ETUDE DE LA REPONSE IMMUNE DIRIGEE CONTRE Yersinia …

Maître ès Sciences

Membres de Jury :

Président : - Pr RANDRIANARIVO Ranjàna

Rapporteurs : - Pr RALAMBORANTO Laurence

- Dr ANDRIANAIVOARIMANANA Voahangy Michèle

Examinateurs : - Dr RAMAROSON Roseline

- Dr RAVAOARISOA Elisabeth

Mémoire de fin d’étude pour l’obtention du Diplôme de Master 2

Domaine : Sciences et Technologies

Mention : BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

Parcours : Biochimie Biodiversité et Santé

ETUDE DE LA REPONSE IMMUNE DIRIGEE CONTRE Yersinia

pestis: MISE AU POINT DES TECHNIQUES DE TEST DE

PROLIFERATION LYMPHOCYTAIRE ET

D’IMMUNOPHENOTYPAGE

Présenté le 16 Mars 2018

par

LANTONIAINA IHARISOA Alice

ii

DEDICACE

Je dédie ce mémoire :

A ma petite fille chérie Anjara, à mes chers parents, à tous mes frères et sœurs.

Merci pour votre amour, votre soutien et votre sacrifice.

i

ii

REMERCIEMENTS

Ce présent mémoire a été réalisé grâce à la collaboration et participation de

nombreuses personnes. Sans chacune d’entre elles, je n’ai jamais pu le réaliser.

Ainsi, je voudrais adresser mes sincères remerciements :

- Au Docteur Voahangy ANDRIANAIVOARIMANANA d’être toujours présente

pour me guider, me conseiller et m’encourager tout au long de ce travail.

- Au Professeur RALAMBORANTO Laurence: vous m’avez apporté beaucoup

de conseils précieux et vous avez sacré votre temps pour bien finaliser ce travail.

- Au Professeur RANDRIANARIVO Ranjàna : vous m’avez fait le grand honneur

de présider le jury.

- Au Docteur RAMAROSON Roseline et Docteur RAVAOARISOA Elisabeth

d’avoir accepté de participer aux membres de jury de ce mémoire.

Je présente également ma profonde reconnaissance et gratitude :

- A Monsieur le Directeur de l’Institut Pasteur de Madagascar de m’avoir donnée

l’opportunité de réaliser mon stage de Master 2.

- Au Docteur Minoarisoa RAJERISON de m’avoir accueillie dans le laboratoire

Peste et de m’avoir apporté son soutien et ses conseils pendant la réalisation de ce

travail.

- Au Docteur Inès VIGAN – WOMAS de m’avoir donné la permission de

travailler dans son unité pendant toutes les manipulations en cytométrie en flux.

Je tiens également à exprimer mes plus vifs remerciements :

- A tous les personnels de l’Unité Peste : vous m’avez beaucoup aidé et vous

m’avez apporté votre affection pendant mon travail.

- A tous les personnels de l’Unité Immunologie des maladies infectieuses de leurs

aimables collaborations, de leurs aides techniques et leurs conseils durant les

manipulations.

- A tous les patients et les donneurs de sang pour avoir accepté de participer à

l’étude. Sans vous je n’ai pas pu faire la mise au point des techniques.

Et pour ceux qui, de près ou de loin, m’ont permis de bien finaliser ce mémoire,

veuillez trouver ici ma profonde gratitude.

Encore un grand merci à vous tous.

iii

TABLE DES MATIERES

DEDICACE ....................................................................................................................... i

REMERCIEMENTS ......................................................................................................... ii

TABLE DES MATIERES ............................................................................................... iii

LISTE DES ABREVIATIONS ...................................................................................... vii

GLOSSAIRE .................................................................................................................... x

LISTE DES FIGURES .................................................................................................... xi

LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................. xiii

INTRODUCTION ............................................................................................................ 1

Partie I: GENERALITES .................................................................................................. 3

I. LA PESTE ............................................................................................................. 3

I.1 HISTORIQUE ET SITUATION ACTUELLE .............................................. 3

I.1.1 Dans le monde ............................................................................................ 3

I.1.2 A Madagascar ............................................................................................. 3

I.2 L’AGENT CAUSAL ...................................................................................... 4

I.2.1 Description .................................................................................................. 4

I.2.2 Facteurs de virulence .................................................................................. 4

I.3 CYCLE DE TRANSMISSION ...................................................................... 5

I.4 LES DIFFERENTES FORMES CLINIQUES ............................................... 6

I.5 DIAGNOSTIC ET TRAITEMENT ............................................................... 8

I.6 VACCIN CONTRE LA PESTE ..................................................................... 9

II. LA REPONSE IMMUNITAIRE ......................................................................... 10

II.1 DEFINITION ............................................................................................... 10

II.2 LES DIFFERENTES CATEGORIES DE LA REPONSE IMMUNITAIRE

……………………………………………………………………………...10

II.2.1 La réponse immunitaire innée ............................................................... 10

II.2.2 La réponse immunitaire adaptative ....................................................... 10

II.2.2.1 La réponse humorale ......................................................................... 11

II.2.2.2 La réponse cellulaire ......................................................................... 11

II.2.2.3 La réponse mémoire .......................................................................... 12

II.3 LA REPONSE IMMUNITAIRE CONTRE LA PESTE .............................. 12

iv

II.3.1 Développement intracellulaire et extracellulaire de Y. pestis pendant

l’infection ............................................................................................................. 12

II.3.2 Y. pestis et la réponse immunitaire innée .............................................. 13

II.3.3 Y. pestis et la réponse immunitaire adaptative ...................................... 14

Partie II: MATERIELS ET METHODES ...................................................................... 15

I. POPULATIONS ETUDIEES .............................................................................. 15

I.1 CAS PESTEUX ............................................................................................ 15

I.2 CAS ASYMPTOMATIQUES ...................................................................... 15

I.3 CAS NON PESTEUX (CONTROLE) ......................................................... 16

II. COLLECTE DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES ..................................... 16

III. REPONSE HUMORALE ANTI-F1 PAR ELISA ............................................... 16

III.1 PRINCIPE .................................................................................................... 16

III.2 METHODE ................................................................................................... 16

III.3 EXPRESSION DES RESULTATS .............................................................. 17

III.4 METHODES STATISTIQUES UTILISEES ............................................... 17

IV. ETUDE DE LA REPONSE CELLULAIRE ....................................................... 18

IV.1 LE TEST DE PROLIFERATION CELLULAIRE ...................................... 18

IV.1.1 Isolement des PBMC............................................................................. 18

IV.1.1.1 Principe ............................................................................................ 18

IV.1.1.2 Méthode ............................................................................................ 18

IV.1.1.3 Expression des résultats ................................................................... 19

IV.1.2 Conservation des PBMC ....................................................................... 20

IV.1.2.1 Principe : .......................................................................................... 20

IV.1.2.2 Méthode : ......................................................................................... 20

IV.1.2.3 Expression des résultats : ................................................................. 22

IV.1.3 Marquage des PBMC au CFSE ............................................................. 23

IV.1.3.1 Principe : .......................................................................................... 23

IV.1.3.2 Méthode : ......................................................................................... 23


IV.1.4 Culture cellulaire ................................................................................... 25

IV.1.5 Acquisition au CMF .............................................................................. 26

IV.1.5.1 Principe : .......................................................................................... 26

IV.1.5.2 Méthodes .......................................................................................... 26


v

IV.2 IMMUNOPHENOTYPAGE ........................................................................ 27

IV.2.1 Principe ................................................................................................. 27

IV.2.2 Méthode ................................................................................................. 28

IV.2.3 Expression des résultats ........................................................................ 28

IV.2.4 Méthodes Statistiques utilisées ............................................................. 29

Partie III: RESULTATS ................................................................................................. 30

I DESCRIPTION DES POPULATIONS ETUDIEES .......................................... 30

I.1 CAS CONFIRMES DE PESTE ................................................................... 30

I.2 IDENTIFICATION DES CAS DE PESTE ASYMPTOMATIQUE ........... 30

I.3 CAS NON PESTEUX .................................................................................. 31

II REPONSE HUMORALE ANTI-F1 DES TROIS CAS ETUDIES .................... 31

III REPONSE CELLULAIRE .................................................................................. 32

III.1 TEST DE PROLIFERATION LYMPHOCYTAIRE ................................... 32

III.1.1 Isolement des PBMC............................................................................. 32

III.1.2 Conservation des PBMC ....................................................................... 32

III.1.2.1 Congélation des PBMC ..................................................................... 32

III.1.2.2 Décongélation de PBMC .................................................................. 34

III.1.3 Marquage des PBMC au CFSE ............................................................. 34

III.1.4 Mise en culture des PBMC ................................................................... 36

III.1.4.1 Nature et concentration de l’agent mitogène favorable pour le témoin

positif ……………………………………………………………………...36

III.1.4.2 Concentration en antigène de stimulation ......................................... 38

III.1.5 Résultats de TPL des cultures des PBMC des cas pesteux et non pesteux

…………………………………………………………………………40

III.2 IMMUNOPHENOTYPAGE ........................................................................ 42

III.2.1 Détermination du volume d’anticorps anti-CD nécessaire pour chaque

test …………………………………………………………………………42

III.2.2 Immunophénotypage des PBMC des cas pesteux et non pesteux après

culture cellulaire .................................................................................................. 44

III.2.2.1 Hétérogénéité intraindividuelle des cas pesteux et cas non pesteux 44

III.2.2.2. Comparaison interindividuelle entre cas pesteux et non pesteux ... 48

Partie IV: DISCUSSION ................................................................................................ 48

Partie V: CONCLUSION ET PERSPECTIVE .............................................................. 56

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................ 60

vi

ANNEXES ......................................................................................................................... I

RESUME ............................................................................................................................

vii

LISTE DES ABREVIATIONS

Ac: Anticorps

CD: Cluster de Différenciation

CFSE: Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester

CMF: Cytométrie en Flux

CMH: Complexe Majeure d’Histocompatibilité

ConA: Concanavaline A

CPA: Cellules Présentatrices d’Antigène

DMSO: (DimethylSulfoxyde).

DO: Densité Optique

ELISA: Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

FITC: Fluorescéine isothiocyanate

FSC: Forward Scatter

IFNγ: Interferon gamma

Ig: Immunoglobuline

IL: Interleukine

IP: Index de Prolifération

KWC: Killed Whole Cell

LB: Lymphocyte B

LPS: Lipopolysaccharide

LT: Lymphocyte T

LTc: Lymphocyte T cytotoxique

viii

LTh: Lymphocyte T helper

LWC: Lived Whole Cell

MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase

NF-kB: Nuclear Factor kappa B

OMS: Organisation Mondiale de la Santé

PAMP: Pathogen Associated Molecular Patterns

PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell (Cellules mononuclées du sang

périphérique

PBS: Phosphate Buffer Saline

PCR: Polymerase Chain Reaction

PE: Phycoérythrine

PE-Cy5: Phycoérythrine Cyanin 5

PHA: Phytohemaglutinine

PMT: Photomultiplicateur

PRR: Pattern Recognition Receptor

PS: Pénicilline-Streptomycine

RPMI: Roswell Park Memorial Institute meduim

SDSP: Service de District de la Santé Publique

SSC: Side Scatter

SST3: Système de Sécrétion de Type 3

SVF: Sérum du Vœu Fœtal

TCR: T Cell Receptor

TDR: Test de Diagnostic Rapide

ix

TLR: Toll-Like –Receptor

TNFα: Tumor Necrosis Factor alpha

TPL: Test de Prolifération Lymphocytaire

WHO: World Health Organisation

Yop: Yersinia Outer Protein

x

GLOSSAIRE

Apoptose : ou mort cellulaire programmée est le processus par lequel des cellules

déclenchent leur auto-destruction en réponse à un signal.

Efferocytose : est un processus physiologique caractérisé par la phagocytose des

cellules apoptotiques par les phagocytes, tels que les macrophages, qui expriment à leur

surface des récepteurs spécifiques.

Fluorochrome ou fluorophore : substance chimique capable d'émettre de la lumière de

fluorescence après excitation avec un laser. Chaque fluorochrome a sa propre longueur

d’onde d’excitation et d’émission.

Hexaacylé : une molécule possédant 6 groupements acyle de formule RCO-

xi

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Cycle de la peste (Chanteau et al, 2006) ........................................................... 6

Figure 2: Localisation de bubon (Chanteau et al., 2006). ................................................. 7

Figure 3: Voies possibles pour l'entrée de Y. pestis dans les macrophages (Fukuto et

Bliska, 2014) ................................................................................................................... 13

Figure 4: Carte montrant les zones d'étude ..................................................................... 15

Figure 5: Schéma de l’ELISA indirect pour la détection de l’IgG humain anti F1 ........ 17

Figure 6: Séparation des constituants sanguins par gradient de densité en utilisant du

Ficoll. .............................................................................................................................. 18

Figure 7: Lame de Malassez ........................................................................................... 19

Figure 8: Boîte de congélation Mr Frosty ....................................................................... 20

Figure 9: Suivi de la prolifération lymphocytaire avec utilisation le CFSE. .................. 23

Figure 10 : Histogrammes montrant les proportions des cellules marquées et non

marquées au CFSE. ......................................................................................................... 24

Figure 11: Cytomètre BD FACSCalibur ........................................................................ 26

Figure 12: Histogrammes montrant les proportions des cellules stimulées et non

stimulées après traitement avec le logiciel FlowJo®. ..................................................... 27

Figure 13: Immunophénotypage ..................................................................................... 28

Figure 14: Réponse en anticorps anti-F1 des trois cas .................................................... 31

Figure 15: Marquage des PBMC avec différentes concentrations de CFSE. ................. 35

Figure 16: Suivi de la prolifération lymphocytaire après stimulation avec différentes

concentrations de PHA et ConA. .................................................................................... 36

Figure 17: Proportion des cellules stimulées pour chaque concentration en PHA et

ConA après différents jours de culture ........................................................................... 37

Figure 18: Suivi de la prolifération lymphocytaire des PBMC de 4 individus sains selon

le nombre de jours de culture (3 et 5) et les concentrations de PHA (5 et 10 µg/ml/puits)

........................................................................................................................................ 37

Figure 19: Proportion de population stimulée dans des cultures des PBMC des cas

pesteux stimulées avec différentes concentrations de deux types d’antigène (F1:

Antigène F1 et YPS: Y. pestis soniqué). ......................................................................... 38

xii

Figure 20: Proportion de population stimulée dans des cultures de 5 et 7 jours des

PBMC des cas pesteux stimulés avec différentes concentrations en antigène F1 (0,2; 2;

5; 10 et 20µg/ml). ........................................................................................................... 38

Figure 21: Observation au microscope inversé des cultures de 5 et 7jours des PBMC

sans CFSE ....................................................................................................................... 39

Figure 22: Proportion de population stimulée dans des cultures de 7 jours des PBMC

des cas non pesteux stimulés avec différentes concentrations en antigène F1 et Y. pestis

soniqué ............................................................................................................................ 40

Figure 23: Proportion de population stimulée des cas pesteux pour chaque concentration

de deux antigènes. ........................................................................................................... 41

Figure 24: Classification des individus selon la réponse suite à la stimulation avec les

deux antigènes. ................................................................................................................ 42

Figure 25: Immunophénotypage des différentes populations cellulaires présentes dans

un échantillon selon le volume d’anticorps utilisé: 10µl/test (A) ou 5µl/test (B) .......... 43

Figure 26: Hétérogénéité des proportions de chaque population cellulaire des cas

pesteux et non pesteux selon les différentes concentrations des deux antigènes. ........... 45

xiii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Résumé des différentes étapes de chaque essai réalisé pour la congélation

des PBMC ....................................................................................................................... 21

Tableau 2: Résumé des étapes de deux méthodes de décongélation utilisées ................ 22

Tableau 3: Résultats des tests sérologiques des plasmas collectés avant et après la saison

pesteuse ........................................................................................................................... 30

Tableau 4: Rendement des cellules récupérées selon les différents essais ..................... 33

Tableau 5: Comparaison des proportions des différentes populations cellulaires

obtenues selon le volume d'anticorps utilisé (5 µl et 10 µl/test) ..................................... 42

Tableau 6 : Valeur de p value dans les cas pesteux (n=16) et cas non pesteux (n=10)

après comparaison de la médiane des différentes sous-populations cellulaire des PBMC

mises en culture sans agent mitogène (témoin négatif) et PBMC mises en culture aves

différentes concentrations d’antigène F1 ........................................................................ 47

Tableau 7 : Valeur de p value dans les cas pesteux (n=16) et cas non pesteux (n=10)

après comparaison de la médiane des différentes sous-populations cellulaire des PBMC

mises en culture sans agent mitogène (témoin négatif) et PBMC mises en culture aves

différentes concentrations de Y. pestis soniqué .............................................................. 47

Tableau 8: Valeur de p value après comparaison de médiane de population cellulaire

stimulée des cas pesteux (n=16) et cas non pesteux (n=10) ........................................... 49

INTRODUCTION

1

INTRODUCTION

La peste est une infection bactérienne due à l’entérobactérie Yersinia pestis. Elle

fait partie des zoonoses des rongeurs, transmissible à l’homme via des vecteurs tels que

les puces. C’est une maladie quarantenaire soumise au règlement international de la

santé et notifiée à l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS).

Dans le monde, elle était responsable de trois grandes pandémies entraînant la

disparition de plus de 200 millions de personnes (Perry et Fetherston, 1997). D’après

ces données, elle est la maladie la plus meurtrière dans l’histoire de l’humanité. De nos

jours, des foyers de peste persistent encore dans quelques régions du monde notamment

en Amérique, en Asie et surtout en Afrique, où l’incidence de la maladie est la plus

élevée (plus de 90% des cas rapportés). Madagascar est actuellement le pays qui déclare

le plus de cas de peste humaine au monde (WHO, 2016).

La forte pathogénicité de la bactérie repose sur sa capacité à détourner le système

de défense de l’hôte. Une fois dans l’organisme, elle utilise des stratégies pour échapper

aux effecteurs de l’immunité afin de se multiplier rapidement; disséminer; coloniser

l’organisme et provoquer la mort de l’hôte.

Trois formes majeures de peste sont connues dans le monde. La peste bubonique,

la forme la plus fréquente, se développe après piqûre de puce infectée ; la peste

pulmonaire, forme rare, se produit après inhalation des particules chargées de bactérie et

la peste septicémique qui est due à une multiplication importante de la bactérie dans la

circulation sanguine (OMS, 1999). Ces différentes formes sont accompagnées de

symptômes tels que la forte fièvre, céphalée, adénopathie, toux avec crachat

sanguinolant, insuffisance respiratoire, choc septique…. Elles sont le plus souvent

mortelles sans traitement précoce et adéquat.

Néanmoins, même si Y. pestis est une bactérie extrêmement virulente; elle ne

provoque pas toujours le développement de l’une de ces différentes formes cliniques.

En effet, quelques observations ont rapporté qu’il existe des personnes portant des

bacilles pesteux mais présentant, apparemment, une excellente santé. Les observateurs

ont relié ces cas à une forme asymptomatique de la peste (Fonquernie, 1931; Leger,

1931; Leger, 1933).

