_______________UMR 42_____________

CARRTEL

Centre Alpin de Recherche sur lesRéseaux Trophiques des Ecosystèmes Limniques

Task Group on Aquatic Microbial Food Webs

__________________________________ Station d’Hydrobiologie Lacustre de Thonon

Solange DUHAMEL

Mémoire de D.E.A. Océanologie Biologique et Environnement Marin Option Connaissance des Producteurs Primaires

Université Pierre et Marie Curie, Paris 6

Etude quantitative et fonctionnelle des bactériophages du lac Léman : Comparaison de méthodes pour estimer

la mortalité bactérienne due à la lyse virale et au broutage par les protozoaires flagellés

Stage effectué sous la responsabilité scientifique de :

Stéphan Jacquet (CR2)

Equipe de Microbiologie Aquatique / UMR CARRTEL INRA – Station d’Hydrobiologie Lacustre

75, avenue de Corzent – BP 511 74203 Thonon cx, France

2003-2004

REMERCIEMENTS

Je remercie Jean-François Humbert, responsable de l’équipe de Microbiologie Aquatique,

pour avoir accepté ma présence dans son équipe.

Je tiens à remercier Stéphan Jacquet pour m'avoir proposé un projet de stage absolument

passionnant, et m'avoir accueilli avec une grande gentillesse. Je le remercie aussi pour le temps

qu’il m’a consacré et pour les nombreux conseils extrêmement précieux qu'il m'a donnés. Enfin, je

le remercie pour son soutien et pour la confiance sans réserve qu’il a su me témoigner.

Un grand merci à Sébastien Personnic et à Isabelle Domaizon pour les conseils et l’aide

qu’ils ont pu m’apporter dans le cadre de mes expériences sur le terrain.

Je tiens à exprimer mes remerciements sincères à tous ceux qui m’ont aidé au cours de ce

stage. Je remercie particulièrement J.C. Hustache et P. Chifflet pour avoir pris le temps de me

conduire sur les points de prélèvements du lac, la gentille Raymonde pour avoir fait ma vaisselle

avec le sourire, les déesses de la biologie moléculaire, Petit Ours et Brigitte. Je remercie tous les

membres de l’équipe de Microbiologie Aquatique. Merci à C. Leboulanger pour sa ficelle magique.

J'adresse également mes remerciements à mes compagnons de la MJC Nicolas et Laurent

qui ont eu la patience de m’attendre parfois très tard pour ne pas me laisser faire le chemin seule. Je

remercie ma dynamique collègue de bureau, Bérengère, en espérant que l’on se retrouvera l’année

prochaine. Un grand merci à Aurélie pour sa bonne humeur communicative et pour ses pouces.

Mes plus chaleureux remerciements vont à mes amis, particulièrement Julie et Pascal, et à

mon frère David sans qui je n’aurais pas abouti à mon rêve « Un frère est un ami donné par la

nature » [Gabriel Legouvé]. Je remercie profondément mes parents pour m'avoir toujours témoigné

leur confiance et mon Mascou pour ses encouragements et son soutien.

.

SOMMAIRE

REMERCIEMENTS

GLOSSAIRE

ABREVIATIONS

INTRODUCTION…………………………………………………………………………….......1

1. Bref historique ………………………………………………………………………….........1

2. Propriétés générales des virus………………………............................……………………...2

2.1. Transferts génétiques……………………………………………………………………..2

2.2. Rôles des virus dans les cycles biogéochimiques : agents de mortalité et de

redistribution de la matière organique…………………………………………...…….…3

3. Contrôle des communautés bactériennes par les virus……………..…………………….…..4

3.1. Contrôle de la diversité bactérienne……………………………………………………...4

3.2. Contrôle de la production bactérienne…………………………………………………....5

4. Objectifs de l’étude et questions posées……………………………………………………...6

MATERIELS ET METHODES………………………………………………………….….....7

1. Contexte………………………………………………………………………………….......7

2. Site d’étude…………………………………………………………………………………..7

3. Le suivi de la dynamique des communautés microbiennes……………………………….…8

3.1. Echantillonnage et conditionnement des échantillons……………………………….….8

3.2. Instruments et protocoles de mesure…………………………………………………….8

3.2.1. Mesures par cytométrie en flux………………………………………………......8

3.2.2. Mesures par microscopie à épifluorescence…………………………………….10

4. Les expériences in situ………………………………………………………………………11

4.1. Prélèvements et incubation………………………………………………………...…...11

4.2. DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis………………………………..…...11

4.3. L’expérience de dilution…………………………………………………………….....12

4.4. L’expérience d’enrichissement………………………………………………..….....…12

RESULTATS………………………………………………………………………………......…14

1. Dynamique des communautés microbiennes……………………………………………….14

1.1. Les données acquises en cytofluorimétrie…………………………………………...…14

1.2. Tests méthodologiques………………………………………………………………....14

1.2.1. Comparaison des données acquises en cytométrie et en microscopie à

épifluorescence……………………………………………………………….…14

1.2.2. Tests de conservation des échantillons……………………………………..…...15

2. Les expériences in situ………………………………………………………………………16

2.1. La première expérience……………………………………………………………..….16

2.1.1. La dilution……………………………………………………………………....16

2.1.2. L’enrichissement…………………………………………...…………………...17

2.2. La seconde expérience……………………………………………………………….....17

DISCUSSION………………………………………………………………………………...…..20

1. Le suivi de la dynamique des communautés microbiennes……………………………..…..20

2. Les tests méthodologiques……………………………………………………………..……21

3. Les expériences in situ………………………………………………………………………22

3.1. Impact des virus vs. protistes flagellés…………………………………………...…….22

3.2. Avantages et limites des méthodes, perspectives………………………………………25

CONCLUSION……………………………………………………………………………...…...27

BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………………...……28

ANNEXES

RESUME

GLOSSAIRE

◊ Bactérie : Etre vivant unicellulaire, Procaryote, c’est-à-dire dépourvu de noyau.

◊ Cyanobactérie : procaryote possédant des pigments assimilateurs lui permettant de réaliser la

photosynthèse.

◊ Epilimnion : couche aquatique supérieure d'un lac située, au cours de la stagnation hivernale et

estivale, au-dessus de la couche du saut thermique (métalimnion) ; dans cette dernière, la transition

thermique s'effectue de façon brusque.

◊ Picocyanobactérie : cyanobactérie de taille comprise entre 0,2 et 2 μm.

◊ Pléomorphique : vient de Pléomorphe, pléomorphisme : terme issu du grec pléôn : plus

abondant, et morphê : forme. Capacité que possède un organisme (essentiellement les bactéries) de

revêtir des formes différentes dans certaines conditions ou sous des influences déterminées.

◊ Protozoaires : microorganismes formés d'une seule cellule, mobiles au moins à un stade de leur

cycle. Ils se déplacent par des pseudopodes (amibes), des flagelles (Trypanosomes) ou des cils

vibratiles (paramécies).

◊ Virus : minuscule parasite des cellules. Incapable de vivre seul, le virus pénètre dans la cellule

et l'utilise pour se multiplier et ainsi contaminer d'autres cellules. Des maladies comme la grippe, la

varicelle mais aussi le SIDA sont provoquées par des virus. Outre l'homme, les animaux, les plantes

et même les bactéries peuvent être infectés par des virus.

LISTE DES ABREVIATIONS

Cmax concentration maximale <11 fraction d’eau du lac filtrée sur une membrane de 11 μm de porosité <2 fraction d’eau du lac filtrée sur une membrane de 2 μm de porosité <0,2 fraction d’eau du lac filtrée sur une membrane de 0,2 μm de porosité <0,02 fraction d’eau du lac filtrée sur une membrane de 0,02 μm de porosité +FV enceinte d’enrichissement = « plus Fraction Virale » -FV témoin = « moins Fraction Virale » MO Matière Organique T0 temps zéro de l’expérience : mise à incubation des bouteilles J0 à J9 jours des expériences in situ compris en le T0 et le 9ème jour ADN Acide DésoxyriboNucléique ARN Acide Ribonucléique DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis PCR Polymerase Chain Reaction FVIC Fréquence des Bactéries Visiblement Infectées VBR Ratio entre les abondances virales et bactériennes

INTRODUCTION

Les virus sont des agents infectieux dont l’organisation structurelle est simple et acellulaire.

Ils possèdent un seul type d’acide nucléique (ADN ou ARN), simple ou double brin et ils ne

peuvent se multiplier indépendamment des cellules vivantes qu’ils infectent, appelées hôtes. Les

virus sont probablement des organismes régressés simplifiés et non des formes primitives de la vie

(Prescott et al., 2003). Bien qu’ils constituent les plus petites entités biologiques connues à ce jour,

avec une taille variant entre 20 et 200 nm (majorité <60 µm), les virus sont aujourd’hui reconnus

comme étant un compartiment intrinsèque des écosystèmes aquatiques. Aussi bien en milieu marin

qu’en milieu lacustre, ils sont extrêmement abondants dans la colonne d’eau. Les comptages directs

montrent qu’il y a environ 3 à 10 VLP (« Virus-like particles ») pour chaque cellule de l’océan

(Bergh et al., 1989 ; Fuhrman, 1999). On sait aujourd’hui que les Bactéries et les Archaes sont les

cellules les plus abondantes dans l’eau de mer, et il est admis que la majeure partie de la

communauté virale est composée de bactériophages, virus infectant les bactéries (Fuhrman, 1999 ;

Wommack et Colwell, 2000 ; Weinbaueur, 2004). Sachant que les milieux aquatiques constituent la

plus grande « biosphère » de notre planète, il est alors logique de penser que les phages marins et

d’eaux douces sont probablement les entités biologiques les plus abondantes de la Terre (Paul et al.,

2002 ; Sime-Ngando et al., 2003). Mis bout à bout, et en considérant une taille moyenne de 50 nm,

l’ensemble des virus aquatiques constitue un « collier de perles » long de 400 000 années lumière

selon Weinbauer et Rassoulzadegan (2004). Toutefois, le rôle fonctionnel, la dynamique et la

diversité des virus dans les écosystèmes aquatiques, en particulier dulçaquicoles, sont encore mal

renseignés.

1. Bref historique

« Vous pouvez vous demander comment de tels naïfs apprirent l’existence des virus

bactériens. Vraiment par accident, je vous l’assure. » Max Delbrück.

Jusqu’à très récemment, l’écologie virale aquatique était une science négligée (Figure 1).

C’est dans les années 70, avec Torella et Morita (1979) que l’on démontre que les virus présents

dans l’eau de mer sont en plus fortes concentrations que ce que l’on avait préalablement rapporté

(>104 particules virales par millilitre). Par la suite, d’autres chercheurs ont corroboré ces

observations en mesurant des abondances virales de l’ordre de 109 à 1010 particules virales par litre

dans les eaux de mer ou de lac (Børsheim et al., 1990 ; Paul et al., 1991 ; Suttle et al., 1991). Dès

lors, de fortes abondances virales ont été observées dans les eaux marines (Bergh et al., 1989 ;

Proctor et Fuhrman, 1990), côtières (Suttle et al., 1990 ; Paul et al., 1991) et douces (Klut et

1

Stockner, 1990 ; Bergh et al., 1989) ; dans les sédiments marins (Paul et al., 1993) et d’eaux douces

(Maranger et Bird, 1996) et dans la glace de la mer polaire (Maranger et al., 1994).

La fin des années 80 a donc marqué un regain d’intérêt pour l’étude de l’écologie des virus

aquatiques bactériens et phytoplanctoniques (Fuhrman, 1992 ; Fuhrman et Suttle, 1993). De

nombreux chercheurs ont alors tenté d’identifier et de travailler sur les différents rôles importants

des virus dans la mortalité du bactérioplancton, des cyanobactéries, et du phytoplancton, dans les

cycles biogéochimiques et le contrôle de la diversité microbienne planctonique (Fuhrman, 1999 ;

Wilhelm et Suttle, 1999 ; Wommack et Colwell, 2000 ; Suttle, 2000 ; Sime-Ngando et al, 2003 ;

Weinbauer et Rassoulzadegan, 2004 ; Weinbauer, 2004).

2. Propriétés générales des virus

Les bactériophages sont le groupe de virus le plus important par le nombre de descriptions.

Ils sont représentés chez les Archae et les Bactéries, ont colonisé tous les habitats connus dans la

nature (Ackermann et Dubow, 1987), et peuvent être trouvés en nombre très élevé (Wommack et

Colwell, 2000). Plus de 5100 virus de bactéries ont été examinés par microscopie électronique

depuis 1959, révélant qu’environ 96% des phages présentent une queue (contractile ou non) et que

seulement 3,6% sont cubiques, filamenteux ou pléomorphiques(*) (Ackermann, 2001).

2.1. Transferts génétiques

Les virus peuvent jouer un rôle central dans le transfert de gènes entre microorganismes, au

travers de deux processus : la transformation et la transduction. Dans le premier cas, le virus induit

le transfert génétique de façon indirecte en provoquant la libération de l’ADN de la cellule hôte

lysée, pouvant être récupéré et utilisé par un autre microorganisme. Dans le second processus, plus

direct, le virus empaquette une partie de l’ADN de son hôte dans sa tête puis l’injecte dans un autre

hôte potentiel (Fuhrman, 2001).

Bien que l’étendue de ces mécanismes dans les systèmes naturels aquatiques ne soit pas

encore bien connue, ils peuvent toutefois avoir un rôle important dans la génétique des populations,

au travers de l’homogénéisation des gènes dans une population hôte potentielle mais également sur

son évolution à plus grande échelle de temps (Ackermann, 2001). Ce sont ces hypothèses qui ont

conduit certains chercheurs à se pencher sur le sujet. Ainsi, Chiura démontre en 1997 la production

spontanée de virus et le transfert de gènes par l’intermédiaire de ces virus chez Escherichia coli

AB1157 comme receveur. Il estime l’efficacité moyenne de l’ensemble des transferts de gènes

comme étant comprise entre 2,62x10-3 et 3,58x10-5 par particule virale. Ces résultats indiquent que

les virus produits par certaines bactéries pourraient être un élément important pour le transfert

2

horizontal de gènes. De la même façon, Jiang et Paul mènent une étude en 1998 pour déterminer le

potentiel du transfert de gènes par l’intermédiaire des bactériophages dans l’environnement marin.

Les fréquences de transduction obtenues chez des bactéries isolées et l’utilisation d’un modèle

numérique leur ont permis d’obtenir des estimations de transduction supérieures à 1,3x1014

évènements de transduction par an dans l’estuaire de Tampa Bay (Floride). Ces résultats suggèrent

que la transduction pourrait être un mécanisme important dans le transfert horizontal de gènes dans

les milieux aquatiques. Plus récemment, Clokie et al. (2003) ont pu démontrer pour la première fois

que les phages infectant la souche marine Synechococcus (Waterbury et al., 1979) pouvaient

encapsider l’ADN de leur hôte (environ 8% du génome complet) avec une fréquence totale de 10-4,

fournissant de nouveau une évidence de l’importance potentielle des phages dans le transfert

horizontal de gènes.

2.2. Rôles des virus dans les cycles biogéochimiques : agents de mortalité et de

redistribution de la matière organique

Depuis deux siècles, la poussée démographique et le développement industriel et agricole

(combustion des énergies fossiles, utilisation des sols...) ont provoqué un profond déséquilibre des

cycles biogéochimiques globaux ainsi qu’un réchauffement climatique (Hansen et al., 1998). La

majorité des composés atmosphériques à impact radiatif (CO2, CH4, N2O, O3, aérosols) a augmenté

très significativement (Hansen et al., 2000 ; Peng et al., 2003). Cette évolution a un effet direct sur

le climat mais également un double impact sur les écosystèmes marins et continentaux. D'une part,

les changements climatiques sont susceptibles de modifier en profondeur à la fois la géochimie et la

dynamique des grands réservoirs, d'autre part, certains composés exercent une influence directe de

fertilisation ou d'inhibition des végétaux (Tilman et Lehman, 2001). Ainsi l'étude de l'état transitoire

actuel des cycles biogéochimiques passe à la fois par le suivi de l'évolution temporelle de

l'atmosphère, de l'océan, de la biosphère et par la compréhension de l'impact global de l'évolution

du climat sur ces grands réservoirs.

