ETUDES DE CANCEROGENESE · ETUDES DE CANCEROGENESE Master 2 - Mention Toxicologie Paris Descartes...

ETUDES DE

CANCEROGENESE

Master 2 - Mention Toxicologie

Paris Descartes – Paris Diderot – Paris Sud

2 Octobre 2013

Dr. Fabrice NESSLANY - Institut Pasteur de Lille

1- Introduction

Ensemble de phénomènes pathologiques conduisant à la transformation d’une cellule normale en cellule cancéreuse

1- INTRODUCTION

Propriétés des cellules cancéreuses :(acquis par modifications génétiques)

- prolifération cellulaire non contrôlée- survie- invasion- migration- développement métastatique

1- Cancérogenèse

�DEFINITIONS

Agent physique (RX, RI…), chimique (médicaments,

pesticides…) ou biologique (cellules, virus…) capable:

- d’induire des tumeurs

- d’en augmenter la malignité

- d’en augmenter la fréquence

- d’en raccourcir le délai d’apparition

1- INTRODUCTION

2- Agent Cancérogène

�DEFINITIONS

• Bénin suffixe « ome »ex: adénome, lipome…..

• MalinOrigine épithéliale: « carcinomes »

ex: carcinome de l’estomac, hépatocarcinome...

Origine mésenchymateuse: « sarcome »ex: fibrosarcome, ostéosarcome, liposarcome

3- Nomenclature

1- INTRODUCTION

�DEFINITIONS

1- INTRODUCTION

• 3 étapes dans la genèse d’un cancer

�MECANISME

- Initiation

- Promotion

- Progression

•Seules les 2 premières étapes sont connues grâce aux modèles expérimentaux

1- INTRODUCTION

- Initiation : atteinte atteinte ggéénotoxiquenotoxique correspondant à une lésion de l’ADN par un cancérogène dit « initiateurinitiateur »�� phph éénomnom èène irrne irr ééversibleversible

- Promotion : processus éépigpigéénnéétiquetique (atteinte non-génotoxique) par un cancérogène dit « promoteurpromoteur »correspondant à la stimulation des cellules initiées�� phph éénomnom èène rne r ééversibleversible

- Progression : phase clinique phase clinique = acquisition des propriétés de multiplication non contrôlée, de perte de la différenciation, de l’invasion locale et métastatique

�MECANISME

Expériences de cancérogenèse cutanée chez le lapin par Berenblum �� modèle d’initiation-promotion

Goudron de houilleFréquence

des tumeurs

0

Huile de croton

v v 0

v v +++

v v 0

v v +++

Conclusions : - Cancérogenèse se réalise en au moins 2 étapes

v

v v +++v v v v

- Initiation ( ) puis promotion ( )- L’étape d’initiation est irréversible

•• MutagMutag èènesnes- cancérogènes génotoxiques = initiateurs- détectables par les études de mutagenèse- atteinte du patrimoine génétique

⇒⇒⇒⇒ avec ou sans seuil (selon le mécanisme)

•• Non MutagNon Mutag èènes nes - cancérogènes épigénétiques = promoteurs- non détectables par les études de mutagenèse- pas d’atteinte du patrimoine génétique- altération de la croissance cellulaire, de l’expression des gènes…

⇒⇒⇒⇒ avec seuil

1- INTRODUCTION

CLASSIFICATION DES AGENTS CANCÉROGÈNES

Seuil et Risque

seuil

Absence de risque

RisqueEffet = f°(dose)

Risqueeffet = f°(dose)

�� Étude du potentiel ET du mécanisme

1- INTRODUCTION

2- Méthodes d’études

�� EtudesEtudes éépidpid éémiologiquesmiologiques

�� EtudesEtudes expexp éérimentalesrimentales

•• EtudesEtudes éépidpid éémiologiquesmiologiques�� BUT: déterminer le lien de causalité entre

l’exposition à un facteur (facteur à risque) et l’effet sur la santé (développement d’un cancer) chez la population

