Evaluation de la performance des tests Abbott Real Time...
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LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE
(LABIOGENE)
UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU ---------------
UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE EN
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE (UFR/SVT)
Mémoire Présenté
Par : Ragnagnewendé Serge Théophile SOUBEIGA
Pour l’obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées
de l’Université de Ouagadougou
SUR LE THEME:
Evaluation de la performance des tests Abbott Real Time
HIV-1 Qualitative (Abbott) et Generic HIV DNA Cell
(Biocentric) pour le diagnostic de l’infection au VIH-1
chez les enfants de moins de 18 mois nés de mères
séropositives Soutenu le……………………. devant le jury composé de :
Président : Pr Lassana SANGARE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou
Dr Virginio PIETRA, Chargé de Recherche, Université de Brescia, Italie
N° d’Ordre .............................../LABIOGENE
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA
Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la justice par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester.
Le master en Biologie Moléculaire et en génétique moléculaires appliquées (BioGeMA) a pour but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires.
Le master BioGeMA est :
Un Master à dimension sous-régionale Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie
moléculaires Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE
Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la relève du corps enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité.
Professeur Jacques SIMPORE
Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire
et de Génétique Moléculaire
UFR/SVT -École Doctorale Sciences et Technologies Université de Ouagadougou
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA
Dédicaces
Nous dédions ce travail de recherche :
A mon père François SOUBEIGA,
A ma mère Marie Rose YONI
A mes frères et sœur Joël, Damien, Nadine et Laurent
A toutes les mères suivant le protocole de la PTME au CMSC
A toutes les personnes Enfants et Adultes vivant avec le VIH/SIDA au Burkina Faso
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA
Remerciements Ce travail a été réalisé au laboratoire du Centre Médical Saint Camille à Ouagadougou au
Burkina Faso (CMSC) et au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI
(CERBA). Nous tenons à exprimer notre profonde gratitude :
Au Professeur Lassana SANGARE, Professeur titulaire, Chef de service du laboratoire de
Bactériologie-Virologie du CHU-YO, pour avoir accepté de présider le jury de notre
soutenance.
Au Professeur Jacques SIMPORE, Professeur titulaire, Coordonnateur du Master de
Biologie et de Génétique Moléculaires Appliquées (BioGeMA), Directeur du laboratoire
du Centre Médical Saint Camille à Ouagadougou, Directeur du Centre de Recherche
Biomoléculaire Pietro ANNIGONI /Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique
(CERBA/LABIOGENE), Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin à Saaba, notre
Directeur de Mémoire pour son encadrement et pour son soutien dans la réussite de notre
Master de recherche.
Au Docteur Virginio PIETRA, Chargé de Recherche à l’Université de Brescia en Italie,
pour sa collaboration et pour avoir accepté être membre du jury de notre soutenance
Au Docteur Cyrille BISSEYE, Enseignant en master 2 BIOGEMA, pour l’encadrement au
laboratoire et dans la rédaction de ce mémoire de Master 2
A Rebecca COMPAORE et à Elsa ASSENGONE pour leur soutien lors de nos
manipulations
Au personnel du laboratoire du CMSC et du CERBA pour leur bonne collaboration
A toute autre personne qui de près ou de loin ont participé à la réalisation et à la qualité de
notre travail
A mes parents, frères et sœur pour leurs soutiens et encouragements
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA
Résumé
Introduction : La PCR qualitative en Temps Réel est une technique largement utilisée dans
le cadre médical, pour la détection virale en analyse clinique de routine. Plusieurs tests
qualitatifs comme Abbott Real Time HIV-1 Qualitative d’Abbott et Generic HIV DNA Cell de
Biocentric peuvent en effet, être utilisés pour le diagnostic précoce du VIH-1 chez les enfants
de moins de 18 mois nés de mère VIH positive dans le cadre de la Prévention de la
Transmission Mère-Enfant (PTME) au Centre médical Saint Camille à Ouagadougou. Leur
performance peut être évaluée en comparant les résultats ainsi que leur sensibilité et leur
spécificité.
Méthode : Des échantillons de DBS ont été collectés chez 160 enfants nés de mères
séropositives suivant le protocole de la PTME et 40 enfants dont les mères ne suivent pas le
protocole de la PTME. Tous les échantillons ont été testés avec le test Abbott Real Time HIV-
1 Qualitative et les 40 échantillons ont en plus été testés avec le test Generic HIV DNA Cell.
Pour le test Generic HIV DNA Cell, l’ADN a été extrait avec le kit Qiagen et l’appareil 7500
Fast Real Time PCR de Applied Biosystems a été utilisé pour l’amplification. Les données
ont été analysées avec SPSS version 17.0 et EpiInfo version 6,0.
Résultats : Les résultats de notre étude ont montré une concordance de 100 % (Kappa=1,
Z=32, p < 0,001) entre les tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA
Cell. Cette étude de recherche a permis de montrer la forte sensibilité (1 copie d’ADN
VIH/PCR), la simplicité, la rapidité ainsi que le faible coût du test Generic HIV DNA Cell par
rapport au test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative (50 copies d’ADN VIH/PCR. Aussi le
taux de transmission était nul (0,0 %) chez les enfants dont les mères étaient sous traitement
(prophylaxie ou HAART) et de 15,0 % chez les enfants dont les mères ne suivent pas le
protocole de la PTME.
Conclusion : Le test Generic HIV DNA Cell peut aussi être utilisé en routine au centre
médical Saint Camille dans le cadre de la PTME. Aussi, le protocole de la PTME appliqué
chez une mère VIH (+) est très efficace et réduit très significativement (p < 0,001) le risque de
transmission du VIH à l’enfant par rapport à une mère VIH (+) qui ne suit pas ce protocole.
Mots clés : PCR qualitative en Temps Réel ; VIH ; PTME
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA
Abstract
Introduction: Qualitative Real-Time PCR is a technique widely used in the medical setting,
for viral detection in clinical routine analysis. Several qualitative tests such as Abbott Real
Time HIV-1 Qualitative (Abbott Molecular) and Generic HIV DNA Cell (Biocentric) tests can
indeed be used for early diagnosis in children who are less than 18 months old, born to HIV-
positive mothers in Prevention of Mother To Child Transmission (PMTCT) in Saint Camille
medical Center in Ouagadougou. Their performance can be assessed by comparing the results
of two tests and their sensitivity and specificity.
Method: Dried blood spots (DBS) samples were collected from 160 children born to HIV-
positive mothers following PMTCT protocol and 40 children born to HIV-positive mothers
not following PMTCT protocol. All samples were tested with test and 40 samples were tested
with Abbott Real Time HIV-1 Qualitative and Generic HIV DNA Cell tests respectively. For
the Generic HIV DNA Cell test, DNA was extracted with a Qiagen kit and the equipment
used for amplification was Applied Biosystem’s 7500 Fast Real-Time PCR. Data were
analyzed using SPSS version 17.0 and EpiInfo Version 6.0.
Results: The results of our study showed 100% concordance (Kappa=1, Z=32, p < 0,001)
between the Abbott HIV-1 Real Time Qualitative and the Generic HIV DNA Cell tests. This
research study has demonstrated the high sensitivity (1 copie of HIV DNA / PCR), simplicity,
speed and low cost of the Generic HIV DNA Cell test from the Abbott Real Time HIV-1
Qualitative test (50 copies of HIV DNA / PCR). As the transmission rate was zero (0.0 %) in
children whose mothers were under treatment (prophylaxis or HAART) and 15.0% in whose
mothers do not follow the PMTCT protocol.
Conclusion: The Generic HIV DNA Cell assay can also be used routinely in Saint Camille
Medical Center in the PMTCT. Also, the PMTCT protocol applied on mothers HIV (+) is
very efficacy and very significantly (p < 0,001) reducing HIV transmission risk to infants
contrary to mother HIV (+) not following up this protocol.