La communauté microbienne n’a été prise en compte dans l’étude des grands cycles

biogéochimiques que tardivement. Il faut attendre Azam et al. (1983) pour qu’apparaisse le concept

de boucle microbienne et que le compartiment microbien soit reconnu comme clef dans le

fonctionnement et la compréhension des processus biogéochimiques en milieu aquatique. La boucle

microbienne est une voie de transfert du carbone (Figure 2) dans les écosystèmes aquatiques, basée

sur l'utilisation par les bactéries de la matière organique allochtone et autochtone. Le carbone

bactérien entre alors dans la chaîne trophique via le broutage des bactéries par le protozooplancton

et éventuellement par certains composants du métazooplancton. Au travers de leur activité de lyse

3

cellulaire, les phages modulent le flux de carbone au travers de la chaîne alimentaire en attaquant

les microbes autotrophes et hétérotrophes (Fuhrman, 1999). En effet, il est établi qu’une large

fraction du carbone total et des flux de nutriments dans les écosystèmes marins passe au travers des

bactéries hétérotrophes via la matière organique dissoute. Lorsqu’une cellule hôte est lysée, les

virus en résultant ainsi que les débris cellulaires constituent des produits (protéines, acides

nucléiques, et autres composants cellulaires) potentiellement utilisables par les bactéries et le

phytoplancton comme éléments nutritifs (Gobler et al., 1997, Noble et al., 1999).

La découverte de l’abondance des populations virales dans les écosystèmes aquatiques a eu

un impact immédiat sur la notion de boucle microbienne. Un modèle conceptuel des virus et de la

lyse virale dans la chaîne alimentaire aquatique est fourni en Figure 3 et démontre que la lyse virale

augmente le flux de la biomasse bactérienne vers le pool de la matière organique dissoute

(Wommack et Colwell, 2000). La Figure 4 permet d’apprécier le phénomène de « court-circuit »

viral dans la chaîne alimentaire. Selon Wilhelm et Suttle (1999), les virus initient le passage du flux

de carbone et de nutriments depuis les consommateurs (flèches noires sur la Figure 4), en détruisant

les cellules hôtes et en libérant le contenu de ces cellules, vers le pool de matière organique dissoute

de l’océan (flèches grises sur la Figure 4). Cette matière organique est alors utilisée comme source

de nourriture par les bactéries, lesquelles transfèrent une partie de ce matériel dans la chaîne

alimentaire. Wilhelm et Suttle (1999) démontrent en utilisant un modèle très simple que 6 à 26% du

carbone organique fixé par photosynthèse est recyclé en matière organique dissoute par la lyse

virale, d’où la notion de court-circuitage du transfert de la matière vers les maillons trophiques

supérieurs. La lyse virale va fournir les éléments azotés, phosphorés et carbonatés essentiels sous

forme de composés facilement assimilables par les microorganismes (Gobler et al., 1997). Par

exemple, les acides nucléiques sont des produits de la lyse virale riches en phosphore. Paul et al.

(1991) suggèrent qu’entre 1 et 12% de l’ADN total « dissous » dans l’eau de mer se trouve dans les

virus. Puisque le temps de renouvellement de l’ADN dans l’eau de mer est rapide, l’ADN viral

pourrait représenter un réservoir important de phosphore organique (Bratbak et al., 1994).

3. Contrôle des communautés bactériennes par les virus

3.1. Contrôle de la diversité bactérienne

La diversité phénotypique et génotypique des populations de phages est liée à l’interaction

entre les phages et leurs hôtes (Cottrell et Suttle, 1995). Les auteurs se servent de cette propriété

pour étudier l’influence des bactériophages sur la diversité du bactérioplancton. Ainsi, le concept

des espèces de virus proposé par Murphy et al. (1995) définit sept familles différentes de

bactériophages basées sur des critères morphologiques.

4

D’après le concept de « killing the winner » (Thingstad et Lignell, 1997), les virus peuvent

garder le contrôle sur les populations ou espèces dominantes ; c'est-à-dire que lorsqu’une population

bactérienne devient dominante, celle-ci est lysée, permettant ainsi la co-existence de populations

moins compétitives tout en maintenant la diversité bactérienne. Ce modèle a été validé par les

résultats trouvés en isolant des systèmes phage – hôte. Par exemple, Middelboe et al. (2001) ont

montré que les phages se propagent en fonction de la densité en hôte et contrôlent l’abondance en

hôtes, changent la composition clonale de l’hôte en forçant la formation de mécanismes de

résistance. Ceci a aussi été suggéré ou démontré en milieu naturel au moment de la terminaison

d’efflorescences phytoplanctoniques (Taruani et al., 2000 ; Jacquet et al. 2002 ; Tomaru et al.,

2004) et en culture (Thyrhaug et al., 2003).

Récemment, Weinbauer et Rassoulzadegan (2004) ont synthétisé des données supportant

l’hypothèse que les gènes viraux et l’activité virale génèrent la variabilité génétique des procaryotes

permettant ainsi leur fonctionnement écologique et leurs changements évolutifs. Un schéma

résumant ces processus de diversification procaryotique via les virus est proposé en Figure 5.

3.2. Contrôle de la production bactérienne

On a longtemps pensé que la production bactérienne aquatique était contrôlée en majeure

partie par la prédation par le microzooplancton (Pace, 1988). Le nombre élevé de virus aquatiques

et le fait que plus de 34% des bactéries marines pourraient contenir des phages matures (Proctor et

Fuhrman, 1990), suggèrent que la lyse virale pourrait être un processus quantitativement important

de l’altération de la production bactérienne. L’ensemble des résultats connus à ce jour révèle

qu’entre 10 et 50% de la production bactérienne journalière pourrait être éliminée par action virale

(Wommack et Colwell, 2000). Certains auteurs ont même rapporté des pourcentages de 97%

(Weinbauer et Hoffle, 1998). Toutefois, il n’existe encore que très peu d’études quantitatives

concernant la contribution relative du contrôle viral sur les populations procaryotiques ou

eucaryotiques par rapport à la prédation (Hennes et Simon, 1995 ; Mathias et al., 1995 ; Vrede et

al., 2003). De plus, la plupart des sujets de recherche concernant les intéractions entre bactéries et

bactériophages ont été réalisés en milieu marin. Il manque donc des informations cruciales pour la

compréhension de la dynamique virale et du rôle des phages dans les systèmes d’eaux douces

(Jacquet et al., soumis).

5

4. Objectifs de l’étude et questions posées

Comme nous avons pu le constater plus haut, l’écologie des virus en milieu lacustre est

encore peu étudiée et manque d’informations pour comprendre la dynamique et la diversité

des peuplements microbiens à la base des réseaux trophiques pélagiques. L’objectif de ce

travail de recherche a été de s’intéresser à cette problématique à travers l’étude du rôle des

bactériophages du lac Léman. Dans ce but, nous avons suivi la dynamique du peuplement

microbien et réalisé des expériences in situ pour tenter d’appréhender le rôle fonctionnel des virus

sur la mortalité et la diversité bactérienne du lac Léman. Les questions auxquelles nous avons

essayé de répondre sont les suivantes :

Quelle est la dynamique de la communauté bactérienne et virale ?

Quel est l’impact de la lyse virale sur la mortalité et la diversité de la communauté

bactérienne comparativement à l’impact de la prédation par les protozoaires* (flagellés) ?

Pour répondre à la première question, nous avons utilisé deux techniques de comptage : la

cytométrie en flux et la microscopie à épifluorescence. Dans le cadre d’études sur le contrôle

bactérien par les virus en milieu lacustre, Jacquet et al. (soumis) ainsi que Fischer et Velimirov

(2002) ont obtenu des conclusions différentes selon la méthode utilisée. Nous avons donc eu

comme premier objectif de déterminer le protocole le mieux adapté à l’étude de la communauté

microbienne et de valider l’exactitude des comptages de virus obtenu par cytométrie en flux (Marie

et al., 1999 ; Chen et al., 2001 ; Jacquet et al., 2002 ; Brussaard 2004, Dorigo et al., en préparation).

Nous avons également testé l’effet de la conservation des échantillons dans l’expectative d’une

analyse différée.

Pour déterminer l’impact des virus et des prédateurs sur le compartiment bactérien, nous

avons comparé deux méthodes en condition de travail in situ : celle de l’enrichissement en fraction

virale de la communauté bactérienne seule ou avec prédateurs, et celle de la dilution de la

communauté bactérienne seule ou avec prédateurs. En effet, la méthode de dilution (Landry et

Hasset, 1982 ; Landry et al., 1995 ; Wilhelm et al, 2002 ; Evans et al., 2003 ; Jacquet et al., soumis)

déjà utilisée en milieu lacustre présente des biais de part les étapes de filtration (Jacquet et al. (en

révision)). La méthode d’enrichissement, utilisée surtout pour l’étude du bacterio – ou

phytoplancton marin (Proctor et al., 1992 ; Hennes et Simon, 1995 ; Noble et al., 1999 ; Hewson et

al., 2001 ; Eissler et Quinones 2003) a également permis d’étudier le rôle des virus et des brouteurs

sur le compartiment microbien. La comparaison entre ces deux méthodes n’ayant jamais été faite, il

était par conséquent intéressant de voire si les résultats fournis iraient dans le même sens et de

déterminer la méthode présentant le moins de biais. Ces expériences ont été réalisées à deux

périodes distinctes (mars et mai 2004).

6

MATERIELS ET METHODES

1. Contexte

Comme nous avons pu le constater dans l’introduction, la dynamique et la diversité des

communautés microbiennes en milieu lacustre sont encore mal renseignées. La première partie de

ce travail de DEA trouve ici son premier intérêt. Les études menées sur ce sujet en milieu marin

sont beaucoup plus nombreuses et sont souvent basées sur une technique de comptage unique. Nous

nous sommes donc demandés quelle technique entre la cytométrie en flux et la microscopie à

épifluorescence était la mieux adaptée à ce type d’étude pour l’énumération bactérienne (auto- et

hétérotrophe) et virale.

Pour comprendre la dynamique et la diversité de ces communautés, il est crucial de

s’intéresser aux processus pouvant expliquer la croissance, le maintien et le déclin de ces

compartiments biologiques. Dans le cadre de ce DEA, nous nous sommes appliqués à étudier les

intéractions de type proie - prédateur et hôte - parasite. En effet, il est aujourd’hui admis que les

virus et les prédateurs (flagellés et ciliés) interviennent significativement dans la mortalité des

populations microbiennes en milieu pélagique. Toutefois, on ne sait encore rien du rôle potentiel

des virus planctoniques dans la régulation des populations bactériennes et phytoplanctoniques du

lac Léman et on ne connaît pas la part imputable aux virus par rapport aux prédateurs unicellulaires.

De nouveau, ce travail bénéficie d’un caractère exceptionnel puisqu’en plus de l’originalité de cette

recherche, nous avons comparé deux techniques déjà utilisées mais dont on ne connaît pas

l’efficacité respective pour ce type d’étude (voir plus loin).

2. Site d’étude

Les prélèvements pour le suivi de la dynamique des communautés microbiennes et pour les

expériences in situ ont été effectués à la station de référence SHL2 du lac Léman qui correspond à

la plus grande profondeur du réservoir (309 m). Le Léman est situé à l'extrémité ouest de la Suisse

et au nord du département français de la Haute-Savoie. Il s’agit du plus grand lac naturel d'Europe

occidentale (Tableau 1). Les eaux du lac Léman sont donc internationales, en raison de sa situation

frontalière entre la France et la Suisse (Figure 6). La pression d'urbanisation y est importante et

renforcée par la proximité de grandes villes telles que Genève ou Lausanne. La qualité des eaux du

Léman est donc suivie depuis 1960 sous l’égide de la CIPEL (Commission Internationale pour la

Protection des Eaux du Léman contre la pollution, http://www.cipel.org). Ce suivi à permis de

constater que le Léman a été oligotrophe avant 1960 et qu’il est devenu eutrophe dans les années

7

70-80 avant de se stabiliser au statut actuel mésotrophe (voir l’Annexe I : critères d’eutrophisation

selon l’OCDE).

3. Le suivi de la dynamique des communautés microbiennes

3.1. Echantillonnage et conditionnement des échantillons

Les prélèvements ont été effectués au point SHL2 du lac Léman, dans le cadre du suivi

orchestré par la CIPEL, à 11 profondeurs : 2,5 ; 7,5 ; 10 ; 15 ; 20 ; 25 ; 30 ; 50 ; 100 ; 200 et 300 m.

Dans un soucis de qualité, les prélèvements ont toujours été effectués par la même personne, selon

un protocole précis. Des flacons Falcon de 50 ml labellisés (profondeur – nom du lac – nom de la

personne) étaient soigneusement rincés deux fois avec l’eau prélevée à la profondeur désignant leur

contenu, puis étaient remplis à ras bord afin de minimiser les effets de turbulence engendrés par le

transport dans les tubes. Les échantillons étaient alors gardés au frais dans une glacière avec packs

de glace jusqu’au retour au laboratoire. A l’arrivée au laboratoire, les échantillons étaient conservés

au frais à 4°C et étaient analysés dans les plus brefs délais (< 1 heure après dépôt au laboratoire).

Afin de tester la validité des mesures après conservation pendant deux jours à 4°C, une mesure

supplémentaire et identique à celle effectuée le jour du prélèvement, a été de reproduite deux jours

plus tard (J+2). Dans les résultats, nous avons fait le choix de ne présenter la dynamique des

communautés que pour les 50 premiers mètres. L’exploitation des données à 100, 200 et 300 mètres

sera faite ultérieurement.

3.2. Instruments et protocoles de mesure

Deux instruments de mesure des abondances cellulaires et/ou particulaires ont été utilisés

dans le cadre du suivi des communautés : la cytométrie en flux et la microscopie à épifluorescence.

3.2.1. Mesures par cytométrie en flux

La cytométrie en flux (CFM) est utilisée en routine pour l’analyse des microorganismes

marins depuis une vingtaine d’années et est désormais considérée comme une technique de

référence en océanographie. D’abord utilisée pour discriminer et énumérer les populations

phytoplanctoniques (Olson et al., 1985), la CFM a été ensuite appliquée à l’analyse des

communautés bactériennes hétérotrophes (Monger et Landry, 1993 ; Li et al., 1995 ; Marie et al.,

1996 ; Marie et al., 1999). C’est Marie et al. qui, en 1999, mettent au point une méthode

d’énumération des virus marins par cytométrie en flux grâce à l’utilisation d’un nouveau colorant

des acides nucléiques : le SYBR Green-I (SYBR-I).

Cette technique permet l’analyse de chaque cellule en suspension dans un liquide. C’est

donc une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de ces particules sur la

8

base de critères optiques émis par chacune d’entre elles après avoir été excitées par un source

lumineuse fournie par un rayonnement laser.

Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs :

• aux propriétés optiques intrinsèques des particules qui correspondent aux

phénomènes de diffusion lumineuse liés aux dimensions de la particule, à sa structure interne, ou à

l’autofluorescence de certaines cellules comme les végétaux (typiquement les pigments du

phytoplancton)...

• aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages

spécifiques de structures ou de fonctions cellulaires (ADN, ARN, activités enzymatiques,…).

Ces signaux séparés par des filtres optiques et/ou le jeu de différents miroirs sont

collectés par des photomultiplicateurs, amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur.

Nous avons utilisé un cytomètre FACSCalibur (Becton Dickinson) équipé d’un laser

fournissant 15 mW à 488 nm avec ses filtres standard. Le protocole expérimental était spécifique

aux types de cellules que nous désirions étudier (phytoplancton autotrophe, bactéries hétérotrophes

et virus). Pour l’ensemble des analyses, les échantillons ont été filtrés sur 60 μm afin d’éliminer les

cellules de trop grande taille pouvant obstruer le système fluidique du cytomètre. Pour les

autotrophes, l’analyse a été effectuée sans addition de fixateur ni de colorant. Seul 0,5 μl d’une

solution de billes calibrées (Fluoresbrite Carboxy YG 10 Micron Microsphere [2,57% Solids-

Latex], Polysciences) a été ajouté à 1 ml de l’échantillon filtré. Les virus et les bactéries ont été

fixés avec 10 μl d’une solution de glutaraldehyde à 25 % filtrée sur 0,2 μm pour 1 ml d’échantillon

filtré, pendant 10 minutes à température ambiante et à l’obscurité. Après ce temps, les bactéries ont

été colorées pendant 15 minutes selon le protocole suivant : 2,5 μl de SYBR-I (1/100 de la solution

obtenue par un fournisseur et filtré sur 0,2 μm) + 0,5 μl de solution de billes + 245 μl d’eau prélevée

à 300 m filtrée sur 0,2 puis 0,02 μm + 5 μl de l’échantillon fixé. Enfin, les virus étaient colorés de la

façon suivante : 2,5 μl de SYBR-I (1/100) + 245 μl de TE (Tris–EDTA, pH = 8) préalablement

filtré sur 0,2 puis 0,02 μm + 2,5 μl de l’échantillon fixé, pendant 5 minutes puis chauffage à 75°C

pendant 10 minutes (pour plus de détails, voire Marie et al., 1999 ou Brussaard, 2004).