•• EtudesEtudes expexp éérimentalesrimentales�� BUT: identifier le potentiel cancérogène d’une substance (cancéro et mutagenèse):

- in vivo : sur l’animal ou - in vitro : sur bactéries et cellulespour en estimer le risque chez l’ Homme

2- METHODES D’ETUDES

2-1- ETUDES

EPIDEMIOLOGIQUES

�� EtudesEtudes prospectivesprospectives

�� EtudesEtudes rréétrospectivestrospectives

�Mesure de l’exposition AVANT la survenue de l’évènement�Exposition antérieure à l’étudeEx: mesure de la consommation journalière de tabac et observation de la survenue de cancer au cours du suivi des sujets

2-1- ETUDES EPIDEMIOLOGIQUES

�� EtudesEtudes prospectivesprospectives

�� EtudesEtudes rréétrospectivestrospectives• Mesure de l’exposition APRES la survenue de l’évènement

• Exposition postérieure à l’étudeEx: demande de la consommation de tabac des 10 dernières années à des sujets ayant déjà un cancer

EtudesEtudes cascas --ttéémoinmoin�Populations: - cas (individus malades)

- témoins (individus sains)�Mêmes caractéristiques générales:

âge, sexe, région, niveau social et professionnel…

�Questionnaire- mode de vie (tabac, alcool, alimentation…)- travaux, loisirs, activité physique- lieu de résidence…

�Comparaison �� recherche des différences• Avantages: rapide, peu de sujets• Limites: non conclusif (indicatif), à posteriori


2-1-1- ÉTUDES RÉTROSPECTIVES

EtudesEtudes de cohortesde cohortes

�Populations: - individus exposés- individus non exposés (témoins)

• Comparaison de l’incidence d’un type de cancer

• Avantages: - conclusive- complète les études cas-témoins

• Limites: - long - nombreux sujets - a posteriori


2-1-2- ÉTUDES PROSPECTIVES

2-2- ETUDES

EXPERIMENTALES

�� EtudesEtudes àà long terme chez le rongeurlong terme chez le rongeur

�� EtudesEtudes àà court terme chez le rongeurcourt terme chez le rongeur

�� EtudesEtudes de de ggéénotoxicitnotoxicit éé et de mutagenet de mutagen èèsese

• Études à long terme chez le rongeur

• Études à court terme chez le rongeur

• Études du potentiel mutagène

• Études mécanistiques


BUTBUT: identifier le potentiel cancérogène d’une substance chez l’ animal pour en estimer le risque chez l’ Homme

��


�� CancCanc éérogenrogen èèsese

S1A Need for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals

S1B Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals

S1C (R2) Dose Selection for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals

�LIGNES DIRECTRICES ICH

• Le cancer n’atteint pas tous les sujets exposés�� étude sur une population importante

• Le délai entre exposition et apparition du cancer peut être long

�� étude sur toute la durée de la vie

• Les effets sont doses dépendants�� étude à doses fortes

• Les effets peuvent atteindre n’importe quel organe

�� étude de tous les organes


�PRINCIPES GENERAUX

�� MMéédicamentsdicaments• Si utilisation clinique ≥ 6 mois

(en continu ou cumulé sur tt la vie)

• Systèmes produisant des expositions prolongées

• Si suspicion

• Génotoxicité- génotoxique douteux- génotoxique non douteux� étude cancéro. non nécessaire

• Produits administrés par voie oculaire ou cutanée- cancéro. non nécessaire SAUF si expo. systémique et > 6 mois

• Maladie grave ou faible espérance de vie -étude de cancéro. non nécessaire


�DANS QUELS CAS ?

�� MMéédicamentsdicaments

Cas de suspicion: • Classe thérapeutique de produits cancérogènes

• Structure à risque

• Lésions pré-néoplasiques dans les études de toxicité à doses répétées

• Accumulation dans un tissu réservoir du produit ou de ses métabolites, à long terme, provoquant une réaction locale ou une réponse pathologique


�DANS QUELS CAS ?


