrage Multiplexines

XXVII XI

V

III

II

I

XXI, XXVI XIX, XX XIV, XVI IX, XII

X

VIIIV VI VII

XVIII

XV

XXVXXIIIXVIIXIII

Glycoprotéines

Fibronectine

Laminines

Vitronectine

Fibulines

Fibrillines

Nidogène

Ténascine

Ostéocalcine

Ostéonectine

FVW…

GAG

Acide Hyaluronique

Riches en Leucine Agrégats surface cellulaire Intracellulaire

Décorine

Biglycane

Fibromoduline…

Versicane

Agrecane

Perlécane

Agrine….

Syndécane

Bétaglycane

Glypicane...

Serglycine

Héparine

HS

CS

DS

KS

Protéoglycannes

membrane basale

K. Senni

un contexte la matrice extracellulaire

Acide hyaluronique (D-GlcU-D-GlcNac)

Kératane sulfate (D-Gal-D-GalNAc)

Héparine/Héparane sulfate (L-IdoA-D-GlcNAc)

Chondroïtines sulfate (D-glcU-D-GalNAc)

Dermatane sulfate (L-IdoA-D-GalNac)

Unités disaccharidiques répétitives des glycosaminoglycannes

Les glycosaminoglycannes

[acide uronique (ose neutre)-hexosamine]n

Unité disaccharidique répétée n fois:

Sulfatation, Epimérisation => grande variabilité à l’intérieur d’une même chaîne

Définit les interactions avec les autres acteurs du remodelage tissulaire: un code?

Protéoglycannes et Glycosaminoglycannes de la matrice extracellulaire

Protéoglycannes formant de grands agrégats matriciels.

Acide Hyaluronique (HA)

Chondroïtine sulfate

Protéine de liaison

Core protéique

Agrécane: Cartilage, 1 centaine de CS quelques KS

Versicane: Peau, Vaisseaux, 1 trentaine de CS

PM: jusqu’à 106 Da

Création d’espaces, rétention d’eau, circulation de petites

molécules

K. Senni

Agrécane

Roseman S 2001

Angiogenic oligosaccharides of hyaluronan induce multiple signaling pathways affecting vascular endothelial cell mitogenic and wound healing response

Slevin et al J biol Chem 277 41046-41059

Fragments d’acides hyaluronique = Matrikine?

Fragments d’acide hyaluronique

Petits protéoglycannes riches en leucine: Décorannes

Décorines: 1 Chaîne CS ou DS en N-ter

Biglycane: 2 chaînes CS ou DS en N-ter

Fibromoduline: jusqu’à 4 à 5 chaînes KS tout au long du core protéique

Fibre de collagènes

Décorine

Chaîne GAG

Structuration de la matrice collagénique

Séquestration du TGF (core protéique)

Liaison au FGFR et activation (décorine)

K. Senni

Structuration du réseau élastique

Heparan Sulfate Depletion Within Pulmonary Fibroblasts: Implications for Elastogenesis and RepairBuszceck-Thomas et al J Cell Physiol 192:294–303 (2002)

Les chaînes héparane sulfate participent à la structuration du réseau élastique

Protéoglycannes de la membrane basale

Perlécane: CS/DS

Collagène XVIII: HS

Filtration: glomérule rénal, barrière hémato-encéphalique

Caractère polyanionique

Crinopexie

Les protéoglycannes de la membrane cellulaire

Syndécane 4 et adhésion cellulaire: formation des contacts focaux d’adhésion

PKC

PIP2

Intégrine

Syndécane 4

fibronectineHéparane sulfate

Microfilaments

D’après Tumova et al 2000

Protéoglycannes à Héparanes sulfate (syndécanes, glypicanes) et facteurs de croissance.