Key words: Qualitative Real-Time PCR; HIV; PMTCT
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA
Table des matières
Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA ...................................................................2
Remerciements .......................................................................................................................4
Résumé ..................................................................................................................................5
Abstract ..................................................................................................................................6
Liste des figures .....................................................................................................................9
Liste des tableaux ................................................................................................................ 10
Liste des sigles et abréviations .............................................................................................. 11
Introduction .......................................................................................................................... 13
1.REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................................... 15
1.1.Diversité génétique du VIH ............................................................................................ 15
1.2.Organisation structurale du VIH-1 .................................................................................. 16
1.2.1.Structure du VIH-1 ...................................................................................................... 16
1.2.2.Organisation du génome du VIH-1 ............................................................................... 16
1.3. Mécanisme d’infection par le VIH et évolution de l’infection ...................................... 17
1.3.1.Mécanisme d’infection par le VIH ............................................................................... 17
1.3.2.Evolution de l’infection virale ...................................................................................... 18
1.4.Modes de transmission du VIH ....................................................................................... 19
1.5.Prévention de la transmission mère-enfant du VIH.......................................................... 20
1.6.Techniques de diagnostic de l’infection par le VIH-1 ...................................................... 20
1.6.1.Diagnostic indirect ....................................................................................................... 20
1.6.1.1.Test ELISA ............................................................................................................... 20
1.6.1.2.Tests de dépistage rapides (TDR) .............................................................................. 21
1.6.2. Techniques de PCR en Temps Réel ............................................................................. 21
1.6.2.1.PCR quantitative en Temps Réel ............................................................................... 21
1.6.2.2.Méthodes de quantification de la charge virale .......................................................... 25
1.6.2.3.PCR qualitative en Temps Réel : Dried Blood Spot (DBS) ........................................ 31
2.OBJECTIFS DE L’ETUDE ............................................................................................... 34
2.1.Objectif principal ............................................................................................................ 34
2.2.Objectifs spécifiques ....................................................................................................... 34
3.MATERIEL ET METHODES ........................................................................................... 35
3.1.Cadre et période d’étude ................................................................................................. 35
3.2.Matériel d’étude.............................................................................................................. 35
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA
3.2.1.Population d’étude et collecte des échantillons ............................................................. 35
3.2.2.Recrutement des patients.............................................................................................. 35
3.3.Aspect éthique ................................................................................................................ 35
3.4.Analyse des données ...................................................................................................... 36
3.5.Matériel utilisé ................................................................................................................ 36
3.6.Méthodes ........................................................................................................................ 37
3.6.1.PCR qualitative avec Abbott Real Time HIV-1 Qualitative .......................................... 37
3.6.1.1.Extraction de l’ADN viral ......................................................................................... 37
3.6.1.2.Amplification de l’ADN viral extrait ......................................................................... 39
3.6.2.PCR qualitative avec Generic HIV DNA Cell .............................................................. 40
3.6.2.1.Extraction de l’ADN viral ......................................................................................... 40
3.6.2.2.Amplification de l’ADN extrait ................................................................................. 41
4.RESULTATS .................................................................................................................... 43
4.1.Protocole de Prévention de la Transmission mère-enfant du VIH au CMSC ................... 43
4.2.Taux de transmission mère-enfant du VIH-1 au CMSC .................................................. 44
4.3.Performance en terme de détection de l’infection au VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois au CMSC ................................................................................................................ 44
4.4.Coût des tests .................................................................................................................. 45
5.DISCUSSION ................................................................................................................... 46
CONCLUSION ET PERSPECTIVES .................................................................................. 49
REFERENCES ................................................................................................................... 50
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Liste des figures
Figure 1 : Les différents groupes de VIH-1 infectant l’homme...............................................15
Figure 2 : Structure du VIH-1..................................................................................................16
Figure 3 : Organisation du génome du VIH-1.........................................................................17
Figure 4 : Etapes du cycle viral................................................................................................18
Figure 5: Evolution de l’infection par le VIH-1......................................................................19
Figure 6 : Etapes de la PCR ....................................................................................................22
Figure 7 : Principe de la reverse transcription..........................................................................23
Figure 8 : Principe de la PCR en Temps Réel.........................................................................25
Figure 9 : Chimie des sondes Beacons.....................................................................................26
Figure 10 : Principe des sondes FRET en tandem...................................................................28
Figure 11 : Principe des sondes Taqman..................................................................................30
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 10
Liste des tableaux
Tableau 1 : Les options de programme de la PTME...............................................................20
Tableau 2 : Comparaison des tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA Cell............................................................................................................................................33
Tableau 3 : Prophylaxie chez les enfants.................................................................................43
Tableau 4 : Répartition des mères suivant ou non le protocole de la PTME et résultats des
PCR des enfants........................................................................................................................44
Tableau 5: Concordance des tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA
Cell............................................................................................................................................45
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Liste des sigles et abréviations
Ac : Anticorps
ADN : Acide désoxyribonucléique
Ag : Antigène
ARN : Acide ribonucléique
ARV : Antirétroviral
AZT/3TC : Zidovudine/Lamivudine
CERBA/LABIOGENE : Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI/
Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire
CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité
CMSC : Centre Médical Saint Camille
CNLST : Conseil National de Lutte Contre le SIDA et les IST
CRF : Circulating Recombinant Form
DBS : Dried Blood Spot
EFV : Efavirenz
ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
Env : Enveloppe
Gag : Groupe antigène
Gp : Glycoprotéine
HAART : Highly Active Antiretroviral Therapy
HLA : Human Leucocyte Antigene
Ig : Immunoglobuline
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INNTI : Inhibiteur non Nucléosidique de la Transcriptase Inverse
NVP : Névirapine
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
ONUSIDA : Organisation des Nations Unies – Syndrome de
L’immunodéficience acquise
Pol : Polymérase
PTME : Prévention de la Transmission Mère-Enfant du VIH
RT-PCR : Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction
SIV : Simian Immunodeficiency Virus
TARV : Traitement antirétroviral
ZDV : Zidovudine
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Introduction
Le nombre de personnes vivant avec le VIH/SIDA dans le monde est estimé à 34,0 millions
en fin 2011 (ONUSIDA, 2011 et 2012). Les adultes (15-49 ans) représentaient 30,1 millions,
les femmes 16,8 millions et les enfants (de moins de 15 ans) 3,4 millions
(ONUSIDA,2011).
L’Afrique sub-saharienne compte à elle seule 23,5 millions soit 69% des personnes infectées
dans le monde (ONUSIDA, 2012). Au Burkina Faso, la prévalence du VIH est variable. Elle
représente 2,5% chez les individus âgés de 15 à 24 ans ; 2,3% chez les femmes enceintes et
16,0% chez les travailleuses de sexe (CNLST, 2009).
Grâce à la forte disponibilité des antirétroviraux (ARV), le nombre de personnes
nouvellement infectées par le VIH a chuté depuis 2002. En 2011, le nombre de nouvelles
infections établies était de 2,5 millions en recul par rapport aux 3,2 millions en 2001
(ONUSIDA,2012). Le Burkina Faso relevait une décroissance de 25-49 % entre 2005-2011
(ONUSIDA,2012) .
Le diagnostic moléculaire du VIH-1 chez les sujets infectés ainsi que le suivi des sujets sous
traitement antirétroviral sont possible grâce à la PCR (réaction de polymérisation en chaîne).
La PCR est devenue un outil essentiel en biologie moléculaire et son application dans la
détection des acides nucléiques a révolutionné l’analyse quantitative des gènes et de leurs
messagers. Ce concept technologique a rapidement évolué au cours de ces dernières années, et
le nombre croissant des applications de la PCR a contribué au développement de la PCR
quantitative et/ou qualitative en Temps Réel. La PCR en Temps Réel, est une technique très
utilisée pour la détection qualitative des génomes viraux. Elle est beaucoup plus fiable et plus
sensible que les techniques en point final (PCR classique). La PCR en Temps Réel est une
technique qui donne la possibilité de suivre au cours du temps (en temps réel ), cycle par
cycle le processus de la PCR à l’aide de la fluorescence (Higuchi et al.,1992).
Le nombre d’enfants infectés par an ne cessait d’augmenter jusqu’en 2002, année où il a
atteint son niveau maximum d’environ 590 000. En 2010, il est passé à 350 000 selon les
estimations (OMS, 2012). La transmission mère-enfant du VIH-1 peut se faire in utero,
pendant l’accouchement, et après la naissance à travers l’allaitement maternel (Kourtis et al.,
2001).
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 14
Le risque de transmission est de 5-10% (grossesse), 10-20% (accouchement) et de 5-10% (6
premiers mois de l’allaitement) et de 10-15% (24 mois de l’allaitement) (OMS, 2005). Au
Burkina Faso, le nouveau protocole de la Prévention de la Transmission Mère-enfant
(PTME) est en vigueur depuis 2007 au Centre Médical Saint Camille. Ce protocole vise à
améliorer le traitement des mères VIH (+) et à réduire significativement le risque de
transmission du VIH de la mère à l’enfant.