L’analyse des résultats a été effectuée avec le logiciel CYTOWIN (Vaulot, 1989 :

disponible sur le site : http://www.sb-roscoff.fr/Phyto/cyto.html#cytowin) après transfert des

fichiers générés par le cytomètre vers un ordinateur PC. Des exemples de cytogrammes obtenus au

moyen de ce logiciel sont présentés en Figure 7. En se basant sur différents critères de taille et de

fluorescence des cellules, on identifie les différentes populations microbiennes : picocyanobactéries

(Synechococcus spp.), bactéries hétérotrophes et virus.

9

3.2.2. Mesures par microscopie à épifluorescence

La microscopie à épifluorescence a été adaptée à l’énumération des particules virales

dans les années 90 et a été améliorée grâce à l’utilisation du marqueur des acides nucléiques SYBR

Green I par Noble et Fuhrman (1998). C’est à partir du protocole proposé par ces auteurs que nous

nous avons réalisé nos analyses. Une série de tests de comparaison de l’efficacité de différents

marqueurs de l’ADN a été conduite par Personnic (2003) dans le cadre de son DEA. Les résultats

de ce travail ont révélé que le SYBR Gold (Molecular Probes) constitue un marqueur plus sensible

que les autres et de durée de fluorescence plus longue, permettant ainsi une observation plus aisée

au microscope. C’est la raison pour laquelle les cellules bactériennes et virales ont été marquées au

SYBR Gold.

Les bactéries et les virus ont d’abord été fixés au formalin, un liant des protéines des

membranes cellulaires et des protéines de la capside des virus (Noble, 2001) : 1,5 ml d’échantillon

pour 40 μl de formalin à 37 % filtré sur 0,02 μm, puis maintenus 30 minutes à 4°C. Pendant ce

temps, une solution d’antifading était préparée (100 mg P-phenylenediamine + 1,5 ml d’eau milliQ

+ 495 μl de PBS + 495 μl de glycerol) et filtrée sur 0,2 μm avant conservation à 4°C. La solution de

colorant (2,5 μl de SYBR Gold 1/10 de la concentration stock + 97,5 μl d’eau) était déposée sous la

forme d’une gouttelette sur boite de petri et conservée à 4°C à l’obscurité. 1 ml des échantillons

fixés était alors filtré sur une membrane de porosité 0,02 μm (Filtre Whatman Anodisc 25). Ce filtre

était alors déposé sur la goutte de solution de colorant et conservé 15 à 20 minutes à l’obscurité.

Pour le montage entre lame et lamelle, le filtre était déposé sur une lame et une goutte d’antifading

était placée sous la lamelle après séchage du filtre.

Les picocyanobactéries n’étaient pas fixées. Nous les avons préparé selon la méthode

développée par Wetzel et Likens (2000). 250 à 300 ml d’échantillon étaient filtrés à travers un filtre

de porosité 3 μm (filtre Whatman GF/D) afin d’éliminer les cellules de taille supérieure au

picoplancton. Le filtrat obtenu était filtré sur une membrane en polycarbonate noir de 0,2 μm de

porosité (filtre Whatman Cyclopore Track Etched Membrane). Ce filtre, une fois séché, était placé

sur une goutte d’huile à immersion (Cargille) et sur une lame. Une goutte d’huile à immersion était

rajoutée entre le filtre et la lamelle.

Les comptages ont été effectués à l’aide d’un microscope à épifluorescence (Leitz

Wetzlar, Dialux 20), muni d’un filtre A 513596 (Ultraviolet : 400 nm, LP 430, bande passante : 340

– 480) pour le comptage des bactéries et des virus et d’un filtre I2/3 (Bleu : 510 nm, LP 515, bande

passante : 450 – 490) pour le comptage des cyanobactéries. La Figure 8 illustre les

picocyanobactéries, les bactéries et les virus observés en microscopie à épifluorescence.

10

4. Les expériences in situ

Pour ces expériences, les abondances cellulaires et particulaires ont été obtenus uniquement

par cytométrie en flux. En plus des comptages, des mesures de diversité bactérienne ont été

conduites par la technique de biologie moléculaire DGGE (Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis). Les mesures par cytométrie en flux ont été effectuées toutes les 24 h pendant 7

jours alors que les expériences de DGGE ont été réalisées à J0, J3 et J7. Selon un article de

Schwalbach et al. (2004), les effets des virus sur les communautés microbiennes sont souvent de

faible intensité en deçà de 5 jours. Ainsi, lors de la première expérience, nous avons choisi de mener

l’expérience sur 9 jours afin d’observer le maximum d’effets. Ayant observé l’effet de confinement

dans ce cas, nous avons réduit le suivi de la deuxième expérience à 7 jours.

4.1. Prélèvements et incubation

Les prélèvements ont été effectués à deux périodes de l’année marquées par des différences

de stratification des eaux du lac, au point SHL1 (Figure 6). Le premier prélèvement a été effectué

le mardi 30 mars et le second le lundi 10 mai. L’échantillon correspondait à un profil intégré de

l’épilimnion(*) (0 - 10 m) où les conditions de lumière et de température sont proches de celles du

lieu d’incubation. Les différents traitements, une fois répliqués, ont été mis à incuber dans le port (à

environ 2 m de profondeur).

4.2. DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

Il y a une dizaine d’années, une méthode de biologie moléculaire, la PCR* (Polymerase

Chain Reaction) suivie par une électrophorèse sur gel à gradient dénaturant (PCR-DGGE), a été

proposée pour l’étude de la diversité des populations bactériennes dans des échantillons

environnementaux (Muyzer et al., 1993). Dans cette méthode, l’ADN microbien total est extrait,

puis les gènes d’ARNr 16S bactérien sont emplifiés par PCR à l’aide d’amorces eubactériennes

universelles (Heuer et Smalla, 1997). Les produits de PCR de même longueur mais de séquence

nucléotidique différente peuvent être séparés selon leurs propriétés de fusion par DGGE (Muyzer et

al., 1993 ; Heuer et Smalla, 1997). En dépit de nombreux efforts, les produits de PCR n’ayant révélé

aucune amplification, aucun résultat de DGGE ne sera présenté. Les expériences seront reconduites

ultérieurement.

11

4.3. L’expérience de dilution

Dans les expériences standards de dilution, le taux de croissance net des bactéries (k) est

considéré comme étant le produit de la croissance instantanée (μ) et de la mortalité (m) des

bactéries due au broutage (mg) par les prédateurs zooplanctoniques (Figure 9). Il est supposé que μ

est constant selon le niveau de dilution (D) alors que mg est considéré comme « densité-

dépendant ». Dans ce cas, le facteur de mortalité imputable aux virus est ignoré. Dans les

expériences standard de dilution, le diluant est généralement filtré sur une membrane < 0,2 μm au

travers de laquelle les virus peuvent passer. Puisque les taux d’infection virale sont « densité-

dépendants », il peut être supposé que la mortalité due aux virus sur les bactéries (mv) est constante

selon D et que par conséquent, l’estimation de μ inclue le composant de mortalité par les virus. Une

estimation directe de la mortalité des bactéries imputable aux virus peut être obtenue en faisant la

différence entre k et D dans des incubations diluées avec un diluant sans virus et avec virus (mv =

(mv + mg) – mg).

Après avoir pré-filtré l’eau du lac sur une maille de 60 – 20 – 11 – 2 et 0,2 μm, deux

gammes de dilution (0 – 20 – 40 – 70 – 100 %) on été réalisées sur l’eau du lac filtré sur 11

μm (noté par la suite <11) : la première était diluée avec de l’eau ultra pure obtenue par

ultrafiltration tangentielle et la seconde était diluée avec de l’eau filtrée sur 2 μm (notée par la suite

<2) dans le cas de la première expérience et sur 0,2 μm (notée par la suite <0,2) dans le cas de la

deuxième expérience (Figure 10). La dilution avec de l’eau filtrée sur 2 μm a été une erreur de

notre part. Elle aurait du être réalisée avec de l’eau filtrée sur 0,2 μm. Aucun résultat ne sera donc

exploité dans le cadre de ce traitement. Pour chaque niveau de dilution, les échantillons ont été

placés dans des bouteilles de 250 ml en polycarbonate (Nalgene, Bioblock), préalablement rincées

trois fois à l’acide. La filtration sur une maille de 11 μm a permis de conserver les virus, les

bactéries et les prédateurs flagellés de l’eau naturelle prélevée. Par contre, la filtration sur 0,2 μm a

permis d’éliminer les prédateurs flagellés et les bactéries tout en conservant les virus et la filtration

sur 2 μm n’a permis d’éliminer que les flagellés. Dans le cadre de la première expérience, chaque

traitement a été suivi en duplicat alors que dans le cadre de la seconde, chaque traitement a été suivi

en triplicat (sauf les témoins (0% d’eau <11) en duplicat).

4.4. L’expérience d’enrichissement

Pour la première expérience d’enrichissement, deux traitements ont été mis en place (Figure

11) : un duplicat de l’eau du lac filtrée sur 11 μm et un duplicat de l’eau du lac filtrée sur 2 μm

enrichis en fraction virale (+FV). Un témoin de chaque traitement a été mis en place en duplicat.

Les témoins ont consisté au même traitement passé à l’autoclave (-FV). De la même façon que pour

12

l’expérience de dilution, des bouteilles de 250 ml en polycarbonate ont été utilisées. Chaque

bouteille a été remplie (475 ml) d’eau prélevée in situ, préalablement filtrée sur 11 ou 2 μm, puis

complétée soit par un volume de 12,5 ml d’eau enrichie en virus que l’on nommera par la suite

enceinte d’enrichissement, soit par un volume de 12,5 ml de la même eau enrichie ayant subie un

passage à l’autoclave. L’enrichissement théorique par bouteille est de 5. Les volumes d’eau enrichis

en matière organique et en virus ont été obtenus en filtrant sur 0,2 μm et en concentrant l’eau du

milieu naturel au moyen d’une pompe péristaltique et d’un système approprié d’ultrafiltration

tangentielle (Proctor et Fuhrman, 1992). Les caractéristiques de l’autoclavage sont les suivantes : 45

minutes pour environ 75 ml d’eau enrichie, résultant en théorie en la perte du potentiel infectieux

des particules virales (Noble et al., 1999).

Le facteur d’enrichissement obtenu lors de la première expérience ayant été beaucoup plus

faible que celui escompté, nous avons décidé de changer le protocole en vue d’améliorer la

concentration virale. Pour la deuxième expérience d’enrichissement, seul le traitement « eau du lac

filtrée sur 2 μm, enrichie en virus (+ FV) » a été mis en place (toujours en duplicat). Deux bouteilles

de 1L ont été remplies (960 ml) d’eau prélevée in situ, préalablement filtrée sur 2 μm, puis

complétées par un volume de 40 ml d’eau enrichie en virus (+FV). Le facteur d’enrichissement

théorique par bouteille, connaissant le facteur réel obtenu lors de la première expérience, est de 4.

Les témoins (en duplicat) n’ont pas été enrichis en MO comme pour la première expérience car

d’après Proctor et Fuhrman (1992), il n’y a pas de différence entre un témoin enrichi ou non en MO.

13

RESULTATS

1. Dynamique des communautés microbiennes

1.1. Les données acquises en cytofluorimétrie

Le suivi de la distribution des communautés microbiennes (picocyanobactéries dominées par

Synechococcus spp., petits eucaryotes, bactéries hétérotrophes et virus) a été réalisé à partir des 11

prélèvements effectués entre le 4 février et le 24 mai 2004 (Figure 12). Il existe une succession

marquée entre les différentes communautés. Le premier groupe pour lequel les concentrations

augmentent de manière significative est celui des petits eucaryotes. Ces derniers présentent deux

pics vers le 15 avril et le 10 mai, atteignant jusqu’à 14x103 cell.ml-1 entre 0 et 15m. Les bactéries

hétérotrophes dominent en avril avec un pic à la fin du mois, et sont suivies par les cyanobactéries

dont la biomasse culmine entre mi avril et fin mai avec un pic en début mai. Alors que les fortes

concentrations des communautés bactériennes (4 à 6x106 cell.ml-1) s’étendent sur les 25 premiers

mètres, celles des picocyanobactéries (10 à 14x103 cell.ml-1) ne s’étendent que sur les 15 à 20

premiers mètres. Les virus présentent des concentrations plus élevées (4 à 5x107 part.ml-1) entre la

surface et les 50 premiers mètres vers le 15 avril et explosent de début à fin mai (4 à 7x107 part.ml-

1), atteignant des concentrations maximales de l’ordre de 8x107 particules.ml-1 en surface. La Figure

12 permet également de repérer les deux jours de prélèvements pour les expériences in situ. Le

premier prélèvement est caractérisé par des abondances relativement faibles des 4 communautés

microbiennes (2x103, 3x103, 3x106, 3x107 cell.ml-1 pour les picocyanobactéries, eucaryotes,

bactéries hétérotrophes et virus respectivement) alors que le second est marqué par de plus fortes

concentrations en picocyanobactéries (12 à 14x103 cell.ml-1), eucaryotes (12 à 14x103 cell. ml-1) et

virus (6 à 7x107 part.ml-1) et par des concentrations moyennes pour les bactéries hétérotrophes

(4x106 cell.ml-1).

1.2. Tests méthodologiques

1.2.1. Comparaison des données acquises en cytométrie et en microscopie à

épifluorescence

En plus de l’analyse par cytométrie en flux, des comptages ont été réalisés par microscopie à

épifluorescence sur 8 des 11 prélèvements. La comparaison de ces données est présentée en Figure

13. Si l’on s’intéresse aux picocyanobactéries, la pente de la droite de régression entre les données

de cytométrie et d’épifluorescence est de 0,37 avec un coefficient de corrélation de 0,89. Cette

corrélation étant statistiquement significative au seuil de 5% selon la distribution de Bravais -

Pearson (rα/2 = 0,42), nous pouvons en déduire que les comptages en microscopie à épifluorescence

14

(EFM) et en cytométrie (CFM) vont dans le même sens. La cytométrie étant beaucoup plus fiable

(comptage direct et total très précis dans le cas des picocyanobactéries), il est possible de conclure

que la EFM entraîne une sous estimation des abondances en picocyanobactéries d’environ 63%.

Pour les bactéries hétérotrophes, la pente de la droite de régression est de 0,28 avec un coefficient

de corrélation de 0,69. Cette corrélation étant statistiquement significative au seuil 5% (rα/2 = 0,30),

nous pouvons en déduire que les comptages en microscopie à épifluorescence et en cytométrie sont

également comparables. La EFM entraînerait donc une sous estimation des abondances en bactéries

hétérotrophes d’environ 72% par rapport aux données obtenues en cytométrie, résultat cohérent

avec le précédent et les résultats obtenus par Personnic (2003). Enfin, la même comparaison pour

les particules virales montre un coefficient de corrélation de 0,16 qui est statistiquement non

significatif au seuil 5% (rα/2 = 0,30). Les comptages en microscopie des particules virales sont assez

constants quelle que soit la date et la profondeur, avec des concentrations de l’ordre de 2x107

particules.ml-1 alors que les comptages en cytométrie varient entre 1x107 et 9x107 particules.ml-1.

Ces quelques constatations nous laissent penser que les comptages en cytométrie sont

beaucoup plus fiables.

1.2.2. Tests de conservation des échantillons

Afin de tester les effets d’un mode de conservation simple des échantillons pour une analyse

différée dans le temps, les communautés ont été dénombrées le jour de l’échantillonnage (J) et deux

jours après conservation à 4°C (J+2). Les résultats sont présentés en Figure 14. Pour chacune des

trois communautés considérées, la régression est statistiquement significative au regard des

coefficients de corrélations obtenus, tous supérieurs à la valeur critique définie par la table de

Bravais - Pearson (rα/2 = 0,38 ; α = 5%). La pente de la droite de régression entre les valeurs

obtenues à J et à J+2 est de 1,16 pour les picocyanobactéries, de 1,12 pour les bactéries

hétérotrophes et de 0,36 pour les virus. Afin de déterminer si la différence observée entre les

dénombrements à J et à J+2 est significative, un test T de Wilcoxon a été appliqué sur les 31

échantillons. Les résultats indiquent que la différence entre les comptages à J et J+2 est non

significative au seuil 5% pour les picocyanobactéries et les bactéries hétérotrophes (p-valeur =

0,6851 et 0,1028 respectivement) alors qu’elle est significative pour les virus (p-valeur = 0,0115).

La conservation des virus 2 jours à 4°C se traduit donc par une perte importante des

communautés virales et ne semble pas constituer un moyen de préservation adéquate.