A Madagascar, la peste reste un problème majeur de la santé publique. Une

augmentation du taux de létalité liée à la peste (12,18% vers 21,44%) a été notée durant

les cinq dernières années (WHO, 2016). De plus, des souches de Y. pestis résistantes

2

aux antibiotiques ont été isolées (Galimand et al., 1997; Galimand et al., 2006 ; Cabanel

et al., 2017). Il a été également démontré que les puces Xenopsylla cheopis vecteurs de

la peste ont acquis une résistance aux insecticides (Ratovonjato et al., 2000; Boyer et

al., 2014). Par ailleurs, le vaccin autrefois utilisé contre la peste ne conférait pas de

protection complète contre la forme pulmonaire qui est pourtant la forme la plus

dangereuse. Par conséquent, le développement d’un nouveau vaccin efficace contre

toutes les différentes formes s’avère être le meilleur moyen de protection contre cette

maladie. Pour atteindre ce but, la compréhension des mécanismes de la réponse

mémoire chez les sujets qui ont été déjà en contact avec l’agent pathogène joue un rôle

primordial.

Ainsi, la présente étude, a pour objectif principal d’étudier la réponse immune

mémoire à médiation humorale et cellulaire contre Y. pestis dans les trois cas suivants:

cas pesteux confirmés au laboratoire; cas pesteux asymptomatiques et cas non pesteux

(contrôle négatif). Et spécifiquement, ses objectifs consistent à :

- identifier les cas de peste asymptomatique dans des foyers d’endémie pesteuse

connus

- détecter l’anticorps anti-F1 (anticorps contre l’antigène F1 spécifique de Y.

pestis) dans le sérum des sujets dans chaque cas pour l’étude de la réponse

humorale

- mettre au point le test de prolifération lymphocytaire et l’immunophénotypage

pour la réponse cellulaire en utilisant la cytométrie en flux.

Au cours de cette étude, après une description générale de la peste ainsi que de la

réponse immunitaire, les différentes techniques utilisées dans cette étude seront décrites

dans la partie «Matériels et Méthodes». Enfin, les résultats obtenus seront présentés puis

analysés dans la partie «Discussion» avant de tirer une conclusion.

Cette étude a obtenu l’autorisation du comité d’éthique selon la référence N°008-

MSANP/CE.

Partie I: GENERALITES

3

PARTIE I: GENERALITES

I. LA PESTE

I.1 HISTORIQUE ET SITUATION ACTUELLE

I.1.1 Dans le monde

La peste a été responsable de trois pandémies majeures dans le monde. « La peste

de Justinien », la première pandémie, a ravagé le pourtour Méditerranéen au VI ème

siècle et comptait 100 millions de victimes (Pollitzer, 1954). La deuxième pandémie, le

tristement célèbre « Peste noire » datait du XIVème siècle et a causé 50 millions de

morts. L’Europe a été décimée par cette épidémie en perdant près du tiers de sa

population. La dernière pandémie, qui a commencé dans la province de Yünnan (Chine)

en 1855, s’est propagée rapidement dans le monde par l’intermédiaire des transports

maritimes (Pollitzer, 1954; Perry & Fetherston, 1997).

Selon l’OMS, 3248 cas de peste humaine dont 584 décès ont été enregistrés entre

2010 et 2015. Ces cas ont été notifiés par 11 pays d’Asie, des Amériques, et surtout

d’Afrique, et particulièrement Madagascar (WHO, 2016).

L’Afrique compte à lui seul plus de 96% du total des cas de peste dans le monde.

Cependant si le nombre de cas a nettement diminué comparé à la situation entre 2004-

2009 (12548 cas rapportés) (WHO, 2010), le taux de létalité était en forte augmentation

(de 6.74% à 17.98%). Par ailleurs, la peste est aussi classée parmi les maladies ré-

émergentes. En effet, elle est réapparue dans des foyers où elle était restée silencieuse

pendant plusieurs années et que l’on croyait totalement disparu (Demeure et al., 2013).

I.1.2 A Madagascar

La peste est apparue pour la première fois à Toamasina en 1898. Grâce à

l’ouverture du chemin de fer reliant Toamasina et Antananarivo, la peste a atteint la

capitale pour s’y installer en 1921. Depuis, elle a colonisé les Hautes Terres

particulièrement les zones situées au-dessous de 800 mètres d’altitude (Brygoo, 1966).

Aujourd’hui, Madagascar est un des foyers de peste les plus actifs au monde et où la

peste constitue un problème majeur et une menace pour la santé publique. La maladie

présente une recrudescence saisonnière de Septembre à Avril sur les Hautes Terres alors

qu’elle s’étend d’Août à Novembre dans la ville côtière de Mahajanga (Champetier de

Ribes et al., 1997). Madagascar reste le pays le plus gravement touché avec 76,98% et

74.01% des cas rapportés respectivement dans la région Africaine et dans le monde,

4

avec un taux de létalité qui atteint 19,80%. Cette augmentation est liée à la fréquence

élevée de la forme pulmonaire (23,30% des cas) (WHO, 2016).

A Madagascar, 41 districts ont déclaré des cas de peste de 2011 à 2015 parmi

lesquels Tsiroanomandidy, Miarinarivo, Ankazobe, et Manandriana sont ceux qui

rapportent le plus de cas (selon les données du laboratoire central de la peste).

I.2 L’AGENT CAUSAL

I.2.1 Description

La bactérie Y. pestis, agent pathogène de la peste, a été isolée pour la première

fois, à partir des bubons de cadavres pesteux humains, par Alexandre Yersin en 1894 à

Hong Kong lors de la troisième pandémie (Yersin, 1894). Elle appartient à la famille

des Enterobacteriaceae au sein de laquelle trois espèces du genre Yersinia sont

pathogènes pour l’homme (Y. pestis, Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia

enterocolitica). La bactérie peut croitre à des températures allant de 4°C à 40°C mais la

température optimale de croissance se trouve entre 28°C et 30°C (Perry & Fetherston,

1997). C’est une bactérie gram négative, immobile et qui se présente sous forme de

coccobacille de 1 à 3 µm de long et 0,5 à 0,8 µm de diamètre. Elle présente une

«coloration bipolaire» c’est- à -dire que ses deux extrémités se colorent intensément par

la coloration de Wayson.

I.2.2 Facteurs de virulence

Les facteurs de virulence de Y. pestis sont codés par 3 plasmides (Ferber &

Brubaker, 1981; Filippov et al., 1990). Le plasmide appelé pYV ou pCD1 (70kb) est

commun aux trois espèces de Yersinia pathogènes pour l’homme (Ben-Gurion et

Shafferman, 1981) et est essentiel à la pathogénicité de Y. pestis (Portnoy et al., 1983).

Il code pour le système de sécrétion de type III (SST3), les régulateurs de l’expression

des gènes du SST3, les protéines effectrices appelées Yops (Trosky et al., 2008), la

translocation des Yops et l’antigène V (LcrV) (Hu et al., 1998) et la protéine Ail de la

membrane externe (Miller et al , 1990). Le SST3 est un ensemble de machinerie qui sert

à injecter les protéines effectrices dans le cytoplasme des cellules de l’hôte (Ghosh,

2004; Bliska et al., n.d.). Ces molécules perturbent la structure du cytosquelette des

cellules de l’hôte; bloquent la phagocytose (Ruckdeschel et al., 1996), inhibent la

production des cytokines pro inflammatoires et induisent la mort des macrophages

5

(Cornelis, 2002; Grosdent et al., 2002; Cantwell et al., 2010; Rosqvist et al., 1990;

Monack et al., 1997). L’antigène V est une protéine multifonctionnelle dans la

pathogénicité de la bactérie (Derewenda et al., 2004). Il stimule l’expression de SST3

dans le cytoplasme de la bactérie. Il intervient dans l’interaction de la bactérie aux

cellules eucaryotes (Fields et al., 1999) en formant des pores au niveau de la membrane

de ces dernières et favorise l’injection des protéines effectrices (Holmström et al.,

2001). Il peut également entrer dans les cellules où il influence la sécrétion des

cytokines (Fields & Straley, 1999; Nakajima et al., 1995; Nedialkov et al., 1997). La

protéine Ail intervient dans la résistance de la bactérie au complément, sa survie à

l’intérieur des macrophages et son adhésion et invasion sur les cellules de l’hôte (Bartra

et al., 2008; Hinnebusch et al., 2011; Kolodziejek, et al., 2012).

Les deux autres plasmides appelés pFra ou pMT1 (100 Kb) et pPla ou pPCP1 (9.5

Kb) sont propres à Y. pestis (Brubaker, 1991). Le plasmide pFra code pour la toxine

murine (phospholipase D) et l’antigène capsulaire F1. La toxine murine est responsable

de la survie de la bactérie dans l’estomac de la puce vectrice (Hinnebusch et al., 2002).

Quant à l’antigène F1, il intervient essentiellement dans l’inhibition de la phagocytose

(Du et al., 2002). Le plasmide pPla code pour les toxines pesticines et l’activateur du

plasminogène (Sodeinde et Goguen, 1988). Les pesticines sont des bactériocines

produites par Y. pestis qui servent à inhiber la croissance de l’espèce voisine Y.

pseudotuberculosis (Ben-Gurion et Hertman, 1958). Le plasminogène est nécessaire à la

dissémination de la bactérie à partir du site d’injection chez les mammifères (Sodeinde

et al., 1992).

I.3 CYCLE DE TRANSMISSION

Le cycle de la peste comprend trois acteurs principaux : les puces, les rongeurs et

la bactérie. La transmission de la maladie par les puces de rongeurs a été découverte par

Paul Louis Simond (Simond, 1898).

A Madagascar, le rat noir ou Rattus rattus constitue le principal réservoir de la

peste dans les zones rurales. Il est associé à deux espèces de puce : X. cheopis, une puce

cosmopolite, et Synopsyllus fonquerniei, qui est endémique à Madagascar (Brygoo,

1966; Blanchy et al., n.d.).

En milieu urbain, Rattus norvegicus ou rat d’égout est le réservoir dominant dans

la ville d’Antananarivo (Chanteau et al., 1998) alors qu’à Mahajanga, il est représenté

6

par Suncus murinus ou la musaraigne (Rahelinirina et al., 2017). Ils sont associés à X.

cheopis (Laventure et al., n.d.; Duplantier et al., 2005; Duchemin et al., 2007;

Andrianaivoarimanana et al., 2013)

La maladie se transmet d’un rongeur à un autre par piqure de puce infectieuse lors

du repas sanguin (Brygoo, 1966). Accidentellement, la puce infectieuse peut piquer

l’homme et entraîne la peste bubonique. Cette forme peut évoluer vers la peste

pulmonaire secondaire. Cette dernière peut se transmettre d’homme à homme par voie

aérienne. Dans ce cas, il s’agit de la peste pulmonaire primaire (Figure 1).

Figure 1: Cycle de la peste (Chanteau et al, 2006)

I.4 LES DIFFERENTES FORMES CLINIQUES

Chez l’homme, la peste revêt plusieurs formes cliniques.

La peste bubonique est la forme la plus fréquente. Elle se produit après la piqure

d’une puce infectieuse (OMS, 1999). Les bactéries injectées rejoignent, par

l’intermédiaire de la circulation lymphatique, les ganglions lymphatiques les plus

proches où elles se multiplient activement. Après 2 à 6 jours d’incubation (Prentice &

Rahalison, 2007), une augmentation de volume et inflammation des ganglions encore

appelés «bubons» peuvent être observées et associées à des symptômes tels qu’une

fièvre brutale, céphalées, frissons et altération de l’état général (Pollitzer, 1954). Selon

7

le site de piqure, on peut distinguer différentes localisations de bubon: cervical, sous-

maxillaire, sus-claviculaire, axillaire, épitrochléen et inguinal (Chanteau et al, 2006)

(Figure 2).

Figure 2: Localisation de bubon (Chanteau et al., 2006).

a) Bubon cervical. b) Bubon sous-maxillaire. c) Bubon sus-claviculaire. d) Bubon axillaire.

e) Bubon épitrochléen. f) Bubon inguinal

La peste pulmonaire est une forme rare mais très dangereuse par le fait qu’elle se

transmet rapidement d’homme à homme et par son taux de létalité très élevé. Elle peut

être soit primaire soit secondaire. La peste pulmonaire primaire survient après

inhalation des gouttelettes d’aérosol chargées de bactéries (OMS, 1999). Quant à la

peste pulmonaire secondaire, c’est une forme qui a évolué à partir de la peste

bubonique. Dans les deux cas, les bactéries vont se multiplier dans les poumons puis les

attaquer. Des signes généraux comme une céphalée brutale, forte fièvre, vomissements,

douleurs abdominales, douleurs thoraciques, toux, insuffisance respiratoire ont été

trouvés chez les malades de peste pulmonaire après une courte durée d’incubation

variant de quelques heures à 2 - 3 jours (Prentice & Rahalison, 2007).

La forme septicémique survient lorsque les bactéries rejoignent la circulation

sanguine (OMS, 1999). Elle peut apparaitre suite à une bactériémie progressive sans

bubon apparent (septicémie primaire) ou survenir suite aux 2 formes de la maladie

(septicémie secondaire). Elles entraînent la défaillance de divers organes, gangrène des

extrémités, choc septique et endophtalmie. Sans traitement précoce et adéquat,

l’évolution vers la mort est inévitable.

8

Mais l’existence de la forme asymptomatique de cette maladie a été également

rapportée (Marshall et al., 1967). Pour eux, les cas de peste asymptomatique

correspondent aux contacts pesteux qui n’ont pas été malades et dont la culture de leurs

prélèvements de gorge a permis d’isoler une souche de Y. pestis.

I.5 DIAGNOSTIC ET TRAITEMENT

La bactériologie avec isolement de souche de Y. pestis est le test de référence pour

le diagnostic de la peste. Elle nécessite la culture de prélèvement biologique (aspirât de

bubon, crachat, sang) sur milieu solide sélectif (complémenté par 3 antibiotiques :

Cefsulodine – Irgasan – Novobiocine : CIN) et liquide (Bouillon cœur- cerveau) à une

température qui se trouve entre 25 et 27°C (Rasoamanana et al., 1996). L’utilisation de

milieu sélectif CIN est avantageuse car il permet d’éliminer une partie des bactéries

contaminantes. D’autres techniques peuvent être utilisées pour diagnostiquer la peste:

- l’examen direct après coloration de Gram ou de Wayson (OMS, 1999)

- l’utilisation de test de diagnostic rapide (TDR), un test

immunochromatographique, pour la détection de l’antigène F1 de Y. pestis dans

différents prélèvements tels que l’aspirat de bubon, crachat, sang, ponction post-

mortem des organes (Chanteau et al., 2003). Ce test est facile à utiliser, sensible,

spécifique et rapide (Chanteau et al., 2003)

- la détection d’anticorps anti-F1 par ELISA (Rasoamanana et al., 1997) à partir

d’une paire de sérums.

La streptomycine, les tétracyclines et les sulfamides constituent les principaux

antibiotiques recommandés et utilisés pour le traitement de la peste humaine. La

gentamycine peut être également utilisée pour traiter la peste pulmonaire. Les

chloramphénicols constituent une alternative des aminoglycosides pour traiter la forme

bubonique et septicémique.

D’après l’OMS, les différents cas de peste sont définis comme suit :

Cas suspect: si les caractéristiques cliniques et épidémiologiques sont compatibles

(exposition à des animaux ou personnes infectés et/ou signes de piqure de puce et/ou

résidence ou voyage dans une zone présentant une endémie au cours des 10 jours

précédents).

Cas probable: s’il satisfait à la définition du cas suspect mais en plus un des tests

suivants est positif (dans le cas d’un foyer d’endémie connu) et au moins deux sont

9

positifs (dans le cas d’un nouveau foyer ou ré-émergent). L’examen microscopique des

prélèvements montre des coccobacilles à Gram négatif, bipolaires après une coloration

de Wayson ou l’antigène F1 de Y. pestis est détecté dans le prélèvement ou l’anticorps

anti-F1 est détecté dans un seul sérum (sans signe d’infection antérieure ni de

vaccination contre la peste) ou détection de Y. pestis par PCR.

Cas confirmé: s’il satisfait à la définition du cas suspect. Mais en plus, une souche

de Y. pestis a été isolée à partir du prélèvement, ou le titre en anticorps anti-F1 est

multiplié par 4 dans des sérums appariés, ou un TDR F1 est positif (en régions

d’endémie et que lorsqu’aucun autre test de confirmation ne peut être pratiqué) (WHO,

2006).

I.6 VACCIN CONTRE LA PESTE

Outre le traitement précoce, la vaccination serait une meilleure alternative pour

protéger les individus exposés à la peste. Deux types de vaccin, le KWC (Killed Whole

Cell) et LWC (Lived Whole Cell), ont été utilisés pour prévenir la peste (Meyer, 1970).

Le KWC est constitué de suspension bactérienne tuée par la chaleur (Titball et

Williamson, 2001). Cependant, ce vaccin ne confère aucune protection contre la forme

pulmonaire et de plus nécessite plusieurs doses de rappels et entraine des effets locaux

tels que malaise, maux de tête, élévation de température et lymphadénopathie.

Le vaccin LWC est par contre constitué de bactéries vivantes atténuées.

L’atténuation de la virulence est obtenue après plusieurs passages de la souche

bactérienne sur du milieu de culture et à température ambiante. Ce vaccin présente un

risque de développement d’une infection dû à l’existence de quelque résidu de

virulence. Comme dans le cas de KWC, LWC provoque également des effets sévères et

ne protège pas contre la forme pulmonaire (Feodorova & Motin, 2012). A Madagascar,

le LWC mis au point par Girard et Robic en 1932 est le vaccin EV76 (Coulanges ,

1983). Il a été aussi utilisé dans l’ancienne Union Soviétique et en Chine. Ce vaccin

EV76 ne protège que contre la peste bubonique et provoque également des effets

sévères comme de forte fièvre avec présence de tuméfaction locale (Coulanges , 1983).

La nouvelle formulation actuelle est un vaccin recombinant constitué de deux

antigènes F1 et V de Y. pestis (F1-V). Des études ont montré que ce vaccin induit une

protection complète contre la forme bubonique et pulmonaire de la peste chez différents

modèles animaux (Jones et al., 2003; Williamson et al., 1997; Williamson et al., 2007).

10

Mais chez l’homme, c’est un bon stimulant pour la réponse humorale mais pas pour la

réponse cellulaire (Williamson et al., 2005; Williamson & Oyston, 2012). Néanmoins; il

est encore en cours d’essai clinique (Williamson, 2009).

II. LA REPONSE IMMUNITAIRE

II.1 DEFINITION

La réponse immunitaire de l’hôte est l’ensemble des mécanismes qui assurent la

reconnaissance, la neutralisation et l’élimination des agents infectieux. Elle tient

essentiellement à l’intervention des leucocytes dont on distingue plusieurs types :

polynucléaires, macrophages, lymphocytes (Male, 2002).