�DANS QUELS CAS ?

�� MMéédicamentsdicaments

Les résultats des études de cancérogenèse

ne sont généralement pas requis

avant la conduite des essais cliniques

SAUF SAUF en cas de signes d'alerte

Mais études à soumettre AVANT dépôt d’AMM


�DANS QUELS CAS ?

�� Produits Chimiques Produits Chimiques > 1000 tonnes / an- si substance classée mutagène catégorie 3, ou - si hyperplasie et/ou lésions prénéoplastiques.

NB : Substances classées mutagènes catégorie 1 ou 2 , l'hypothèse par défaut est qu'un mécanisme génotoxique de carcinogénicité est probable �� Essai de carcinogénicité n'est normalement pas nécessaire

�� Pesticides et Additifs AlimentairesPesticides et Additifs Alimentaires

• Dans tous les cas

StratStrat éégie de basegie de base

• Une étude à long-terme chez le rongeurET

• Une étude à court-terme chez le rongeur :- modèle d’initiation-promotion- modèle transgéniques- modèle néo-natal

OU• Une 2nde étude chez une 2nde espèce rongeur

�LES ÉTUDES REQUISES


Exception au Exception au «« standard standard »» requis requis

Une 2nde étude peut être considérée inutile si:

- les lésions observées dans les études chroniques

- les résultats des études standard de génotoxicité

montrent que le produit présente clairement un risque cancérogène pour l’ Homme

�LES ÉTUDES REQUISES


En fonction de: En fonction de:

•Pharmacologie

•Toxicité par administration réitérée

•Métabolisme

•Toxicocinétique

•Voie d’administration

�CHOIX DE L’ESPECE


Pourquoi les rongeurs?Pourquoi les rongeurs?Avantages:•coût « limité »•disponibilité•entretien facile•facilité manipulations (prélèvements, microchirurgie…)

•petite taille � grand nombre d’animaux

•durée de vie courte � traitement toute la vie

•large utilisation (pharmaco-toxicologie)

•bonne connaissance du profil tumoral (tumeurs spontanées)



Avantages supplémentaires

• plus de génotoxiques détectés�� meilleure sensibilité

(étude OMS: cancérogènes connus chez l’Homme sont positifs chez le rat et la souris)

• banques de données historiques (internes, externes)


�� Etudes chez ratrat ET sourissouris



• Variabilité interspécifique +++- adénomes pulmonaires: souris A- tumeurs du foie: souris C3H- lymphome: souris AKR- tumeurs mammaires: souris femelles C3H- fibroadénomes mammaires: rats (souches multiples )

• Variabilité environnementalerégime alimentaire, éclairage, bruit, T°…

�CHOIX DE L’ESPECE�� Etudes chez ratrat et sourissourisTaux spontanés de tumeurs

�� Témoins historiques


�� au moins 3 dosesau moins 3 doses

• Dose faiblefaible multiple de l’exposition humaine (dose thérapeutique envisagée)

• Dose moyennemoyenne géométrique

• Dose forte- dose maximale tolérée (DMT)

- étude préliminaire de 90 jours (dose-ranging)

�CHOIX DES DOSES


• Dose forte- dose provoquant:

- un effet toxique minimal- perte pondérale ≤ 10%- effet toxique minimal sur un organe- pas ↓ de la durée de vie

- Limité à 1500 mg / kg / jour en gavage si:- produit non génotoxique- dose maximale thérapeutique < 500 mg / jour

- ≤≤≤≤ 5% dans nourriture

- saturation d’absorption

- médicaments �� ≥ 25 fois l’AUC humaine

�CHOIX DES DOSES

• Identique ou comparable à l’exposition humaine(orale, cutanée, inhalation, IV, SC…)