15

2. Les expériences in situ

2.1. La première expérience

2.1.1. La dilution

Les résultats qui suivent concernent l’eau du lac initialement prélevée et filtrée à travers 11

μm ne contenant donc que virus, bactéries et flagellés. Dans un premier temps, nous avons vérifié

que la gamme de dilution à l’eau ultra pure entraînait bien un gradient de concentration en virus. La

Figure 15 illustre en effet que la fraction non diluée contient environ 4 fois plus de virus que la

fraction à 20%. Dans un second temps nous avons suivi les variations d’abondances des trois

communautés étudiées dans cette première expérience (Figure 16). Les picocyanobactéries

montrent une augmentation de leurs concentrations cellulaires jusqu’au 7ème jour pour la fraction

non diluée et les fractions diluées à 40 et 70%. Le taux de croissance net sur cette période varie

entre 0,24 j-1 pour la fraction la plus diluée (20% d’<11) et 0,20 j-1 pour la fraction d’eau totale. Au-

delà, on observe une chute brutale des concentrations en picocyanobactéries, à l’exception de la

fraction diluée à 20% (Fig 16A). Les bactéries hétérotrophes présentent une augmentation de leurs

concentrations cellulaires jusqu’au 4ème jour dans la fraction totale et jusqu’au 5ème jour pour les

fractions diluées. Le taux de croissance net sur cette période varie entre 0,58 j-1 pour la fraction la

plus diluée (20% d’<11) et 0,32 j-1 pour la fraction totale. Au-delà de ces 5 jours, les bactéries

hétérotrophes présentent une rapide diminution de leurs concentrations cellulaires. Les virus

présentent une légère augmentation de leurs concentrations jusqu’au 5ème jour puis montrent une

brutale augmentation entre le 5ème et le 6ème jour pour les fractions totale et diluées à 70 et 20%.

Seule la fraction diluée à 40% ne présente pas ce pic mais montre une légère croissance continue

sur l’ensemble de la durée de l’expérience.

Le suivi des communautés virales en cytométrie en flux a révélé l’apparition d’une

population que l’on nommera par la suite VLP3 (« Virus-Like-Particules 3 »). Ses caractéristiques

de fluorescence et de taille ont permis de la discriminer des autres populations (Annexe II). Les

courbes de croissance de cette population sont présentées sur la Figure 17. La population VLP3

émerge entre le 4ème et le 6ème jour de l’expérience passant d’environ 3x104 part.ml-1 à 3x106

part.ml-1, puis sa concentration reste quasi-constante jusqu’à la fin du suivi (au 9ème jour).

Dans un troisième temps, nous avons suivi les variations du taux de mortalité imputable aux

virus et aux prédateurs. Ces résultats sont présentés en Figure 18. Les taux de mortalité imputables

aux virus et aux brouteurs flagellés ont été déterminés selon la méthode d’Evans et al. (2003). La

corrélation obtenue pour les picocyanobactéries (r = 0,76 ; rα/2 = 0,27) et pour les bactéries

hétérotrophes (r = 0,99 ; rα/2 = 0,31) est significative au seuil de 5%. Nous obtenons un taux de

mortalité moyen journalier imputable aux virus et aux flagellés de 4,2%.j-1 chez les

16

picocyanobactéries sur 7 jours (entre T0 et J7) contre 30,9%.j-1 chez les bactéries

hétérotrophes sur 5 jours (entre T0 et J5).

2.1.2. L’enrichissement

Le facteur d’enrichissement obtenu n’a été que de 1,6 dans la fraction <11 et de 1,8 dans la

fraction <2, au lieu de la valeur x5 théoriquement escomptée. Les courbes de croissance des

communautés microbiennes étudiées sont présentées en Figure 19. En ce qui concerne la fraction

<11, les picocyanobactéries et les bactéries présentent des dynamiques comparables à celles

obtenues dans le cadre de l’expérience de dilution. Les bactéries hétérotrophes présentent

néanmoins une baisse de leurs concentrations cellulaire le 6ème jour au lieu du 4ème ou 5ème jour en

dilution. Les concentrations cellulaires des picocyanobactéries dans les fractions enrichies en virus

sont inférieures à celles des témoins et les concentrations cellulaires de la fraction <2 sont

inférieures à celles de la fraction <11. Le taux de croissance net journalier des picocyanobactéries

dans le traitement <11+FV est de 0,17 j-1 contre 0,23 j-1 dans le témoin (<11-FV). Ce même taux de

croissance dans le traitement <2+FV est de 0,16 j-1 contre 0,18 j-1 dans le témoin (<2-FV). Les

concentrations cellulaires des bactéries hétérotrophes présentent des résultats opposés à ceux

observés chez les picocyanobactéries. En effet, leurs concentrations cellulaires dans les fractions

enrichies en virus sont supérieures aux témoins et les concentrations cellulaires de la fraction <2

sont supérieures à celles de la fraction <11. Le taux de croissance net journalier des bactéries

hétérotrophes dans le traitement <11+FV est de 0,28 j-1 contre 0,27 j-1 dans le témoin (<11-FV). Ce

même taux de croissance dans le traitement <2+FV est de 0,39 j-1 contre 0,36 j-1 dans le témoin (<2-

FV).

Des corrélations entre les concentrations cellulaires des picocyanobactéries, des bactéries

hétérotrophes et des virus dans la fraction enrichie en virus (+FV) en fonction de celles du témoin

uniquement enrichi en MO (-FV) ont été réalisées pour l’<11 et l'<2 et sont présentées en Annexe

III. Pour les picocyanobactéries et les bactéries hétérotrophes, bien que les corrélations soient

significatives au regard des coefficients de corrélation supérieurs au rα/2 de 0,71 au seuil 5%, le test

U de Mann et Whitney révèle qu’il n’y a pas de différence significative entre les échantillons (α =

5%). En revanche, ce même test appliqué au virus dénombrés dans les enceintes d’enrichissement

montre qu’ils sont significativement en nombre supérieur à ceux dénombrés dans les témoins.

2.2. La seconde expérience

Le but de la seconde expérience, outre le fait de se placer à un autre moment de l’année et

d’observer possiblement un impact différent, a été d’améliorer et affiner la qualité des

résultats précédents. Pour l’expérience de dilution, la fraction <11 a été diluée avec de l’eau ultra

pure et de l’eau filtrée sur <0,2 μm pour tenter de dissocier l’effet des virus de celui des

17

protozoaires. Nous avons aussi travaillé avec des triplicats. Pour l’expérience d’enrichissement,

nous avons décidé de ne travailler que sur la fraction <2 afin d’essayer d’améliorer le facteur de

concentration. Malheureusement, aucun résultat probant n’a été obtenu, faute attribuable à la

méthodologie employée. Nous n’en parlerons donc pas et ne développerons dans la suite que les

résultats de l’expérience de dilution.

Sur la Figure 20 sont représentés les gradients de concentration en virus suite à la dilution

de l’échantillon avec l’eau ultra pure (Fig 20 A) et l’eau filtrée sur 0,2 μm (Fig 20 B). La figure A

montre que qu’il y a 5 fois plus de virus dans la fraction totale que dans celle diluée 5 fois, comme

escompté. La figure B montre qu’il y a 0,7 fois plus de virus dans la fraction totale que dans celle

diluée 5 fois. Ce gradient de concentration virale, n’est pas significatif, comme escompté.

Dans le cadre de cette seconde expérience, le suivi des eucaryotes a été aussi pris en

considération, notamment en raison de l’émergence des VLP3 obtenus au cours de la 1ère

expérience.

Avec la dilution à l’eau ultra pure (Figure 21), les picocyanobactéries présentent une

augmentation de leurs concentrations cellulaires jusqu’au 5ème jour pour les fractions <11 totale et

diluées à 40 et 70% et jusqu’au 6ème jour pour la fraction 20%. Le taux de croissance net sur cette

période varie entre 0,35 j-1 pour la fraction diluée à 20% et 0,46 j-1 pour la fraction totale. Les

eucaryotes montrent des concentrations cellulaires croissantes dans le temps, quelque soit la

dilution. Les concentrations des fractions 0,2 à 0,7 doublent en sept jours. Les virus quant à eux

présentent des concentrations quasi constantes tout au long de l’expérience. Les bactéries présentent

des dynamiques différentes. En effet, jusqu’au 4ème jour les concentrations cellulaires croissent pour

toutes les dilutions puis diminuent. Le taux de croissance net sur cette période varie entre 0,64 j-1

pour la fraction diluée à 20% et 0,24 j-1 pour la fraction totale. De plus, moins la fraction est diluée

et plus les concentrations sont élevées alors qu’à partir du 4ème jour cette tendance s’inverse.

Avec la dilution avec de l’eau filtrée sur 0,2 μm (Figure 22), les picocyanobactéries

présentent une augmentation de leurs concentrations cellulaires jusqu’au 5ème jour pour les fractions

<11 totale et diluée à 70% et jusqu’au 6ème jour pour les fractions 20 et 40%. Le taux de croissance

net entre les 6 premiers jours varie entre 0,27 j-1 pour la fraction diluée à 20% et 0,30 j-1 pour la

fraction totale. Les eucaryotes présentent une augmentation de leurs concentrations cellulaires sur la

durée de l’expérience. Les concentrations enregistrées dans les fractions totale et 40% doublent

alors que la concentration dans la fraction 20% triple en sept jours. Les virus montrent des

concentrations qui augmentent sur la durée de l’expérience (on note une différence de l’ordre de 107

particules/ml entre le T0 et le 7ème jour). Les bactéries des traitements 70 et 100% présentent une

augmentation de leurs concentrations cellulaires entre le début et le premier jour de l’expérience 2

puis une quasi constance jusqu’au 4ème jour avant de diminuer fortement jusqu’à la fin du suivi (les

18

concentrations du 4ème jour sont divisées par 2 environ). Les bactéries des fractions 0,4 et 0,2

présentent une faible augmentation de leurs concentrations cellulaires jusqu’au 6ème jour avant de

diminuer ; le 2ème jour faisant exception puisque les concentration sont plus faibles qu’au 1er et 3ème

jour. Le taux de croissance net entre les 5 premiers jours varient entre 0,51 j-1 pour la fraction diluée

à 20% et 0,22 j-1 pour la fraction totale.

Les résultats concernant les calculs des taux de mortalité des bactéries (entre T0 et J4) et

picocyanobactéries (entre T0 et J5) sont présentés en Figure 23. Les corrélations entre les taux de

croissance nets journaliers et les facteurs de dilution obtenues pour les picocyanobactéries (r =

0,93 et r = 0,64 ; rα/2 = 0,27) et pour les bactéries hétérotrophes (r = 0,77 et r = 0,89 ; rα/2 = 0,27)

sont significatives au seuil de 5%. Les résultats obtenus pour les picocyanobactéries ne permettent

pas de calculer de taux de mortalité. En effet, les pentes des droites de régression sont positives.

Nous obtenons néanmoins un taux de mortalité moyen journalier imputable aux virus et aux

flagellés de 41,5 %.j-1 et un taux de mortalité imputable aux flagellés de 32 %.j-1 chez les

bactéries hétérotrophes sur 6 jours (T0 à J6). Nous en déduisons un taux de mortalité

imputable aux virus de 9,5 %.

Tout comme dans la première expérience in situ, nous avons détecté la présence de la

population virale nommée VLP3. Cette population est présente en concentrations non négligeables

(>1.106 part.ml-1 dans la fraction 100% d’<11) dès le début de l’expérience 2, contrairement à ce

que l’on avait pu constater lors de la première expérience (~104 part.ml-1). Les concentrations de ces

particules virales sont multipliées par 2,2 entre le 5ème et dernier jour de la manip, passant de

7,5x105 à 1,8x106 part.ml-1 dans la fraction d’eau totale. Ces concentrations passent même de 1x105

à 1,1x106 part. ml-1 dans la fraction 20% d’<11. Bien que cette population soit présente dès le début

de la seconde expérience, ses concentrations n’atteignent pas celles observées dans la première

(Cmax = 1,9.106 part.ml-1 contre 3.106 dans la 1ère manip). Les corrélations entre les concentrations

des VLP3 et des autres communautés étudiées (picocyanobactéries et bactéries hétérotrophes)

n’avaient rien révélé de significatif dans le cadre de la 1ère expérience de dilution. La signature de

cette population semblant se rapprocher de ce qui a déjà était décrit comme étant celle d’un virus à

eucaryote (voir discussion), nous avons décidé d’étudier la population eucaryotique dans le cadre de

la seconde expérience. Les résultats des corrélations linéaires obtenues entre les abondances des

VLP3 et des eucaryotes sont présentés en Figure 24. Les corrélations obtenues dans le cas de la

dilution à l’eau ultra pure (Fig 24 A) et dans le cas de la dilution à l’<0,2 (Fig 24 B), sont

significatives au seuil 5% (rα/2 = 0,38) ; les pentes sont respectivement de 54 et 50. On compte donc

environ 54 VLP3 par eucaryote dans l’expérience de dilution à l’eau ultra pure et 50 VLP3 par

eucaryote dans l’expérience de dilution à l’<0,2.

19

DISCUSSION

1. Le suivi de la dynamique des communautés microbiennes

Aucune donnée concernant la dynamique des communautés microbiennes du lac Léman n’a

été publiée à ce jour. Seules celles acquises par Personnic dans le cadre de son DEA (2003)

permettent d’avoir un point de comparaison. La succession des communautés enregistrée entre

février et mai 2004 est comparable à celle de 2003. En effet, après l’augmentation des abondances

des picoeucaryotes, les bactéries puis les picocyanobactéries voient leur biomasse augmenter avant

celle des virus.

Les picocyanobactéries présentent les variations classiquement observées en milieu lacustre

sur la période d’étude comprise entre février et mai (Weisse, 1993 ; Callieri et Stockner, 2002 ;

Bettarel et al., 2003). En effet, après la période hivernale caractérisée par des concentrations

relativement faibles, on observe une prolifération printanière classique entre 0 et 20 mètres,

favorisée par l’augmentation des températures, l’accroissement de la luminosité et la présence de

nutriments dans les eaux de surface.

La communauté bactérienne présente également une expansion du nombre de cellules au

printemps typiquement observée en milieu lacustre comme en milieu marin (Li, 1998 ; Bettarel et

al., 2003). On aurait pu s’attendre à observer l’accroissement de biomasse bactérienne après celle

des picocyanobactéries puisque la théorie suppose que les bactéries profitent du développement

phytoplanctonique pour récupérer la matière organique libérée par les cellules autotrophes. On peut

donc supposer que dans le lac Léman, les bactéries hétérotrophes tirent avantage d’un autre apport

en matière organique. Cet apport est probablement lié aux petits eucaryotes puisqu’ils présentent

deux pics de concentration dont un antérieur à celui des bactéries.

La communauté virale révèle également une nette augmentation de ses concentrations au

printemps. Les abondances virales augmentent nettement suite à la prolifération des bactéries

hétérotrophes. En théorie, les virus présentent une augmentation de leurs concentrations cellulaires

suite à l’augmentation des abondances de leurs hôtes. L’augmentation précoce des virus en avril par

rapport à celle des bactéries a déjà été mesurée par Wommack et al. (1992) dans la baie de

Chesapeake en milieu marin et avait également été observé en octobre. Il serait donc intéressant de

poursuivre le suivi de la dynamique des communautés microbiennes du lac Léman durant la période

automnale, d’autant que cette augmentation attendue a en effet été observée sur le lac du Bourget,

voisin (Personnic et al., non publié).

Le rapport entre les abondances virales et bactériennes (VBR) a également été analysé car ce

paramètre peut être utile pour la construction de théories concernant les effets de l’infection virale

sur les communautés d’hôtes bactériens. Toutefois, Wommack et Colwell (2000) soulignent qu’il

20

est important de considérer que ce rapport peut être influencé par une multitude de facteurs

contrôlant la production et la perte de virus et de bactéries et qu’il faut l’interpréter avec précaution.

D’après ces mêmes auteurs, les valeurs de VBR sont faibles pour les environnements peu productifs

car pauvres en nutriments. Aussi, après avoir consulté les valeurs de suivi des nutriments dans le

cadre de la CIPEL (données non montrées), il apparaît que la concentration des nutriments est la

plus faible lors de la période des blooms de virus, de picocyanobactéries et de bactéries

hétérotrophes. Nos résultats indiquent que la période correspondant aux plus faibles concentrations

en sels nutritifs coïncide avec les plus faibles valeurs de VBR obtenues.