II.2 LES DIFFERENTES CATEGORIES DE LA REPONSE IMMUNITAIRE

Elle est classée en deux grandes catégories:

- la réponse immunitaire innée ou naturelle ou non spécifique

- la réponse immunitaire adaptative ou acquise ou spécifique constituée de

l’immunité humorale et cellulaire (Medzhitov & Janeway, 2000)

Quel que soit la nature de la réponse immunitaire ; elle se déroule toujours en

deux étapes : la reconnaissance de l’agent pathogène puis le développement des

mécanismes destinés à son élimination (Male, 2002).

II.2.1 La réponse immunitaire innée

La réponse immunitaire innée constitue la première ligne de défense de

l’organisme contre les agents infectieux. Ses éléments sont constitués de barrières

anatomiques (la peau, les épithéliums internes, le péristaltisme intestinal et les

oscillations des cils broncho-pulmonaires), de molécules secrétées ainsi que de

composants cellulaires (cellules phagocytaires, le système du complément et les

cytokines). (Warrington et al., 2011; Turvey & Broide, 2010). C’est une immunité non

spécifique du pathogène.

II.2.2 La réponse immunitaire adaptative

La réponse immunitaire adaptative est une réponse tardive mais elle présente une

efficacité et spécificité très élevée vis-à-vis de l’agent pathogène. De plus, elle est aussi

caractérisée par la mémoire qu’elle garde lors des contacts antérieurs avec le même

agent pathogène (Male, 2002). Elle fait intervenir des cellules immunocompétentes

11

appelées lymphocytes. Il existe deux grands groupes de lymphocytes : les lymphocytes

T (LT) et les lymphocytes B (LB) (Harlow & Lane, 1991; Bartl et al., 2003). A leur

tour, les LT se divisent en LT4 appelés aussi LT auxiliaires ou helper (LTh) et LT8 ou

LT cytotoxiques (LTc). La réponse adaptative se divise en deux catégories selon les

effecteurs. D’une part, la réponse humorale qui fait intervenir des anticorps produits par

les LB matures ou plasmocytes. Et d’autre part, la réponse cellulaire qui est médiée par

les LT (Harlow & Lane, 1991). Cependant les LT ne peuvent pas fonctionner seuls mais

en coopération avec d’autres cellules (macrophages, cellules dendritiques) qui servent

de cellules présentatrices d’antigène (CPA). Notons que les LB peuvent également jouer

ce rôle. L’activation de ces LT nécessite l’interaction entre leur récepteur membranaire

appelé TCR et le peptide antigénique associée au Complexe Majeure

d’Histocompatibilité (CMH) des CPA (Braciale & Braciale, 1991). De plus, des

molécules costimulatoires telles que CD 28/B7 et CD69 et de cytokine (IL-2) sont aussi

indispensables pour leur activation.

II.2.2.1 La réponse humorale

Elle est mediée par des molécules protéiques appelées anticorps (Ac) ou

immunoglobulines (Ig) qui sont des molécules secrétées uniquement par les

plasmocytes.

Les LB ont la capacité de reconnaître l’antigène entier par leurs Igs

membranaires. Ces derniers ont une partie spécifique appelée paratope qui se lie avec

une partie de l’antigène appelée épitope. La fixation de l’épitope sur le paratope entraîne

l’activation du LB. A son tour, le LB activé se prolifère. Une partie de ces clones se

transforme en LB mémoires et l’autre partie en plasmocytes qui sont capables de

produire des anticorps spécifiques de l’antigène. Ces anticorps se trouvant dans le

liquide lymphatique et dans le sang circulant participent à l’élimination de l’agent

pathogène par divers mécanismes.

II.2.2.2 La réponse cellulaire

C’est une réponse mediée par les lymphocytes T en coopération avec les CPA.

Les LT possèdent des récepteurs membranaires appelés TCR (Hood et al., 1985) tandis

que les CPA sont caractérisées par la présence de CMH à leurs surfaces. Les CMH se

répartissent en deux classes : CMH de classe I et CMH de classe II. Le mécanisme de

12

reconnaissance de l’antigène par les LT passe par la phagocytose de l’antigène par les

CPA. Ils seront alors dégradés en petits fragments peptidiques constitués de 8 à 9 acides

aminés. Ce sont ces petits fragments associés aux molécules de CMH qui vont être

présentés au TCR des LT. Quand il s’agit des LT4, c’est le fragment antigénique

associé à la molécule de CMH II qui va être reconnu par le TCR. Alors que pour les

LT8, c’est le fragment antigénique associé à la molécule de CMH I (Blum et al., 2013).

Une fois que le fragment antigénique est en contact avec le TCR, les LT sont activés et

ils se prolifèrent comme dans le cas des LB. Une partie de ces clones va se transformer

en cellules mémoires et l’autre partie en cellules effectrices responsables également de

l’élimination de l’agent pathogène.

II.2.2.3 La réponse mémoire

Lors du deuxième contact avec le même agent pathogène, la phase de

reconnaissance n’existe plus car la réponse adaptative garde en sa mémoire l’agent

pathogène lors du premier contact. Immédiatement, les cellules mémoires (LB

mémoires, LT mémoires) se prolifèrent activement et rapidement pour pouvoir éliminer

l’agent pathogène dans une durée très courte. Il s’agit d’une réponse très efficace et très

spécifique et qui constitue l’élément fondamental de l’étude de vaccin.

II.3 LA REPONSE IMMUNITAIRE CONTRE LA PESTE

II.3.1 Développement intracellulaire et extracellulaire de Y. pestis pendant

l’infection

Pendant la phase initiale de l’infection, Y. pestis est phagocytée par les

macrophages et les neutrophiles. La majorité des bactéries phagocytées par les

neutrophiles sont éliminées mais une petite partie peut survivre. Les neutrophiles

infectés présente de la phosphatidylserine (PS) au niveau de leur surface membranaire.

Cette molécule sert de ligand pour les cellules phagocytaires (Fadok et al., 1998; Fadok

et al., 2001; Murakami et al., 2014). Il en résulte alors la phagocytose de ces

neutrophiles par les macrophages par le phénomène d’efferocytose. Cependant les

bactéries phagocytées par les macrophages ont la capacité de survivre dans les

phagosomes et de s’y répliquer (Spinner et al., 2014 ; Pujol et Bliska, 2003). Dans ce

cas on parle de développement intracellulaire; en même temps les bactéries acquièrent

des facteurs de résistance à la phagocytose. Après ce stade, les macrophages s’éclatent

13

en libérant les bactéries qui vont, par la suite, développer une multiplication

extracellulaire.

Figure 3: Voies possibles pour l'entrée de Y. pestis dans les macrophages (Fukuto et Bliska,

2014)

II.3.2 Y. pestis et la réponse immunitaire innée

Pour pouvoir survivre et se multiplier, Y. pestis utilise des stratégies afin de

détourner la réponse immunitaire de l’hôte (Li & Yang, 2008). Elle inhibe l’activation

de TLR4 (Toll-like Receptor 4) qui est un PRR (Pattern Recognition Receptor) retrouvé

dans les cellules de l’immunité innée. Suite à cette inhibition, l’expression des gènes

codant pour les cytokines proinflammatoires comme le TNFα (Tumor necrosis factor

alpha) et l’IFNγ (Interferon gamma) est inhibée. Y. pestis réalise ce phénomène en

produisant du LPS (Lipopolysaccharide), qui sert de PAMP (Pathogen Associated

Molecular Patterns), avec du lipide A tetraacylé à 37°C (Kawahara et al., 2002). Cette

forme de lipide est un mauvais stimulateur et est un antagoniste du lipide A hexaacylé

produit par la bactérie à une température de 21 à 27°C. Il a été également démontré que

les protéines YopM, YopH et YopJ sont responsables de l’inhibition de la sécrétion de

l’IFNγ et de TNFα, respectivement (Cantwell et al., 2010 ; Boland et Cornelis , 1998 ;

Lemaître et al., 2006). La protéine LcrV intervient également dans l’inhibition de la

sécrétion de ces deux cytokines (Nakajima et Brubaker, 1993) mais aussi dans

l’induction de la sécrétion de l’IL-10 (Interleukine 10), une cytokine anti-inflammatoire

(Brubaker, 2003)

En plus, Y. pestis peut également inhiber la phagocytose par les polynucléaires

neutrophiles qui sont des leucocytes recrutés en premier lieu sur le site d’infection et les

14

macrophages. Cette résistance à la phagocytose permet à la bactérie de développer une

multiplication extracellulaire. Outre l’inhibition de la phagocytose, la bactérie induit

aussi l’apoptose des macrophages naïfs après l’inactivation de MAPK (Mitogen

Activated Protein Kinase) et de NF-kB (Nuclear Factor kappa B). Les travaux de

Monack D.M. et ses collaborateurs ont montré que YopJ et YpkA sont impliqués dans

ce phénomène (Monack et al., 1997). Pour sa survie dans le sang, lors de sa

transmission de la puce vectrice vers l’hôte, Y. pestis développe également une

résistance au complément à 26 et 37°C. Des études ont montré que cette résistance est

conférée par la protéine Ail (Bartra et al., 2008) et LPS pour la bactérie (Porat et al.,

1995).

II.3.3 Y. pestis et la réponse immunitaire adaptative

Y. pestis est capable d’inhiber la réponse adaptative en influençant la sécrétion des

cytokines par les cellules de l’immunité innée et en agissant directement sur les cellules

effectrices.

A part la perturbation de la sécrétion des cytokines, la bactérie altère aussi la

fonction des cellules dendritiques. A l’état immature, ces cellules sont localisées dans

les tissus épithéliaux périphériques où ils servent de sentinelle pour les microorganismes

étrangers. Suite à leur contact avec l’agent pathogène, le phénomène d’internalisation

s’effectue et elles deviennent matures. Ce phénomène est accompagné de la dégradation

de l’agent pathogène en fragments peptidiques qui seront par la suite associés au CMH

et présentés aux LT afin de les activer. Cependant, des études ont montré que les

cellules dendritiques sont parmi les cibles de Y. pestis pour l’injection des Yops. Par

conséquent, ces Yops empêchent leur maturation et entrainent leur paralysie après le

dérangement de la fonction de leur cytosquelette (Lindner et al., 2007 ; Velan et al.,

2006).

Il a été également démontré que la bactérie inactive les LT et LB en inhibant la

sécrétion de cytokines et l’expression des molécules costimulatoires telles que CD28 et

CD69 nécessaires à l’activation de ces derniers. Des travaux de recherche ont permis

d’identifier que non seulement YopH est responsable de cette inhibition (Yao et al.,

1999 ; Alonso et al., 2004 ; Gerke et al., 2005) mais induit également leur apoptose

(Bruckner et al., 2005).

Partie II: MATERIELS ET

METHODES

15

PARTIE II: MATERIELS ET METHODES

I. POPULATIONS ETUDIEES

I.1 CAS PESTEUX

Ce cas regroupe 33 patients confirmés de peste (entre 2000 et 2017) dont des

souches de Y. pestis ont été isolées à partir de leur prélèvement biologique. Ils

présentaient tous une forme bubonique de la peste. Et ils résident dans les 5 communes

suivantes: Analavory; Ankazobe; Antsahafilo et Miarinarivo.

I.2 CAS ASYMPTOMATIQUES

Les 11 individus définis comme présentant une forme asymptomatique de peste

sont des personnes qui n’ont jamais eu d’antécédent d’infection pesteuse mais

produisent des anticorps dirigés contre la peste et qui n’ont pas reçu d’antibiotique au

cours de l’étude.

Pour l’identification de ces cas, des participants volontaires ont été recrutés dans

des zones d’endémie pesteuse qui déclarent régulièrement des cas de peste humaine

chaque année. Ainsi, nos sites ont été les fokontany de la commune d’Ankazobe I

(SDSP d’Ankazobe), d’Amparaky (SDSP de Miarinarivo) et Miandrarivo I (SDSP de

Tsiroanomandidy) (Figure 4). Les individus ont été prélevés deux fois (avant et après la

saison pesteuse). Et avant chaque prélèvement, des questionnaires individuels relatifs à

l’exposition à la peste ont été administrés à chacun d’eux.

Figure 4: Carte montrant les zones d'étude

16

I.3 CAS NON PESTEUX (CONTROLE)

Ce cas regroupe 10 personnes qui n’ont jamais été en contact avec Y. pestis et

séronégatifs pour la peste. Ces personnes résident à Antananarivo et servent de contrôle

négatif dans notre étude.

II. COLLECTE DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES

Pour chaque individu, 8 ml de sang total ont été collectés dans 2 tubes Héparine-

Lithium de 5 ml. Le plasma et les cellules mononuclées périphériques (PBMC) ont été

séparés. Le plasma a été conservé à -20°C pour la sérologie anti-F1 par la technique

ELISA, tandis que les PBMC ont été conservées dans de l’azote liquide (cas

asymptomatique) et à l’état frais (cas pesteux et non pesteux) pour l’étude de la réponse

cellulaire.

III. REPONSE HUMORALE ANTI-F1 PAR ELISA

L’antigène F1 est une glycoprotéine capsulaire spécifique de Y. pestis . Il est

secrété à 37°C et codé par le plasmide pFra (Brubaker, 1991). Il est utilisé pour le test

sérologique par son extrême immunogénicité.

III.1 PRINCIPE

La méthode ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) est une technique

immuno-enzymatique sur support solide qui permet de détecter la présence d'un

anticorps ou d'un antigène dans un échantillon. Cette technique utilise un ou deux

anticorps dont l’un est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes

immuns (antigène-anticorps) et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire

permet l'émission d'un signal par un substrat chromogène et dont la coloration est

proportionnelle à la quantité d’anticorps contenu dans le sérum testé.

III.2 METHODE

L’ELISA anti-F1 utilisé comprend différentes étapes intercalées par des phases

d’incubation à 37°C et des lavages avec 100 µl/puits de PBSX-tween 0.05%. Les puits

d’une microplaque ont été sensibilisés avec 50µl/puits d’antigène F1 de concentration

3,3µg/ml pendant une nuit à +4°C. Les sites non spécifiques de la microplaque ont été

17

ensuite saturés avec 50 µl/puits du PBSX-tween 0.05%- lait écrémé avant d’ajouter 50

µl des sérums humains à tester dilués au 1/100è. Le test a été effectué en duplicate. La

détection se fait par ajout de 50µl/puits d’un anticorps anti-IgG humain marqué à la

peroxydase (A-8419, Sigma). L’ajout de 50 µl/puits d'O-phénylènediamine (OPDA),

substrat de l’enzyme, constitue l’étape de révélation. L’ajout de 50µl/puits de solution

d’arrêt a été suivi de la lecture de la densité optique (DO) à 492 nm à l’aide d’un lecteur

de plaque (Multiskan, Labsystems) (Rasoamanana et al, 1997). Le témoin positif et

négatif sont les témoins utilisés au laboratoire peste depuis 2008. Les étapes de l’ELISA

sont résumées dans la figure 5.

Figure 5: Schéma de l’ELISA indirect pour la détection de l’IgG humain anti F1

III.3 EXPRESSION DES RESULTATS

Le test ELISA pour la détection d’IgG anti-F1 utilisé au laboratoire a été évalué

sur des sérums de convalescents pesteux malgaches. Le test est considéré positif quand

la DO à 492 nm est supérieur ou égale à 0,350 (Rasoamanana et al, 1997). Les individus

séropositifs sont classés en forts répondeurs si DO>1 et faibles répondeurs si DO<1.

III.4 METHODES STATISTIQUES UTILISEES

Le résultat sérologique (positif ou négatif) et la classification des individus

séropositifs en forts répondeurs et faibles répondeurs en fonction du sexe ont été

analysés avec le test de Chi2. Pour contre, la réponse en fonction de durée de

convalescence et l’âge ont été traités avec le test de corrélation de Spearman.

18

IV. ETUDE DE LA REPONSE CELLULAIRE

L’étude de la réponse cellulaire consiste à détecter la réactivation des cellules

mémoires dirigées contre la peste chez des personnes ayant été déjà en contact avec Y.

pestis. Elle est effectuée en utilisant le test de prolifération lymphocytaire (TPL) par

CFSE sur des PBMC isolées suivi d’une acquisition au cytomètre en flux (CMF) et

l’immunophénotypage.

IV.1 LE TEST DE PROLIFERATION CELLULAIRE

Le TPL est basé sur le fait que les lymphocytes sensibilisés par un antigène, se

transforment en lymphoblastes et prolifèrent lors d’une nouvelle exposition à ce même

antigène. Ce test nécessite les différentes étapes suivantes:

IV.1.1 Isolement des PBMC

IV.1.1.1 Principe

Les PBMC sont séparées des autres constituants du sang, par utilisation de Ficoll

(17-1440-03, GE Healthcare), qui est un polymère glucidique de masse molaire élevée,

en fonction de leur gradient de densité après centrifugation. La solution de Ficoll a une

densité (d) égale à 1.077. Après centrifugation, le plasma, les plaquettes et l’anneau de

PBMC (d< 1.077) se trouvent au-dessus du Ficoll alors que les hématies et les

granulocytes (d> 1.077) se déposent au fond.

IV.1.1.2 Méthode

Dans un tube Falcon 15 ml, le sang total est délicatement déposé au-dessus de 3

ml de Ficoll. Après centrifugation à 2200 t/mn pendant 30 mn et à température

ambiante, on obtient 4 phases bien distinctes (Figure 6).

Figure 6: Séparation des constituants sanguins par gradient de densité en utilisant du Ficoll.

A) Avant centrifugation: formation de 2 phases

par le sang total (a) et le Ficoll (b).

B) Après centrifugation: formation de 4 phases

formées de plasma (1), anneau de PBMC

(2), Ficoll (3) et granulocytes et érythrocytes (4).

19

Le plasma est conservé à -20°C pour le test sérologique ELISA et le dosage de

cytokines. L’anneau de PBMC est récupéré puis lavé 2 fois dans du RPMI de volume

respectif 10 et 5 ml par centrifugation à 2500 t/mn pendant 15 mn. Le dernier culot de

PBMC est remis en suspension dans 1 ml de milieu RPMI- SVF5% - PS1% (Annexe 1).

Puis 20µl de cette suspension est dilué avec 20 µl de bleu Trypan (T8154, Sigma) pour

être comptée sur une lame de Malassez (Figure 7) sous microscope optique. Le bleu

Trypan est un colorant vital qui a la capacité de pénétrer la membrane des cellules

mortes. Ainsi les cellules mortes sont colorées en bleu alors que les cellules vivantes

sont incolores et réfringentes.