Les circonstances de diagnostic de l’infection par le VIH-1 chez l’enfant font appel à
différentes techniques de diagnostic qui doivent être mises en œuvre en fonction du contexte
thérapeutique et de l’âge de l’enfant. La technique de PCR qualitative en Temps Réel
demeure de nos jours la plus utilisée dans le diagnostic précoce du VIH-1 chez les enfants de
moins de 18 mois nés de mère séropositive. Cette technique, plus sensible, contrairement à la
PCR classique permet d’obtenir un meilleur résultat qu’en à la détection du VIH-1 chez les
enfants infectés.
Plusieurs tests d’amplification par PCR en Temps Réel existent et permettent tous de détecter
le VIH-1 chez les enfants infectés. Afin d’améliorer la qualité des résultats, il serait alors
nécessaire d’évaluer certains tests comme celui de Abbott (Abbott Real Time HIV-1
Qualitative) et de Biocentric (Generic HIV DNA Cell) qui sont tous des tests d’amplification
par PCR qualitative en Temps Réel utilisés dans notre laboratoire dans le cadre du diagnostic
précoce du VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois nés de mère séropositive.
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 15
1. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. Diversité génétique du VIH
Le virus du SIDA présente une très forte variabilité génétique. Il existe deux principaux types
de virus : le VIH-1 et le VIH-2.
Le VIH-1, le plus répandu dans le monde, comprend quatre groupes ( M (Major), N (New), O
(Outlier) et P ) qui présentent des caractéristiques génétiques différentes. A l'intérieur du
groupe M, le plus fréquent, on distingue encore 9 sous-types (A, B, C, D, F, G, H, J, K)
comportant des souches recombinantes appelées formes recombinantes circulantes (CRF01 à
CRF37) (Peeters et al., 2008).
Pour le VIH-2, 8 groupes (A, B, C, D, E, F, G, H) ont été définis. Les groupes A et B sont les
plus représentés. L’infection par le VIH-2 touche majoritairement des patients originaires
d’Afrique de l’Ouest et d’Afrique Centrale, en particulier au Sénégal, en Côte d’Ivoire, au
Mali, en Guinée-Bissau, au Burkina Faso, en Angola et au Mozambique.
Figure 1 : Les différents groupes de VIH-1 infectant l’homme
(Source : http://www.futura-sciences.com/magazines/sante/infos/actu/d/medecine-souche-vih-
quon-pensait-disparue-infecte-nouveau-34865 )
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 16
1.2. Organisation structurale du VIH-1
1.2.1. Structure du VIH-1
La structure du VIH comporte :
o Une enveloppe virale constituée d'une double bicouche lipidique et de deux sortes de
glycoprotéines : gp120 (VIH-1) et gp 41. La molécule gp 120 joue le rôle de récepteur
viral de la molécule membranaire CD4 des cellules hôtes.
o Un core viral ou nucléocapside, qui inclut une couche de protéine p17 et une couche
plus profonde de protéines p24.
o Un génome constitué de deux copies d'ARN simple brin associées à deux molécules
de transcriptase inverse (p64) et à d'autres protéines enzymatiques (protéase p10 et
intégrase p34).
Figure 2 : Structure du VIH-1 (Karlson Hedestam et al., 2008)
1.2.2. Organisation du génome du VIH-1
Le génome du VIH-1 se compose d'un ARN simple brin de 9 181 nucléotides. Il comporte
trois gènes principaux (Gag, Pol, et Env), ainsi que quelques gènes de régulation. Le VIH
possède 9 gènes codant pour différentes protéines virales : les protéines de structure et les
protéines régulatrices.
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 17
Figure 3 : Structure du génome du VIH-1 (Peterlin et Trono, 2003)
1.3. Mécanisme d’infection par le VIH et évolution de l’infection
1.3.1. Mécanisme d’infection par le VIH
Il existe au moins deux récepteurs sur les lymphocytes T sur lesquels le VIH se fixe : le
récepteur fondamental, CD4 qui présente une haute affinité pour la molécule gp120 et les co –
récepteurs CCR5, CXCR4 appartenant à la famille des chimiokines (Kim et al.,2009). La
principale cible du VIH est le lymphocyte T CD4 bien qu’il existe d’autres types de cellules
comme les macrophages, les monocytes et les cellules dendritiques qui sont infectées par ce
dernier.
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 18
Figure 4: Etapes du cycle viral du VH-1 (Adapté de Engelmann et Cherepanov, 2012)
1.3.2. Evolution de l’infection virale
Trois phases se distinguent lors d’une infection par le virus du SIDA :
La phase de primo-infection : elle correspond aux premières semaines qui suivent
l’entrée du virus dans l’organisme. Le virus se multiplie alors intensivement dans ses cellules
cibles, les lymphocytes T CD4. Durant cette période, appelée syndrome rétroviral aigüe, la
charge virale plasmatique est élevée et on observe une déplétion des T CD4. Plus tard, le
nombre de lymphocytes augmente mais est généralement inférieur à la normal.
La phase asymptomatique : l’individu atteint ne présente aucun symptôme de la
maladie. Le virus continue de se répliquer, tandis que le taux de lymphocytes T CD4
circulants continue de baisser régulièrement. Nonobstant le contrôle de la maladie par le
système immunitaire, les lymphocytes T sont progressivement détruits par le virus.
La phase SIDA : le nombre des lymphocytes CD4 diminue et par conséquent, il se
produit une dépression du système immunitaire principalement de type cellulaire mais
également de type humorale. Ces événements conduisent à l’apparition des premiers
symptômes de la maladie et des infections opportunistes (Tuberculose, pneumocystose,
Toxoplasmose cérébrale, Sarcome de Kaposi, infection à Cytomégalovirus etc.)
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 19
Figure 5: Evolution de l’infection par le VIH-1 (Munier et Kelleher, 2007)
1.4. Modes de transmission du VIH
Trois modes de transmission de l’infection à VIH ont été éventuellement identifiés :
Le premier est la transmission directe à travers des contacts sexuels non-protégés
entre deux personnes dont l'une au moins est infectée par le VIH.
Le deuxième mode est également direct. C'est la transmission mère-enfant ou
transmission verticale. Cette transmission du VIH de la mère à l'enfant peut s'effectuer
pendant la grossesse (10%), au moment de l'accouchement (15%) et après la naissance au
cours de l'allaitement maternel (10%) (Simporé et al., 2007).
Le troisième mode est indirect, c'est la transmission parentérale par le sang. Cette
transmission par le sang se fait selon différentes modalités :
La première unanimement reconnue est la transfusion de sang contaminé,
La deuxième modalité est la transmission par une aiguille ou par tout instrument
contaminé par le VIH perçant la peau d'une personne,
La troisième modalité est la pénétration dans l'organisme du VIH véhiculé par le
sang à travers une peau ou une muqueuse lésée.
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 20
1.5. Prévention de la transmission mère-enfant du VIH
Les nouvelles lignes directrices 2013 de l’OMS recommandent une initiation du traitement
antirétroviral (TAR) pour toutes les femmes enceintes et allaitantes vivantes avec le VIH.
Tableau I: Les options du programme de la PTME (OMS, 2013)
1.6. Techniques de diagnostic de l’infection par le VIH-1 1.6.1. Diagnostic indirect
1.6.1.1. Test ELISA
Deux tests ELISA existent pour le dépistage du VIH :
ELISA indirect : les anticorps anti-VIH à doser réagissent dans un premier temps avec
l’Ag immobilisé. Dans un deuxième temps, la quantité d’Ac anti-VIH fixé sur l’Ag en excès
est mesurée à l’aide d’un deuxième Ac anti-immunoglobuline (anti-IgM, IgG) conjugué à une
enzyme. L’activité enzymatique est proportionnelle à la quantité d’Ac anti-VIH à doser.
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ELISA sandwich : Un Ac spécifique d’un Ag est immobilisé sur un support. Dans un
premier temps, l’Ag à doser est capté par l’Ac spécifique immobilisé sur le support. Dans un
deuxième temps, la quantité d’Ac complexé avec l’Ag est mesurée après sa réaction avec un
Ac rajouté dans le milieu réactionnel, de même spécificité et couplé à une enzyme (ou Ac
conjugué). C’est ce test qui donne les résultats les plus satisfaisants aussi du point de vue de la
spécificité que de la reproductibilité.
1.6.1.2.Tests de dépistage rapides (TDR)
Le test de dépistage rapide du VIH détecte la présence des anticorps du VIH dans le sang. Ces
anticorps apparaissent de quelques semaines à quelques mois après que le virus ait pénétré à
l’intérieur du corps. Il existe plusieurs TDR actuellement pouvant être effectués soit à partir
du plasma, du sang total ou à partir de la salive.