2. Les tests méthodologiques

La comparaison de méthodes effectuée entre les données de cytométrie et de microscopie à

épifluorescence semble montrer que la seconde sous estime de manière importante les résultats liés

au comptage. En effet, on sous estime à plus de 60% les abondances en picocyanobactéries et en

bactéries hétérotrophes. La technique de comptage des bactéries et virus en cytométrie ayant fait ses

preuves (Marie et al., 1999 ; Brussard et al, 2000 ; Brussaard et al., 2004), on peut penser que ce

biais est imputable à la microscopie et plus précisément à la préparation de l’échantillon et son

observation. En effet, la microscopie repose sur des comptages effectués par l’homme et non par la

machine. On estime les abondances bactériennes et virales sur des échantillons filtrés. Ces étapes de

filtration peuvent entraîner une perte de cellules par passage au travers de la maille filtrante mais

aussi par rupture des cellules suite aux pressions mécaniques. Les échantillons sont également

traités au SYBR Gold qui est un colorant de l’ADN dont l’intensité de fluorescence diminue avec le

temps d’observation (Chen et al., 2001). Il est donc certain qu’une partie des particules n’est pas

comptée. De plus l’ensemble des cellules et particules présentes sur le filtre n’est pas totalement

énuméré puisque seulement 5 champs sont observés et les abondances cellulaires et particulaires

sont extrapolées à l’ensemble du filtre. Le biais majeur concerne les comptages de virus. En effet,

aucune corrélation n’a pu être établie entre les données fournies par les deux méthodes. Il

semblerait qu’en microscopie les comptages, bien que fournissant des nombres de l’ordre de

grandeur de ceux obtenus en cytométrie (~ 107), ne permettent pas d’observer les variations en

fonction de la profondeur et du temps détectées comme en cytométrie. Enfin, le protocole suivi pour

la coloration des particules virales dans le cadre des comptages en épifluorescence ne comporte pas

d’étape de chauffage des échantillons à 75°C comme dans le protocole de cytométrie. Or, on peut

penser, comme le suggèrent Marie et al. (1999), que les virus des échantillons frais pourraient avoir

une structure rendant les acides nucléiques non immédiatement accessibles au colorant. Ainsi, la

chaleur dénaturerait la capside virale, permettant au colorant une meilleur pénétration. Ceci pourrait

21

expliquer pourquoi seule une partie des virus a été comptée en microscopie à épifluorescence alors

que la cytométrie a fournie des résultats plus proches de la réalité. Cette hypothèse sera bientôt

vérifiée à partir de la comparaison entre différentes méthodes de comptage incluant la microscopie

électronique à transmission.

Le test de conservation des échantillons a révélé qu’il était possible d’analyser les

picocyanobactéries et bactéries hétérotrophes après 2 jours de conservation à 4°C sans risquer de

biaiser les résultats et sans avoir à fixer les échantillons. Ce résultat est intéressant étant donné la

surcharge d’analyses à faire en laboratoire à certaines périodes et compte tenu des pertes que

peuvent engendrer la fixation. Jacquet et al. (1998) avaient déjà montré que 10h de conservation à

4°C n’avaient pas d’influence sur les paramètres observés en cytométrie pour les souches

Prochlorococcus (MED4) et Synechococcus (WH 8103). Sur 48h, les cellules ont eu le temps de se

diviser mais il semble donc que les basses températures inhibent la division cellulaire si bien que les

concentrations restent les mêmes. Par contre, il ne semble pas possible de différer l’analyse à deux

jours pour les virus dont la perte est très importante. Dans l’avenir, il sera intéressant de tester ce

mode de préservation sur les communautés eucaryotiques, réputées sensibles, mais également

d’utiliser différents fixateurs et modes de conservation pour des préservations plus longues (4°C, -

22°C, -80°C, azote liquide).

3. Les expériences in situ

3.1. Impact des virus vs. protistes flagellés

Dans leur article sur les estimations de la contribution de la lyse virale et du broutage par le

microzooplancton sur la mortalité de populations du picoeucaryote Micromonas sp., Evans et al.

(2003) concluent qu’il est nécessaire de mener de nouvelles expériences sur de nouvelles

communautés. C’est ce à quoi répond une partie de ce travail de DEA. Lors de l’expérience réalisée

en avril, le taux de mortalité imputable conjointement aux virus et aux flagellés a été de 4,2% pour

les picocyanobactéries. Ce résultat est en accord avec ceux trouvés dans la littérature. Bien que

nous ne fassions pas la part entre la mortalité imputable aux virus et aux flagellés, il semble que

généralement l’impact des virus sur les cyanobactéries du genre Synechococcus est relativement

faible (<10%, Suttle, 2000). L’impact des flagellés peut aussi être faible, les picocyanobactéries

étant plutôt la proie de prédateurs plus grands comme les ciliés ou le métazooplancton (Weisse et

al., 1993). Nous n’avons pas obtenu de résultast chez les picocyanobactéries pour la même

expérience réalisée en mai. Cette lacune semble indiquer que la méthode n’est pas bien adaptée à

l’étude des communautés picocyaobactériennes, comme déjà souligné par de Jacquet et al.

(soumis).

22

Le taux de mortalité imputable aux virus et aux flagellés sur les communautés bactériennes a

été de 30,8% en avril contre 41,5 % en mai. Il semblerait donc que la mortalité des bactéries

augmente avec l’accroissement des températures printanières. Il est admis que la température peut

être un important facteur dans le contrôle des abondances virales et qu’elle contrôle les taux de

croissance bactériens et a un effet positif significatif sur la production bactérienne (White et al.,

1991 ; Jiang et Paul, 1994). Ainsi, on peut supposer que l’augmentation des abondances

bactériennes en mai ait favorisée la probabilité de contact entre les virus et leurs hôtes bactériens,

conduisant in fine à l’augmentation des taux de mortalité enregistrés en mai. De plus, les

populations bactériennes ont présenté un « bloom » quelques jours avant la seconde expérience in

situ, offrant donc très certainement une plus grande diversité bactérienne à des virus qui avaient

moins d’hôtes potentiels en avril. Ces hypothèses seront confirmées ou infirmées grâce aux données

de DGGE qui seront obtenues cet été. La part de mortalité imputable aux virus n’a pu être calculée

que pour les bactéries hétérotrophes de la seconde expérience (9,5%). Ces résultats sont en accord

avec ceux trouvés dans la littérature. D’après Wommack et Colwell (2000), la gravité de la lyse

virale in situ peut être différente selon le groupe planctonique considéré. Nos résultats sont en

accord avec ceux trouvé par Suttle (1994) qui conclue qu’entre 10 et 20% des populations de

bactéries hétérotrophes sont perdues par jour à cause de l’infection virale alors qu’un nombre

considérablement plus faible de cyanobactéries (<3% j-1) sont tuées par lyse virale. La part de

mortalité imputable aux flagellés calculée pour la seconde expérience (32%) est également en

accord avec les données fournies dans la littérature. En effet, celle-ci peut varier ente 0,1 et 71,5%

(Annexe V).

La succession des pics de bactéries hétérotrophes et des virus observée dans le cadre du

suivi de la dynamique des populations microbiennes du lac Léman supporte l’idée que les

bactériophages provoquent la lyse et par conséquent les changements des abondances bactériennes.

Les expériences de dilution confirment cette hypothèse. En effet, en considérant que la majorité des

virus comptés en cytométrie sont des bactériophages, on observe des VBR compris entre 2 et 10

dans la première expérience de dilution à l’eau ultra pure et compris entre 0,02 et 0,3 dans la

seconde. D’après la littérature, ces ratios sont généralement compris entre 3 et 10 mais peuvent être

plus élevés pour les environnements riches en nutriments (Wommack et Colwell, 2000 ; Annexe

IV). On considère que des valeurs de VBR <10 sont révélatrices de faibles niveaux de mortalité

bactérienne imputable aux virus, alors que des valeurs >10 sont caractéristiques des conditions

favorables à la lyse virale (Wilcox et Fuhrman, 1994). Par conséquent, dans le cadre de nos

expériences, les valeurs des ratios indiquent que les virus contribuent à une faible part de la

mortalité des bactéries du lac Léman aux périodes étudiées.

23

Il semble que la part de mortalité imputable aux virus soit liée au statut trophique du lac. En

effet, en Annexe IV sont synthétisées les données concernant les abondances virales ainsi que les

données relatives à l’impact viral sur la mortalité bactérienne dans différents lacs se distinguant par

leur statut trophique. Il apparaît clairement que plus le lac est eutrophisé et plus le VIBM, c'est-à-

dire la part de mortalité bactérienne imputable aux virus, est élevée. De la même façon sont

synthétisés en Annexe V les données concernant l’impact des brouteurs sur la mortalité bactérienne

de différents lacs différant par leur statut trophique. La part de mortalité bactérienne imputable aux

brouteurs ne semble pas liée au statut trophique. En effet, les valeurs mesurées pour un lac varient

fortement (6-71,5% de perte due au broutage dans le lac d’Annecy).

A défaut d’intervenir de manière importante ou visible dans la mortalité du bactérioplancton,

il est possible que les virus aient plus un rôle dans le contrôle de la biodiversité. C’est en partie ce

que nous voulions vérifier au travers des expériences d’enrichissement, travail qui sera poursuivi au

cours de l’été. Les expériences d’enrichissement ont révélé que bien que les facteurs

d’enrichissement obtenus soient plus faibles que ceux escomptés, il y a significativement plus de

virus dans les bouteilles enrichies que dans les témoins mais cette augmentation ne provoque pas de

variation significative des quantités de picocyanobactéries et de bactéries par rapport aux témoins.

Alors que l’on observe une augmentation des abondances bactériennes avant une chute sur les deux

derniers jours de l’expérience, les concentrations virales présentent une faible augmentation de leurs

concentrations. On aurait du s’attendre à une forte augmentation des concentrations virales suite à la

chute de celles des bactéries. En effet, après avoir infecté son hôte, le virus se multiplie et est libéré

en grande quantité dans le milieu. Dans les enceintes d’enrichissement, les bactéries et/ou le

phytoplancton pourraient être responsable de la production d’enzymes qui dégradent les protéines

virales et les acides nucléiques. Il a été montré que le picoplancton est capable d’excréter une

substance muqueuse qui les protège indirectement de l’infection virale (Murray, 1995) et il est

également possible que l’enrichissement viral déclenche la production bactérienne d’exoenzymes

nécessaire au métabolisme de dégradation des composants viraux. Enfin, il est également possible

qu’une large part des virus ajoutés dans les enceintes d’enrichissement n’aient pas trouvé d’hôte à

leur convenance. On peut supposer que le nombre de cellules hôtes dans les enceintes d’incubation

soit en assez grand nombre pour éliminer une partie des virus. Le but des expériences

d’enrichissement qui seront reconduites sera donc d’améliorer le facteur d’enrichissement

suffisamment pour pouvoir calculer des taux de mortalité. Avec des résultats significatifs, nous

pourrions alors comparer les deux méthodes et faire le choix de celle la mieux adaptée à ce type

d’étude.

Il est relativement difficile de comparer nos résultats avec la littérature puisque seules 3

études ont utilisé la même approche de dilution sur les communautés naturelles (Evans et al., 2003 ;

24

Wilehlm et al., 2002 ; Jacquet et al., soumis). De plus, aucune étude n’a suivi la mortalité des

picocyanobactéries en plus de celle des bactéries hétérotrophes ou n’a utilisé les 2 méthodes en

parallèle.

La population virale nommée VLP3 détectée lors des 2 expériences in situ est présente en

faible abondance pendant les 5 premiers jours de la première alors qu’elle apparaît en forte

abondance dès le début de la seconde. L’émergence de ces virus entre le 4ème et 5ème jour de la

première expérience mène à supposer que ces virus ont infectés leurs hôtes entre le 1ère et 5ème jour.

Cette population virale a la même signature que celle observée dans des études concernant

l’infection virale chez des eucaryotes phytoplanctoniques. Jacquet et al. (2002) révèlent, sur la base

de la signature cytofluorimétrique, la présence d’une population virale qui infecte l’eucaryote

photosynthétique Emiliana huxleyi. De la même façon, Brussard et al., (1999), décrivent les

caractéristiques de la signature cytofluorimétrique d’une population virale qui infecte le

Prymnesiophyceae Phaeocystis pouchetii. Les données des corrélations obtenues entre les VLP3 et

les petits eucaryotes photosynthétiques semblent indiquer que cette population virale infecte les

populations eucaryotiques avec 50 VLP3 pour 1 eucaryote. Il est donc fort probable que ces VLP3

soient des virus à eucaryote. L’émergence de ce virus n’était pas spécialement attendu au moment

de l’élaboration de ce projet, si bien que nous n’avons pas concentré nos recherches au-delà (voir

les perspectives).

3.2. Avantages et limites des méthodes, perspectives

L’inconvénient majeur rencontré dans les expériences in situ a été l’expérience

d’enrichissement. En effet, le facteur d’enrichissement escompté pour les deux expériences n’a pas

été atteint. Ce problème est la conséquence d’un manque de matériel spécifique à l’étape d’ultra

concentration. Etant muni d’une seule pompe péristaltique, cette étape nous demandait environ 3

heures pour 5 litres d’eau du lac préfiltrée sur 0,2 μm. Les volumes importants que nous avions à

ultra filtrer ne nous permettaient pas d’augmenter les quantités. Le facteur temps n’a pas été le seul

problème puisque d’après nos calculs, nous aurions du obtenir le concentrât nécessaire. La seconde

limite est la cassette d’ultra filtration, dans un futur proche, il est prévu d’acquérir du matériel plus

performant mais aussi d’utiliser un autre protocole de concentration virale : l’ultra centrifugation.

Bien que la technique de dilution semble présenter moins de biais de filtration que

l’enrichissement puisqu’il n’y a pas d’étape d’ultra concentration, cette technique repose également

sur des étapes de filtration en série. Aussi, on sait bien que ces différentes étapes ne sont pas

dépourvues de biais : à chaque niveau, des organismes que l’on pense éliminer, peuvent passer au

travers de la maille filtrante. Aussi, des échantillons de chaque étape de dilution ont été conservés et

25

comptés en cytométrie en flux ou fixés dans le but de vérifier l’absence ou la présence des protistes

(en cours).

La difficulté majeure de ce travail est de raisonner sur des communautés. En effet, les

travaux précurseurs se sont intéressés à des populations précises et non à des assemblages. La

complexité de ces associations microbiennes ainsi que l’hétérogénéité spatiale de leurs distributions

font que les résultats sont à considérer avec une extrême précaution. Nous ne sommes donc qu’aux

prémices de ce type d’étude qui demande à être reconduite plusieurs fois à différents moments de

l’année pour valider les résultats.

Sur l’ensemble des traitements mis en place dans le cadre des deux expériences de dilution

et d’enrichissement, soit 78 échantillons, nous avons pratiqué des expérience de biologie

moléculaire afin d’étudier les variations de diversité bactérienne. Nous avions choisi de pratiquer la

technique de DGGE, maîtrisée en routine au Laboratoire de Microbiologie Aquatique de Thonon.

Malheureusement, aucun résultat n’a été obtenu à ce jour. En effet, il semble que la quantité d’ADN

par échantillon ait été trop faible pour pouvoir obtenir une amplification par PCR. Différents tests

ont donc été mis en place afin d’amplifier l’ADN contenu dans nos échantillons mais pour l’instant

sans résultat. Nous avons donc pour objectif de poursuivre ces tests afin de pouvoir amplifier

suffisamment l’ADN bactérien et réaliser les expériences de DGGE.

Les études supplémentaires imaginables dans le cadre des expériences in situ pourraient être

d’effectuer un suivi de l’activité bactérienne par la méthode d’incorporation de la thymidine tritiée

et de l’infectivité virale par observation en microscopie électronique à transmission (envisageable

dans le cadre de la collaboration existant avec le Laboratoire de Biologie des Protistes de Clermont-

Ferrand). En effet, ces données donnent déjà des résultats très intéressants dans le cadre

d’expériences similaires à cette étude. Il semble qu’en milieu lacustre la fréquence des bactéries

visiblement infectées (FVIC) soit supérieur dans les environnements moins productifs (Bettarel et

al., 2004) alors qu’en milieu marin les valeurs de FVIC augmentent avec la productivité (Steward,

1996 ; Weinbauer et al., 2003) ou il n’y a pas d’évidence de relation entre FVIC et productivité

(Noble et Fuhrman, 2000). Les sels nutritifs peuvent devenir limitants dans les enceintes

d’incubation. Il serait donc intéressant de faire un suivi des variations des concentrations en sels

nutritifs dans les différentes bouteilles au cours du temps mais cela suppose de travailler avec des

volumes importants, ce qui est très difficile avec ce type de schéma expérimental. Enfin, il serait

intéressant d’isoler, caractériser et travailler sur les implications écologiques de la population virale

nommée VLP3.