IV.1.1.3 Expression des résultats

Le nombre des cellules vivantes comptées dans 10 rectangles subdivisés en 20

petits carrés est utilisé pour calculer le nombre correspondant à un volume de 1µl puis

ramené à 1ml de suspension cellulaire initiale selon la formule suivante :

N= A x 100 x 2 x 1000

Tel que: N: nombre de cellule dans 1ml de suspension cellulaire

A: moyenne de nombre de cellules comptées dans 10 rectangles

100: nombre de rectangles correspondant à un volume de 1µl

2: coefficient de dilution avec le bleu de trypan

1000: volume total de la suspension cellulaire (1000 µl = 1 ml)

Figure 7: Lame de Malassez

20

IV.1.2 Conservation des PBMC

IV.1.2.1 Principe :

Dans certains cas où les PBMC ne peuvent pas être utilisées immédiatement, elles

doivent être conservées. La conservation doit se faire d’une manière correcte pour éviter

la perte d’un grand nombre de cellules et la modification de leurs activités lors des

essais fonctionnelles après décongélation. Le milieu utilisé est le SVF mélangé avec

10% DMSO (DimethylSulfoxyde) (D5879, Sigma) qui est un agent cryoprotecteur.

Malgré les précautions prises, les PBMC des cas asymptomatiques conservées

dans de l’azote liquide lors des missions sur terrain ont été malheureusement

irrécupérables lors de la décongélation. En effet après décongélation et dilution au bleu

Trypan, toutes les cellules étaient colorées en bleu. Aussi, nous avons procédé à la mise

au point de la technique de conservation (congélation et décongélation) pour les cas

pesteux et contrôles.

IV.1.2.2 Méthode :

Mise au point de la technique de congélation:

Après numération, la suspension cellulaire est centrifugée à 2500 t/mn pendant

15mn. Le culot obtenu est remis en suspension dans 1800 ml de SVF et 200µl de

DMSO est ajouté immédiatement. Après homogénéisation, la solution est distribuée

dans 2 cryotubes nunc. Puis plusieurs essais avec ou sans utilisation de Mr Frosty ont

été effectués pour la congélation afin de déterminer celui qui permet d’avoir un meilleur

rendement après décongélation.

Mr Frosty est une boîte qui permet la diminution progressive de la température de

–1°C par minute jusqu’à –80°C. Il s’agit d’un récipient en polycarbonate avec

couvercle. A l’intérieur, il y a un insert en mousse et un portoir pour les cryotubes. Son

utilisation consiste à enlever le portoir avant d’ajouter 250 ml d’alcool isopropylique

pur. Puis il est remis en place avec les cryotubes contenant les PBMC. Ensuite la boîte

est fermée et l’ensemble est placé immédiatement dans un congélateur à -80°C.

Figure 8: Boîte de congélation Mr Frosty

21

Les différentes étapes de chaque essai sont résumées dans le tableau ci-dessous:

Tableau 1: Résumé des différentes étapes de chaque essai réalisé pour la congélation des PBMC

Numéros Essais Etapes

1 PBMC dans l’azote liquide

2 PBMC à -80°C (7 jours)

Azote liquide (68 jours)

3 PBMC à -20°C (une nuit)



à -80°C (7jours)

5 PBMC dans Frosty à -80°C (48h)




à -80°C sans Frosty (20 jours)

8 PBMC dans Frosty à -80°C (7

jours)



à -80°C sans Frosty (48h)


Dans Frosty à -80°C (48h)



à -80°C (48h)


-80°C sans Frosty (33 jours)


à -80°C dans Frosty (48h)


22

Mise au point de la technique de décongélation

Deux méthodes de décongélation ont été utilisées afin de déterminer celle qui est

la plus favorable.

Tableau 2: Résumé des étapes de deux méthodes de décongélation utilisées

Méthodes 1 2

Etapes propres Décongélation progressive de

PBMC dans une glace

Transfert de PBMC

décongelées dans un tube

falcon 15 ml contenant 5ml du

milieu RPMI

Décongélation de PBMC dans

un bain marie préchauffé à

37°C pendant 60s

Dilution de PBMC décongelées

avec 500µl du milieu RPMI

préchauffé à 37°C

Transfert de PBMC diluées

dans un tube falcon 15 ml

contenant 5ml du RPMI

préchauffé

Etapes communs Lavages deux fois par centrifugation à 2500 rpm pendant 15 mn et

à 20°C

Remise en suspension de culot obtenu après un dernier lavage dans

1 ml de RPMI - SVF 10% - PS1%

Numération cellulaire

IV.1.2.3 Expression des résultats :

Après numération cellulaire, le nombre de cellule obtenu est utilisé pour calculer

le nombre total dans 1ml de suspension cellulaire initiale (voir expression des résultats

de l’isolement des PBMCs). Puis le rendement des cellules récupérées est calculé en

utilisant la formule suivante (Posevitz-Fejfár et al., 2014):

23

IV.1.3 Marquage des PBMC au CFSE

IV.1.3.1 Principe :

Afin d’estimer la prolifération des PBMC, elles sont d’abord marquées au CFSE

(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester) avant d’être mises en culture dans

différentes conditions. CFSE est un colorant qui a la capacité de pénétrer la membrane

cellulaire. Il est stocké sous forme de CFDA-SE qui est non fluorescent. Le groupement

acetate, qui favorise sa pénétration à l’intérieur de la cellule, va être clivé par les

estérases intracellulaires. Par la suite, il se transforme en CFSE qui est un dérivé

fluorescent. Après chaque division cellulaire, CFSE est reparti en proportion égale dans

les cellules filles. Ceci se traduit par une diminution de moitié de la fluorescence de la

cellule mesurée lors de l’acquisition au CMF (Figure 9).

Figure 9: Suivi de la prolifération lymphocytaire avec utilisation le CFSE.

A) Diminution de l’intensité de fluorescence du CFSE dans les cellules filles après chaque

division cellulaire. B) Suivi de la prolifération lymphocytaire par la diminution de l’intensité de

fluorescence du CFSE. Chaque pic représente le nombre de division cellulaire effectuée par les

cellules.

IV.1.3.2 Méthode :

Avant de commencer le marquage, le nombre de cellules est ajusté à 106/ml avec

le milieu de culture RPMI-SVF 10%-PS 1%.

24

Mise au point

La concentration de CFSE utilisée pour marquer les cellules avant de les mettre en

culture est essentielle. Elle doit être en quantité suffisante sans pour autant provoquer

d’effet toxique sur les cellules. Pour cela, une gamme de concentrations (0,5; 1; 1,25;

2,5 et 5 µM/ ml de suspension lymphocytaire) a été testée afin de choisir celle qui donne

le meilleur marquage. Le protocole de marquage utilisé est celui du fournisseur

(eBioscience) (Annexe 3). En bref, le marquage consiste à laver deux fois les PBMC à

2500 t/mn pendant 15 mn avec 5 ml du Phosphate Buffered Saline (PBS) stérile. Puis, la

suspension cellulaire de concentration finale 106/ml est incubée avec la concentration de

CFSE voulue pendant 10 mn à température ambiante et à l’obscurité. La réaction de

marquage est arrêtée en ajoutant 5 fois le volume de milieu complet préalablement

incubé dans un bac à glace. Après une incubation de 5 mn, les PBMC ont été lavés 3

fois avec le milieu de culture afin d’éliminer l’excès de CFSE.

Avant de procéder à l’étape de culture cellulaire; les PBMC ont été remis en

suspension dans un milieu de culture. La concentration cellulaire finale demeure 106/ml.

100 µl de cette suspension est prélevé pour vérifier l’efficacité de marquage par

acquisition au CMF.


Après traitement des résultats de l’acquisition au CMF sur le logiciel FlowJo®,

les résultats de marquage se présentent sous forme d’histogramme montrant les

proportions des cellules marquées et/ou non marquées (Figure 10).

Figure 10 : Histogrammes montrant les proportions des cellules marquées et non marquées au

CFSE.

a) avant marquage. b) et c) après marquage. Le cas de b est obtenu si la concentration de

CFSE utilisé n’est pas optimale. Par contre c’est c si elle est optimale

25

IV.1.4 Culture cellulaire

Après numération et ajustement de nombre de cellules à 106/ml, les PBMC sont

réparties en quantité égale. Une partie est marquée au CFSE pour le suivi de la

prolifération alors que l’autre non marquée est destinée pour l’immunophénotypage.

Puis, chaque type de PBMC est mis en culture dans une microplaque de 96 puits à fond

rond contenant 100 µl du milieu de culture RPMI 1640 (R8758-500ml, Sigma)

supplémenté avec 10% de Sérum de Veau fœtal décomplementé (SVF; F2442 Sigma)

(Annexe 2) et 1% de Pénicilline-Streptomycine (PS; P4333 Sigma). Le SVF apporte les

protéines nécessaires à la croissance cellulaires et le mélange d’antibiotique permet de

prévenir une contamination bactérienne. La culture de ces deux types des PBMC ont été

effectuée selon les mêmes conditions suivantes :

- dans les puits témoins négatifs: 100 µl de suspension cellulaire est ajouté au

milieu de culture.

- dans les puits témoins positifs : 100 µl de suspension cellulaire et un volume

d’agent mitogène (varie selon la concentration voulue) sont ajoutés. Les

agents mitogènes tels que la phytohémagglutinine (PHA ; L2769, Sigma) ou la

concanavaline A (ConA ; C7275, Sigma) stimulent les lymphocytes de façon

non spécifique. Ils sont les témoins de la réactivité cellulaire.

- dans les puits tests: 100 µl de suspension cellulaire et un volume de l’antigène

de Y. pestis (varie selon la concentration voulue) sont ajoutés. L’antigène F1

de Y. pestis et du Y. pestis soniqué sont testés.

La culture cellulaire est effectuée dans une étuve à 37°C sous une atmosphère

humide à teneur en CO2 de 5% afin de reproduire les conditions in vivo.

Pour la mise au point, plusieurs paramètres ont été déterminés :

- La nature et la concentration de l’agent mitogène favorables pour le témoin

positif : PHA ou ConA à 5 ou 10 µg/ml/puits

- Le nombre de jour de culture optimal : 3 ; 5 ou 7 jours de culture dans une

étuve à 37°C avec une teneur en CO2 de 5%

- La meilleure concentration en antigène de stimulation : antigène F1 à 0,2 ; 2 ;

5 ; 10 ; 20 µg/ml/puits et Y. pestis soniqué à 5; 10 et 20 µg/ml/puits.

Au dernier jour de culture, le contenu de chaque puits est homogénéisé. Le

contenu des puits correspondants à un test est transféré dans un tube micronics 1 ml

pour être centrifugé à 1500 t/mn pendant 5 mn. Le culot de PBMC marquées au CFSE

26

est lavé deux fois avec 500 µl du PBSX avant l’acquisition au CMF pour suivre la

prolifération. Par contre, le culot de PBMC non marquées servira au phénotypage par

marquage extracellulaire avec des anticorps couplés aux fluorochromes.

IV.1.5 Acquisition au CMF

IV.1.5.1 Principe :

C’est une technique moderne incontournable dans le domaine de l’immunologie.

Elle permet de mesurer simultanément plusieurs caractéristiques de chaque cellule en

suspension dans un échantillon. Les caractères mesurés sont la taille (Forward Scatter

ou FSC), la granularité du cytoplasme (Side Scatter ou SSC) et surtout la fluorescence

de la cellule par l’utilisation des anticorps marqués aux fluorochromes. Elle a plusieurs

applications mais, dans notre étude, elle est utilisée pour l’étude de la prolifération

lymphocytaire et l’immunophénotypage. Elle nécessite l’utilisation d’un appareil

spécifique appelé Cytomètre (Annexe 4).

IV.1.5.2 Méthodes

L’acquisition des échantillons à tester a été effectuée sur FACSCalibur (Figure

11), un cytomètre pourvu de 2 lasers (bleu à 488 nm et rouge à 633 nm) pouvant exciter

4 fluorochromes différents selon le spectre d’excitation et d’émission (Annexe 5). Mais

seul le laser bleu était fonctionnel, donc trois fluorochromes excitables étaient utilisés.

Le programme d’acquisition est fixé jusqu’à 10.000 évènements.

Figure 11: Cytomètre BD FACSCalibur

27


Les résultats de l’acquisition au CMF ont été traités à l’aide du logiciel FlowJo®.

Pour le TPL, ils sont présentés sous forme d’histogrammes avec les différentes

proportions des cellules stimulées et non stimulées (Figure 12).

Figure 12: Histogrammes montrant les proportions des cellules stimulées et non stimulées après

traitement avec le logiciel FlowJo®.

A) Proportion des cellules non stimulées avant culture B) Proportions des cellules non

stimulées et stimulées après culture.

IV.2 IMMUNOPHENOTYPAGE

IV.2.1 Principe

L’Immunophénotypage consiste à caractériser et à déterminer la proportion des

différentes populations cellulaires présentes dans un échantillon sanguin. Chaque

population cellulaire possède un marqueur membranaire spécifique appelé aussi

antigène de surface ou Cluster de différenciation (CD). Pour l’immunophénotypage,

chaque population cellulaire a été marquée par un anticorps anti- CD couplé au

fluorochrome:

- anti-CD4 FITC: marqueur des lymphocytes T auxiliaires couplé à

l'isothiocyanate de fluorescéine (555346, Healthactiv)

- anti-CD3 PE: marqueur des lymphocytes T couplé à la phycoérythrine

(555340, Healthactiv)

- anti-CD8 PE-Cy5: marqueur des lymphocytes T cytotoxiques couplé à la

phycoérythrine - Cyanin 5 (555368, Healthactiv)

Lymphocytes

marquées au

CFSE 98,1%

Lymphocytes stimulés 87,9%

Lymphocytes

non stimulés

12%

28

- anti-CD19 PE-Cy5: marqueur des lymphocytes B couplé à l'isothiocyanate de

fluorescéine (555414, Healthactiv)

- anti-CD14 PE: marqueur des monocytes/ macrophages couplé à la

phycoérythrine (555398, Healthactiv)

IV.2.2 Méthode

Le marquage extracellulaire comprend deux étapes:

- Incubation des cellules collectées après le dernier jour de culture avec un

volume (à mettre au point) des anticorps anti-CD3 PE, anti-CD4 FITC, anti-

CD8 PE-Cy5, anti-CD19 PE-Cy5 et anti-CD14 PE à +4°C et à l’obscurité

pendant 30mn.

- Lavage 2 fois avec 500 µl du PBSX, préalablement incubé dans un bac à

glace, par centrifugation à 1500 t/mn pendant 5 mn afin d’éliminer l’excès

d’anticorps.

Pour la mise au point, nous avons déterminé le volume d’anticorps anti-CD

nécessaire pour bien distinguer les différentes populations cellulaires se trouvant dans

un échantillon lors de l’acquisition au CMF. Pour cela, deux volumes ont été testés: 5 et

10 µl/ puits.

IV.2.3 Expression des résultats

Pour l’immunophénotypage, les résultats de l’acquisition sont présentés sous

forme des cytogrammes avec 4 quadrants montrant les proportions des différentes

populations cellulaires (Figure 13).

Figure 13: Immunophénotypage

Q1: proportion de population cellulaire marquée

avec l’anticorps anti-CD couplé au PE. Q2:

proportion de population cellulaire marquée à la

fois avec l’anticorps couplé au FITC et l’anticorps

couplé au PE. Q3: proportion de population

cellulaire marquée avec l’anticorps anti-CD couplé

au FITC. Q4: proportion de population cellulaire ni

marquée avec l’anticorps anti-CD couplé au FITC

ni avec l’anticorps anti-CD couplé au PE.

29

IV.2.4 Méthodes Statistiques utilisées

Dans chaque cas (cas pesteux et non pesteux), le test de Wilcoxon-Mann Whitney

a été utilisé pour la comparaison intra individuelle de la proportion des différentes sous-

populations cellulaires des PBMC mise en culture sans agent mitogène (témoin négatif)

et celles des PBMC mises en culture avec différentes concentrations des antigènes de

stimulation. Puis la comparaison interindividuelle, entre les cas pesteux et non pesteux,

a été également effectuée avec ce test.

Partie III: RESULTATS

30

PARTIE III : RESULTATS

I DESCRIPTION DES POPULATIONS ETUDIEES

I.1 CAS CONFIRMES DE PESTE

Pour l’étude de la réponse humorale, 33 convalescents pesteux ont été étudiés.

Mais pour la réponse cellulaire, ils sont au nombre de 16 parmi ces 33. L’âge de ces

patients se situe entre 6 à 45 ans avec un sexe ratio (M/F) de 1,2. La durée du temps

entre leur date de début de la maladie et leur date de prélèvement sanguin varient de 1 à

174 mois.

I.2 IDENTIFICATION DES CAS DE PESTE ASYMPTOMATIQUE

Au total, avant la saison pesteuse, 683 personnes ont accepté d’être recrutées et

prélevées au cours de cette étude. Cependant après la saison pesteuse, 150 personnes

n’ont pas pu être prélevés pour diverses raisons : absentes lors de notre deuxième

passage, déménagement ou refus d’être prélevé de nouveau. En tout, sur 533 paires de

plasma, 13 ont présenté une séroconversion (négative/ positive). Néanmoins, deux

individus parmi les 13 ont été exclus car ils ont reçu une chimioprophylaxie suivant les

résultats issus de leur questionnaire. Finalement, 11 cas asymptomatiques ont été

identifiés. Le résultat des analyses sérologiques est résumé ci-dessous (Tableau 3)

Tableau 3: Résultats des tests sérologiques des plasmas collectés avant et après la saison

pesteuse

Après saison pesteuse

Avant saison

pesteuse

Négatifs

Positifs

Absents

Total

Négatifs 505 13 147 665

Positifs 3 12 3 18

Total 508 25 150 683

31

I.3 CAS NON PESTEUX

Pour les cas non pesteux, 10 sujets sains résidant à Antananarivo ont été étudiés.

Leur âge varie de 24 à 45 ans et le sexe ratio (M/F) correspondant est de 0,66.

II REPONSE HUMORALE ANTI-F1 DES TROIS CAS ETUDIES

Tous les plasmas des cas non pesteux (n= 10) ont tous été négatifs en anticorps

IgG anti-F1.

La réponse en anticorps anti-F1 chez les cas confirmés de peste (n= 33) est

cependant très hétérogène. Certains sujets ont eu des DO inférieures au seuil de

positivité (DO<0,350). Les individus séronégatifs en IgG anti-F1 représentent 33,33%

alors que les individus séropositifs comptent 66,8%. Parmi les séropositifs, 54,6% sont

des forts répondeurs (DO>1) et 45,4% des faibles répondeurs (DO<1). La figure 14 ci-

dessous résume ce résultat.

Parmi les 11 cas asymptomatiques identifiés, un individu est considéré comme

étant un fort répondeur, les 10 restant sont tous des faibles répondeurs (Figure 14).

Figure 14: Réponse en anticorps anti-F1 des trois cas

32

III REPONSE CELLULAIRE

III.1 TEST DE PROLIFERATION LYMPHOCYTAIRE

III.1.1 Isolement des PBMC

Le nombre des PBMC isolées a été largement varié d’un individu à l’autre dans

les cas pesteux et non pesteux étudiés (entre 3,94x106 jusqu’à 16,46x10

6cellules/ml).