Signal

syndécane

FGFR

HS

Membrane cellulaire

FGF

K Senni

D’après Plotnikof et al 1999

Zn

ZnZn

Zn

Zn

V3

MMP-2

TIMP-2

MT1-MMP

CD44 V3 isoform

MMP-7

MMP-9

Heparan sulfate

D’après Seiki Curr Op Cell Biol 2002Membrane plasmique

Interaction CD44 - protéases matricielles:

migration cellulaire, remodelage tissulaire

V3V3

Réplication, différentiation, survie cellulaire

proHB-EGF

ErbB4

CD44v3MMP-7

Focalisation de la MMP-7 (matrilysine) par le CD44v3

Implication dans la survie cellulaire

D’après Yu et al 2002

Les glycosaminoglycannes sont impliqués dans de nombreux mécanismes biologiques

Crinopexie:potentialisation/protection des facteurs de croissance

Contrôle de la protéolyse matricielle

Structuration macromoléculaire/formation d’hydrogels

Régulent avec la margination des cellules inflammatoires

Des acteurs essentiels à la résolution des remodelages tissulaires

De bons candidats en thérapie tissulaire

MAIS

ORIGINE ANIMALEACTIVITE ANTICOAGULANTE

VOLUME/COÛT

II Favoriser la régénération tissulaire.

Trouver des substituts

GAGs mimétiques

I S’opposer au processus inflammatoire

Exopolysaccharides bactéries extrêmophiles

Fucanes

Source: biotechnologie marine

2 Des structurants tissulaires, des biomatériaux

1 Des effecteurs pharmacologiques

Héparane-mimétiques

Hyaluronane-mimétiques

Polysaccharides GAGs mimétiques

Héparane-mimétiques: Portrait robot

- PM: 5 à 80 kDa

- 20 à 40% sulfates/sulfonates

-Structure tridimensionnelle importante -Souplesse de chaîne, embranchements

FucanesPolysaccharides pariétaux des phéophycées

Ascophyllum nodosum

29%6.3%55.7%16000Fucane

OSO3-Ac uronique L-fucosePM

OOH

ROO

OSO3-

OSO3-

RO

O

O

RO

O

O

R = SO3- ou fucose sulfaté

R= SO3-, fucose sulfaté ou acide uronique

Yellow submarine

Source hydrothermale profonde

Écosystème extrême

Exopolysaccharides des bactéries extrêmophyles abyssales (EPS)

Exopolysaccharides des bactéries extrêmophyles abyssales (EPS)

Sélection

Fermentation Production pilote

Boisset C

GY 785 DR

Sulfatation

GY 785

Dépolymérisation radicalaire

EPS d’Altéromonas infernus: GY 785

GY 785 DR0S

Sulfate

Brevet FR0406405

[SO3Na] 2

[4)--Glc-(14)--GalA-(14)--Gal-(1] 3 1

-Glc-(1 6)--Gal -(14)--GlcA -(1 4)--GlcA 2 3

1 1 -Glc -Glc

[SO3Na]

[SO3Na]

[SO3Na]

3

4

6

GY 785 DROS

Roger et al 2004

40%, de sulfates, des acides uroniques, des oses neutres et une structure branchée

PM 20-30 kDa

I S’opposer au processus inflammatoire

(+)

Roulement + adhésion faible

(sélectines)

Perméabilité vasculaire

Prolifération

Chimiotactisme

(+)

C5aC3a (+)

Histamine

IL-8 LTB4 LPS F-Met peptides C5a

Leucocytes

Margination

Adhésion forte(Intégrines…)

Emigration

Cascade du complément

Lumière vasculaire Endothélium Membrane basale

Protéases

Protéases

IL-1

(+)

Chimiokines(IL-2, TNF

(+)

(+)

Pro-MMP 12

Mastocyte sensibilisé

(Dégranulation)

Dégradation et désorganisation de la matrice extracellulaire

MMP 8

(+)

Polynucléaire neutrophile

MMPs

Pro-MMP 8

ElastaseleucocytaireCathepsine G

SynergieMMP 12

Macrophage (+)

(+)