�� Voie dVoie d ’’expositionexposition

• Gavage vs Nourriture choix: stabilité, solubilité, palatabilité, viscosité, volume d’administration, usage humain…• Injection vs Perfusionchoix: produit injectable ou non, volume à administrer, problème de tolérance locale, usage humain…

�� FormeForme

�� FrFrééquencequence• 7 jours / 7• 365 jours / an

�ADMINISTRATION / TRAITEMENT

•Population cible

•Posologie clinique

•Propriétés génotoxiques

•Propriétés pharmacodynamiques chez l’animal et l’humain

•Résultats des études de toxicologie par administration réitérée

�PRE-REQUISES NECESSAIRES








�� DurDur éée des e des éétudestudes

Toute la vieToute la vie

• Rat- 2 ans dans tous les cas

• Souris- 2 ans pour les médicaments

- 18 mois pour les produits chimiques et pesticides

1. Études à long terme chez le rongeur


1.1. Etude préliminaire

• Espèce / Souche: - Rat (Sprague-Dawley) - Souris (CD1)

• Age: au sevrage

• Durée d’étude: 90 jours

• Fréquence: 7 jours / semaine

• Nombre de lots: 1 témoin, ≥ 3 traités (≥ 3 doses)

• Nombre d’animaux: 15 / sexe / lot



• Signes cliniques: - mortalité: quotidien- approfondi: 1 fois / semaine

• Poids corporel: au moins hebdomadaire

• Consommations: hebdomadaire

• Ophtalmo, biochimie, hémato…: - pré-étude- fin d’étude

•TK: - J1- ~ 1 mois

• Autopsie et histopathologie: tous les animaux (y compris morts et moribonds)

1.1. Etude préliminaire



• Espèce / Souche: - Rat (Sprague-Dawley) - Souris (CD1)

• Age: au sevrage

• Durée d’étude: - 24 mois pour le rat - 18-24 pour la souris

• Fréquence: 7 jours / semaine

• Nombre de lots: 1 ou 2 témoins, ≥ 3 traités (≥ 3 doses)

• Nombre d’animaux: ≥ 50 / sexe / lot

1.2. Etude définitive



�� Validation de lValidation de l ’’exposition systexposition syst éémique: mique: éétudes de TKtudes de TK

• Tous les lots:- traités- témoins

• Groupes satellites:- 2 ans: médicaments- 18 mois: produits chimiques et pesticides

• Temps:- J1, J30, J90 ou J180, J365



• Evolution pondérale:1 fois / semaine pendant 3 mois puis tous les mois

• Consommation (eau, nourriture):1 fois / semaine pendant 3 mois puis tous les mois

• Recherche de tumeurs:par palpation ou visibles à l’œil nu1 fois / semaine

• Dates et conditions de la mort:origine tumorale ou non ?


�� ExamensExamens



• Hématologie, biochimie:fin de traitement

• Examens anatomo-pathologiques:- autopsie: moribonds + sacrifiés en fin d’étude- examens macroscopiques- pesée des organes- examens histopathologiques (gros organes)

2.1.8. Etude définitive

2.1. Études long terme chez le rongeur


�� ExamensExamens

• Aorte• Cæcum• Cerveau *• (et moelle)• Cervelet• Cœur*• Épididyme*• Œsophage• Estomac (glandulaire et

pré-estomac§)• Fémur (et moelle

osseuse)• Foie*• Ganglions lymphatiques*• (mandibulaires,

mésentériques et thoraciques)

• Glandes lacrymales • Glandes mammaires• Glandes salivaires • Hypophyse*• Langue• Intestin (duodénum,

iléon, jéjunum)• Larynx• Moelle osseuse (frottis)• Muscle• Nasopharynx• Nerf sciatique• Œil (nerf optique)• Ovaires*• Pancréas• Peau