1.6.2. Techniques de PCR en Temps Réel
1.6.2.1. PCR quantitative en Temps Réel
La réaction PCR
La PCR par définition est une réaction en chaîne au cours de laquelle les produits issus d’un
cycle d’amplification servent de matrice pour le cycle suivant. Ainsi, la réaction en chaîne qui
s’établit par la répétition des cycles de dénaturation-hybridation-élongation aboutit à une
accumulation exponentielle théorique de 2n fois par molécule d’ADN. Autrement dit, la
quantité de produits de PCR double à chaque cycle d’amplification suivant la relation
mathématique suivante : N = N0. 2n (Où : N est le nombre de molécules amplifiées au final,
N0 le nombre initial de molécules et n le nombre de cycles d’amplification).
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 22
Figure 6 : Etapes de la PCR (Laudenbach, 2006)
La Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
La Reverse Transcriptase PCR, est une PCR après transcription inverse d'un acide
ribonucléique (ARN) en ADN complémentaire (ADNc). En réalité, il s'agit d'une PCR
"classique" réalisée sur un ADN complémentaire (ou ADNc), qui est une copie d'un ARN
obtenue par une transcription inverse. La transcription inverse est une réaction délicate du fait
d‘une part, de sa faible reproductibilité et, d’autre part, de la fragilité de l’ARN et de sa
contamination fréquente par de l’ADN. Il faudra aussi dans certains cas obtenir une
amplification spécifique dans un milieu où des séquences homologues peuvent être présentes
en quantité très largement supérieure à celle de la séquence d‘intérêt (Cave et al., 2003).
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 23
Figure 7: (a) : Séparation de l’ARNm des autres ARN cellulaires (b) : Transformation de
l’ARNm en ADNc par la reverse transcriptase (Pray, 2008)
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Principe de la PCR quantitative en Temps Réel
Le principe de la PCR quantitative en Temps Réel repose sur le suivi cycle par cycle de la
réaction d’amplification enzymatique au moyen d’une molécule reporter fluorescente capable
d’émettre dans des conditions bien définies un rayonnement fluorescent dont l’intensité sera
directement mesurée à un moment donné au cours de chaque cycle PCR. L’intensité de la
fluorescence émise par la molécule reporter augmente à chaque cycle PCR. Par ce suivi, il est
alors possible de tracer une courbe, de caractériser les différentes phases de la cinétique PCR
et de mesurer la quantité de produit d’amplification généré en un point de la phase
exponentielle (figure 8). C’est uniquement au cours de cette phase qu’il sera possible
d’extrapoler la quantité de matrice cible initialement présente avant amplification. Au cours
des premiers cycles d’amplification, l’intensité de la fluorescence émise est très faible et va
permettre de définir la ligne de base de la courbe. Après un certain nombre de cycles,
l’accumulation des produits de PCR entraîne une variation mesurable de l’intensité de la
fluorescence émise. Le point de départ de la phase exponentielle, phase au cours de laquelle
l’efficacité d’amplification est supposée rester constante, est appelé cycle seuil optique.
Plus précisément, le cycle seuil optique est le nombre fractionnaire de cycles pour lequel
l’intensité de la fluorescence émise a dépassé une valeur seuil (ou seuil de détection optique)
significativement différente du bruit de fond. Selon l’algorithme utilisé pour son calcul, il est
symbolisé par les lettres Ct (threshold cycle) ou Cp (crossing point). Le cycle seuil est un
point remarquable de la cinétique d’amplification car il se trouve inversement proportionnel
au logarithme du nombre N0 de molécules d’acide nucléique cible initialement présentes
avant amplification par PCR (Heid et al., 1999). Si l’on suit la fluorescence au cours du
temps d’une PCR en Temps Réel, on observe une augmentation de cette fluorescence et
donc du nombre de fragments PCR en 3 phases distinctes :
Phase de bruit de fond : La quantité de fragment amplifié est insuffisante pour générer
un signal fluorescent supérieur au seuil de détection.
Phase exponentielle : La quantité de fragment amplifié génère un signal fluorescent
supérieur au seuil de détection de l’appareil, puis le nombre de produits amplifié
double à chaque cycle.
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 25
Phase de plateau (ou de saturation) : certains composants de la réaction (et en
particulier le nombre de molécules de Taq disponibles) deviennent limitant. Le
système ne permet plus une amplification exponentielle.
Figure 8 : Principe de la PCR quantitative en Temps Réel
(Source : www.gene-quantification.info)
Dans les approches de quantification par RT-PCR, une séquence endogène sert de standard
interne. Cette séquence est co-amplifiée avec la séquence cible au cours d’une même réaction
PCR utilisant deux couples d’amorces spécifiques. La méthode permet d’évaluer la quantité
relative de gène cible par rapport au gène de référence, ce dernier permettant de normaliser la
quantité et la qualité d’acide nucléique extrait (Tse et Capeau, 2003).
1.6.2.2. Méthodes de quantification de la charge virale
Méthode Beacons
Le principe est basé sur l'utilisation d'une seule sonde doublement marquée avec un
rapporteur et un bloqueur, possédant une structure complémentaire lui permettant de se replier
sur elle-même. Quand la sonde s'hybride à la séquence cible, elle subit un changement de
conformation spontané forçant les deux fluorophores à s'éloigner, et permettant ainsi au
rapporteur d'émettre une fluorescence (Tyagi et Kramer , 1996). L’inconvénient majeur du
système Beacon est la difficulté de conception des sondes.
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 26
Figure 9 : La chimie des sondes Beacons (Tse et Capeau, 2003)
Méthode FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Le système utilise un couple de sondes d’hybridation très courtes portant chacune un
fluorophore (figure 10). La sonde en amont porte le fluorophore donneur à son extrêmité 3’ et
la sonde en aval porte le fluorophore accepteur à son extrêmité 5’. La particularité de ce
système réside dans le fait que le processus de transfert d’énergie par FRET s’effectue entre
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 27
les deux fluorophores séparés par moins de cinq nucléotides, le fluorophore donneur ayant un
spectre d’émission se chevauchant avec le spectre d’excitation du fluorophore accepteur. Les
sondes sont conçues afin qu’elles s’hybrident à leur séquence cible en restant adjacentes. Une
fois que les sondes sont hybridées, les fluorophores donneurs et accepteurs sont proches l’une
de l’autre (Simon et al., 2004). Le transfert d’énergie est alors direct et hautement efficace :
l’énergie libérée par le fluorophore donneur de haute énergie est directement captée par le
fluorophore accepteur de moindre énergie qui ainsi excité émet à son tour un signal
fluorescent mesurable.
À la différence du signal fluorescent émis par une sonde TaqMan, celui émis à l’aide d’un
couple de sondes FRET en tandem est directement lié à l’hybridation des sondes sur une cible
qui leur est spécifique. De plus, les sondes ne subissant pas d’hydrolyse, l’émission de
fluorescence est réversible et la production d’une courbe de fusion est réalisable après PCR.
Le système des sondes FRET en tandem est simple mais cependant limité par le choix du
couple de fluorophores. Le transfert d’énergie par FRET n’est efficace que lorsque la
fluorescéine est associée à l’un des fluorophores très particuliers que sont les Red Light
Cycler LC Red 640 et LC Red 705, ce qui limite à deux cibles maximum la capacité du
système à quantifier simultanément plusieurs cibles (Tse et Capeau, 2003). Les sondes FRET
sont extrêmement utiles pour le génotypage, la détection des SNP (Single Nucleotide
Polymorphism) et la détection d’autres mutations.
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Figure 10: Principe des sondes FRET en tandem (Tse et Capeau, 2003)
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Méthode TaqMan
De nombreuses techniques sont applicables à la RT-PCR en Temps Réel (SybrGreen, test
d'hybridation, sonde Beacon etc.) ; néanmoins, la plus utilisée pour la quantification des
génomes viraux est la méthode TaqMan. À l'heure actuelle, le TaqMan est très utilisé en
recherche, car il présente de très nombreux avantages et, malgré son coût élevé, son utilisation
en diagnostic clinique au sein des laboratoires d'analyses se développe de plus en plus. La
PCR Taqman est une procédure PCR basée sur l’hydrolyse quantitative de sonde fluorescente,
qui peut être employée pour la détection de la sensibilité et de la spécificité des acides
nucléiques (Valasek et Repa, 2005).