III.1.2 Conservation des PBMC

III.1.2.1 Congélation des PBMC

Les différentes techniques utilisées pour la conservation des PBMC donnent des

résultats très variés (Tableau 4). L’utilisation de l’azote liquide n’est pas vraiment

praticable. La diminution progressive de la température de conservation est essentielle

pour éviter le choc thermique qui provoque l’éclatement de la cellule. Ainsi, l’étape

utilisant la boîte de congélation Mr Frosty est indispensable pour la congélation.

33

Tableau 4: Rendement des cellules récupérées selon les différents essais

Numéros Essais Etapes Rendement des cellules

récupérées (%)

1 PBMC dans l’azote liquide 0

2 PBMC à -80°C (7 jours)


0



0


à -80°C (7jours)

34,99

5 PBMC dans Frosty à -80°C (48h) 98,07



25



44,28

8 PBMC dans Frosty à -80°C (7 jours)


91,21


à -80°C sans Frosty (48h)

69,07



54,83



à -80°C (48h)

74,43


-80°C sans Frosty (33 jours)

68,33


à -80°C dans Frosty (48h)


72,05

Ce tableau montre les différents rendements en cellules vivantes récupérées

suivant les différents essais. Les essais avec utilisation de l’azote liquide (essai 1, 2, 3)

n’ont pas permis de récupérer des cellules vivantes. En essayant de diminuer la

température de congélation de –20°C à –80°C (essai 4), on a pu récupérer des cellules

vivantes mais le rendement a encore été faible. D’où l’essai a été poursuivi avec

l’utilisation de la boîte de congélation Mr Frosty (essai 5). Après une congélation de

48h à –80°C dans cette boîte, selon les recommandations du fabricant, on a pu récupérer

des cellules vivantes avec un bon rendement de 97,80%. Mais comme la boîte n’est pas

faite pour une conservation de longue durée, des essais ont été testés par transfert dans

34

l’azote liquide ou à –80°C (essai 6 et 7). Après décongélation, une chute du rendement a

été notée surtout pour les cryotubes transférés dans l’azote liquide. Par la suite, la

prolongation de la conservation dans Mr Frosty jusqu’à 7 jours avant de transférer les

cryotubes à –80°C (essai 8) a permis d’avoir un rendement de 91.21%. En plaçant les

PBMC dans Mr Frosty d’abord à -20°C puis à -80°C (avec ou sans Mr Frosty) (essais 9

à 13), le rendement en cellules obtenus restent très variables (54.80% à 72.05%).

III.1.2.2 Décongélation de PBMC

Parmi les 2 méthodes utilisées, la décongélation rapide des PBMC dans un bain

marie préchauffé à 37° C (méthodes 2) permet de récupérer beaucoup plus de cellules

par rapport à la décongélation progressive dans un bac à glace (méthode 1)

III.1.3 Marquage des PBMC au CFSE

Après acquisition au CMF et analyse sur FlowJo®, la meilleure concentration de

CFSE qui a permis de marquer toutes les cellules avant leur mise en culture est de

2,5µM/ ml de suspension cellulaire (Figure 15). C’est la concentration minimale où la

proportion des PBMC marquées est la plus élevée.

35

Figure 15: Marquage des PBMC avec différentes concentrations de CFSE.

a

g

f e

d c

b

a) Cytogrammes montrant la proportion de la

population lymphocytaire dans l’échantillon par

rapport au nombre d’évènement acquis au CMF.

b) Histogramme avec la proportion des

lymphocytes non marqués (PBMC sans CFSE).

c, d, e, f, g) PBMC marquées au CFSE aux

concentrations respectives de 0,5; 1; 1,25; 2,5 et

5 µM/ml de suspension cellulaire

65% 69,7%

63,3%

98,5%

98,3%

100%

27,7%

32,9% 27,3%

33,2%

36

III.1.4 Mise en culture des PBMC

III.1.4.1 Nature et concentration de l’agent mitogène favorable pour le

témoin positif

La détermination de la nature et la concentration de l’agent mitogène pour avoir le

témoin positif ont été faites en parallèle avec le nombre de jours de culture. Aussi, le

PHA est l’agent mitogène favorable pour le témoin positif à une concentration finale de

5µg/ml/puits comparé à la ConA après 5 jours de culture cellulaire (Figure 16, 17 et 18).

Figure 16: Suivi de la prolifération lymphocytaire après stimulation avec différentes

concentrations de PHA et ConA.

a) Témoin négatif (cellules mises

en culture sans agent mitogène)

b) Cellules mises en culture avec

PHA 5µg/ml.

c) Avec ConA 5µg/ml.

d) Avec PHA 10µg/ml. e) Avec

ConA 10µg/ml.

98,1%

87,9%

12%

90,2%

9,94%

93,6%

6,36%

45,9%

52,6%

37

Figure 17: Proportion des cellules stimulées pour chaque concentration en PHA et ConA après

différents jours de culture

Figure 18: Suivi de la prolifération lymphocytaire des PBMC de 4 individus sains selon le

nombre de jours de culture (3 et 5) et les concentrations de PHA (5 et 10 µg/ml/puits)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

PHA 5 ConA 5 PHA 10 ConA 10

% P

op

ula

tio

n s

tim

ulé

e

[Agent mitogène] en µg/ml

Culture 3j

Culture 5j

38

III.1.4.2 Concentration en antigène de stimulation

Des PBMCs isolés de 4 convalescents pesteux ont été stimulés avec soit de l’Ag

F1, soit du Y. pestis soniqué. Après 5 jours de culture, seul un sur les quatre a montré

une stimulation (Figure 19).

Figure 19: Proportion de population stimulée dans des cultures des PBMC des cas pesteux

stimulées avec différentes concentrations de deux types d’antigène (F1: Antigène F1 et YPS: Y.

pestis soniqué).

Ainsi, nous avons continué la mise au point mais uniquement avec l’antigène F1

pour économiser du Y. pestis soniqué. Il est utilisé à différentes concentrations (0,2; 2;

5; 10; 20 µg/ml) dans des cultures de 5 et 7 jours sur des PBMC des cas pesteux. La

comparaison des observations, au microscope inversé, des cultures de PBMC sans

CFSE et la comparaison des proportions de population stimulée ont montré que la

culture de 7 jours est meilleure que celle de 5 jours (Figure 20 et 21).

Figure 20: Proportion de population stimulée dans des cultures de 5 et 7 jours des PBMC des

cas pesteux stimulés avec différentes concentrations en antigène F1 (0,2; 2; 5; 10 et 20µg/ml).

-5

0

5

10

15

20

25

30

55/15 95/15 221/15 07/16

% P

op

ula

tio

n S

tim

ulé

e

Individus testés

Tneg

Tpos

5 µg/ml F1

10 µg/ml F1

20 µg/ml F1

5 µg/ml YPS

10 µg/ml YPS

39

En effet, pour la culture de 7 jours, la proportion de population stimulée est

beaucoup plus élevée par rapport à celle de 5 jours à toutes les différentes

concentrations utilisées sauf pour celle de 0,2 µg/ml pour l’individu 225/11. Ce résultat

est confirmé par l’observation des cultures au microscope inversé et qui se traduit par la

présence des tâches noires représentant des amas cellulaires. La figure 21 illustre bien

ces amas cellulaires observés après une culture de 7 jours par rapport à celle de 5 jours.

Figure 21: Observation au microscope inversé des cultures de 5 et 7jours des PBMC sans CFSE

A) Culture de 5 jours. B) Culture 7 jours. a) Témoin négatif. b) Témoin positif. c) PBMC + 0,2

µg/ml de F1. d) PBMC+2 µg/ml F1. e) PBMC+5 µg/ml F1. f) PBMC+10 µg/ml F1. g)

PBMC+20 µg/ml F1.

225/11

457/14

5/16

40

III.1.5 Résultats de TPL des cultures des PBMC des cas pesteux et non

pesteux

Parmi les 10 cas non pesteux étudiés, 9 ont répondu à la stimulation avec deux

concentrations d’antigène F1 et Y. pestis soniqué (Figure 22). Ainsi, les stimulations

cellulaires observées chez les 16 cas pesteux ont été comparées avec la moyenne de

celles des 10 cas non pesteux (Figure 23). Avec la stimulation de 5 et 10 µg/ml de F1,

12,5 (2/16) et 31,2% (5/16) ont répondu respectivement. Par contre avec 5 µg/ml de Y.

pestis soniqué 37,5% (6/16) des individus ont répondu et le résultat augmente jusqu’à

50% (8/16) avec la concentration 10 µg/ml.

Figure 22: Proportion de population stimulée dans des cultures de 7 jours des PBMC des cas

non pesteux stimulés avec différentes concentrations en antigène F1 et Y. pestis soniqué

-5

0

5

10

15

20

25

30

#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10

% P

op

ula

tio

n S

tim

ulé

e

Numeros des individus testés

Tpos

Tneg

5 µg/ml F1

10 µg/ml F1

5 µg/ml YPS

10 µg/ml YPS

41

Figure 23: Proportion de population stimulée des cas pesteux pour chaque concentration de

deux antigènes.

A) 5 µg/ml de F1.B) 10µg/ml de F1.C) 5 µg/ml de Y. pestis soniqué. D) 10µg/ml de Y. pestis

soniqué.

Les individus cas pesteux étudiés ont été divisés en deux groupes selon la valeur

de leur proportion cellulaire stimulée par rapport à la moyenne des non cas étudiés. Le

premier groupe rassemble les individus dont la valeur de leur proportion cellulaire

stimulée est inférieure à celle de la moyenne des non cas tandis que les individus qui ont

une valeur supérieure à la moyenne constituent le deuxième groupe. La figure 24

résume ce classement des individus. La figure montre que le nombre d’individu

répondeur augmente dans la stimulation avec Y. pestis soniqué surtout avec la

concentration 10 µg/ml. Donc Y. pestis soniqué stimule mieux les PBMC que F1.

42

Figure 24: Classification des individus selon la réponse suite à la stimulation avec les deux

antigènes.

III.2 IMMUNOPHENOTYPAGE

III.2.1 Détermination du volume d’anticorps anti-CD nécessaire pour

chaque test

Pour le marquage extracellulaire avec les anticorps anti-CD couplés avec des

fluorochromes, 5 µl de chaque anticorps par test est suffisant pour bien distinguer les

différentes populations cellulaires présentes dans un échantillon lors de l’acquisition au

CMF (Figure 25). En effet, les différentes proportions cellulaires obtenues n’ont pas

présenté une différence remarquable, qui l’on utilise un volume d’anticorps de 5 ou

10µl par test (Tableau 5).

Tableau 5: Comparaison des proportions des différentes populations cellulaires obtenues selon

le volume d'anticorps utilisé (5 µl et 10 µl/test)

Volume d’anticorps utilisé par

test

Proportions des différentes populations

cellulaires %

CD3 CD4 CD8

5 µl 80,6 50,37 13,70

10 µl 82,6 55,01 11,89

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

5µg/ml F1 10 µg/ml F1 5 µg/ml YPS 10 µg/ml YPS

%

[Antigénes de stimulation]

Non Repondeur

Repondeur

43

Figure 25: Immunophénotypage des différentes populations cellulaires présentes dans un

échantillon selon le volume d’anticorps utilisé: 10µl/test (A) ou 5µl/test (B)

a, d) Cytogrammes montrant la proportion de population lymphocytaire dans un échantillon

selon la taille et la granularité des cellules par rapport au nombre total d’évènement acquis au

CMF. b, c, e, f) Cytogrammes montrant les différentes populations cellulaires après marquage

au FITC anti-CD4; PE anti-CD3; PE-Cy5 anti-CD8. Q1: proportion des cellules dites CD3+

CD4-. Q2: proportion des cellules CD3

+ CD4

+. Q3: proportion des cellules CD3

- CD4

+ (cette

population n’existe jamais en réalité). Q4: proportion des cellules CD3- CD4

-. Q5: proportion

de population cellulaire CD3-CD8

+ (population qui n’existe jamais dans la réalité). Q6:

proportion de population cellulaire CD3+CD8

+. Q7: proportion de population cellulaire CD3

+

CD8-. Q8: proportion de population cellulaire CD3

-CD8

-.

44

III.2.2 Immunophénotypage des PBMC des cas pesteux et non pesteux

après culture cellulaire

III.2.2.1 Hétérogénéité intraindividuelle des cas pesteux et cas non

pesteux

Les résultats de l’immunophénotypage des cas pesteux et non pesteux ont montré

que les proportions de chaque population cellulaire obtenues varient largement d’un

individu à l’autre (Figure 26). Par ailleurs, pour un même individu, elles sont différentes

dans chaque condition de culture.

45

Figure 26: Hétérogénéité des proportions de chaque population cellulaire des cas pesteux et non

pesteux selon les différentes concentrations des deux antigènes.

Cas pesteux (n= 16) Cas non pesteux (n= 10)

46

Les proportions de chaque population des PBMC stimulés et celles du témoin

négatif ont été comparées pour chaque individu selon le test de Wilcoxon-Mann

Whitney. Les valeurs de p (p value) obtenues sont résumées dans les tableaux 6 et 7.

Ainsi, une différence significative a été observée pour les lymphocytes, plus

particulièrement chez les LB des convalescents pesteux après stimulation avec 5 µg/ml

de F1 et 5 µg/ml de Y. pestis soniqué. Dans ce cas, leurs proportions sont inférieures à

celles des témoins négatifs. Par contre, chez les non pesteux, seule la stimulation à 5

µg/ml de F1 a montré une différence. Pour les LT, seules les proportions de LT8 des cas

pesteux ont présenté une différence significative où elles diminuent dans les cas

stimulés.

Par ailleurs, les proportions en monocytes sont significatives avec une stimulation

de 10 µg/ml de F1 et de Y. pestis soniqué chez les cas pesteux (les proportions dans les

cas de stimulation sont supérieures à celles des témoins négatifs). Il en est de même

chez les cas non pesteux.

47

Tableau 6 : Valeur de p value dans les cas pesteux (n=16) et cas non pesteux (n=10) après comparaison de la médiane des différentes sous-populations

cellulaire des PBMC mises en culture sans agent mitogène (témoin négatif) et PBMC mises en culture aves différentes concentrations d’antigène F1

Sous-population

cellulaire

Cas pesteux Cas non pesteux

Condition de

comparaison

p value Condition de

comparaison


comparaison


comparaison

p value

Lymphocytes T neg vs 5µg/ml 0,0038* T neg vs10µg/ml 0,0001* T neg vs 5µg/ml 0,0039* T neg vs10µg/ml 0,0019*

LT T neg vs 5µg/ml 0,1876 T neg vs10µg/ml 0,1319 T neg vs 5µg/ml 0,5748 T neg vs10µg/ml 0,6250

LB T neg vs 5µg/ml 0,0124* T neg vs10µg/ml 0,4887 T neg vs 5µg/ml 0,0273* T neg vs10µg/ml 0,1054

LT4 T neg vs 5µg/ml 0,5994 T neg vs10µg/ml 0,8903 T neg vs 5µg/ml 0,0644 T neg vs10µg/ml 0,2324

LT8 T neg vs 5µg/ml 0,0301* T neg vs10µg/ml 0,0467* T neg vs 5µg/ml 0,6953 T neg vs10µg/ml 0,2753

Monocytes T neg vs 5µg/ml 0,2523 T neg vs10µg/ml 0,0301* T neg vs 5µg/ml 0,1601 T neg vs10µg/ml 0,0039*

Tableau 7 : Valeur de p value dans les cas pesteux (n=16) et cas non pesteux (n=10) après comparaison de la médiane des différentes sous-populations

cellulaire des PBMC mises en culture sans agent mitogène (témoin négatif) et PBMC mises en culture aves différentes concentrations de Y. pestis soniqué

Sous-population

cellulaire

Cas pesteux Cas non pesteux

Condition de

comparaison


comparaison


comparaison


comparaison

p value

Lymphocytes T neg vs 5µg/ml 0,0013* T neg vs10µg/ml 0,0019* T neg vs 5µg/ml 0,0001* T neg vs10µg/ml 0,0019*

LT T neg vs 5µg/ml 0,2523 T neg vs10µg/ml 0,2841 T neg vs 5µg/ml 0,1353 T neg vs10µg/ml 1

LB T neg vs 5µg/ml 0,0102* T neg vs10µg/ml 0,0644 T neg vs 5µg/ml 0,2077 T neg vs10µg/ml 0,0644

LT4 T neg vs 5µg/ml 0,4898 T neg vs10µg/ml 0,9218 T neg vs 5µg/ml 0,2077 T neg vs10µg/ml 0,8457

LT8 T neg vs 5µg/ml 0,0124* T neg vs10µg/ml 0,6250 T neg vs 5µg/ml 0,0015* T neg vs10µg/ml 1

Monocytes T neg vs 5µg/ml 0,1688 T neg vs10µg/ml 0,0273* T neg vs 5µg/ml 0,0883 T neg vs10µg/ml 0,0273*

* : valeur significative

48

III.2.2.2. Comparaison interindividuelle entre cas pesteux et non pesteux

Les résultats dans les deux groupes étudiés (cas pesteux et cas non pesteux) ont

été ensuite comparés en utilisant le Test de Wilcoxon-Mann Whitney comme le montre

les valeurs de p dans le tableau 8. Quant à la comparaison entre les deux groupes

étudiés, il n’y a pas de différence pour les lymphocytes sauf dans le cas de stimulation

avec 10 µg/ml de Y. pestis soniqué. Dans ce cas les proportions des lymphocytes des cas

pesteux sont inférieures à celles des non cas.

Pour les LT, leur proportion dans les PBMC non stimulées (témoin négatif) est

significativement élevée chez les cas pesteux. Par contre aucune différence n’a été

trouvée après stimulation avec les différentes concentrations d’antigène F1 et Y. pestis

soniqué.

Après stimulation, la proportion des LB et LT4 des cas pesteux sont

significativement élevée quelques soient la concentration et la nature des antigènes

utilisés.

Pour la population LT8, la proportion ne présente pas de différence pour les cas

pesteux et non pesteux.

Quant aux monocytes, la proportion des cas non pesteux est significativement

élevée par rapport à celle des cas.

Au cours de cette étude, la proportion des lymphocytes diminue fortement quand

il y a une prolifération cellulaire.

49

Tableau 8: Valeur de p value après comparaison de médiane de population cellulaire stimulée

des cas pesteux (n=16) et cas non pesteux (n=10)

Condition de Stimulation Sous population cellulaire p value

T neg Lymphocyte 0.1016

LT 0.0428*

LB 0.1203

LT4 0.0350*

LT8 0.5305

Monocyte 0.2018

5 µg/ml F1 Lymphocyte 0.1438

LT 0.2222

LB 0.0011*

LT4 0.0066*

LT8 0.8678

Monocyte 0.0709

10 µg/ml F1 Lymphocyte 0.1025

LT 0.0545

LB 0.0079*

LT4 0.0162*

LT8 0.6976

Monocyte 0.0162*

5 µg/ml YPS Lymphocyte 0.0713

LT 0.1014

LB 0.0036*

LT4 0.0079*

LT8 0.8065

Monocyte 0.0264*

10 µg/ml YPS Lymphocyte 0.0115*

LT 0.0638

LB 5.9349E-5*

LT4 0.0135*

LT8 0.2852

Monocyte 0.0225*

*: valeur significative (p< 0,05)

Partie IV: DISCUSSION

50

PARTIE IV : DISCUSSION

Dans le cadre de ce mémoire nous nous sommes fixés comme objectifs (1)

d’identifier les cas de peste asymptomatique, (2) d’étudier la réponse humorale anti-F1

dirigée contre Y. pestis et enfin (3) d’évaluer la réponse cellulaire des différents types de

cas de peste par mise au point du test de prolifération lymphocytaire et

immunophénotypage en utilisant la technique de cytométrie en flux.