• Poumons* • Prostate*• Reins*• Rate* • Surrénales*• Testicules *• Thymus*• Thyroïde* (et para-

thyroïde)• Utérus*• Vagin• Vésicules

séminales*• vessie• Lésions apparentes,

tumeurs, grosseurs

* Organes pesés, § rat, souris


� Examens histopathologiques


�� ValiditValidit éé de lde l ’é’étudetude

• Perte < 10% des animaux d’un lot

• survie > 50% pour tous les lots

Remarque: animaux moribonds sacrifiés avant la fin de l’étude � autopsie




�� InterprInterpr éétationtation• Comparaison aux témoins de l’ étude et historiques

• Evaluation du potentiel tumorigène- délai d’apparition des tumeurs- fréquence des tumeurs

- traitement statistique- correction des mortalités (méthode Doll et Peto)

• Nécessité d’ études mécanistiques supplémentaires- compréhension du rôle des effets toxiques- extrapolation aux faibles doses- pertinence des résultats pour l’Homme à doses théra p.

1.2. Etude définitive1. Études à long terme chez le rongeur






• Modèle d’initiation - promotion

• Modèle transgénique (souris transgéniques)

• Modèle néo-natal (rongeurs nouveaux nés)


2. Études à court terme chez le rongeur

�� Les modLes mod èèles possiblesles possibles


ModMod èèle de le de ItoIto (Ito N et al., 2003)(Ito N et al., 2003)

2.1. Modèle d’ initiation – promotion2. Études à court terme chez le rongeur

• Mise en évidence des hhéépatopato --canccanc éérogrog èènesnes

• Chez le rat

• Traitement par un agent initiateur

• Hépactectomie � stimule la prolifération hépatocytaire

• Traitement par le produit à tester

• Recherche de foyers pré-néoplasiques

0 2 3 8SEMAINES

DEN = diéthyl nitrosamine(200 mg/kg en IP)

NaCl (en IP)

Produit à tester

Sans traitement

2/3 hépatectomie

S

S

S

S Sacrifice �� recherche foyers pré-néoplasiques

1

2

3

LOT


2.1. Modèle d’ initiation – promotion2. Études à court terme chez le rongeur

ModMod èèle de le de ItoIto sur le foie sur le foie �� hhéépatocancpatocancéérogrogèènesnes

• Modification du patrimoine génétique (addition, délétion, modification de gènes, de séquences d’ADN)

• Pour les rendre plus sensibles (� processus cancéreux détecté plus vite) ou pour mimer une pathologie

• Espèce usuelle : souris

• Mee des effets cancérogènes en 6 mois

• Problèmes : instabilité des souches, coût…


2.2. Études à court terme chez le rongeur2.2. Souris transgéniquesSouris rendues hypersensibles aux cancSouris rendues hypersensibles aux canc éérogrog èènesnes

• Oncogène activé et/ou surexprimé - Tg. AC gène v-Ha-Ras sous le contrôle de zéta globuline de souris

- Tg. ras H2 gène ras humain 5 à 6 copies

• Gène suppresseur de tumeurs inactivé - p53 +/-

• Gène de réparation de l’ADN inactivé- XPA -/-



• Nombre d’animaux : 20 à 25 / sexe /dose

• Nombre de lots : 1 témoin -, 1 témoin +, 3 traités

• Traitement : pendant 26 semaines (fréquence variable)

• Suivi des animaux :pesée, consommation de nourriture, examen clinique, palpation, pesée des organes, examens biochimique, hématologique, histopathologique…



Cancérogène

direct

Cancérogène

direct

réactif

electrophile

adduits à l'ADN

métabolisme

réplication réparation

de l'ADN

MUTATIONS ADN normal

Souris

XPA

Souris

P53 +/-

tumeur bégnine

tumeur maligne

promotion Souris

TG.AC

ras H2

Animaux hypersensibles aux cancAnimaux hypersensibles aux canc éérogrog èènesnes

• Traitements : 2 ou 3 pendant les 2 premières semaines de la vie

• 3 doses : forte, moyenne, faible

• Suivi des animaux :pesée, consommation de nourriture, examen clinique, palpation, pesée des organes, examens biochimique, hématologique, histopathologique, autopsie…