De nos jours, les nouvelles sondes Taqman ne possèdent plus de Quencher à leur extrêmité 3’,
mais le principe demeure le même. La fluorescence émise par le Reporter n’est plus absorbée
du fait de l’absence du Quencher. La particularité du système Taqman est d’exploiter
l’activité 5’-3’ nucléase de l’ADN polymérase qui permet d’hydrolyser la sonde hybridée à sa
cible spécifique lors de l’étape d’élongation des amorces (Holland et al,.1991). À chaque brin
synthétisé, la molécule fluorescente est libérée et la quantité de fluorescence est par
conséquent directement proportionnelle au nombre de copies du gène amplifié. Par ailleurs,
elle n'est pas influencée par l'accumulation de produits non spécifiques (comme des dimères
d'amorces) sur lesquels la sonde marquée ne s'hybride pas.
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Figure 11 : Principe de la méthode Taqman (Adapté de Yang et Rothman, 2004)
Polymerisation completed
R
Probe displacement by 5’ exonuclease of Taq polymerase
R
R
3 5
5 3R
Polymerisation
Primers and probe annealing
Denatured DNA
Reporter dye
Primers
Fluorescent emitting
Reporter dye
Synthesised DNA
R
R
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1.6.2.3. PCR qualitative en Temps Réel : Dried Blood Spot (DBS)
La PCR qualitative en Temps Réel est une technique d’amplification in vitro qui permet la
détermination qualitative des acides nucléiques du VIH-1 à partir de plasma humain et de
sang total sur papier buvard DBS. Elle est utilisée lors du diagnostic de l’infection au VIH
chez les enfants et adultes.
Les tests de détection des acides nucléiques du VIH-1 ont été recommandés pour la détection
de l’infection chez les patients pédiatriques jusqu’à l’âge de 18 mois (Read, 2007 ;
Prendergast et al., 2007). La PCR qualitative en Temps Réel utilise la technologie PCR
associée à une méthode de détection par fluorescence en temps réel pour détecter des acides
nucléiques du VIH-1. Elle permet l’obtention d’un résultat qualitatif. Cette technique est
utilisée dans le cadre de la PTME au CMSC à Ouagadougou pour vérifier une infection
probable au VIH-1 chez des enfants de moins de 18 mois nés de mère séropositive.
Principe du test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative
Le test Abbott Real Time HIV-1 qualitatif utilise la PCR pour créer des produits amplifiés à
partir des acides nucléiques du VIH-1. La présence de la séquence cible VIH-1 est indiquée
par un signal fluorescent généré grâce à l’utilisation de sondes oligonucléotidiques marquées
par des fluorochromes en utilisant l’appareil Abbott m2000rt. Une séquence d’ARN ne
correspondant pas à la séquence cible du VIH-1 est introduite dans chaque échantillon au
début de la préparation des échantillons. Cette séquence sert de contrôle interne (IC) afin de
démontrer le traitement correct de chaque échantillon. Pendant la réaction d’amplification,
l’ADN cible est amplifié sous l’activité de l’ADN polymérase thermostable rTh ADN. La
séquence cible du test Abbott Real Time HIV-1 qualitatif se situe dans la région codant
l’intégrase gène pol du génome du VIH-1, une région hautement conservée (Myers et al.,
1994).
La sonde VIH-1 possède une fraction fluorescente liée de manière covalente à l’extrémité 5’.
Un oligonucléotide servant d’inhibiteur (quencher) est complémentaire de l’extrémité 5’ de la
sonde VIH-1 et possède un fragment désactivant à son extrémité 3’. En présence d’une
séquence cible VIH-1, la sonde VIH-1 s’hybride de préférence avec la séquence cible, la
dissociant du quencher et permet ainsi la détection par fluorescence. Le résultat du test est
soit "Detected" soit "Not Detected".
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Principe du test Generic HIV DNA CELL de Biocentric
Le test Generic HIV DNA CELL (Biocentric, Paris, France) est un test de PCR en temps réel
pour la détection qualitative ou quantitative de l’ADN VIH-1. Ce test exploite le principe de
PCR par hydrolyse d’une sonde nucléotidique doublement marquée avec un groupement 5’
reporter et un groupement 3’quencher. Pendant la PCR, les amorces sens et anti-sens
s’hybrident à une séquence spécifique au niveau des amplicons. La sonde contenue dans le
même mélange réactionnel s’hybride à une séquence cible de l’amplicon. Elle se fixe
spécifiquement entre les deux sites où sont hybridés les amorces sens et anti-sens et inhibe
toute activité polymérase de la Taq polymérase, mais active sa fonction 5’-3’ exonucléase qui
clive la sonde entre le reporter et le quencher. Le reporter, libéré du quencher, émet un signal
fluorescent enregistré en temps réel par des capteurs. L’augmentation du signal fluorescent est
détectée seulement si la séquence cible est complémentaire à la sonde et si elle est amplifiée
par PCR. Ainsi, une amplification non spécifique ne peut pas être détectée.
Le kit Generic HIV DNA CELL inclut un standard composé d’ADN extrait de la lignée
cellulaire 8E5 et contient 3x106 copies/ml. Cette lignée cellulaire est chroniquement infectée
par le VIH-1 à raison d’une copie d’ADN par cellule.
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Tableau II : Comparaison entre les tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA CELL
Abbott Real Time HIV-1 Qualitative Generic HIV DNA CELL
Système Fermé Ouvert
PCR en temps réel Qualitative ou Quantitative Qualitative ou Quantitative
Amplification 3h 2h
Méthode Taqman Taqman
Sensibilité
2 500 copies/ml (DBS) soit 50 copies d’ADN VIH/PCR
1 copie d’ADN VIH/PCR
Spécificité 100% 100%
Durée du test 6 h minimum 5 h
Coût Très élevé Peu élevé
Contrôles
-Contrôle interne -Contrôle négatif -Contrôle positif
Absence de contrôle
Région cible Intégrase du gène pol LTR
Thermocycleur Abbott m2000rt Biorad CFX96
Applied 7500 etc.
Détection sous-types VIH-1, groupe M (A à H), groupe N et groupe O et CRF
VIH-1, groupe M (A à H), groupe N et groupe O
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2. OBJECTIFS DE L’ETUDE
2.1. Objectif principal
L’objectif principal est d’évaluer la performance des tests qualitatifs Abbott et Biocentric
dans le diagnostic de l’infection au VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois nés de mères
séropositives.
2.2. Objectifs spécifiques
Les objectifs spécifiques liés à l’objectif principal sont :
o Evaluer le protocole de la PTME au centre médical Saint Camille
o Effectuer le test de PCR avec chacun des tests Abbott et Biocentric ;
o Comparer les résultats obtenus par les deux tests ;
o Voir la possibilité d’utiliser le test Generic HIV DNA Cell pour le diagnostic précoce du
VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois au Centre Médical Saint Camille.
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3. MATERIEL ET METHODES
3.1. Cadre et période d’étude
Notre étude s’est déroulée à Ouagadougou, Burkina Faso :
Au laboratoire du Centre Médical Saint Camille ;
Au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI / Laboratoire de Biologie
Moléculaire et de Génétique (CERBA/LABIOGENE)
L’étude s’est déroulée pendant une période d’une (01) année allant d’Août 2012 à Août 2013.
3.2. Matériel d’étude
3.2.1. Population d’étude et collecte des échantillons
Notre étude a concerné au total 200 enfants âgés de moins de 18 mois parmi lesquels 160
enfants sont nés de mères suivant le protocole de la PTME et 40 enfants orphelins nés de
mères mortes ou inconnues. Des spots ont été réalisés sur des papiers buvards (DBS) avec 50
µl de sang total ou directement par piqûres des doigts et ensuite conservés à température
ambiante.
3.2.2. Recrutement des patients
Critère d’inclusion
o Les enfants de moins de 18 mois nés de mère séropositive
o Les enfants nés de mère suivant ou pas le protocole de la PTME au CMSC
Critère de non inclusion
o Les enfants dont les mères ne sont pas suivies au CMSC
o Les enfants âgés de plus de 18 mois
3.3. Aspect éthique et confidentialité
• Le comité d’éthique du CMSC a approuvé cette étude et les mères ont librement
consenti de participer à l’étude et toutes les informations recueillies auprès de ces
mères ont été rendues confidentielles.
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3.4. Analyse des données
Les données cliniques ont été saisies sur Excel 2007 et ensuite analysées avec le logiciel standard
Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 17,0 pour Windows et par le logiciel EpiInfo
version 6.0.