(1) L’identification des cas de peste asymptomatique

La peste est surtout connue pour ses symptômes plus ou moins spécifiques et

selon la forme clinique qu’elle présente et aussi pour son taux de mortalité élevée, en

absence de traitement adéquat. Mais de nombreuses considérations ont mentionné

l’existence de la peste asymptomatique (Leroy, 1997; Raharimanga et al., 2001;

Fonquernie, 1931; Leger, 1931; Leger, 1933) qui est restée au stade de concept car les

preuves scientifiques étaient insuffisantes pour confirmer son existence. En effet, des

observations antérieures (Fonquernie, 1931; Leger, 1931; Leger, 1933) ont noté que des

sujets ayant des ganglions minuscules, n’avaient ni douleur ni fièvre et présentaient

apparemment une excellente santé. Pourtant, des bactéries ont été mises en évidence

dans la sérosité de ces microganglions.

Au cours de notre étude, 11 cas de peste asymptomatiques ont été identifiés. Ils

ont été recrutés en zone d’endémie pesteuse avant et après la saison pesteuse.

L’identification s’est basée sur leur séroconversion au cours de ces 2 périodes par la

détection de l’IgG anti-F1 dans leurs plasmas, à leur exposition à divers facteurs relatifs

à la peste et à l’absence de prise de chimioprophylaxie. Des cas similaires d’infection

asymptomatique par Y. pestis ont été déjà rapportés à Madagascar lors des enquêtes

sérologiques (sur un seul sérum) réalisées chez les sujets contacts au cours de deux

épidémies de peste survenues dans les Districts d’Ambatolampy en 1997 (Ratsitorahina

et al, 2000) et d’Ikongo en 1998 (Migliani et al., 2001). Environ 10% de la population

contact ont montré une séroprévalence à la peste au cours de ces 2 épidémies mais on ne

peut pas exclure une décapitation de l’infection par chimioprophylaxie. Par ailleurs, une

étude menée en Chine a fait état d’individus ayant une forme asymptomatique de peste

(Li et al., 2005). Il s’agit de 25/63 chasseurs de marmottes séropositifs mais ne

présentant pas de signe clinique de la peste. Dans ces études, un seul sérum par

personne a été testé et l’absence de symptômes a été expliquée par la prise de

chimioprophylaxie tels que la sulfamethoxazole ou la tétracycline en automédication.

51

On ne peut donc pas les assimiler à la peste asymptomatique. Dans notre étude,

l’utilisation de pair de sérums a permis d’avoir une certitude sur le statut sérologique de

l’individu avant et après la saison pesteuse. De plus, le questionnaire administré

individuellement a aussi permis d’exclure ceux qui auraient pu développer la maladie

mais restés à l’état subclinique par prise d’antibiotique. Néanmoins, ce genre d’étude

n’était pas sans difficulté dû à la réticence de la population à être prélevé mais aussi aux

moyens logistiques mis en œuvre pour sa réalisation.

(2) Etude de la réponse humorale anti-F1 dirigée contre Y. pestis

La réponse immunitaire humorale chez 3 catégories d’individus a été testée par la

technique ELISA qui détecte la présence d’anticorps IgG anti-F1. Comme attendu,

aucun anticorps anti-F1 n’a été détecté chez les cas non pesteux. Ce résultat semble

normal étant donné que ces personnes n’ont jamais eu d’antécédent d’infection

pesteuse. Cela démontre également la spécificité du test ELISA utilisé.

Chez les cas pesteux, l’analyse sérologique des 33 patients confirmés de peste a

montré des résultats très hétérogènes. En effet, parmi eux 22 individus ont été

séropositifs et 11 séronégatifs. Chez les 22 individus séropositifs, l’anticorps peut être

détecté de 1 mois jusqu’à 14 ans après l’infection. Et pour les 11 séronégatifs,

l’anticorps disparaît entre 5 mois à 12 ans. Dans notre étude, l’anticorps anti-F1 peut

persister jusqu’à 14 ans post infection alors que jusqu’à 6 ans dans celle de

Rasoamanana et ses collaborateurs (Rasoamanana et al., 1997). Nos résultats

confirment ceux de Li et ses collègues (Li et al., 2012). Dans leur étude faite sur des

convalescents pesteux chinois, ils ont trouvé que l’anticorps persiste de quelques années

jusqu’à plus d’une décennie. Donc la différence entre ces trois études peut être

s’expliquée par le nombre des échantillons différent (n= 9 dans l’étude de Rasoamanana

et ses collaborateurs, n= 33 dans notre étude et n= 65 dans celle de Li et ses collègues).

La durée de la persistance des anticorps contre la peste est donc largement variable d’un

individu à l’autre. Et on pourrait alors s’attendre à trouver une durée de persistance très

longue si on augmentera encore le nombre des échantillons. Cette variabilité en IgG

anti-F1 pourrait être liée au laps de temps passé entre le début de leur maladie et leur

date de prélèvement sanguin. Cependant, l’analyse de nos résultats a montré qu’elle

n’était ni associée à cette période (p= 0,394 ; test de corrélation de Spearman) ni à

d’autres paramètre tels que le sexe (avec p= 1 ; test de Chi2) ou l’âge de l’individu (p=

0,394 ; test de corrélation de Spearman). Cette observation a aussi été retrouvée par Li

52

et ses collègues (Li et al., 2012). Cette différence de réponse peut être due à un ou des

facteurs intrinsèques à chaque individu. Par ailleurs, en se focalisant uniquement sur les

cas pesteux ayant une sérologie positive en anticorps anti-F1, on peut encore les

subdiviser en 2 groupes d’individus: les «fort répondeurs» (ayant une DO>1) et les

«faible répondeurs» (ayant une DO<1) (Rasoamanana et al., 1997). Ainsi 54,5% étaient

des «fort répondeurs» et 45,4% des «faible répondeurs» ce qui est aussi en accord avec

les résultats obtenus précédemment (Rasoamanana et al., 1997). Nous avons vu que ce

phénomène ne dépend pas non plus du sexe (p= 0,092 ; test de Chi2).

Nos résultats montrent également une différence significative entre les sujets

«faible répondeurs» et «fort répondeurs» chez les cas asymptomatiques et les cas

confirmés de peste (p= 0,011 ; test de Chi2). Plus précisément, la majorité des cas

asymptomatiques sont des individus «faible répondeurs» alors que la plupart des

individus pesteux sont des «fort répondeurs». Pour expliquer cette différence, on

pourrait supposer que chez les personnes présentant la forme asymptomatique, la dose

bactérienne reçue est inférieure à la dose infectante. Donc elles ont produit des anticorps

mais une quantité faible est suffisante pour éliminer l’agent pathogène et par conséquent

n’entraine pas de symptôme grave de la maladie.

(3) Evaluation de la réponse cellulaire par mise au point du test de prolifération

lymphocytaire et immunophénotypage en utilisant la technique de cytométrie en flux.

Les résultats obtenus par différents essais de congélation des PBMC ont été très

variés. Ainsi, dans l’étude de la réponse cellulaire, la meilleure solution était d’utiliser

les PBMC à l’état frais. Cependant, dans un cas où ils doivent être conservés, il est

nécessaire d’utiliser la boîte de congélation Mr Frosty. Néanmoins la conservation ne

peut pas dépasser une semaine à -80°C. Dans cette présente étude, il a été trouvé que

l’utilisation de l’azote liquide n’est pas conseillée pour la conservation.

Pour la mise au point du TPL, la concentration de CFSE optimale pour marquer

les cellules avant de les mettre en culture a été de 2,5 µM par ml de suspension

cellulaire. L’utilisation de CFSE pour le suivi de la prolifération lymphocytaire est très

intéressante de par sa forte intensité de fluorescence et sa faible toxicité pour les cellules

(Quah & Parish, 2010). Par ailleurs, elle permet de suivre la prolifération jusqu’à la 8e

division cellulaire et la migration des cellules in vivo (Parish & Warren, 2001). Et elle

peut tout aussi bien être utilisée dans des études in vitro qu’in vivo. De plus, elle permet

l’étude de l’apoptose et peut être couplée avec l’immunophénotypage. L’étude de la

53

prolifération cellulaire peut également être faite par ajout de thymidine tritiée qui sera

incorporée dans l’ADN des cellules filles nouvellement formées. Dans ce cas, la mesure

de la prolifération se fait par la mesure de la quantité de thymidine incorporée à l’aide

d’un appareil compteur-β (Duché & Barré, 2005). Cependant, son utilisation présente

plus de risque du fait de sa radioactivité et donc de son élimination. Même si

l’utilisation de CFSE est très avantageuse, elle a aussi ses limites car son utilisation à

une concentration très élevée (à partir de 0.75µM) a une influence sur l’étude et surtout

très toxique pour les cellules (Parish & Warren, 2001).

La détermination de l’agent mitogène pour le contrôle positif de la culture

cellulaire a montré que le PHA à 5µg/ml est meilleur que la ConA. Les deux sont des

agents mitogènes très classiques pour l’étude de la prolifération lymphocytaire mais

pour les lymphocytes humains plusieurs études ont utilisé le PHA (Padureanu et al.,

2003; Casella-Martins et al., 2015; Wanschitz et al., 2005; Carloni et al., 2001).

Dans notre étude, après stimulation des PBMC avec les différents antigènes de Y.

pestis, les résultats de la prolifération cellulaire ont été très hétérogènes. Chez les cas

non pesteux une stimulation de la prolifération cellulaire a été observée pour les deux

antigènes utilisés. Ce fait a été déjà retrouvé dans d’autres cas d’infections bactériennes

telles qu’une infection à Mycobacterium tuberculosis (Huygen et al., 1988; Padureanu

et al., 2003) et à Helicobacter pylori (Birkholz et al., 1993). Dans ces deux cas,

l’investigation du rôle de l’IL-2 dans la réponse cellulaire des individus non infectés a

démontré que la dérégulation de la production de cette molécule d’interleukine est un

facteur critique pour la réponse. Ils ont trouvé que la réponse est inhibée par l’addition

de l’anticorps anti-IL-2 récepteur (Birkholz et al., 1993; Toossi et al., 1986).

Chez les cas pesteux, la stimulation avec du Y. pestis soniqué a permis d’avoir une

meilleure réponse qu’avec l’antigène F1. Cela peut s’expliquer par le fait qu’il possède

d’autres protéines antigéniques capables d’induire une réponse cellulaire autre que F1.

Une étude similaire a rapporté une observation de prolifération cellulaire lorsque les

PBMC des convalescents pesteux (prélevés entre 2 à 24 mois après leur début de la

maladie) ont été stimulés avec de l’Ag F1 à 10 µg/ml (Del Prete et al., 2009). Par

contre, l’étude de Li et ses collègues a montré qu’aucune réponse cellulaire mémoire

contre l’Ag F1 et LcrV de Y. pestis n’a pu être détectée chez des convalescents pesteux

après 4 à 6 ans d’infection pesteuse (Li et al., 2012). Dans cette étude chinoise, la

réponse mémoire a été étudiée en dosant la cytokine IFNγ produite par les PBMC après

54

stimulation avec les antigènes mais aucune différence n’a été trouvée pour les

convalescents pesteux et pour les contrôles négatifs. Outre le fait que F1 n’est pas un

antigène dominant pour les lymphocytes, l’absence de la réponse mémoire s’explique

également par le fait que la réponse cellulaire contre l’Ag F1 et LcrV ait été produite

dans la phase aigüe et la phase de convalescence de la maladie mais ne persiste pas

longtemps.

La technique utilisant la CFSE peut aussi avoir une influence directe sur les

résultats. En effet, même si actuellement elle est largement utilisée dans l’étude de la

lymphoprolifération; le fait qu’elle peut perturber la fonction cellulaire ne peut pas être

exclue (De Clerck et al., 1994; Lašt’ovička et al., 2009; Nolte et al., 2004). Par ailleurs,

dans notre étude, les individus considérés comme non cas pesteux ne proviennent pas de

zones non endémiques de la peste.

Dans cette étude, seules les réponses cellulaires des cas confirmés de peste et des

cas non pesteux ont pu être réalisées. Comme il était déjà indiqué plus haut, les PBMC

des cas asymptomatiques n’ont pas pu être récupérées après conservation dans l’azote

liquide. Cette étude supplémentaire sera effectuée ultérieurement mais ne fera

malheureusement pas partie de ce mémoire.

Pour la mise au point de l’immunophénotypage, nous n’avons pas vu une

différence entre les proportions des cellules avec les deux volumes d’anticorps utilisés

(5 et 10 µl). Mais une légère différence a été noté par rapport aux proportions normaux

(Servan et al., 2012). Pour les individus testés ; une grande variation existe. Cette

variation a été déjà remarquée par des études antérieures : celle d’Autissier et ses

collègues qui a été menée sur des 9 individus sains volontaires lors de l’évaluation des

sous-populations cellulaires en utilisant un cytomètre à 12 couleurs.(Autissier, et al.,

2010) et celle de Williamson et ses collaborateurs qui a été faite sur des individus sains

volontaires vaccinés avec les antigènes F1 et V recombinants (Williamson et al, 2005).

L’immunophénotypage effectué avant et après l’administration des vaccins n’ont pas

présenté de différence en termes de proportions cellulaire. L’immunophénotypage est

une technique très intéressante pour l’étude de différentes populations cellulaires en

immunologie. Son intérêt repose surtout sur la reconnaissance du type de réponse mise

en jeu et également sur la variation de nombre d’une population cellulaire lors d’une

infection (Lees, 2000).

55

L’utilisation de la CMF, qui est une technique incontournable dans le domaine de

l’immunologie présente beaucoup d’intérêt. Elle permet premièrement une analyse

multiparamétrique (taille, fluorescence des cellules). C’est une technique rapide

permettant l’analyse d’un grand nombre des cellules en un temps très court. Elle permet

de faire une analyse aussi bien quantitative que qualitative des cellules (Brown &

Wittwer, 2000; Bakke, 2001).

Partie V: CONCLUSION

ET PERSPECTIVE

56

PARTIE V : CONCLUSION ET PERSPRCTIVE

L’identification des cas de peste asymptomatique est une première à être menée à

Madagascar. Bien qu’ils ne représentent que 11 individus sur 533, recrutés dans 3

fokontany de communes d’endémie pesteuse, on pourrait étendre la zone d’étude pour

avoir plus de chance de retrouver d’autres cas asymptomatiques. Cependant, il est

important de savoir quel serait leur rôle dans l’épidémiologie de la peste: sont-ils juste

des porteurs sains ou sont-ils infectieux et pourraient alors transmettre la maladie?

Les résultats obtenus concernant la réponse immunitaire contre la peste suggèrent

qu’elle varie largement d’un individu à l’autre. En effet, l’étude de la réponse humorale

a démontrée qu’elle était bien fonctionnelle lors d’une infection pesteuse et qu’elle peut

persister pendant des années durant la phase de convalescence. Cependant, les études de

la réponse cellulaire faites jusqu’ici n’ont pas données d’éléments suffisants pour bien

comprendre la génération de la réponse mémoire. Ceci pourrait constituer un obstacle

pour la recherche d’un vaccin efficace contre la peste car l’action combinée des

réponses humorale et cellulaire est essentielle pour assurer la protection contre la

maladie. Des études complémentaires seront à envisager tels que le dosage des anticorps

produits par les plasmocytes et les cytokines produites par les cellules après stimulation

des PBMC avec des antigènes de Y. pestis. L’étude sur les marqueurs membranaires des

cellules mémoires et les cellules régulatrices compléteraient également les informations.

REFERENCES

BIBLIOGRAPHIQUES

57

Alonso, A., Bottini, N., Bruckner, S., Rahmouni, S., Williams, S., Schoenberger, S.

P., & Mustelin, T. , 2004. Lck Dephosphorylation at Tyr-394 and Inhibition of T Cell

Antigen Receptor Signaling by Yersinia Phosphatase YopH. Journal of Biological

Chemistry, 279(6), pp 4922–4928.

Andrianaivoarimanana, V., Kreppel, K., Elissa, N., Duplantier, J.-M., Carniel, E.,

Rajerison, M., & Jambou, R. , 2013. Understanding the Persistence of Plague Foci in

Madagascar. PLOS Neglected Tropical Diseases, 7(11), pp 1–8.

Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., & Williams, K. C. , 2010. Evaluation of a 12-

color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in

humans. Journal of International Society for Advancement of Cytometry, 77, pp 410–

419.

Bakke, A. C. , 2001. The Principles of Flow Cytometry. Laboratorymedicine, 32(4), pp

207–211.

Bartl, S., Baish, M., Weissman, I. L., & Diaz, M. , 2003. Did the molecules of

adaptive immunity evolve from the innate immune system? Integrative and

Comparative Biology, 43, pp 338–346.

Bartra, S. S., Styer, K. L., O’Bryant, D. M., Nilles, M. L., Hinnebusch, B. J.,

Aballay, A., & Plano, G. V. , 2008. Resistance of Yersinia pestis to Complement-

Dependent Killing Is Mediated by the Ail Outer Membrane Protein. Infection and

Immunity, 76(2), pp 612–622.

Ben-Gurion, R., & Hertman, I. , 1958. Bacteriocin-like Material Produced by

Pasteurella pestis. J. Gen. Microbiol., 19, pp 289–297.

Ben-Gurion, R., & Shafferman, A. , 1981. Essential virulence determinants of

different Yersinia species are carried on a common plasmid. Plasmid, 5(2), pp 183–187.

Birkholz, S., Knipp, U., & Opferi, W. , 1993. Stimulatory Effects of Helicobacter

pylori on Human Peripheral Blood Mononuclear Cells of H. pylori Infected Patients and

Healthy Blood Donors. Zbl. Bakt, 280, pp 166–176.

Blanchy, A., Ranaivoson, G., & Rakotojanabelo, A. (n.d.). Epidémiologie Clinique

de la peste à Madagascar. Unité de Surveillance Epidémiologique -Ministère de La

Santé, B.P. 460, 101 Antananarivo, pp 27–34.

Bliska, J. B., Ryndak, M. B., & Grabenstein, J. P. (n.d.). Type III Secretion Systems

in Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis. Bacterial Genomes and Infectious

Diseases, pp 213–226.

Blum, J. S., Wearsch, P. A., & Cresswell, P. , 2013. Pathways of antigen processing.

Annual Review of Immunology, 31, pp 443–473.