2.3. Rongeurs nouveaux nés

2.2. Études à court terme chez le rongeur




• Études du potentiel mutagène� cf. cours





• Études du potentiel mutagène� cf. cours



4. Études mécanistiques

�� ObjectifObjectif : : DDéémonstration du mmonstration du m éécanisme dcanisme d ’’actionaction

•Utiles à l’interprétation des résultats

•A réaliser pour les produits ayant des propriétés particulières ou suite à des résultats inattendus dans les études de cancérogénèse

•Evaluer la relation dose-effet


�� ObjectifObjectif : : DDéémonstration du mmonstration du m éécanisme dcanisme d ’’actionaction

• Mécanismes / cancérogènes génotoxiques ⇒⇒⇒⇒ mutagenèse

• Mécanismes / cancérogènes épigénétiques ⇒⇒⇒⇒ études complémentaires



Modifications cellulaires spécifiques- morphologiques, histochimiques, fonctionnelles(apoptose, prolifération, foyers d’altérations hépatiques …)

Paramètres biochimiques- hormones (T3/T4, TSH, prolactin…)- facteurs de croissance- liaison avec des protéines- activité enzymatique spécifique

Tests de génotoxicité supplémentaires- Si produit cancérogène mais non génotoxique dans labatterie standard (cancérogène épigénétique )(activation métabolique, lésions et réparation de l’ADN…)

Groupes d’animaux satellites - avec interruption du trt et réversibilité des effets


3- Classification

des cancérogènes

Catégorie 1 Démontré chez l’Homme

Catégorie 2A Probable pour l’Homme

Catégorie 2B Possible pour l’Homme

Catégorie 3 Non classable

Catégorie 4 Probablement non

cancérogène

Classification du Centre International de Recherche sur le Cancer

(CIRC/IARC)

3- CLASSIFICATION DES CANCEROGENES

Catégorie 1 (105 composés) ex: aflatoxines naturelles, arsenic,amiante, benzène, cadmium, chrome[VI],CPA, DES, certains papillomavirus humains, boissons alcoolisées, fumée de cigarette

Catégorie 2A (66) ex: benzo[a]pyrene, UVAB etC (solarium), PCBs

Catégorie 2B (248) ex: acétaldehyde, chloroform, DDT, plomb, styrène

Catégorie 3 (515) ex: ampicilline, anthracène, bromoforme, eau potable chlorée, chrome, paracétamol, polystyrè ne

Catégorie 4 (1 seul composé) : Caprolactam (monomère utilisé en grande quantité dans l’industrie du nylon)

3- CLASSIFICATION DES CANCEROGENES

4- Etiquetage Européen

Les CancLes Canc éérogrog èènesnes

4- ETIQUETAGE EUROPEEN

UE , avant le 20/01/2009 SGH


Catégories de danger 1A, 1B

SGHSGH AncienAncien

Classe de Classe de dangerdanger

??

DangerDanger ToxiqueToxiquePeut provoquer le cancer (1) H350

Peut causer le cancer. R45

Peut provoquer le cancer par inhalation

H350iPeut causer le

cancer par inhalation

R49

(1) indiquer la voie d'exposition s'il est formellement prouvé qu'aucune autre voie d'exposition ne conduit au même danger


SGHSGH AncienAncien

Classe de Classe de dangerdanger

AttentionAttention NocifNocifSusceptible de provoquer le cancer (1)

H351Effet

cancérogène suspecté, preuves

insuffisantes

R40

(1) indiquer la voie d'exposition s'il est formellement prouvé qu'aucune autre voie d'exposition ne conduit au même danger

Catégories de danger 2


Merci pour votre attention

[email protected]

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