3.5. Matériel utilisé
Photo 1: ABBOTT m2000rt Photo 2: 7500 Fast Real Time PCR Systems
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 37
3.6. Méthodes
3.6.1. PCR qualitative avec Abbott Real Time HIV-1 Qualitative
3.6.1.1. Extraction de l’ADN viral
L’ADN viral a été extrait à partir des spots (DBS) en utilisant le kit d’extraction manuelle
« Abbott TM mSample Preparation System DNA » (Promega Corporation Madison ; WI USA
53711) selon le protocole suivant :
1. Préparation des réactifs d’extraction
Ajouter 35 ml d’éthanol dans le flacon mLysis DNA
Ajouter 23 ml d’éthanol dans le flacon mWash1 DNA
Ajouter 70 ml d’éthanol dans le flacon mWash2 DNA
Vortexer le contrôle interne 3 à 5 secondes et ajouter 750 µl dans le flacon de mLysisDNA
Inverser doucement tous les réactifs sauf les microparticules
Agiter vigoureusement le flacon de mMicroparticulesDNA
2. A l’aide d’un ciseau bien nettoyé, découper 2 spots valides dans le papier buvard
Whatman 903 et les transférer dans le tube correspondant ;
3. Ajouter 1,7ml de tampon mLysis Buffer DNA dans chaque tube ; s’assurer que les
spots sont entièrement immergés dans le tampon mLysisDNA
4. Incuber à température ambiante pendant 20 mn tout en remuant délicatement à
intervalles réguliers à l’aide d’une pipette Pasteur stérile ;
5. Ajouter 40 µl de mMircoparticulesDNA dans chaque tube de 5ml puis ajouter ensuite
2,4 ml de mLysis DNA ;
6. Ajouter 1ml de chaque contrôle et de chaque échantillon dans chaque tube de 5 ml et
placer les tubes dans le bloc de 50°C pendant 20 mn ;
7. Au bout des 20 mn, retirer les tubes du bloc et homogénéiser le mélange et replacer les
tubes dans le bloc à 50°C pendant 10 mn ;
8. Au bout des 10 mn, placer les tubes dans un support de capture magnétique (rouge)
pendant 2 mn ; Retirer soigneusement et complètement le lysat avec une pipette
Pasteur stérile ; Transférer ensuite les tubes dans un support non magnétique ;
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 38
mWash1DNA
9. Ajouter 700 µl de mWash1 DNA dans chaque tube et resuspendre les particules
magnétiques délicatement puis placer les tubes au bloc chauffant à 50°C pendant 5
mn ;
10. Retirer les tubes du bloc et homogénéiser le mélange et placer les tubes dans un
portoir magnétique (rouge) pendant 1 mn pour permettre la capture des particules;
11. Retirer soigneusement et complètement le mWash1 DNA avec une pipette Pasteur
stérile et transférer ensuite les tubes dans un support non magnétique.
mWash2DNA- Premier lavage
12. Ajouter 800 µl de mWash2 DNA dans chaque tube et resuspendre les particules
magnétiques délicatement et transférer le mélange dans un tube de 1,5ml à bouchon et
à vis étiqueté ;
13. Placer les tubes dans un portoir magnétique (bleu) pendant 1 minute afin de permettre
aux particules d’être capturées ;
14. Retirer soigneusement et complètement le mWash2 DNA avec une pipette Pasteur
stérile et transférer ensuite les tubes dans un support non magnétique ;
mWash2DNA-Deuxième lavage
15. Ajouter 800 µl de mWash2 DNA dans chaque tube et resuspendre les particules
magnétiques délicatement ; puis placer les tubes dans un portoir magnétique (bleu)
pendant 1 minute afin de permettre aux particules d’être capturées ;
16. Retirer soigneusement et complètement le mWash2 DNA avec une pipette Pasteur
stérile ; transférer les tubes dans le bloc chauffant à 75°C pendant 10 mn pour
permettre l’évaporation de l’éthanol.
mElutionDNA
17. Ajouter 88 µl de mElution DNA dans chaque tube et resuspendre les particules
magnétiques délicatement et placer les tubes dans le bloc chauffant à 75°C pendant 5
mn ;
18. Retirer les tubes du bloc et homogénéiser le mélange puis replacer les tubes dans le
bloc chauffant à 75°C pendant 5 mn ; placer ensuite les tubes dans un portoir
magnétique (bleu) pendant 1 minute afin de permettre aux particules d’être capturées ;
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 39
19. Retirer soigneusement et complètement l’échantillon élué de chaque tube; Transvaser
les échantillons élués dans de nouveaux tubes de 1,5ml ou dans une plaque en
polypropylène de 96 puits.
3.6.1.2.Amplification de l’ADN viral extrait
Préparation du master mix d’amplification
Le master mix est composé de différents réactifs qui jouent des rôles bien précis lors de
l’amplification :
1. Ajouter 271 µl de réactif HIV-1 activation reagent (réactif 1) et 979 µl de réactif HIV-1
oligonucléotide reagent (réactif 2) dans le flacon thermostable rTth DNA polymérase
enzyme (réactif 3) puis transférer le mélange dans un tube de master mix.
2. Distribuer des aliquotes de 50 µl du master mix d’amplification dans chaque puits de la
plaque Abbott de réaction optique à 96 puits.
Préparation de l’amplification
1. Transférer 50 µl de chaque éluât d’échantillon sur la plaque Abbott de réaction
optique à 96 puits placés sur le StrataCooler 96. Vérifiez visuellement qu'un total de 100µl (et
pas plus !) a bien été distribué dans chaque puits ;
2. Sceller la plaque et la centrifuger à 5000 g pendant 5 mn.
3. Placer la plaque de réaction optique à 96 puits sur l’appareil Abbott m2000rt et
appuyer sur « set up run» pour lancer le processus d’amplification.
Les conditions de la PCR sont : (programme installé sur l’appareil Abbott m2000rt)
o 59°C pendant 30 mn
o 95°C pendant 40 secondes o 46°C pendant 30 secondes
4 cycles
1 cycle
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 40
o 92°C pendant 30 secondes o 60°C pendant 30 secondes
o 92°C pendant 30 secondes
o 56°C pendant 1minute 30 secondes
o 35°C pendant 1 minute
3.6.2. PCR qualitative avec Generic HIV DNA Cell
3.6.2.1. Extraction de l’ADN viral
L’ADN du VIH-1 a été extrait à partir du protocole d’extraction du kit Qiagen "QIAmp DNA
Mini kit" selon le protocole suivant :
1. Couper 3 mm (1/8 inch) de diamètre perforé sur le DBS avec un cercle et placer 3
dans un tube de 1,5 ml puis ajouter 180 µl de Buffer ATL
2. Incuber à 85°C pendant 10 mn. Centrifuger brièvement pour récupérer les gouttelettes
à l'intérieur du couvercle.
3. Ajouter 20 µl de protéinase K, passer au vortex et incuber à 56°C pendant 1 h.
Centrifuger brièvement pour récupérer les gouttelettes à l'intérieur du couvercle.
4. Ajouter 200 µl de Buffer AL, passer au vortex vigoureusement et incuber à 70°C
pendant 10 mn. Centrifuger brièvement pour récupérer les gouttelettes à l'intérieur du
couvercle.
5. Ajouter 200 µl d’éthanol (100%), passer au vortex vigoureusement, Centrifuger
brièvement pour récupérer les gouttelettes à l'intérieur du couvercle.
6. Transférer attentivement tout le mélange dans une colonne QIAmp sans toucher le
bord. Centrifuger à 6000 x g (8000 rpm) pendant 1 mn. Jeter le tube contenant le filtrat
et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur
7. Ouvrer attentivement la colonne QIAmp et ajouter 500 µl de Buffer AW1 sans
toucher le bord. Centrifuger à 6000 x g (8 000rpm) pendant 1 mn. Jeter le tube
contenant le filtrat et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur.
8. Ouvrer attentivement la colonne QIAmp et ajouter 500 µl de Buffer AW2 sans
toucher le bord. Centrifuger à 20 000 x g (14 000rpm) pendant 3 mn.
37 cycles
6 cycles
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 41
9. Recommandation : Jeter le tube contenant le filtrat et placer la colonne dans un
nouveau tube collecteur et centrifuger à grande vitesse pendant 1 mn pour éliminer le
reste de Buffer AW2.