26

CONCLUSION

En plus de montrer une nouvelle fois l’efficacité de la cytométrie en flux pour suivre la

dynamique des populations microbiennes aquatiques, cette étude a révélé que les eaux de surface du

lac Léman subissent des variations importantes en terme d’abondances des populations

picophytoplanctoniques, bactériennes et virales. Après une période hivernale caractérisée par des

concentrations microbiennes relativement faibles, ces communautés présentent des « blooms »

printaniers successifs. Afin de mieux comprendre certains processus qui régissent la dynamique

microbienne, nous avons étudié le rôle fonctionnel des virus et des protistes flagellés en tant

qu’agents de mortalité bactérienne. Les premiers résultats montrent que les flagellés induisent la

plus grande part de la mortalité des bactéries hétérotrophes (>30%) bien que celle imputable aux

virus est loin d’être négligeable (9,5%). Cette étude nécessiterait d’être reconduite pour plusieurs

raisons. En supposant que les expériences d’enrichissement fournissent des résultats, une

comparaison entre celles-ci et la méthode de dilution pourra être effectuée, ce qui permettra de dire

laquelle est la plus appropriée et pourquoi. Nous pourrions envisager de compléter les analyses

effectuées sur les échantillons par des mesures de production bactérienne pour déterminer plus

précisément les effets de la lyse virale et du broutage sur les cycles de la matière au sein de la

boucle microbienne ou encore par des mesures de taux d’infection virale par microscopie

électronique à transmission. Enfin, bien que les expériences de DGGE n’ont pas encore fourni de

résultats, il est probable que nous obtiendrons des informations cruciales à la compréhension des

résultats déjà acquis. Les perspectives sont donc nombreuses et prometteuses.

27

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Ackermann, H.W., 2001. Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000. Archives of Virology 146, 843 – 857.

Ackermann, H.W., Dubow, M.S., 1987. Viruses of prokaryotes, vol I, general properties of bacteriophages. CRC Press, Boca Raton, pp. 13-47.

Azam, F.T., Fenchel, J.G., Field, J.S., Gray, L.A., Meyer, R., Thingstad, F., 1983. The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology - Progress Series 10, 257 – 263.

Bergh, Ø., Børsheim, K.Y., Bratbak, G., Heldal, M., 1989. High abundances of viruses found in aquatic environments. Nature 340, 467 – 468.

Bettarel Y., Sime-Ngando T., Amblard C., Carrias J.F., Portelli C., 2003. Virioplankton and microbial communities in aquatic systems : a seasonal study in two lakes of differing trophy. Freshwater Biology 48, 810 – 822.

Bettarel, Y., Sime-Ngando, T., Amblard, C., Dolan, J., 2004. Viral Activity in Two Contrasting Lake Ecosystems. Applied and Environmental Microbiology 70, 2941 – 2951.

Børsheim, G., Bratbak, G., Heldal, M., 1990. Enumeration and biomass estimation of planktonic bacteria and viruses by transmission electron microscopy. Applied and Environmental Microbiology 56, 352 – 356.

Bratbak, G., Heldal, M., Norland, S., Thingstad, T.F., 1990. Viruses as partners in spring bloom microbial trophodynamics. Applied and Environmental Microbiology 56, 1400 – 1405.

Brussaard, C.P.D., 2004. Optimization of procedures for counting viruses by flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology 70, 1506 – 1513.

Brussaard, C.P.D., Marie, D., Bratbak, G., 2000. Flow cytometric detection of viruses. Journal of Virology Methods 85, 175 – 182.Ackermann HW, 2001. Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000. Archives of Virology, 146 : 843 – 857.

Brussaard, C.P.D., Thyrhaug, R., Marie, D., Bratbak, R., 1999. Flow cytometric analyses of viral infection in two marine phytoplankton species, Micromonas pusilla (Prasinophyceae) and Phaeocystis pouchetii (Prymnesiophyceae). Journal of phycology 35, 941 – 948.

Callieri C., Stockner J.G., 2002. Freshwater autotrophic picoplankton : a review. Journal of Limnology 61, 1 – 14.

Chen, F., Lu, J., Binder, B.J., Liu, Y., Hodson, R.E., 2001. Application of Digital Image Analysis and Flow Cytometry To Enumerate Marine Viruses Stained with SYBR Gold. Applied and Environmental Microbiology 67, 539 – 545.

Chiura, H.X., 1997. Generalized gene transfer by virus-like particles from marine bacteria. Aquatic Microbial Ecology 13, 75-83.

Clokie, M.R.J., Millard, A.D., Wilson, W.H., Mann, N.H., 2003. Encapsidation of host DNA by bacteriophages infecting marine Synechococus strains. FEMS Microbiology Ecology 46, 349 – 352.

Cottrell, M.T., Suttle, C.A., 1995. Genetic diversity of algal viruses which lyse the photosynthetic picoflagellate Micromonas pusilla. Applied and Environmental Microbiology 61, 3088 – 3091.

Eissler, Y., Quinones, A.R., 2003. The effsct of viral concentrate addition on the respiration rate of Chaetoceros gracilis cultures and microplankton from a shallow bay (Coliumo, Chile). Journal of Plankton Research 25, 927-938.

Evans, C., Archer, S.D., Jacquet, S., Wilson, W.H., 2003. Direct estimates of the contribution of viral lysis and microzooplankton grazing to the decline of a Micromonas spp. population. Aquatic Microbial Ecology 30, 207 – 219.

Fisher, U.R., Velimirov, B., 2002. High control of bacterial production by viruses in a eutrophic oxbow lake. Aquatic Microbial Ecology 27, 1 – 12.

Fuhrman, J.A. and Suttle, C.A., 1993. Viruses in marine planktonic systems. Oceanography 6, 51 – 63.

28

Fuhrman, J.A., 1992. Bacterioplankton roles in cycling of organic matter : the microbial food web. In Primary productivity and biogeochemical cycles in the sea. Falkowski PG, Woodhead AD (eds) Plenum Press New York 361 – 383.

Fuhrman, J.A., 1999. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Nature 399, 541 – 548.

Fuhrman, J.A., Noble, R.T., 1995. Viruses and protists cause similar bacterial mortality in coastal seawater. Limnology and Oceanography 42, 1236 – 1242.

Furhman, J.A., 2001. Plankton viruses. Encyclopedia of life sciences. Nature Publishing group. London

Gobler, C.J., Hutchins, D.A., Fisher, N.S., Cosper, E.M., Sanudo-Wilhelmy S.A.,, 1997. Release and bioavailability of C, N, P, Se and Fe following viral lysis of a marine chrysophyte. Limnology and Oceanography 42, 1492 – 1504.

Hansen, J., Sato, M., Ruedy, R., Lacis, A., Oinas V., 2000. Global warming in the twenty-first century: An alternative scenario. Proceedings of the National Academy of Sciences 97, 9875 – 9880.

Hansen, J.E., Sato, M., Lacis, A., Ruedy, R., Tegen, I., Matthews, E., 1998. Climate forcings in the Industrial era. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 12753 – 12758.

Heldal, M., Bratbak, G., 1991. Production and decay of viruses in aquatic environments. Marine Ecology Progress Series 72:205-212.

Hennes, K.P., Simon, M., 1995. Significance of bacteriophages for controlling bacterioplankton growth in a mesotrophic lake. Applied and Environmental Microbiology 61, 333 - 340.

Heuer, H., Smalla, K., 1997. Application of denaturing gradient gel electrophoresis and temperature gradient gel electrophoresis for studying soil microbial communities, p. 353-373. In: J. D. van Elsas, J. T. Trevors, and E. M. H. Wellington (ed.), Modern soil microbiology. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.

Hewson, I.J., O’Neil, J.M., Heil, C.A., Bratbak, G., Dennison, W.C., 2001. Effects of concentrated viral communities on photosynthesis and community composition of co-occuring benthic microalgae and phytoplankton. Aquatic Microbial Ecology 25, 1 – 10.

Jacquet, S, Lennon, J.F., Vaulot, D., 1998. Application of a compact automatic sea water sampler to high frequency picoplankton studies. Aquatic Microbial Ecology 14 : 309 – 314.

Jacquet, S., Domaison, I., Personnic, S., Duhamel, S., Pradeep Ram, A.S., Heldal, M., Sine-Ngando T., 2004. Temporal variations in the viral lysis vs. protozoan predation of bacteria of Lake Bourget, France. (soumis)

Jacquet, S., Heldal, M., Iglesias-Rodriguez, D., Larsen, A., Wilson, W., Bratbak, G., 2002. Flow cytometric analysis of an Emiliana huxleyi bloom terminated by viral infection. Aquatic Microbial Ecology 27, 111 – 124.

Jiang, S.C., Paul, J.H., 1994. Seasonal and diel abundance of viruses and occurrence of lysogeny/bacteriocinogeny in the marine environnement. Marine Ecology Progress Series 104, 163 – 172.

Jiang, S.C., Paul, J.H., 1998. Gene transfert by transduction in the marine environnement. Applied and Environmental Microbiology 64, 2780 - 2787.

Klut, M.E., Stockner, J.G., 1990. Virus-like particles in an ultraoligotrophic lake on Vancouver Island, British Columbia. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 47, 725 – 730.

Landry, M.R., Hasset, R.P., 1982. Estimating the grazing impact of marine microzooplankton. Marine Biology 67, 283 – 288.

Landry, M.R., Kirshtein, J., Constantinou, J., 1995. A refined dilution technique for measuring the community grazing impact of microzooplankton, with experimental tests in the central equatorial Pacific. Marine Ecology - Progress Series 120, 53 – 63.

Li, W.K.W., 1998. Annual average abundance of heterotrophic bacteria and Synechococcus in surface ocean waters. Limnology and Oceanography 43, 1746 – 1753.

29

Maranger, R., Bird, D.F., Juniper, S.K., 1994. Viral and bacterial dynamics in Arctic sea ice during the spring algal bloom, near Resolute, NWT, Canada. Marine Ecology - Progress Series 111, 121 – 127.

Marie D., Vaulot D., Partensky F., 1996. Application of the novel nucleic acid dyes YOYO-1, YO-PRO-1, and PicoGreen for flow cytometric analysis of marine prokaryotes. Applied and Environmental Microbiology 62, 1649 – 1655.

Marie, D., Brussaard, C.P.D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D., 1999. Enumeration of Marine Viruses in Culture and Natural Samples by Flow Cytometry. Applied and Environmental Microbiology 65, 45 – 52.

Mathias, C.B., Kirschner, A.K.T., Velimirov, B., 1995. Seasonal variations of virus abundance and viral control of the bacterial production in a backwater system of the Danube river. Applied and Environmental Microbiology 61, 3734 – 3740.

Middelboe, M., Hagström, A., Blackburn, N., Sinn, B., Fischer, U., Borch, N., Pinhassi, J., Simu, K., Lorenz, M.G., 2001. Effects of bacteriophages on the population dynamics of four strains of pelagic marine bacteria. Microbial Ecology 42, 395 – 406.

Murphy, F.A., Fauquet, C.M., Bishop, H.L., Ghabrial, A.W., Jarvis, A.W., Martelli, G.P., Mayo, M.A., Summers, M.D. (ed.), 1995. Virus taxonomy : classification and nomenclature of viruses. Springer, Vienna, Austria.

Muyzer G., de Waal E.C., Uitterlinden A.G., 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, 59, 695 – 700.

Muyzer, G., De Waal, E.C., Uitterlinden, A.G., 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analyses of polymerase chain reaction-amplified genes for 16S rRNA. Applied and Environnemental Microbiology 59, 695 – 700.

Noble, R.T., 2001. Enumeration of viruses. In : Methods in microbiology, vol. 30, Academic Press, pp 43 – 51.

Noble, R.T., Fuhrman, J.A., 1998. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquatic Microbial Ecology 14 : 113 – 118.

Noble, R.T., Fuhrman, J.A., 2000. Rapid virus production and removal as mesured with fluorecently labeled viruses as tracers. Applied and Environmental Microbiology 66, 3790 – 3797.

Noble, R.T., Middelboe, T.M., Fuhrman, J.A., 1999. Effects of viral enrichment on the mortality and growth of heterotrophic bacterioplankton. Aquatic Microbial Ecology 18, 1 – 13.

Pace, M.L., 1988. Bacterial mortality and the fate of bacterial production. Hydrobiologia 9, 41 – 49. Padan, E., Shilo, M., 1973. Cyanophages viruses attacking blue-green algae. Microbiology Revue

37, 343 – 370. Paul JH, Rose JB, Jiang SC, Kellogg CA, Dickson L, 1993. Distribution of viral abundance in the

reef environment of Key Largo, Florida. Applied and Environmental Microbiology 59, 718 – 724.

Paul, J.H., Jiang, S.C., Rose, J.B., 1991. Concentration of viruses and dissolved DNA from aquatic environments by vortex flow filtration. Applied and Environmental Microbiology, 57 : 2197 – 2204.

Paul, J.H., Sullivan, M.B., Segall, A.M., Rohwer, F., 2002. Marine phage genomics. Comparative Biochemistry and Physiology Part B 133, 463 – 476.

Peng, T.H., Wanninkhof, R., Feely, R.A., 2003. Increase of anthropogenic CO2 in the Pacific Ocean over the last two decades. Deep Sea Research Part II : Topical Studies in Oceanography 50, 3065 – 3082.

Personnic, S., 2003. Importance quantitative et approche du rôle fonctionnel des virus en milieu lacustre (Lacs Léman, d’Annecy et du Bourget). Stage de DEA Océanologie Biologique effectué à la station d’Hydrobiologie Lacustre INRA-Thonon, 31 p.

Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A., 2003. Les virus : introduction et caractères généraux. In : Microbiologie, De Boeck & Larcier s.a. (ed), pp 361 – 380.

30

Proctor, L.M., Fuhrman, J.A., 1990. Viral mortality of marine bacteria and cyanobacteria. Nature 343, 60 – 62.

Proctor, L.M., Fuhrman, J.A., 1992. Mortality of marine bacteria in response to enrichments of the virus size fraction from seawater. Marine Ecology - Progress Series 87, 283 – 293.

Rapport CIPEL. Commission Internationale pour la Protection des Eaux du Léman, 2002, 150 p. Schauer M., Balagué V., Pedros-Alio C., Massana R., 2003. Seasonal changes in the taxonomic

composition of bacterioplankton in a coastal oligotrophic system. Aquatic Microbial Ecology 31, 163 – 174.

Schwalbach, M.S., Hewson, I., Fuhrman, J.A., 2004. Viral effects on bacterial community composition in marine plankton microcosms. Aquatic Microbial Ecology 34, 117 – 127.

Sime-Ngando, T., Bettarel, Y., Chartogne, C., Sean, K., 2003. The imprint of wild viruses on freshwater microbial ecology. Recent Research Development in Microbiology 7, 481 – 497.

Steward, G.F., Smith, D.C., Azam, F., 1996. Abundance and production of bacteria and viruses in the Chukchi Seas. Marine Ecology Progress Series 131, 287 – 300.

Suttle, C.A., 1994. The significance of viruses to mortality in aquatic microbial communities. Microbial Ecology 28, 237 – 243.

Suttle, C.A., 2000. Cyanophages and their role in the ecology of cyanobacteria. In: the Ecology of cyanobacteria, BA Whitton & M Potts (ed), pp 563 – 589.

Suttle, C.A., Chan, A.M., Cottrell, M.T., 1990. Infection of phytoplankton by viruses and reduction of primary productivity. Nature 347, 467 – 469.

Tarutani, K.K., Nagasaki, Yamaguchi, M., 2000. Viral impacts on total abundance and clonal composition of the harmful bloom-forming phytoplankton Heterosigma akashiwo. Applied and Environmental Microbiology 66, 4916 – 4920.

Thingstad, T.F., Lignell, R., 1997. Theoretical models for the control of bacterial growth rate, abundance, diversity and carbon demand. Aquatic Microbial Ecology 13, 19 – 27.

Thyrhaug, R., Larsen, A., Thingstad, T.F., Bratbak, G., 2003. Stable coexistence in marine algal host-virus systems. Marine Ecology Progress Series 254, 27 – 35.

Tilman, D., Lehman, C., 2001. Human-caused environmental change: Impacts on plant diversity and evolution. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 5433 – 5440.

Tomaru Y., Tarutani K., Yamaguchi M., Nagasaki K., 2004. Quantitative and qualitative impacts of viral infection on a Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae) bloom in Hiroshima Bay, Japan. Aquatic Microbial Ecology, 34, 227 – 238.

Torella, F., Morita, R., 1979. Evidence by electron micrographs for a incidence of bacteriophage particles in the waters of Yaquina Bay. Applied and Environmental Microbiology 37, 774 – 778.