Boland, A., & Cornelis, G. R. , 1998. Role of YopP in suppression of tumor necrosis

factor alpha release by macrophages during Yersinia infection. Infection and Immunity,

66(5), pp 1878–1884. Retrieved from

58

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=108138&tool=pmcentrez&r

endertype=abstract\nhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9573064\nhttp://www.pubm

edcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=PMC108138

Boyer, S., Miarinjara, A., & Elissa, N. , 2014. Xenopsylla cheopis (Siphonaptera:

Pulicidae) Susceptibility to deltamethrin in Madagascar. PLoS ONE, 9(11), pp e111998.

Braciale, T. J., & Braciale, V. L. , 1991. Antigen presentation:structural themes and

functional variations. Immunology Today, 12(4), pp 124–129.

Brown, M., & Wittwer, C. , 2000. Flow cytometry: Principles and clinical applications

in hematology. Clinical Chemistry, 46(8 B), pp 1221–1229.

Brubaker, R. R. , 1991. Factors Promoting Acute and Chronic Diseases Caused by

Yersiniae. Clinical Microbiology Reviews, 4(3), pp 309–324.

Brubaker, R. R. , 2003. Interleukin-10 and Inhibition of Innate Immunity to Yersiniae : Roles of Yops and LcrV ( V Antigen ). Infection and Immunity, 71(7), pp 3673–3681.

Bruckner, S., Rhamouni, S., Tautz, L., Denault, J. B., Alonso, A., Becattini, B.,

Salvesen, G. S., & Mustelin, T. , 2005. Yersinia phosphatase induces mitochondrially

dependent apoptosis of T cells. Journal of Biological Chemistry, 280(11), pp 10388–

10394.

Brygoo, E. R. , 1966. Epidémiologie de la peste à Madagascar. Archives de l’Institut

Pasteur de Madagascar, 35, pp 9–147.

Cabanel, N., Bouchier, C., Rajerison, M., & Carniel, E. , 2017. Plasmid-mediated

doxycycline resistance in a Yersinia pestis strain isolated from a rat. International

Journal of Antimicrobial Agents.

Cantwell, A. M., Bubeck, S. S., & Dube, P. H. , 2010. YopH inhibits early pro-

inflammatory cytokine responses during plague pneumonia. BMC Immunology, 11(29),

pp 1–11.

Carloni, M., Meschini, R., Ovidi, L., & Palitti, F. , 2001. PHA-induced cell

proliferation rescues human peripheral blood lymphocytes from X-ray-induced

apoptosis hierarchically preceded by the so-called large scale DNA. Mutagenesis, 16(2),

pp 115–120.

Casella-Martins, A., Ayres, L. R., Burin, S. M., Morais, F. R., Pereira, J. C.,

Faccioli, L. H., Sampaio, S. V., Arantes, E. C., Castro, F. A., & Pereira-Crott, L. S. , 2015. Immunomodulatory activity of Tityus serrulatus scorpion venom on human T

lymphocytes. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases,

21(46), pp 1–8.

Champetier de Ribes, G., Rasoamanana, B., Randriambelosoa, J., Rakoto, L.-J.,

Rabeson, D., & Chanteau, S. , 1997. La peste à Madagascar: données

épidémiologiques de 1989 à 1995 et programme national de lutte. Cahiers Santé, 7, pp

53–60.

59

Chanteau, S., Boisier, P., Carniel, E., Duchemin, J. B., Duplantier, J.-M.,

Goodman, S. M., Handschumacher, P., Jeanne, I., Laventure, S., Mauclère, P.,

Migliani, R., Rabeson, D., Rahalison, L., Rasolofonirina, N., Ratsifasoamanana, L.,

Rasoamanana, B., Ratsitorahina, M., Ratovonjato, J., Rosso, M.-L., Roux, J., &

Tall, A. , 2006. Atlas de la peste à Madagascar. (IRD, Ed.) (IRD/IP/AUF). Paris:

Duffusion.

Chanteau, S., Nato, F., & Migliani, R. , 2003. L’intérêt des tests rapides par

immunochromatographie pour la surveillance des maladies à caractère épidémique dans

les pays en développement: l'exemple de la peste à Madagascar. Medecine Tropicale,

63, pp 574–576.

Chanteau, S., Rahalison, L., Ralafiarisoa, L., Foulon, J., Ratsitorahina, M.,

Ratsifasoamanana, L., Carniel, E., & Nato, F. , 2003. Development and testing of a

rapid diagnostic test for bubonic and pneumonic plague. The Lancet, 361, pp 211–216.

Chanteau, S., Ratsifasoamanana, L., Rasoamanana, B., Rahalison, L.,

Randriambelosoa, J., Roux, J., & Rabeson, D. , 1998. La peste, une maladie ré-

émergente à Madagascar -. Retrieved January 26, 2016, from

http://wwwnc.cdc.gov/eid/page/98-0114FR

Cornelis, G. R. , 2002. Yersinia type III secretion: Send in the effectors. Journal of Cell

Biology, 158(3), pp 401–408.

Coulanges, P. , 1983. Cinquantenaire du vaccin antipesteux EV. Archive de l’Institut

Pasteur de Madagascar, 50(1), pp 169–184.

De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., & Stevens, W. J. ,

1994. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to

endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of

Immunological MethodsJournal of Lmmunological Methods, 172, pp 115–124.

Del Prete, G., Santi, L., Andrianaivoarimanana, V., Amedei, A., Domarle, O.,

D’Elios, M. M., Arntzen, C. J., Rahalison, L., & Mason, H. S. , 2009. Plant

derivedrecombinant F1, V, and F1-V fusion antigens of Yersinia pestisactivate human

cells of the innate and adaptive immune system. International Journal of

Immunopathology and Pharmacology, 22(1), pp 133–143.

Demeure, C., Dubos, M., & Carniel, E. , 2013. La peste, maladie ré-émergente.

Association Des Anciens Elèves de l’Institut Pasteur, 55(214), pp 5–9.

Derewenda, U., Mateja, A., Devedjiev, Y., Routzahn, K. M., Evdokimov, A. G.,

Derewenda, Z. S., & Waugh, D. S. , 2004. The Structure of Yersinia pestis V-Antigen

, an Essential Virulence Factor and Mediator of Immunity against Plague National

Cancer Institute at Frederick. Structure, 12, pp 301–306.

Du, Y., Rosqvist, R., & Forsberg, Å. , 2002. Role of Fraction 1 Antigen of Yersinia

pestis in Inhibition of Phagocytosis. Infection and Immunityction and I, 70(3), pp 1453–

1460.

60

Duché, J. C., & Barré, J. , 2005. Le test de transformation lymphocytaire. Document

Pour Le Médecin de Travail, (103), pp 323–326.

Duchemin, J. B., Duplantier, J. M., Goodman, S., Ratovonjato, J., Rahalison, L., &

Chanteau, S. , 2007. La Peste à Madagascar: faune endémique et foyers sylvatiques. In

M. Signoli, D. Chevé, P. Adalian, G. Boëtsch, & O. Dutour (Eds.), Peste: entre

épidémies et sociétés (Fireinze U, pp. 247–254). Fireinze.

Duplantier, J. M., Duchemin, J. B., Chanteau, S., & Carniel, E. , 2005. From the

recent lessons of the Malagasy foci towards a global understanding of the factors

involved in plague reemergence. Veterinary Research, 36, pp 437–453.

Fadok, V. A. ., De Cathelineau, A., Daleke, D. L., Henson, P. M., & Bratton, D. L. ,

2001. Loss of phospholipid asymmetry and surface exposure of phosphatidylserine is

required for phagocytosis of apoptotic cells by macrophages and fibroblasts. Journal of

Biological Chemistry, 276(2), pp 1071–1077.

Fadok, V. A., Bratton, D. L., Frasch, S. C., Warner, M. . L., & Henson, P. M. ,

1998. The role of phosphatidylserine in recognition of apoptotic cells by phagocytes.

Cell Death and Differentiation, 5, pp 551–562.

Feodorova, V. A., & Motin, V. L. , 2012. Plague vaccines : current developments and

future perspectives. Emerging Microbes & Infections, 1, pp 1–5.

Ferber, D. M., & Brubaker, R. R. , 1981. Plasmids in Yersinia pestis. Infection and

Immunity, 31(2), pp 839–841.

Fields, K. A., Nilles, M. L., Cowan, C., & Straley, S. C. , 1999. Virulence role of V

antigen of Yersinia pestis at the bacterial surface. Infection and Immunity, 67(10), pp

5395–5408.

Fields, K. A., & Straley, S. C. , 1999. LcrV of Yersinia pestis enters infected

eukaryotic cells by a virulence plasmid-independent mechanism. Infection and

Immunity, 67(9), pp 4801–4813.

Filippov, A. A., Solodovnikov, N. S., Kookleva, L. M., & Protsenko, O. A. , 1990.

Plasmid content in Yersinia pestis strains of different origin. FEMS Microbiology

Letters, 67, pp 45–48.

Fonquernie, J. , 1931. Observation sur un cas de pestis minor. Bulletin de La Societé

Pathologique Exotique, 24, pp 446–448.

Fukuto, H. S., Svetlanov, A., Palmer, L. E., Karzai, A. W., & Bliska, J. B. , 2010.

Global Gene Expression Profiling of Yersinia pestis Replicating inside Macrophages

Reveals the Roles of a Putative Stress-Induced Operon in Regulating Type III Secretion

and Intracellular Cell Division. Infection and Immunity, 78(9), pp 3700–3715.

61

Galimand, M., Carniel, E., & Courvalin, P. , 2006. Resistance of Yersinia pestis to

antimicrobial agents. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50(10), pp 3233–3236.

Galimand, M., Guiyoule, A., Gerbaud, G., Rasoamanana, B., Chanteau, S.,

Carniel, E., & Courvalin, P. , 1997. Multidrug resistance in Yersinia pestis mediated

by a transferable plasmid. The New England Journal of Medicine, 337(10), pp 677–680.

Gerke, C., Falkow, S., & Chien, Y. , 2005. The adaptor molecules LAT and SLP-76

are specifically targeted by Yersinia to inhibit T cell activation. The Journal of

Experimental Medicine, 201(2), pp 361–71.

Ghosh, P. , 2004. Process of Protein Transport by the Type III Secretion System.

Microbiology and Molecular Biology Reviews, 68(4), pp 771–795.

Grosdent, N., Maridonneau-Parini, I., Sory, M., & Cornelis, G. R. , 2002. Role of

Yops and Adhesins in Resistance of Yersinia enterocolitica to Phagocytosis. Infection

and Immunity, 70(8), pp 4165–4176.

Harlow, E., & Lane, D. , 1991. Anticorps un manuel de laboratoire.

Hinnebusch, B. J., Jarrett, C. O., Callison, J. A., Gardner, D., Buchanan, S. K., &

Plano, G. V. , 2011. Role of the Yersinia pestis Ail Protein in Preventing a Protective

Polymorphonuclear Leukocyte Response during Bubonic Plague. Infection and

Immunity, 79(12), pp 4984–4989.

Hinnebusch, B. J., Rudolph, A. E., Cherepanov, P., Dixon, J. E., Schwan, T. G., &

Forsberg, Å. , 2002. Role of Yersinia Murine Toxin in Survival of Yersinia pestis in the

Midgut of the Flea Vector. Science, 296, pp 733–735.

Holmström, A., Olsson, J., Cherepanov, P., Maier, E., Nordfelth, R., Pettersson, J.,

Benz, R., Wolf-Watz, H., & Forsberg, Å. , 2001. LcrV is a channel size-determining

component of the Yop effector translocon of Yersinia. Molecular Microbiology, 39(3),

pp 620–632.

Hood, L., Kronenberg, M., & Hunkapiller, T. , 1985. T cell antigen receptors and the

immunoglobulin supergene family. Cell, 40, pp 225–229.

Hu, P., Elliott, J., McCready, P., Skowronski, E., Garnes, J., Kobayashi, A.,

Brubaker, R. R., Cready, P. M. C., Brubaker, R. R., & Garcia, E. , 1998. Structural

Organization of Virulence-Associated Plasmids of Yersinia pestis. Journal of

Bacteriology, 180(19), pp 5192–5202. Retrieved from

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Cita

tion&list_uids=9748454

Huygen, K., Van Vooren, J. ‐P, Turneer, M., Bosmans, R., Dierckx, P., & De

Bruyn, J. , 1988. Specific Lymphoproliferation, Gamma Interferon Production, and

Serum Immunoglobulin G Directed against a Purified 32 kDa Mycobacterial Protein

Antigen (P32) in Patients with Active Tuberculosis. Scandinavian Journal of

Immunology, 27, pp 187–194.

62

Jones, S. M., Griffin, K. F., Hodgson, I., & Williamson, E. D. , 2003. Protective

efficacy of a fully recombinant plague vaccine in the guinea pig. Vaccine, 21(25-26), pp

3912–3918.

Kawahara, K., Tsukano, H., Watanabe, H., Lindner, B., & Matsuura, M. , 2002.

Modification of the Structure and Activity of Lipid A in Yersinia pestis

Lipopolysaccharide by Growth Temperature Modification of the Structure and Activity

of Lipid A in Yersinia pestis Lipopolysaccharide by Growth Temperature. Society,

70(8), pp 4092–4098.

Kolodziejek, A. M., Hovde, C. J., & Minnich, S. A. , 2012. Yersinia pestis Ail : multiple roles of a single protein. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2,

pp 1–10.

Lašt’ovička, J., Budinský, V., Špíšek, R., & Bartůňková, J. , 2009. Assessment of

lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of

activation markers. Cellular Immunology, 256, pp 79–85.

Laventure, S., Rasoamanana, B. ., Boisier, P., Rasolomaharo, M., Rahilison, L.,

Randriantsoa, J., Andrianirina, Z., Chanteau, S., Duplantier, J. M., Rakoto, L.,

Eppel, G., Andriamahefazafy, B., Randriantsimaniry, D., & Roux, J. (n.d.).

Epidémies de peste urbaine à Majunga, côte ouest de Madagascar.

Lees, O. , 2000. Immunophenotypage: apport de la cytométrie à la biologie clinique.

Revue Française Des Laboratoires, 2000(327), pp 91–103.

Leger, M. , 1931. A propos de la communication de Fonquernie sur des cas de Pestis

minor. Bulletin de La Societé Pathologique Exotique, 24, pp 44_–450.

Leger, M. , 1933. Pestis levissima. Bulletin de La Societé Pathologique Exotique, 26,

pp 762–764.

Lemaître, N., Sebbane, F., Long, D., & Hinnebusch, B. J. , 2006. Yersinia pestis

YopJ Suppresses Tumor Necrosis Factor Alpha Induction and Contributes to Apoptosis

of Immune Cells in the Lymph Node but Is Not Required for Virulence in a Rat Model

of Bubonic Plague. Infection and Immunity, 74(9), pp 5126–5131.

Leroy, F. , 1997. Etude séro-épidémiologique de la peste humaine à Madagascar.

Annales de Biologie Clinique, 55(4), pp 332–336.

Li, B., Du, C., Zhou, L., Bi, Y., Wang, X., Wen, L., Guo, Z., Song, Z., & Yang, R. ,

2012. Humoral and Cellular Immune Responses to Yersinia pestis Infection in Long-

Term Recovered Plague Patients. Clinical and Vaccine Immunology, 19(2), pp 228–

234.

Li, B., & Yang, R. , 2008. Interaction between Yersinia pestis and the Host Immune

System. Infection and Immunity, 76(5), pp 1804–1811.

63

Li, M., Song, Y., Li, B., Wang, Z., Yang, R., Jiang, L., & Yang, R. , 2005.

Asymptomatic Yersinia pestis Infection , China. Emerging Infectious Diseases, 11(9),

pp 1494–1495.

Lindner, I., Torrvellas-garcia, J., Kolonias, D., Carlson, L. M., Tolba, K. A., Plano,

G. V., & Lee, K. P. , 2007. Modulation of dendritic cell differentiation and function by

YopJ of Yersinia pestis. European Journal of Immunology, 37, pp 2450–2462.

Male, D. , 2002. Introduction au système immunitaire. In Immunologie (pp. 1–12).

Marshall, J. D., Quy, D. V., & Gibson, F. L. , 1967. Asymptomatique pharyngeal

plague infection in Vietnam. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene,

16(2), pp 175–177.

Medzhitov, R., & Janeway, C. , 2000. Innate Immunity. The New England Journal of

Medicine, 343(5), pp 338–344.

Meyer, K. F. , 1970. Effectiveness of Live or Killed Plague Vaccines in Man. Bulletin

de l’Organisation Mondiale de La Santé, 42, pp 653–666.

Migliani, R., Ratsitorahina, M., Rahalison, L., Rakotoarivony, I., Duchemin, J. B.,

Duplantier, J. M., Rakotonomenjanahary, J., & Chanteau, S. , 2001. Résurgence de

la peste dans le district d ’ Ikongo à Madagascar en 1998: Aspects épidémiologiques

dans la population humaine. Bulletin de La Societé Pathologique Exotique, 94(2), pp

115–118.

Miller, V. L., Bliska, J. B., & Falkow, S. , 1990. Nucleotide sequence of the Yersinia

enterocolitica gene and characterization of the Ail gene product. Journal of

Bacteriology, 172(2), pp 1062–1069.

Monack, D. M., Mecsas, J., Ghori, N., & Falkow, S. , 1997. Yersinia signals

macrophages to undergo apoptosis and YopJ is necessary for this cell death.

Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 94, pp 10385–10390.

Murakami, Y., Tian, L., Voss, O. H., Margulies, D. . H., Krzewski, K., & Coligan,

J. . E. , 2014. CD300b regulates the phagocytosis of apoptotic cells via

phosphatidylserine recognition. Cell Death and Differentiation, 21, pp 1746–1757.

Nakajima, R., & Brubaker, R. R. , 1993. Association between Virulence of Yersinia

pestis and Suppression of Gamma Interferon and Tumor Necrosis Factor Alpha.

Infection and Immunity, 61(1), pp 23–31.

Nakajima, R., Motin, V. L., & Brubaker, R. R. , 1995. Suppression of cytokines in

mice by protein A-V antigen fusion peptide and restoration of synthesis by active

immunization. Infection and Immunity, 63(8), pp 3021–3029.

Nedialkov, Y. A., Motin, V. L., & Brubaker, R. R. , 1997. Resistance to

lipopolysaccharide mediated by the Yersinia pestis V antigen-polyhistidine fusion

peptide: Amplification of interleukin-10. Infection and Immunity, 65(4), pp 1196–1203.

64

Nolte, M. A., Kraal, G., & Mebius, R. E. , 2004. Effects of fluorescent and

nonfluorescent tracing methods on lymphocyte migration in vivo. Cytometry Part A,

61A, pp 35–44.

OMS. , 1999. Manuel de la peste: Epidémiologie,répartition, surveillance et lutte.

Padureanu, L., Cozmei, C., Sorete-Arbore, A., Gramada, D., Arama, S., Mihaescu,

T., & Carasevici, E. , 2003. Flow Cytometric Analysis of specific proliferation in

Tuberculosis using the CFSE Dye dilution technique. The Journal of Preventive

Medicine, 11(1), pp 67–74.