10. Placer la colonne QIAmp dans un nouveau tube de 1,5 ml et jeter le tube collecteur
contenant le filtrat. Ouvrer attentivement la colonne QIAmp et ajouter 150 µl de
Buffer AE sans toucher le bord. Incuber à température ambiante (15-25°C) pendant 1
mn, et centrifuger à 6000 x g (8000 rpm) pendant 1 mn.
11. L’éluât contient de l’ADN viral et peut être utilisé immédiatement pour l’amplification
ou être conservé à -20°C.
3.6.2.2. Amplification de l’ADN extrait
Préparation des standards
Préparer les différents points de gamme en procédant à des dilutions en cascade de 10 en 10
dans la solution d’ADN génomique humain jusqu’à l’obtention des 4 points de gamme ci-
après :
10 µl Standard + 90 µl Solution d’ADN génomique humain
10 µl Standard + 90 µl Solution d’ADN génomique humain
10 µl Standard + 90 µl Solution d’ADN génomique humain
10 µl Standard + 90 µl Solution d’ADN génomique humain
90 µl Standard (3x105 copies/ml)
90 µl Standard (3x102 copies/ml)
90 µl Standard (3x103 copies/ml)
90 µl Standard (3x104 copies/ml)
Vortexer 20 secondes
Vortexer 20 secondes
Vortexer 20 secondes
Vortexer 20 secondes
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Préparation du mélange réactionnel
Calculer le nombre d’échantillons à tester, sans oublier les quatre standards VIH,
Dans un microtube stérile de 1,5 ml, préparer le mélange réactionnel suivant pour un
échantillon. Pour un nombre "n" d’échantillons, multiplier par "n+1" tous les volumes
indiqués :
o Amorce A : 1 µl x (n+1) échantillons
o Amorce B : 1 µl x (n+1) échantillons
o Sonde C : 1 µl x (n+1) échantillons
o Mélange réactionnel 2X : 25 µl x (n+1) échantillons
o H2O : 2 µl x (n+1) échantillons
Volume total : 30 µl x (n+1) échantillons
Homogénéiser la solution obtenue au vortex. Récupérer les éventuelles gouttelettes
présentes sur les bords du tube en centrifugeant pendant 1 min
Répartir dans une plaque Taqman 30 µl de mélange réactionnel obtenu.
Passer au vortex chaque standard ou échantillon pendant au moins 30 secondes puis
déposer 20 µl d’échantillon ou de standard dans chaque puits.
Volume réactionnel final : 50 µl
Programme d’amplification
L’amplification a été faite avec l’appareil 7500 Fast Real Time PCR System selon le
programme suivant :
95°C.......................................10 minutes (Activation de l’enzyme)
95°C.......................................15 secondes (Dénaturation)
60°C....................................... 1 minute (Hybridation)
Remarque : l’élongation des amorces a lieu durant le passage de 60°C à 95°C.
x 50 cycles
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 43
4. RESULTATS
4.1. Protocole de Prévention de la Transmission mère-enfant du VIH au CMSC
Le protocole PTME appliqué à Saint Camille est le protocole national en vigueur au BF
(option A) qui prévoit aussi la trithérapie pour les gestantes en besoin de traitement
(CD4 350 cellules/mm3 et/ou stade clinique III ou IV). Les femmes VIH (+) sous prophylaxie
sont celles qui ont un taux de CD4 350 cellules/mm3. Elles prennent de l’AZT à partir de
la 14ème semaine de grossesse puis une dose unique de NVP et une première dose
d’AZT/3TC au moment de l’accouchement. Après l’accouchement, elles sont mises sous
AZT/3TC tous les jours pendant une semaine.
La prophylaxie chez les enfants est indiquée dans le tableau ci-dessous (tableau 3).
Tableau III: Prophylaxie chez les enfants
Allaitement au sein
(sevrage à 12 mois)
Allaitement artificiel
Mère en prophylaxie
(option A)
Dose de NVP/ jour jusqu’à
une semaine après sevrage
Dose de NVP/jour
pendant 4-6 semaines
Mère sous traitement sans
indications * (option B)
Dose de NVP/jour
pendant 4-6 semaines
Mère sous traitement avec
indications **
* Mères ayant un taux de CD4 350 cellules/mm3 ou au stade clinique OMS 1 ou 2
** Mères ayant un taux de CD4<350 cellules/mm3 ou Stade clinique OMS 3/4
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 44
4.2. Taux de transmission mère-enfant du VIH-1 au CMSC
Parmi les 200 enfants concernés par notre étude, nous avons 40 enfants dont les mères VIH(+)
n’ont pas suivies le protocole de la PTME, et 160 enfants dont les mères VIH (+) ont suivies
le protocole de la PTME et parmi lesquelles 101 mères étaient sous HAART et 59 mères
étaient sous prophylaxie. Cette étude a montré que le taux de transmission verticale était de
0,00 % (0/160) chez les enfants dont les mères étaient sous HAART ou sous prophylaxie. Par
contre, chez les mères qui ne sont pas suivies dans le cadre de la PTME, nous notons une
transmission verticale de 15,0 % (6/40) (Tableau 4). Les PCR des enfants ont été effectuées
avec le test Abbott Real Time VIH-1 Qualitative.
Tableau 4 : Répartition des mères suivant ou non le protocole de la PTME et résultats des
PCR des enfants
Traitement
Mères VIH (+)
Enfants
PCR (-) PCR (+)
HAART 101 101 (100 %) 0 (0,00 %)
Prophylaxie 59 59 (100 %) 0 (0,00 %)
Sans traitement 40 34 (85,00 %) 6 (15,00 %)
Total 200 200 (17,00 %) 6 (3,00 %)
4.3. Performance en terme de détection de l’infection au VIH-1 chez les enfants de
moins de 18 mois au CMSC
La performance des tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA Cell a été
évaluée par l’analyse d’échantillons, prélevés au CMSC à Ouagadougou chez des enfants âgés
de moins de 18 mois, nés de mère VIH (+). Des échantillons de DBS de 40 sujets ont été
analysés avec chacun des 2 tests. La concordance entre les résultats des tests Abbott Real
Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA Cell était de 100% (Kappa = 1 avec Z= 6, 32 et
erreur type kappa = 0,16, p < 0,001) (Tableau 5).
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 45
Tous les 34 (85,0 %) enfants détectés Négatifs ainsi que les 6 (15,0 %) enfants détectés
Positifs par le test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative ont également été détectés tous
Négatifs et Positifs par le test Generic HIV DNA Cell.
Tableau 5: Concordance des tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA
Cell
Abbott Real Time HIV-1 Qualitative
Total Négatif Positif
Generic HIV DNA Cell
Négatif
34 (85,0%)
0 (0,0%)
34 (85,0%)
Positif
0 (0,0%)
6 (15,0%)
6 (15,0%)
Total
34 (85,0%)
6 (15,0%)
40 100,0%
Concordance : 100 % Coefficient kappa = 1, Z= 6,32 ; erreur type kappa = 0,16 (p < 0,001)
4.4. Coût des tests
Le coût du test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative (Système fermé) a été évalué en tenant
compte du coût des réactifs, de la main d’œuvre tandis que celui de test Generic HIV DNA
Cell (système ouvert) a été évalué en tenant compte du coût du réactif d’amplification, du kit
Qiagen pour l’extraction de l’ADN, des plaques à 96 puits (7500 Fast Real Time PCR
Systems), et de la main d’œuvre. Le prix non subventionné pour chaque patient est de 18 500
FCFA pour Generic HIV DNA Cell et de 50 000 FCFA pour Abbott Real Time HIV-1
Qualitative.
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 46
5. DISCUSSION
Les résultats de la transmission verticale trouvés dans notre étude chez les mères sous
prophylaxie ou HAART (0,00 %) et celles qui ne sont pas sous traitement (15,0 %) (6/40)
témoignent l’efficacité de la Névirapine (NVP) et de la Trithérapie dans la prévention de la
transmission mère-enfant du VIH confirmée par certains auteurs tels Pignatteli et ses
collaborateurs en 2006 et ensuite par Simporé et ses collaborateurs en 2007. Le taux de
transmission de 0,0% (0/160) trouvé dans notre étude chez les mères suivant le protocole de la
PTME est très faible à celui trouvé par Linguissi et al. (2012) qui trouvaient un taux de
transmission verticale de 4,8% par la technique de PCR en temps réel. Dans cette étude, on
notait une prévalence de 0,0% chez les enfants nés de mères sous HAART et de 6,8% chez les
enfants dont les mères étaient sous prophylaxie (p< 0,01).Une étude menée par Kouanda et
al.(2010) trouvait un taux de transmission verticale de 0,0% (0/195) et de 4,6% (12/259)
respectivement chez les mères sous HAART et celles sous prophylaxie. Tous les enfants
infectés (15,0%) dans notre étude étaient tous nourris au lait maternel.