Cellules résidentes

TNF

IL-1

Pro-MMPs

Lymphocytes

K Senni

Inflammation

CIBLE 1

Recrutement des cellules inflammatoires: activités anti-complémentaires

Inhibition de la voie du complément

Productions d’anaphylatoxines, d’opsonines

Activation et Recrutement

Recrutement des cellules inflammatoires: activités anti-complémentaires

C5aC3a

Cascade du complément

C5 et C3 convertases

0

20

40

60

80

100

5µg 10µg

Pou

rcen

tage

d'i

nhib

itio

n

Fucane FTDR

GY785 DROS

GY785 OSDR

Activités anti-complémentaires des dérivés de l’EPS GY785 et du fucane

Courtois A

Inhibition de l’activité cytolytique

Brevet FR0406405

CIBLE 2

Recrutement des cellules inflammatoires: inhibition de la margination

Recrutement des cellules inflammatoires: inhibition de la margination

-Interférence avec les sélectines

-Séquestration des chimiokines

Leucocytes

ProtéasesGlycosidases

Rolling des leucocytes

ProtéasesGlycosidases

Membrane basales

Modèle « d’air pouch » chez la souris: chambre de chémo-attraction in vivo

Dr CD Arréto: Faculté de Chirurgie Dentaire Montrouge, Données personnelles

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000N

om

bre

de

cellu

les

x 10

00Témoin

FucoidineLeucocytes PMNs

Fucane (10mg/kg/h)

Fucane--

Les protéases matricielles

CIBLE 3

Les protéases matricielles

2 Métalloprotéases matricielles (MMPs): (collagénases, gélatinases, stromélysines…)

Inhibiteurs: Serpins

Remodelage tissulaire:Physiologique: embryogénèse, angiogénèse, cicatrisation…Pathologique: Invasion tumorale, ulcèrations chroniques, parodontopathies, …

1 Sérine Protéases (PAs, plasmine, élastase leucocytaire, cathepsine G…)

Dégradation et désorganisation de la matrice extracellulaire

Elastase leucocytaireCathepsine G

Synergie Activation des MMPs

1 Sérine protéases

- Utilisation de fucane comme régulateur de la reconstruction des tissus conjonctifs. Senni et al 1997 Brevet FR2772618

Inhibition de sérine protéases

Substrat synthétique

Interaction avec lysines du site actif

sur substrat naturel?

Exemple: Les fibres élastiques cutanées

Coupes histologiques

Témoin ELH

ELH/ Fucane (10µg/ml)

ELH / Fucane (100µg/ml)

EpFE

Inhibition de l’élastase leucocytaire humaine (ELH)

Ox

Ela

Inhibition de l’élastase leucocytaire humaine (ELH) par un fucane

Lu

LE

Témoin

ELH/fucane (1µg/ml)

ELH/Fucane (100µg/ml)

ELH

Métalloprotéases matricielles (MMPs)

Dégradation et désorganisation de la matrice extracellulaire

MMPs

Cellules résidentes

TNF

IL-1

Pro-MMPs

Les fucanes inhibent la sécrétion de la gélatinase A par des fibroblastes dermiques en culture

Les fucanes inhibent l’induction par l’IL-1 de la MMP-3 sécrétée par des fibroblastes dermiques en culture

(+)

Roulement + adhésion faible

(sélectines)

Perméabilité vasculaire

Prolifération

Chimiotactisme

(+)

C5aC3a (+)

Histamine

IL-8 LTB4 LPS F-Met peptides C5a

Leucocytes

Margination

Adhésion forte(Intégrines…)

Emigration

Cascade du complément

Lumière vasculaire Endothélium Membrane basale

Protéases

Protéases

IL-1

(+)

Chimiokines (IL-2, TNF

(+)

IL-1

(+)

Pro-MMP 12

Mastocyte sensibilisé

(Dégranulation)

Dégradation et désorganisation de la matrice extracellulaire

MMP 8

(+)

Polynucléaire neutrophile

MMPs

Pro-MMP 8

ElastaseleucocytaireCathepsine G

SynergieMMP 12

Macrophage(+)

(+)

Cellules résidentes

TNF

IL-1

Pro-MMPs

Lymphocytes

K Senni

Les héparane-mimétiques marins: des anti-inflammatoires non conventionnels?