Parish, C. R., & Warren, H. S. , 2001. Use of the Intracellular Fluorescent Dye CFSE

to Monitor Lymphocyte Migration. Current Protocols in Immunology, 4.9.1 -

4.(Supplement 49), pp 10p.

Perry, R. D., & Fetherston, J. D. , 1997. Yersinia pestis -Etiologic agent of plague.

Clinical Microbiology Reviews, 10(1), pp 35–66. Retrieved from

http://cmr.asm.org/content/10/1/35.full.pdf

Pollitzer, R. , 1954. La peste. (Masson & Compagnie, Eds.). Genève: OMS.

Porat, R., McCabe, W. R., & Brubaker, R. R. , 1995. Lipopolysaccharide associated

resistance to killing of yersiniae by complement. Journal of Endotoxin Research, 2, pp

91–97.

Portnoy, D. A., Blank, H. F., Kingsbury, D. T., & Falkow, S. , 1983. Genetic analysis

of essential plasmid determinants of pathogenicity in Yersinia pestis. Journal of

Infectious Diseases, 148(2), pp 297–304. Retrieved from

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Cita

tion&list_uids=6310003

Posevitz-Fejfár, A., Posevitz, V., Gross, C. C., Bhatia, U., Kurth, F., Schütte, V.,

Bar-Or, A., Meuth, S. G., & Wiendl, H. , 2014. Effects of Blood Transportation on

Human Peripheral Mononuclear Cell Yield, Phenotype and Function: Implications for

Immune Cell Biobanking. PLoS ONE, 9(12), pp e115920.

Prentice, M. B., & Rahalison, L. , 2007. Plague. The Lancet, 369, pp 1196–1207.

Pujol, C., & Bliska, J. B. , 2003. The Ability To Replicate in Macrophages Is

Conserved between Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis. Infection and

Immunity, 71(10), pp 5892–5899.

Quah, B. J. C., & Parish, C. R. , 2010. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate

Succinimidyl Ester ( CFSE ) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of

Visualised Experiments, pp 1–3.

Raharimanga, V., Ratsitorahina, M., Migliani, R., Rosso, M. L., Rahalison, L., &

Chanteau, S. , 2001. La peste dans le marché Tsenabe Isotry à Antananarivo : une

situation épidémiologique complexe. Archive de l’Institut Pasteur de Madagascar,

67(1-2), pp 19–20.

65

Rahelinirina, S., Rajerison, M., Telfer, S., Savin, C., Carniel, E., & Duplantier, J.-

M. , 2017. The Asian house shrew Suncus murinus as a reservoir and source of human

outbreaks of plague in Madagascar. PLOS Neglected Tropical Diseases, 11(11), pp

e0006072.

Rasoamanana, B., Leroy, F., Boisier, P., Rasolomaharo, M., Buchy, P., Carniel, E.,

& Chanteau, S. , 1997. Field evaluation of an immunoglobulin G anti-F1 enzyme-

linked immunosorbent assay for serodiagnosis of human plague in Madagascar. Clinical

and Diagnostic Laboratory Immunology, 4(5), pp 587–591.

Rasoamanana, B., Rahalison, L., Raharimanana, C., & Chanteau, S. , 1996.

Comparaison of Yersinia CIN agar and mouse inoculation assay for the diagnosis of

plague. Transaction of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 90(6), pp

651.

Ratovonjato, J., Duchemin, J. B., Duplantier, J.-M., & Chanteau, S. , 2000.

Xenopsylla cheopis (Siphonaptera: Xenopsyllinae), puces des foyers ruraux de peste des

Hautes Terres malgaches: niveau de sensibilité au DDT, aux pyréthrinoïdes et aux

carbamates après 50 années de lutte chimique. Arch Inst Pasteur Madagascar, 66(1&2),

pp 9–12. Retrieved from http://www.researchgate.net/profile/Jean-

Bernard_Duchemin/publication/242762087_Xenopsylla_cheopis_(Siphonaptera__Xeno

psyllinae)_puces_des_foyers_ruraux_de_peste_des_Hautes_Terres_malgaches__niveau

_de_sensibilit_au_DDT_aux_pyrthrinodes_et_aux_carbamates_a

Ratsitorahina, M., Chanteau, S., Rahalison, L., Ratsifasoamanana, L., & Boisier,

P. , 2000. Epidemiological and diagnostic aspects of the outbreak of pneumonic plague

in Madagascar. The Lancet, 355, pp 111–113.

Rosqvist, R., Forsberg, a., Rimpilainen, M., Bergman, T., & Wolf-Watz, H. , 1990.

The cytotoxic protein YopE of Yersinia obstructs the primary host defence. Molecular

Microbiology, 4(4), pp 657–667.

Ruckdeschel, K., Roggenkamp, A., Schubert, S., & Heesemann, J. , 1996.

Differential contribution of Yersinia enterocolitica virulence factors to evasion of

microbicidal action of neutrophils . These include : Differential Contribution of Yersinia

enterocolitica Virulence Factors to Evasion of Microbicidal Action of Neutrophi.


Servan, B. C., Defasque, S., Hémar, C., & Mossafa, H. , 2012. Recommandation pour

le diagnostic et l’interprétation d'unehyperlymphocytose sanguine. les cahier CERBA.

France.

Simond, P. L. , 1898. La propagation de la peste. Annales de l’Institut Pasteur, 12, pp

625–687.

Sodeinde, O. A., & Goguen, J. D. , 1988. Genetic Analysis of the 9 . 5-Kilobase

Virulence Plasmid of Yersinia pestis. Infection and Immunity, 56(10), pp 2743–2748.

66

Sodeinde, O. A., Subrahmanyam, Y. V. B. K., Stark, K., Quan, T., Baa, Y., &

Goguens, J. D. , 1992. A Surface Protease and the lnvasive Character of Plague.

Science, 258, pp 1004–1007.

Spinner, J. L., Winfree, S., Starr, T., Shannon, J. G., Nair, V., Steele-Mortimer, O.,

& Hinnebusch, B. J. , 2014. Yersinia pestis survival and replication within human

neutrophil phagosomes and uptake of infected neutrophils by macrophages. Journal of

Leukocyte Biology, 95(3), pp 389–98.

Titball, R. W., & Williamson, E. D. , 2001. Vaccination against bubonic and

pneumonic plague. Vaccine, 19, pp 4175–4184.

Toossi, Z., Kleinhenz, M. E., & Ellner, J. J. , 1986. Defective interleukin 2 production

and responsiveness in human pulmonary tuberculosis. Journal of Experimental

Medicine, 163, pp 1162–1172.

Trosky, J. E., Liverman, A. D. B., & Orth, K. , 2008. Yersinia outer proteins: Yops.

Cellular Microbiology, 10(3), pp 557–565.

Turvey, S. E., & Broide, D. H. , 2010. Chapter 2: Innate Immunity. Journal of Allergy

and Clinical Immunology, 125(2 Suppl 2), pp 1–17.

Velan, B., Bar-Haim, E., Zauberman, A., Mamroud, E., Shafferman, A., & Cohen,

S. , 2006. Discordance in the Effects of Yersinia pestis on the Dendritic Cell Functions

Manifested by Induction of Maturation and Paralysis of Migration. Infection and

Immunity, 74(11), pp 6365–6376.

Wanschitz, F., Nell, A., Patruta, S., Wagner, A., & Ewers, R. , 2005. Influence of

three currently used bone replacing materials on the in vitro proliferation of human

peripheral blood mononuclear cells. Clinical Oral Implants Research, 16, pp 570–574.

Warrington, R., Watson, W., Kim, H. L., & Antonetti, F. R. , 2011. An introduction

to immunology and immunopathology. Allergy, Asthma & Clinical Immunology,

7(Suppl 1), pp 1–8.

WHO. , 2006. Réunion internationale sur la lutte contre la peste: cette calamité

ancienne a encore de l’avenir. Weekly Epidemiological Record Relevé Épidémiologique

Hebdomadaire, (28), pp 273–284.

WHO. , 2016. La peste à travers le monde 2010-2015. Weekly Epidemiological Record,

91(8), pp 89–104.

Williamson, E. D. , 2009. Plague. Vaccine, 27(SUPPL. 4), pp 56–60.

Williamson, E. D., Eley, S. M., Stagg, A. J., Green, M., Russell, P., & Titball, R. W. , 1997. A sub-unit vaccine elicits IgG in serum, spleen cell cultures and bronchial

washings and protects immunized animals against pneumonic plague. Vaccine, 15(10),

pp 1079–1084.

67

Williamson, E. D., Flick-Smith, H. C., LeButt, C., Rowland, C. a., Jones, S. M.,

Waters, E. L., Gwyther, R. J., Miller, J., Packer, P. J., & Irving, M. , 2005. Human

immune response to a plague vaccine comprising recombinant F1 and V antigens.


Williamson, E. D., & Oyston, P. C. F. , 2012. The natural history and incidence of

Yersinia pestis and prospects for vaccination. Journal of Medical Microbiology, 61, pp

911–918.

Williamson, E. D., Stagg, a. J., Eley, S. M., Taylor, R., Green, M., Jones, S. M., &

Titball, R. W. , 2007. Kinetics of the immune response to the (F1 + V) vaccine in

models of bubonic and pneumonic plague. Vaccine, 25(6), pp 1142–1148.

Yao, T., Mecsas, J., Healy, J. I., Falkow, S., & Chien, Y. , 1999. Suppression of T

and B lymphocyte activation by a Yersinia pseudotuberculosis virulence factor, yopH.

The Journal of Experimental Medicine, 190(9), pp 1343–1350.

Yersin, A. , 1894. La peste bubonique à Hong-Kong. Annales de l’Institut Pasteur, 8,

pp 662–667.

ANNEXES

I

Annexe 1 : Préparation de RPMI – SVF10% - PS1%

- Ajouter 45 ml de RPMI dans un tube falcon 50 ml

- Ajouter 5 ml de SVF décomplementé

- Bien mélanger l’ensemble par agitation

- Pipeter 500 µl de ce mélange et le jeter

- Remplacer le par 500 µl de mélange d’antibiotique PS

- Bien mélanger le contenu du tube

Annexe 2 : Protocole d’Inactivation ou décomplementation de SVF

- Laisser se décongeler le SFV à température ambiante

- Agiter avant de le mettre dans un bain marie préchauffé à 56°C pendant 30

minutes

- Bien agiter le flacon tous les 10 minutes

- Laisser le flacon 30 mn à température ambiante avant de faire des aliquots de

50 ml

- Conserver les aliquots à – 20°C

II

Annexe 3 : Protocole de marquage des PBMC avec CFSE (eBioscience)

III

Annexe 4: Description de Cytomètre

Le cytomètre est composé de trois systèmes: le système fluidique, optique et

électronique. Le système fluidique est constitué de deux liquides qui ne se mélangent

jamais : le liquide de gaine et le liquide contenant les cellules en suspension. Une

pression est exercée sur le liquide de gaine, par conséquent, les cellules sont alignées les

unes derrière les autres et se présentent une à une devant le faisceau de laser (Figure 1).

Figure 1: Système fluidique d'un cytomètre

(http://img11.hostingpics.net/pics/86872650g.png)

Le système optique regroupe le laser qui sert de source lumineuse et les

photomultiplicateurs (PMT) qui collectent les signaux lumineux. Les rayons diffractés

collectés dans le même axe du laser donnent une information sur la taille de la cellule

tandis que ceux dans un angle de 90° renseignent sur sa granularité. Les fluorescences

des cellules par marquage aux fluorochromes sont également captées par des PMT

(Figure 2).

IV

Figure 2: Système optique du BD FACSCalibur (Biosciences, 2010)

Le système électronique est responsable de la conversion des signaux lumineux en

signaux électriques et numériques. Puis les valeurs numériques issues des convertisseurs

sont stockées par la composante informatique du CMF et présentées à l’écran sous

forme d’histogramme monoparamétrique ou biparamétrique (cytogramme) (Figure 3).

Figure 3: Exemple d'Histogramme monoparamétrique et biparamétrique

A) Histogramme monoparamétrique: l’axe des abscisses représente l’intensité de

fluorescence et l’axe des ordonnés représente le nombre de cellules. B) Histogramme

biparamétrique (cytogramme) permet de différencier les différentes populations

cellulaires du sang en fonction de leur taille (sur l’axe des abscisses) et de leur

granularité (sur l’axe des ordonnés).

V

Annexe 5: Les fluorochromes qui peuvent être utilisés avec FACSCalibur

Lasers

Sources

lumineuses

Canaux de

fluorescence

Fluorochromes

correspondants

Spectre

d’excitation

(nm)

Spectre

d’émission

(nm)

Bleu FL1 FITC/CFSE 488 518

Bleu FL2 PE 488 575

Bleu FL3 PE-Cy5 488 690

Rouge FL4 APC 633 660

VI

Annexe 6: Résultats de l’ELISA des plasmas des cas non pesteux, pesteux et

asymptomatiques étudiés

Sigle/Nom de

l’échantillon

DO Conclusion

Témoin positif

Humain

1,982 Positif

Témoin négatif 0,097 Négatif

Cas non pesteux #1 0,128 Négatif

#2 0,054 Négatif

#3 0,011 Négatif

#4 0,066 Négatif

#5 0,013 Négatif

#6 0,018 Négatif

#7 0,029 Négatif

#8 0,071 Négatif

#9 0,039 Négatif

#10 0,054 Négatif

Cas pesteux TLO 780/00 1,604 Positif

TLO 221/02 1,464 Positif


TLO 373/02 0,103 Négatif












VII


TLO 69/14 1.233 Positif

















Cas asymptomatiques O 67519 0,696 Positif

O 67612 1,309 Positif

O 67626 0,374 Positif

O 67728 0,373 Positif

O 67768 0,373 Positif

O 67787 0,408 Positif

O 67840 0,434 Positif

O 68003 0,383 Positif

O 68103 0,872 Positif

O 68227 0,785 Positif

O 68238 0,536 Positif

VIII

Annexe 7: Information sur les sujets cas pesteux étudiés dans la réponse cellulaire

Identification Sexe Age Nombre de mois post

infection

Conclusion en

Ac

TLO 225/11 M 23 60 Négatif

TLO 273/12 M 35 53 Positif

TLO 69/14 F 14 39 Positif



TLO 457/14 F 7 20 Négatif







TLO 157/16 F 13 6 Négatif







RESUME

Last name: Alice

First name: LANTONIAINA IHARISOA

Title: Study of immune response against Yersinia pestis: development of lymphocytes

proliferation assay and immunophenotyping

Plague is a zoonosis which affects mainly rodents and caused by the bacterium

Yersinia pestis. It is transmitted from rodents to humans by the bites of infected fleas.

The disease has three major forms: bubonic plague, pneumonic plague and septicemic

plague. Y. pestis is an extremely virulent bacterium that can hijack the host’s immune

response. However, the existence of persons who are carriers of Y. pestis but in

excellent health has been reported. These cases have been considered as asymptomatic

plague. Therefore, the aim of our study is to identify those asymptomatic plague cases

and then to assess humoral and cellular immune response against plague in confirmed

plague cases, asymptomatic plague cases and healthy individuals (negative controls).

The study of humoral immune response was performed using ELISA technique for the

detection of anti- F1 IgG antibodies in plasmas. Cell proliferation assay by CFSE

incorporation and immunophenotyping were developed using flow cytometer for

cellular response evaluation. PBMC labeled with CFSE (for lymphocyte proliferation

assay) and unlabeled (for immunophenotyping) were cultured in the presence of either

Y. pestis F1 antigen or sonicated Y. pestis. Positive control was constituted by PBMC

and PHA mitogen agent. Our results showed that the persistence of anti- F1 IgG

antibodies among confirmed plague cases was highly variable, ranging from 1 month to

14 years post-infection. Most plague cases were high responders (12/22) while

identified asymptomatic cases (10/11) were low responders. Cellular response

assessment revealed that that PBMC stimulated with sonicated Y. pestis showed a better

lymphocyte proliferation index compared to F1 antigen. A great variation in cell

subpopulation proportions between individuals was also found after

immunophenotyping.

Keywords: Yesinia pestis, asymptomatic plague, immune response, TPL,

immunophenotyping

Supervisors: Pr RALAMBORANTO Laurence

Dr ANDRIANAIVOARIMANANA Voahangy Michèle

Nom : LANTONIAINA IHARISOA

Prénom : Alice

Titre : Etude de la réponse immune dirigée contre Yersinia pestis: mise au point des

techniques de test de prolifération lymphocytaire et d’immunophénotypage

La peste est une zoonose causée par la bactérie Yersinia pestis. Elle se transmet

entre les rongeurs par l’intermédiaire de puces vectrices. L’homme s’infecte

accidentellement suite à une piqûre de puce infectieuse. La maladie se présente sous

trois formes majeures: la peste bubonique, la peste pulmonaire et la peste septicémique.

Y. pestis est une bactérie extrêmement virulente capable de détourner la réponse

immunitaire de l’hôte. Cependant, des observations ont rapporté l’existence de

personnes porteuses de la bactérie mais présentant une excellente santé. Ces cas ont été

reliés à la peste asymptomatique. Ainsi, notre étude s’intéresse particulièrement à

l’identification des cas asymptomatiques puis d’évaluer la réponse immunitaire

humorale et cellulaire dirigées contre Y. pestis chez les cas confirmés de peste,

asymptomatiques identifiés et les individus sains (contrôles négatifs). L’étude de la

réponse humorale a été effectuée par détection d’anticorps IgG anti-F1 dans les plasmas

des sujets en utilisant la technique ELISA. Le test de prolifération cellulaire par

incorporation de CFSE ainsi que l’immunophénotypage après acquisition au cytomètre

en flux ont été mis au point pour évaluer la réponse cellulaire. Des PBMC marquées au

CFSE (pour le test de prolifération lymphocytaire) et non marquées (pour

l’immunophénotypage) de ces sujets ont été mises en culture en présence d’antigène F1

de Y. pestis ou de Y. pestis soniqué. Le témoin positif était constitué de PBMC mis en

présence d’agent mitogène PHA. Nos résultats ont montré que la persistance des IgG

anti-F1 chez les cas confirmés de peste était très variable, allant de 1 mois jusqu’à 14

ans post-infection. La plupart des cas pesteux (12/22) sont des forts répondeurs alors

que les cas asymptomatiques identifiés (10/11) sont des faibles répondeurs. Quant à la

réponse cellulaire la stimulation avec Y. pestis soniqué a montré un index de

prolifération cellulaire meilleur comparé à l’antigène F1. Une grande variation des

proportions de sous-populations cellulaires a également été observée entre individus

après immunophénotypage.

Mots clés : Yersinia pestis, peste asymptomatique, réponse immune, TPL,

immunophénotypage

Encadreurs: Pr RALAMBORANTO Laurence

Dr ANDRIANAIVOARIMANANA Voahangy Michèle

ETUDE DE LA REPONSE IMMUNE DIRIGEE CONTRE Yersinia …

Documents

Transcript of ETUDE DE LA REPONSE IMMUNE DIRIGEE CONTRE Yersinia …