Les résultats trouvés dans notre étude nous permettent de dire qu’un traitement (prophylaxie
ou HAART) bien suivi par une femme enceinte ou bien une mère écarte la possibilité d’une
infection au VIH par un enfant. Aussi, il est d’une grande importance que toute femme
enceinte dépistée positive au VIH suive le protocole de la PTME afin de réduire le risque de
transmission du VIH à son enfant. La prophylaxie avec un ou plusieurs ARV réduit le risque
de transmission pendant l’accouchement (Leroy et al., 2005) mais le risque de transmission
postnatale reste élevé dans les milieux où l’allaitement maternel est pratiqué (Coutsoudis et
al., 2004). Selon l’OMS, les femmes enceintes ayant un taux de CD4 350 cellules/mm3sont
éligibles pour la trithérapie. Une fois initiée, le traitement antirétroviral hautement actif
(HAART) réduit rapidement et constamment la charge virale maternelle dans le plasma et
dans le lait, réduisant probablement le risque de la transmission mère-enfant du VIH à travers
l’allaitement maternel (Shapiro et al., 2005).
L’efficacité du protocole de la PTME réalisé dans notre étude vient démontrer l’avantage de
débuter le traitement chez une femme VIH(+) au début de sa grossesse. Mais l’inconvénient
majeur est le développement d’une résistance chez certaines mères et de leurs enfants à la
Névirapine après 6 mois car la névirapine induit des mutations entraînant la résistance des
antirétroviraux sur les gènes pol (Hazen et al., 2005).
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 47
Plusieurs auteurs ont également confirmé que la névirapine peut provoquer la substitution de
la Valine en position 106 (V106I) sur la transcriptase inverse (Bacheler et al., 2001 ; Ferris et
al., 2005). 1/10ème à 2/3 des femmes qui prennent une simple dose de NVP développeront une
résistance virale aux inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTIs)
(Arrive et al., 2007). C’est pour donc éviter la résistance du VIH à la Névirapine, que l’OMS
préconise désormais la combinaison AZT/3TC à la place de la NVP. Ce problème peut être
considérablement réduit en combinant la NVP avec 3TC (± ZDV) pendant sept (7) jours après
accouchement (Chaix et al., 2006). Une simple dose intrapartum de Ténofovir (TDF) et
d’Emtricitabine (FTC) peut aussi réduire cette résistance aux INNTIs de moitié
(Chi et al., 2007).
Selon les nouvelles recommandations de 2013, l’OMS préconise le TARV pour toute femme
enceinte et allaitante infectée par le VIH quel qu’en soit le stade clinique ou le nombre de
CD4. Le traitement doit être initié et maintenu après accouchement et cessation de
l’allaitement (Option B+). Pour les femmes enceintes et allaitantes qui ne sont pas éligibles au
traitement (CD4 500 cellules/mm3), le traitement doit être initié et arrêté après accouchement
et cessation de l’allaitement. Pour les femmes développant un échec thérapeutique pendant
leur grossesse ou pendant la période d’allaitement, le traitement de seconde ligne doit être
imposé. Dans le cas des femmes allaitantes, le TARV doit être arrêté une semaine après la
cessation de l’allaitement ; et en cas d’allaitement artificiel, le TARV doit être arrêté après
l’accouchement (Option B) (OMS, 2013). Ces nouvelles recommandations de l’OMS rentrent
dans l’objectif global de l’ONUSIDA qui est de réduire de 5% le risque de TME/VIH dans le
monde d’ici 2015.
Notre étude a également permis d’évaluer la performance des tests Abbott Real Time HIV-1
Qualitative et Generic HIV DNA Cell dans le diagnostic précoce du VIH-1 chez les enfants
âgés de moins de 18 mois nés de mères séropositives. Ainsi, la concordance trouvée entre les
deux tests est de 100 % (Kappa = 1 avec Z= 6, 32 et erreur type kappa = 0, 16, p < 0,01). Une
étude menée par Huang et ses collaborateurs en 2011, montrait une concordance de 95,5%
(Kappa = 0,86 avec Z= 14 et erreur type kappa = 0,06) entre Abbott Real Time HIV-1
Qualitative et Roche Amplicor HIV-1 DNA version 1,5.
Les résultats trouvés dans notre étude montrent que le test Generic HIV DNA Cell de
Biocentric étant plus sensible (1 Copie d’ADN VIH/ PCR pour les DBS ) et moins coûteux
que le test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative (50 copies d’ADN VIH/PCR pour les DBS)
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 48
peut également être utilisé en routine pour faire le diagnostic précoce du VIH-1 chez les
enfants de moins de 18 mois nés de mère séropositive au CMSC à Ouagadougou au Burkina
Faso. En effet, le test Generic HIV DNA Cell présente plusieurs avantages par rapport au test
Abbott Real Time HIV-1 Qualitative. Il est moins coûteux (18 500 FCFA/test), simple et plus
rapide ( 2 heures d’amplification) que le test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative qui, lui
coûte plus chère (50 000 F CFA), est un peu plus compliqué et a un temps d’amplification
plus long (3 heures).
Aussi, nous notons qu’avec le test Abbott, il faut nécessairement 24 échantillons pour lancer
une PCR alors qu’avec le test Generic VIH DNA Cell, le mix d’amplification est préparé en
fonction du nombre d’échantillon disponible. Ce qui montre que pour des cas d’urgence, il
serait plus facile donc d’utiliser le test Generic HIV DNA Cell que celui d’Abbott. Le test
Generic HIV DNA Cell de Biocentric tout comme Abbott, utilise la méthode Taqman et peut
être également utilisé pour quantifier la charge virale plasmatique du VIH-1 mais avec comme
thermocycleur Biorad CFX96, Applied 7500/ 7500 Fast Real Time PCR Systems etc.
Le test Abbott nécessite un personnel beaucoup plus qualifié au regard de la complexité du
protocole d’extraction et le risque élevé d’échec de certains tests au sortie des résultats. En cas
d’échec, l’échantillon doit être à nouveau extrait car le volume d’ADN restant ne suffit plus
pour retester l’échantillon, ce qui constitue une perte de réactifs donc d’argent. Par contre,
avec le test Generic HIV DNA Cell de Biocentric, la manipulation est beaucoup plus simple et
le kit Qiagen utilisé pour l’extraction de l’ADN du VIH-1 permet d’avoir au moins 100 µl
d’ADN. Ce qui permet alors de retester l’échantillon en cas d’échec (Volume d’échantillon
pour le mélange réactionnel = 20µl).
De par sa forte sensibilité, sa simplicité et son faible coût, le test Generic HIV DNA Cell peut
être utilisé à la place du test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative pour le diagnostic précoce
des enfants de moins de 18 mois nés de mère séropositive lors d’études épidémiologiques
dans les pays à ressources limitées. Cela permettra d’éviter les ruptures de stock et de faciliter
le fonctionnement permanent des laboratoires d’analyses en routine dans les centres médicaux
en charge de la prévention de la transmission mère-enfant du VIH.
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 49
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
L’évaluation de la performance des tests qualitatifs Abbott et Biocentric faite dans notre étude
montre que ces deux tests peuvent être utilisés dans le diagnostic précoce de l’infection au
VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois nés de mères séropositives. Le test Generic HIV
DNA Cell présente des avantages du point de vue sensibilité, simplicité, coût, rapidité par
rapport au test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative. De ce fait, il est donc possible de
l’utiliser à la place du test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative dans le cadre de la prévention
de la transmission verticale du VIH au centre médical Saint Camille à Ouagadougou. Etant
donné que le test Generic HIV DNA Cell permet également de quantifier la charge virale
plasmatique du VIH-1, il serait aussi intéressant de comparer sa performance avec le test
quantitatif d’Abbott.
La transmission verticale nulle trouvée chez les enfants dont les mères sont sous traitement,
montre que le protocole de la Prévention de la transmission mère-enfant réduit très
significativement le risque de transmission du VIH d’une mère VIH (+) à l’enfant. Malgré ce
résultat, il est important de rester tout de même vigilant car une inattention peut augmenter ce
taux.
Mémoire/Master II/BioGeMA/2011- 2012/ - R. S .Théophile SOUBEIGA 50
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