II Favoriser la régénération tissulaire

Signal

syndécane

FGFR

Héparane sulfate

Membrane cellulaire

FGF

Senni K

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

J2 J4 J7 J10

jour de culture

Ind

ice

Té

mo

in

Témoin0,1µg/ml1µg/ml10µg/ml100µg/ml

0

20

40

60

80

100

120

140

160

J2 J4 J7 J10

Jours de culture

Ind

ice

Té

mo

in

Témoin

1µg/ml

10µg/ml

100µg/ml

Prolifération de fibroblastes dermiques en culture bidimensionnelle

GY785 DROS

Fucane

Dérivés d’EPS, fucanes et prolifération cellulaire

K Senni

FGF

Forte concentration en polysaccharides:

prolifération

Signal

FGFR

Dérivés d’EPS, fucane

Membrane cellulaire

FGF

Faible concentration en polysaccharides:

prolifération

Ex: Fibroblastes

Myofibroblaste SMA positif

Fibroblaste SMA négatif

Résolution des pathologies fibrotiques ?

Sélection phénotypiques

Lors de certains types de fibroses il y persistance d’un phénotype fibroblastique sécrétoire: le myofibroblaste

Sélection de sous populations fibroblastiques par le GY785DROSImmuno-détection de l' actine des muscles lisses dans des cultures fibroblastiques en cours de

prolifération (7ème jours)

a

fe

dc

b

Observation de sous populations myofibroblastiques dans une culture de fibroblastes dermiques: (a, c et e) GY785 DRS (10µg/ml) (b, d et f) Témoin. -Grandissements: a et b 13; c et d 26, e et f 52 -Immunodétection de l' SMA et contre-coloration à l'hémalun). Myofibroblaste isolé,

La stimulation de la prolifération cellulaire s'accompagne d'une sélection des sous populations non myofibroblastiques

TEMOINGY785 DROS

Senni KBrevet FR0406405

En présence d’une matrice extracellulaire?

Tissu conjonctif reconstruit

(fibroblastes, cellules souches mésenchymateuses)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Jours de culture

No

mb

re d

e c

ellu

les

(x

10

-5)

Témoin GY785 DRS 10µg/ml

Prolifération au sein d’un derme reconstruit

GY785 DROS 10µg/ml

Brevet FR0406405 Gueniche F

Hyaluronane-mimétiques : Portrait robot

-Viscosité

- PM 1000 kDa

Couverture épidermiques des plaies chroniques

L’acide hyaluronique: un biomatériau

Acide hyaluronique: PM = 500 à 1000 kDa

[((3)D GlcNac-(1-4) D-GlcA (1)]n

HE800: PM = 800kDa

(3) D GlcNAc (1-4) D GlcA (1-4) D GlcA (1-4)-D-GalNAc (1)]n

L’exopolysaccharides de Vibrio diabolicus

HE 800 = Hyaluronate mimétique?

A New Bone-Healing Material: A Hyaluronic Acid-Like Bacterial Exopolysaccharide Zanchetta et al Calcif Tissue Int (2003) 72:74–79

Cicatrisation osseuse in vivo

Fischer AM

U765 LBMM

Guézennec J

EA 2496

Godeau G

-Biotechnologie marine

-Thérapies tissulaires

GdR Exopolysaccharides bactériens

Chimie, angiogenèse, ingénierie et régénération tissulaire

-Valorisation industrielle

Faculté de Chirurgie Dentaire

Gaston Godeau

Myriam Yousfi

Farida Gueniche

Grégory Korb

Florence Fioretti

Sylvie Igondjo-Tchen

Karim Senni

Biotechnologie et Molécules marine

Les bretons

Jean Guézennec

Sylvia Colliec-Jouault

Claire Boisset

Corinne Sinquin

Jacqueline Rastikol

Anthony Courtois

Patrick Durand