Vaulot, D., 1989. CytoPC : processing software for flow cytometric data. Signal Noise 2:8. Vrede, K., Stensdotter, U., Lindström1, E.S., 2003. Viral and Bacterioplankton Dynamics in Two

Lakes with Different Humic Contents. Microbial Ecology 46, 406 – 415. Waterbury, J.B., Watson, S.W., Guillard, R.R.L., Brand, L.E., 1979. Widespread occurence of a

unicellular marine planktonic cyanobacterium. Nature 277, 293 – 294. Weinbauer M. G., 2004. Ecology of prokaryotic viruses. Fems Microbiology Reviews, 28, review

article, 127 – 260. Weinbauer, M.G., Chrisaki, U., Nedoma, J., Simek, K., 2003. Comparing the effects of resource

enrichment and grazing on viral production in a meso-eutrophic reservoir. Aquatic Microbial Ecology 31, 137 – 144.

Weinbauer, M.G., Höfle, M.G., 1998. Significance of Viral Lysis and Flagellate Grazing as Factors Controlling Bacterioplankton Production in a Eutrophic Lake. Applied and Environmental Microbiology 64, 431 – 438.

Weinbaueur, M.G., Rassoulzadegan, F., 2004. Are viruses driving microbial diversification and diversity ? Environtal Microbioly 6, 1 – 11.

31

Weisse, T., 1993. Dynamics of autotrophic picoplankton in marine and freshwater ecosystems. Advances in Microbial Ecology 13, 327 – 370.

Wetzel, Likens, 2000. Limnological analyses, 3rd edition, Springer verlag, NY, 429 p, pp 156 – 157. White, P.A., Kalff, J., Rasmussen, J.B., Gasol, J.M., 1991. The effect of temperature and algal

biomass on bacterial production and specific growth rate in freshwater and marine habitats. Microbial Ecology 21, 99 – 118.

Wilcox, R.M., Fuhrman, J.A., 1994. Bacterial viruses in coastal seawater : lytic rather than lysogenic production. Marine Ecology Progress Series 114, 35 – 45.

Wilhelm, S.W., Suttle, C.A., 1999. Viruses and nutrient cycles in the sea. Biosciences 49, 781 – 788.

Wilhelm, S.W;, Brigden, S.M., Suttle, C.A., 2002. A dilution technique for the direct measurement of viral production : a comparison in startified and tidally mixed coastal waters. Microbial Ecology 43, 168 – 173.

Wommack, K.E., Colwell, R.R., 2000. Virioplankton : viruses in aquatic ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews 64, 69 – 114.

Wommack, K.E., Hill, R.T, Martin, K., Russek-Cohen, E., Colwell R.R., 1992. Distribution of viruses in the Chesapeake Bay. Applied and Environmental Microbiology 58, 2965 – 2970.

32

ANNEXE I

Tableau des valeurs fournies par l’OCDE (Organisation for Economic Co-operation and Development) pour évaluer le niveau trophique d’un lac. D’après le rapport de l’O.C.D.E., 1982. Eutrophisation des Eaux. Méthodes de Surveillance, d´Évaluation et de Lutte. OCDE, Paris.

Catégorie trophique Ptot (μg.l-1) Chl a (μg.l-1)

Moyenne

Chl a (μg.l-1)

Maximum

Secchi (m)

Moyenne

Secchi (m)

Minimum

Ultra-oligotrophie ≤ 4 ≤ 1 ≤ 2,5 ≥ 12 ≥ 6

Oligotrophie ≤ 10 ≤ 2,5 ≤ 8 ≥ 6 ≥ 3

Mésotrophie 10 - 35 2,5 - 8 8 - 25 6 - 3 3 - 1,5

Eutrophie 35 - 100 8 - 25 25 - 75 3 – 1,5 1,5 – 0,7

Hypereutrophie ≥ 100 ≥ 25 ≥ 75 ≤ 1,5 ≤ 0,7

ANNEXE II

Exemples de cytogrammes obtenus lors de la première expérience terrain entre le jour 1 (J1) et le jour 9 (J9) : en bleu la population de virus VLP1, en rose la population de virus VLP2 et en rouge la population de virus VLP3. FSC et SSC correspondent à des critères de taille, FL1 et FL3 correspondent à des critères de fluorescence.

J1 J9

ANNEXE III

Relations entre les concentrations cellulaires de chaque communauté pour l’échantillon enrichi (+FV) en virus et l’échantillon non enrichi (-FV) constituant le témoin.

Picocyanobactéries pour l'<11

y = 1,2886x - 1315,3R2 = 0,9889

0,0E+00

8,0E+03

1,6E+04

2,4E+04

0,0E+00 8,0E+03 1,6E+04 2,4E+04

Enrichi

Tém

oin

y = 0,8538x + 337623R2 = 0,9928

0,0E+00

5,0E+06

1,0E+07

1,5E+07

0,0E+00 8,0E+06 1,6E+07

Enrichi

Tém

oin

Bactéries hétérotrophes pour l'<11

Virus pour l'<11

y = 0,6367x + 1E+06R2 = 0,9537

2,0E+07

6,0E+07

1,0E+08

2,0E+07 6,0E+07 1,0E+08

Enrichi

Tém

oin

Picocyanobactéries pour l'<2

y = 1,2693x - 1254,9R2 = 0,9625

0,0E+00

8,0E+03

1,6E+04

2,4E+04

0,0E+00 8,0E+03 1,6E+04

EnrichiTé

moi

n

y = 0,8781x + 195249R2 = 0,9906

0,0E+00

5,0E+06

1,0E+07

1,5E+07

0,0E+00 8,0E+06 1,6E+07

Enrichi

Tém

oin

Bactéries hétérotrophes pour l'<2

Virus pour l'<2

y = 0,8112x - 9E+06R2 = 0,533

3,00E+06

4,30E+07

8,30E+07

3,0E+06 4,3E+07 8,3E+07

Enrichi

Tém

oin

A D

EB

C F

ANNEXE IV

Abondances virales, VBR (Ratio Virus:Bacterie), BS (Burst Size ou nombre de particules virales libérées par lyse de cellules hôtes), FVIC (Fraction of Visibly Infected Cells), FIC (Fraction of Infected Cells) and VIBM (Virus-Induced Bacterial Mortality) dans quelques lacs européens. O: Oligotrophique, M: Mesotrophique and E: Eutrophique. nd: non déterminé.

Lac et localisation Statut trophique

Abondance (x 106 Part.mL-

1)

VBR BS FVIC ou FIC (%)

VIBM (%)

Référence

Gossenköllesee, Autriche

O <0.02 - <5 1-10

0.1-11 4-31

4-45 0.9-2.3

5-28 Höfer & Sommaruga (2001) Pina et al. (1998)

Rédo, Pyrenées centrales

O 3-30 9-43 Pina et al. (1998)

Constance, Allemagne

M 10-40 21-121 0-1.8 1-17

0.11-18.4 Hennes & Simon (1995)

Plussee, Allemagne

E 0.3->200 19-35 19-87 0.5-3.4 7.7-97.3 Bergh et al. (1989) Demuth et al. (1993) Weinbauer & Hoffle (1998)

Kalandsvannet, Norvège

50 2-16 2-24 h-1 Heldal & Bratbak (1991)

Pavin, France O-M 10-54 4-13 13-54 0.5-3.1 2-74 Bettarel et al. (2003, 2004)

Aydat, France E 25-99 4-14 16-60 0.4-2.8 1-38 Bettarel et al. (2003, 2004)

Reservoire Sep, France

O-M 8-130 2-12 8-140 0.5-3.7 5-60 Pradeep Ram et al. (unpublished)

Alte Donau, Autriche

E 17-117 4-39 2.3-9 55-63 Fisher & Velmirov (2002)

Reservoire Rimov, Republique Tchèque

M-E 8-47 13-69

4-40

19-40

1.7-4 1.1 -5.2

15-37 d-1

18-66 d-1Simek et al. (2001) Weinbauer et al. (2003)

Gäddtjärn Fisklösen (Norvège)

O O

22-23.5 29-31

3-12 5-24

6-18 6-21

9-41 (23) 10-43 (25)

Vrede et al. (2003)

Bourget, France M 47-100 5-27 11-49 1.2-1.9 8-14.5

9.3-19.2 Jacquet et al. (soumis)

ANNEXE V

Taux d’ingestion, impact du broutage per capita des flagéllés hétérotrophiques et mixotrophiques et broutage par les flagéllés induisant des pertes bactériennes dans des lacs différant par leur statut trophique. O: Oligotrophique, M: Mesotrophique et E: Eutrophique.

Taux d’ingestion Bacterie Ind-1 h-1

(large variation selon le taxon)

Taux de broutage Per capita Bacterie L-1 h-1

% de perte due au broutage BSS : Bacterial Standing Stock BP : Bacterial Production

Methodea

Site

Statut trophique

Référence

Flagellés Heterotrophiques

1 - 45

Max : 36x106

BSS % : 14.7 - 19.2

FMS

Lac du Bourget France M

Jacquet et al. (soumis)

1.8 – 72.3 Max : 30.7x106

BP % : 0.5 – 115 FMS

Lac Pavin France O-M Bettarel et al. (2003)

0 – 15.6 Max : 6.1x106

BSS % : 0.2 - 11.7 BP % : 0.1 – 62.3 FMS

Lac d’AnnecyFrance O

Domaizon et al. (2003)

0 – 31

BP % : 0.5 – 48.3 FMS Lac Constance Allemagne M-E

Cleven & Weisse (2001)

21-53

BSS % : 8 – 28 (bacterivores <20µm)

FLB

Réservoire Rimov République Tchèque

E

Simek & Kojeka (1999) Simek et al. (1997)

0 – 3.3

Max : 1.5x106

FMS

Réservoire Sep France O-M

Thouvenot et al. (1999)

2.2 – 26.5

BP % : 0.3 - 20 FLB Alte Dauno Autriche E

Wieltschnig et al. (1999)

BP % : 2.9 – 108 Plussee Allemagne E

Weinbauer & Höfle (1998)

10 - 37

FLB Lac Erie USA M

Hwang & Heath (1997)

1.6 – 92.4 Max : 18.9x106

FMS

Lac Pavin France O-M Carrias et al. (1996)

2 - 53

BSS % : Max : 20% BP % : Max : 77%

FMS

Lac Oglethorpe USA E Sanders et al. (1989)

Flagellés Mixotrophiques

3.7 - 86

Max : 63x106

BSS % : 3.5 – 46.7

FMS

Lac du Bourget France M

Jacquet et al. (this study)

0 – 54.8 Max : 68x106

BSS % : 6 – 71.5 FMS

Lac Annecy France O

Domaizon et al. (2003)

0 - 38.3

FLB

Bassin artificiel England E

Hitchmann & Jones (2000)

0 – 137.6

Max : 2.6x106

FMS

Reservoire Sep France O-M

Thouvenot et al. (1999)

1.3 - 87 Max : 4.5x106

FMS

Lac Pavin France O-M Carrias et al. (1996)

2 - 53

FMS

Lac Oglethorpe USA E Sanders et al. (1989)

a : FLB : Fluorescent Labelled Bacteria – FMS : Fluorescent Micro-Spheres

_______________UMR 42_____________

CARRTEL

Centre Alpin de Recherche sur lesRéseaux Trophiques des Ecosystèmes Limniques

Task Group on Aquatic Microbial Food Webs

__________________________________ Station d’Hydrobiologie Lacustre de Thonon

Solange DUHAMEL

Résumé de mémoire de D.E.A. Océanologie Biologique et Environnement Marin Option Connaissance des Producteurs Primaires

Université Pierre et Marie Curie, Paris 6 Stage effectué sous la responsabilité scientifique de :

Stéphan Jacquet (CR2) 2003-2004

Etude quantitative et fonctionnelle des bactériophages du lac Léman :

Comparaison de méthodes pour estimer la mortalité bactérienne due à la lyse virale et au broutage par les protozoaires flagellés

L’énumération et le rôle écologique des virus en milieu lacustre ont été très peu étudiés si bien que

les informations manquent pour comprendre la dynamique et la diversité des peuplements microbiens à la

base des réseaux trophiques pélagiques. Cette constatation est particulièrement vraie pour le lac Léman

pour lequel aucune donnée n’existait à ce jour. Le but de ce travail a donc été d’étudier la succession des

peuplements microbiens du lac Léman au travers des techniques de cytométrie en flux et de microscopie à

épifluorescence et de tenter d’apprécier la mortalité des bactéries par l’action virale. La comparaison des

méthodes a révélé l’efficacité de la cytométrie en flux pour le comptage des microorganismes et a montré

que la microscopie sous-estimait de façon significative les concentrations des bactéries auto- et

hétérotrophes et des virus. Le suivi de la distribution des populations microbiennes du lac Léman a révélé

une succession marquée des communautés entre février et mai 2004 ainsi que l’apparition de pics

d’abondance printaniers, à commencer par les picoeucaryotes puis les bactéries hétérotrophes, suivi par

les picocyanobactéries et enfin les virus. Des expériences in situ ont été élaborées pour tenter

d’appréhender l’impact de la lyse virale sur la mortalité et la diversité de la communauté bactérienne

comparativement à l’impact de la prédation par les protistes flagellés. Les premiers résultats indiquent

que les flagellés et les virus seraient responsables de seulement 4% de la mortalité des picocyanobactéries

mais de 31 à 42% de celle des bactéries hétérotrophes. En mai, les virus expliqueraient 10% de la

mortalité des bactéries contre 32% pour les flagellés. Nos essais d’estimation de la diversité bactérienne

n’ont rien donné à ce jour mais ils seront renouvelés prochainement.

Mots clefs : virus, enrichissement, dilution, cytométrie en flux, lac.

1955

1ère description des particules virales

planctoniques (Spencer)

1983

Concept de la boucle microbienne (Azam

et al.)

1973

1ère synthèse sur les

cyanophages

(Padan & Shilo)

1979

1ère estimation d’abondances

virales planctoniques (104 particules

.ml-1) (Torrela & Morita)

1989

Preuve que l’abondance en virus dépasse généralement

106 particules.ml-1 (Bergh et al.)

1990

Mise en évidence du contrôle des blooms alguaux par les virus

(Bratback et al.)

1991

Méthode de production

virale lytique (Bratback et

al.)

1993

1ère revue sur les virus dans le système planctonique marin

(Fuhrman & Suttle)

1995

50% de la mortalité bactérienne est imputable

aux virus (Fuhrman & Noble)

1999

Adaptation de la cytométrie à

l’étude des virus (Marie et al.)

1ère revue sur l’écologie des virus aquatiques

(Fuhrman)

1998

Mise en place d’un protocole pour l’étude des virus en épifluorescence

(Noble & Fuhrman)

1999

1ère revue sur le contrôle des virus dans les cycles de la matière (Wilhelm et Suttle)

2003

Etude de l’impact des virus par

méthode de dilution (Evans et al.)

Preuve de l’encapsidation de l’ADN

hôte par les bactériophages de

Synechococcus (Clockie et al.)

2004

1ère revue sur l’écologie des phages (Weinbauer

et al.)

1ère revue sur l’analyse en cytométrie des virus

aquatiques (Brussaard et al.)

Figure 1 : Chronologie des évènem

ents majeurs ayant m

arqué l’histoire de l’écologie virale en m

ilieu aquatique

Figure 2 : Exemple d’utilisation de modèles de flux de carbone pour illustrer le cycle du carbone passant par la boucle microbienne (cas du Golfe du Saint-Laurent). Source : http://www.osl.gc.ca/fr/ecosystemes/flux-carbone/accueil.html.

Figure 3 : Les virus et la boucle microbienne : schéma du réseau microbien mettant en évidence du rôle potentiel de l’infection et de la lyse virale dans la production de matière organique dissoute et particulaire dans les écosystèmes aquatiques.

Figure 4 : Schéma du « court-circuit » viral dans la chaîne alimentaire marine. Le pourcentage de production de carbone issu de la lyse virale sur les bactéries hétérotrophes varie entre 8% et 42% au large et entre 6,8% et 25% à la côte. D’après Wilhelm et Suttle (1999).

Virioplancton

Bactéries hétérotrophes,

picophytoplancton picocyanobactéries

Brouteurs

Nutriments minéraux

Phytoplancton : Microalques,

cyanobactéries

Photosynthèse

Broutage

Lyse virale et

production de virus

Exudats phyto-planctoniques

Excrétion

Matière Organique Dissoute et Particulaire

Lyse virale et

production de virus

Respiration

Broutage

Respiration

Production bactérienne

Lyse virale et

production de virus

Macrozooplancton

Bactéries hétérotrophes

Microzooplancton

Phytoplancton

Matière Organique Dissoute

Virus

Virus

Virus

Virus

Figure 5 : Schéma résumant les effets potentiels que peuvent avoir les virus sur la diversité des procayotes. D’après Weinbauer et Rassoulzadegan (2004).

Lyse : « Killing the winner » : les virus gardent le contrôle sur les dominants compétitifs, ce qui

permet la co-existence des espèces procaryotiques

Lyse : « Lysis product release » : les virus libèrent une source de

matière organique par lyse cellulaire, qui est utilisée

différemment par les espèces procaryotiques et apportent des enzymes affectant les espèces

de différentes façons

Diversité des procaryotes

Lysogénie : « Phage conversion » : développement de l’immunité contre

des phages homologues chez les procayotes, transfert de traits

morphologiques et métaboliques

Transduction : transfert de traits morphologiques et métaboliques

des hôtes

Gènes viraux et activité virale augmentent la diversité procaryotique. Cette diversité est une source de sélection et une source de fonctions écologiques

Tableau 1 : Principales caractéristiques du lac Léman. D’après le rapport CIPEL 2002.

Superficie du plan d'eau 582 km2 Superficie pour la Suisse 348 km2 (60%) Superficie pour la France 234 km2 (40%)

Périmètre du lac 167 km Altitude moyenne 372 m

Profondeur maximum 309 m Volume total d'eau 89.109 m3 Largeur maximum 13,8 km

Longueur dans l'axe 72,3 km Temps moyen de renouvellement

des eaux12 ans

Figure 6 : a) Situation géographique du lac Léman en Europe occidentale. b) Schéma du lac Léman précisant la localisation des stations de prélèvement SHL1 et SHL2 (point de référence du suivi de la qualité des eaux).

A

B

Nord

Est

Sud

Ouest

Figure 7 : Exemples de cytogrammes obtenus le 14 avril 2004 sur un échantillon du lac Léman prélevé à 2,5 m de profondeur. A : les picocyanobactéries sont entourées en rose, les billes en bleu ; B : les bactéries hétérotrophes sont entourées en rose, les billes en bleu ; C : les virus nommés VLP1 sont en rose sur les graphiques alors que les virus nommés VLP2 sont en rouge. Les populations sont identifiées selon 5 critères : FSC et SSC correspondent à des critères de taille, FL1, FL2et FL 3 correspondent à des critères de fluorescence (verts, oranges et rouges).

A B

C

Figure 8 : Exemples de photographies obtenues en microscopie à épifluorescence. A : les picocyanobactéries, B : les bactéries hétérotrophes, C : les virus.

A

B

C

Picocyanobactérie

Bactéries

Virus

0 20 40 60 80 100

Dilution sans brouteurs Dilution sans brouteurs ni virus

Fraction d'eau filtrée sur 11µm (D) (%)

Taux

de

croi

ssan

ce n

et (k

)

Figure 9 : Droites de régression théoriques obtenues lors des dilutions de l’eau du lac filtrée sur 11 µm par de l’eau filtrée contenant uniquement des virus (eau filtrée sur 0,2 µm) ou ne contenant pas de virus (eau filtrée sur 10 000 Da). Les taux de croissance des bactéries hétérotrophes et/ou photosynthétiques les plus élevés sont attendus pour les échantillons les plus dilués à cause du retrait d’une des causes de mortalité (broutage et/ou lyse virale). K = taux de croissance net des bactéries, µ = taux de croissance instantané des bactéries, mg = mortalité due aux brouteurs, mv = mortalité due à la lyse virale, D = fraction d'eau filtrée sur 11 µm. D’après Evans et al. (2003).

Figure 10 : Schéma du protocole expérimental de l’expérience de dilution. Dans la première gamme de dilution, l’eau du lac filtrée sur 11 µm est diluée avec de l’eau ultra-pure obtenue par ultrafiltration tangentielle. Dans la seconde gamme de dilution, l’eau du lac filtrée sur 11 µm est diluée avec de l’eau filtrée sur 0,2 µm. En théorie, l’eau filtrée sur 11 µm contient les virus, les bactéries et les prédateurs flagellés de l’échantillon naturel alors que l’eau filtrée sur 0,2 µm ne contient que les virus.

20% 40% 70% 100% 0% Contrôle

Eau du lac filtrée sur

11 µm

250 ml 50 ml 175 ml 100 ml

75 ml 150 ml 200 ml

250 ml

Eau du lac filtrée sur

0,2 µm

20% 40% 70% 100% 0% Contrôle

Eau du lac filtrée sur

11 µm

250 ml 50 ml 175 ml 100 ml

75 ml 150 ml 200 ml

250 ml

Eau du lac ultrafiltrée

Figure 11 : Schéma du protocole expérimental de l’expérience d’enrichissement. L’enrichissement en particules virales + matière organique (+FV) est effectué sur l’eau du lac filtrée sur 11 µm afin de conserver les prédateurs flagellés et sur l’eau du lac filtrée sur 2 µm afin de les éliminer. Pour chaque type d’enrichissement un contrôle (-FV) a été aussi mis en place.

Contrôle (-FV) Enrichissement (+FV)

Organismes de taille < 11 µm : Bactéries + Virus + Flagellés

Organismes de taille < 2 µm : Bactéries + Virus

Eau du lac filtrée sur

2 µm

Eau du lac filtrée sur

11 µm

Témoin (-FV) +FV

févr. mars avr. mai juin

10

20

30

40

50

1e+7 2e+7 3e+7 4e+7 5e+7 6e+7 7e+7 8e+7 Virus

févr. mars avr. mai juin

10

20

30

40

50

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 Eucaryotes

févr. mars avr. mai juin

Pro

fond

eur (

m) 10

20

30

40

50Picocyanobactéries

févr. mars avr. mai juin

10

20

30

40

50

1e+6 2e+6 3e+6 4e+6 5e+6 6e+6 Bactéries hétérotrophes

Pro

fond

eur (

m)

Pro

fond

eur (

m)

Pro

fond

eur (

m)

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

A

C

D

B

cell/ml

cell/ml

cell/ml

part/ml

Figure 12 : Suivi de la distribution des communautés microbiennes (picocyanobactéries dominées par Synechococcus spp., eucaryotes, bactéries hétérotrophes et virus) entre le 4 février et le 24 mai 2004. Les lignes blanches en pointillés symbolisent le jour du prélèvement pour les expériences in situ.

Picocyanobactéries (cell.ml-1)

y = 0,3667x + 191,48R2 = 0,8018

0,E+00

2,E+03

4,E+03

6,E+03

8,E+03

0,E+00 2,E+03 4,E+03 6,E+03 8,E+03CFM

EFM

Bactéries Hétérotrophes (cell.ml-1)

y = 0,2836x + 234877R2 = 0,4835

0,E+00

2,E+06

4,E+06

6,E+06

0,E+00 2,E+06 4,E+06 6,E+06CFM

EFM

Virus (part.ml-1)

y = 0,0254x + 2E+07R2 = 0,0246

0,E+00

2,E+07

4,E+07

6,E+07

8,E+07

1,E+08

0,E+00 2,E+07 4,E+07 6,E+07 8,E+07 1,E+08CFM

EFM

Figure 13 : Relations entre les données de cytométrie en flux (CFM) et d’épifluorescence (EFM) à partir des données obtenues dans le cadre du suivi temporel des populations picocyanobactériennes (A), bactériennes (B) et virales (C). La droite en pointillés symbolise la relation 1 :1.

A

B

C

Picocyanobactéries (cell.ml-1)

y = 1,1635x - 238,66R2 = 0,9227

0,E+00

2,E+03

4,E+03

6,E+03

8,E+03

1,E+04

1,E+04

0,E+00 5,E+03 1,E+04 2,E+04

J

J+2

Bactéries hétérotrophes (cell.ml-1)

y = 1,1195x + 125726R2 = 0,8946

0,E+00

2,E+06

4,E+06

6,E+06

0,E+00 2,E+06 4,E+06 6,E+06

J

J+2

Virus (part.ml-1)

y = 0,3574x + 1E+07R2 = 0,5144

0,E+00

2,E+07

4,E+07

6,E+07

8,E+07

1,E+08

0,E+00 2,E+07 4,E+07 6,E+07 8,E+07 1,E+08

J

J+2

Figure 14 : Relations entre les données de cytométrie mesurées le jour du prélèvement (J) et celles obtenues après conservation 2 jours à 4°C (J+2) pour les picocyanobactéries (A), les bactéries hétérotrophes (B) et les virus (C). La droite en pointillés symbolise la relation 1:1.

A

B

C

Figure 15 : Mise en évidence du gradient de concentration virale obtenu pour la première expérience de dilution à l’eau ultra pure de la fraction <11.

picocyanobactéries

0,E+00

1,E+04

2,E+04

0 100 200

Temps d'incubation (heure)

0,2 0,4 0,7 1

Con

c. (c

ell.m

l -1)

Bactéries Hétérotrophes

0,E+00

4,E+06

8,E+06

0 100 200

Temps d'incubation (heure)

0,2 0,4 0,7 1

Con

c. (c

ell.m

l -1)

Virus

0,E+00

4,E+07

8,E+07

0 100 200Temps d'incubation (heure)

0,2 0,4 0,7 1

Con

c. (c

ell.m

l -1)

Figure 16 : Courbes de croissance des picocyanobactéries (A), bactéries hétérotrophes (B) et des virus (C) dans la première expérience de dilution à l’eau ultra pure dans la fraction <11 (voire les matériels et méthodes pour plus de détails).

y = 4E+07x - 3E+06R2 = 0,9367

0,0E+00

1,5E+07

3,0E+07

4,5E+07

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0fraction d'eau <11 diluée

C

onc.

viru

s (p

art.m

l-1)

J7 J5 J4

J6C

A B

Figure 17 : Courbes de croissance de la population virale nommée VLP3 dans les différents traitements de la première expérience de dilution à l’eau ultra pure. Chaque courbe correspond à un traitement différent : 0,2 = 20% d’<11 ; 0,4 = 40% d’<11 ; 0,7 = 70% d’<11 ; 1,0 = 100% d’<11.

Picocyanobactéries

y = -0,0421x + 0,2541R2 = 0,5801

0,15

0,19

0,23

0,27

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0Fraction d'eau <11 diluée

Taux

de

croi

ssan

ce n

et

jour

nalie

r

Bactéries hétérotrophes

y = -0,3085x + 0,627R2 = 0,9847

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Fraction d'eau <11

Taux

de

croi

ssan

ce n

et

jour

nalie

r

Figure 18 : Régression linéaire entre les taux de croissance nets journaliers et le facteur de teneur en fraction <11 pour la première expérience de dilution à l’eau ultra pure. La pente en figure A correspond au taux de mortalité imputable aux virus et aux brouteurs des picocyanobactéries (entre T0 et J7), celle en figure B correspond au même taux de mortalité pour les bactéries hétérotrophes (entre T0 et J5).

0,E+00

2,E+06

4,E+06

0 50 100 150 200 250temps

0,2 0,4 0,7 1,0

VLP

3 (p

art.m

l-1)

J6

J4

J9

A

B

Picocyanobactéries

0,0E+00

6,0E+03

1,2E+04

1,8E+04

2,4E+04

0 50 100 150 200 250

Temps (heure)

<11 + FV <2 + FV <11 -FV <2 -FV

Con

c. (c

ell.m

l -1)

Bactéries hétérotrophes

0,0E+00

6,0E+06

1,2E+07

1,8E+07

0 50 100 150 200 250

Temps (heure)

<11 + FV <2 + FV <11 -FV <2 -FV

Con

c. (c

ell.m

l -1)

Virus

0,0E+00

6,0E+07

1,2E+08

0 50 100 150 200 250

Temps (heure)

<11 + FV <2 + FV <11 -FV <2 -FV

Con

c. (p

art.m

l-1)

Figure 19 : Courbes de croissance des picocyanobactéries (A), bactéries hétérotrophes (B) et des virus (C) dans la première expérience d’enrichissement : + FV = traitement enrichi en virus ; -FV = témoin enrichi en matière organique.

J7

J6 J5

A

B

C

y = 5E+07x + 5E+06R2 = 0,9998

0,E+00

2,E+07

4,E+07

6,E+07

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Con

c. (p

art.m

l -1)

Proportion d'eau <11µm diluée (%)

y = 7E+06x + 5E+07R2 = 0,1131

0,E+00

2,E+07

4,E+07

6,E+07

8,E+07

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Con

c. (p

art.m

l-1)

Proportion d'eau <11µm diluée (%)

Figure 20 : Seconde expérience in situ : A : concentration virale en fonction de la dilution à l’eau ultra pure dans la fraction <11 µm : mise en évidence d’un gradient de concentration virale à T0 ; B : concentration virale en fonction de la dilution à l’<0,2 µm: mise en évidence de l’absence du gradient de concentration virale à T0.

A

B

Picocyanobactéries

0,E+00

2,E+04

4,E+04

0 50 100 150 200

Temps (heure)0,2 0,4 0,7 1,0

Con

c.(c

ell.m

l-1)

Eucaryotes

0,E+00

2,E+04

4,E+04

0 50 100 150 200

Temps (heures)0,2 0,4 0,7 1,0

Con

c.(c

ell.m

l-1)

Bactéries hétérotrophes

0,E+00

4,E+06

8,E+06

0 50 100 150 200

Temps (Heure)0,2 0,4 0,7 1,0

Con

c.(c

ell.m

l-1)

Virus

0,E+00

4,E+07

8,E+07

0 50 100 150 200

Temps (heure)

0,2 0,4 0,7 1,0

Con

c.(p

art.m

l-1)

Figure 21 : Courbes de croissance des picocyanobactéries (A), eucaryotes photosynthétiques (B), bactéries hétérotrophes (C) et des virus (D) dans la deuxième expérience de dilution à l’eau ultra pure.

J5A

B

C

D

J4

Picocyanobactéries

0,E+00

2,E+04

4,E+04

0 50 100 150 200

Temps (heure)0,2 0,4 0,7 1,0

Con

c.(c

ell.m

l-1)

Eucaryotes

0,E+00

2,E+04

4,E+04

0 50 100 150 200

Temps (heures)0,2 0,4 0,7 1,0

Con

c.(c

ell.m

l-1)

Bactéries hétérotrophes

0,E+00

2,E+06

4,E+06

6,E+06

8,E+06

0 50 100 150 200

Temps (heure)

0,2 0,4 0,7 1,0

Con

c.(c

ell.m

l-1)

Virus

0,E+00

4,E+07

8,E+07

0 50 100 150 200Temps (heure)

0,2 0,4 0,7 1,0

Con

c.(p

art.m

l-1)

Figure 22 : Courbes de croissance des picocyanobactéries (A), eucaryotes photosynthétiques (B), bactéries hétérotrophes (C) et des virus (D) dans la deuxième expérience de dilution à l’<0,2 µm. 0 = 0% de la fraction <11 µm ; 1 = 100% de la fraction <11 µm.

J5 J6

A

B

C

D

J1

Picocyanobactéries

y = 0,1181x + 0,3465R2 = 0,8736

y = 0,0398x + 0,2788R2 = 0,4153

0

0,4

0,8

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

<0,02 <0,2Linéaire (<0,02) Linéaire (<0,2)

Fraction d'eau <11 diluée

Taux

de

croi

ssan

ce n

et jo

urna

lier

Bactéries hétérotrophes

y = -0,4147x + 0,6022R2 = 0,5974

y = -0,3194x + 0,5129R2 = 0,7946

0

0,4

0,8

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

<0,02 <0,2Linéaire (<0,02) Linéaire (<0,2)

Taux

de

croi

ssan

ce n

et jo

urna

lier

Fraction d'eau <11 diluée

Figure 23 : Régression linéaire entre les taux de croissance nets journaliers et le facteur de teneur en fraction <11 pour la deuxième expérience de dilution à l’eau ultra pure (en bleu) et à l’<0,2 (en rose). En figure A, la pente de la droite correspondant à la dilution à l’eau ultra pure (<0,02) fournit le taux de mortalité imputable aux virus et aux brouteurs sur les picocyanobactéries (entre T0 et J5) alors que celle correspondant à la dilution à l’<0,2 fournie le taux de mortalité imputable aux brouteurs. Les pentes en figure B correspondent aux même taux de mortalité sur les bactéries hétérotrophes (entre T0 et J4).

Dilution à l'eau ultra pure

y = 53,905x - 54292R2 = 0,6027

0,E+00

1,E+06

2,E+06

3,E+06

0,E+00 1,E+04 2,E+04 3,E+04 4,E+04

Eucaryotes (cell/ml)

VLP

3 (p

art.m

l-1)

Dilution à l'<0,2

y = 50,421x - 82807R2 = 0,8045

0,E+00

1,E+06

2,E+06

3,E+06

0,E+00 1,E+04 2,E+04 3,E+04 4,E+04

Eucaryotes (cell/ml)

VLP

3 (p

art.m

l-1)

Figure 24 : Régressions linéaires entre les abondances en eucaryotes et en VLP3 lors de la deuxième dilution à l’eau ultra pure (A) et à l’<0,2 (B).

A

B

A B