Etude biochimique de l’interaction entre les cals de pois ...Les cals d’entre-nœuds et de...

Mémoire de Magister Présenté par

DJEDIAI Souad

Thème :

Etude biochimique de l’interaction entre les cals de pois chiche Cicer arietinum L. et le mycélium d’Ascochyta

rabiei (Pass.) Lab., agent de l’anthracnose

Soutenu le 08/02/2011

Devant la commission d’examen

Président

Examinateur

Examinateur

Encadreur

: Mr BELKHOUDJA Moulay

: Mme BENBAYER HABCHI Zoubida

: Mme IGHIL HARIZ Zohra

: Melle BOUABDALLAH Louiza

Professeur Université d’Oran

Maître de conférences Université d’Oran

Maître de conférences Université d’Oran Maître de conférences Université d’Oran

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Remerciements

"Je remercie d’abord et avant tous Dieu tout puissant d’avoir permis à ce travail d’avoir lieu et de m’avoir permis de l’achever."

Je remercie humblement mon encadreur docteur BOUABDALLAH L. maître de

conférences à la faculté des sciences de l’université d’Oran. Veuillez trouver ici l’expression de

ma sincère gratitude. Je vous remercie pour votre soutien et vos encouragements.

Je remercie monsieur le professeur BELKHOUDJA M. Maître de conférences à la faculté

des sciences de l’université d’Oran pour avoir bien voulu présider le jury de mon mémoire de

magister.

Je remercie madame le docteur BENBAYEGH-HABCHI Z. Maître de conférences à la

faculté des sciences de l’université d’Oran d’avoir accepté de juger mon modeste travail. Je vous

remercie également de m’avoir toujours prêté une oreille attentive et conseillée.

Je remercie madame le docteur IGHIL-HARIZ Z. Maître de conférence à la faculté des

sciences de l’université d’Oran d’avoir accepté de juger mon travail. Merci d’avoir répondu

présente de m’avoir encouragée, éclairer de vos conseilles avisés, soutenue et aidée.

Je remercie vivement les personnes qui ont participé à la réussite de ce travail à savoir Pr

Maarouf, Dr Aoues, Dr Bekki, Dr Benaceur, Dr Bensahla, Dr Boudjema, Dr Hassini, Mme

Senouci, Mr et Mme Kerkachi.

Je remercie cordialement les techniciens de laboratoires du département de biologie de

l’université d’Oran Es-senia Abdelkader, Ahmed, Mohammed, Fatima, Amina, Faiza et Wahiba.

Je remercie Nadjet et Badra du laboratoire de génétique moléculaire et cellulaire de l’université

des sciences et technologie d’Oran (USTO).

Je remercie chaleureusement mes collègues et amies, qui m’ont soutenue à chaque étape

de ce travail je cite Amina B., Amina K., Amina H., Chahinez, Houda, Fatima, Nesrine et Asma.

Je ne peux faire tous ces remerciements sans oublier d’honorer la mémoire de Mme

kaouaidjia-Daoudi Malika sans laquelle rien de ce magister n’aurait pu être possible. Que dieu

tout puissant et miséricordieux vous accepte dans son vaste paradis, merci.

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Dédicace

Je dédie ce travail à mes chers parents. Vous m’êtes

inestimables et votre soutient à mon égard m’est

incomparable. Vous m’avez donné le courage de

poursuivre mes études et d’aller jusqu’au bout, pour cela

ma gratitude est infinie et mon dévouement indéfectible

A mes frères sans vous, je n’aurais pas eu la force de

faire se magister

A mes tentes zineb, habiba et houria amies et

conseillères

A mes oncles chérif, nourréddine et mourad pour plus

que votre soutient moral

Je ne peux oublier d’avoir une pensée pour ma défunte

grand-mère (Que dieu tout puissant et miséricordieux

t’accepte dans son vaste paradis)

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. .

. .

.

. .

. L. Cicer

arietinum .

L.Cicer arietinum.

MS )2,4-DANAKinétine

BAP .( ) MS(

) ( )7E 1H.(

.

.

L. Cicer arietinum .

)( )199 INRATwist C150FLIP 82- ( ) .(

Ma )l/mg2 2,4-D l/mg 4 Kinétine (

199 INRA 82-150C FLIP. Mh )l/mg3 2,4-D

l/mg3 BAP ( C150FLIP 82- Twist .

L.Cicer arietinum

.

.

: L. Cicer arietinum .

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Résumé

Les graines de pois chiche sont riches en protéines et en molécules énergétiques. Leur

production est limitée par Ascochyta rabiei agent de l’anthracnose du pois chiche. Ce

champignon attaque toutes les parties végétatives de la plante engendrant des pertes de

rendement. Les moyens de lutte conventionnels se sont avérés insuffisants. La biotechnologie

peut nous orienter vers d’autres moyens de lutte plus performants. La callogenèse est utilisée

pour la recherche de variants résistants. L’interaction du pois chiche avec le pathogène

Ascochyta rabiei active la production de phytoaléxines, composés phénoliques de défense.

L’augmentation des phénols totaux est généralement corrélée à la résistance. L’objectif de notre

travail est l’étude de l’interaction entre cals de Cicer arietinum L. et mycélium d’Ascochyta

rabiei pour mettre en évidence la production de phénols totaux.

Les cals d’entre-nœuds et de folioles proviennent de différents génotypes de pois chiche

Cicer arietinum L. Les milieux de leur induction correspondent à la solution de base MS

additionnée d’hormones de croissance (2,4-D, ANA, Kinétine et BAP). La confrontation s’est

effectuée par la mise en contact des cals d’entre-nœuds et de folioles (sur milieu MS) de deux

génotypes (tolérant et résistant) avec le mycélium de deux isolats d’Ascochyta rabiei (E7 et H1).

Les phénols totaux ont été extraits par macération des cals dans le méthanol pour en estimer la

concentration. L’étude quantitative et qualitative a été effectuée par spectrophotométrie et

chromatographie sur couche mince.

La culture de tissus de l’hôte Cicer arietinum L. a permis d’induire une callogenèse.

Celle-ci est influencé par la composition hormonale (nature et concentration), le génotype (INRA

199, Twist et FLIP 82-150C) et l’organe (entre-nœuds de tige et folioles). Le milieu Ma (2mg/l

2,4-D et 4mg/l Kinétine) a induit un taux de callogenèse élevé d’entre-nœuds des génotypes

INRA 199 et FLIP 82-150C. Un bon pourcentage est signalé sur le milieu Mh (3mg/l 2,4-D et

3mg/l BAP) pour les génotypes Twist et FLIP 82-150C à partir des entre-nœuds et des folioles.

L’interaction entre cals de Cicer arietinum L. et le mycélium d’Ascochyta rabiei a pu

mettre en évidence des différences quantitatives des phénols totaux en fonction du génotype et

de l’origine des cals. L’analyse qualitative des extraits phénoliques totaux révèle une bande

discriminant les cals confrontés des cals témoins.

Mots clés : Cicer ariétinum, callogenèse, Ascochyta rabiei, résistance, composés phénoliques

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Abstract

The chickpea grains are rich of proteins and energetic molecules. Their production is

limited by Ascochyta rabiei, the chickpea blight agent. This fungus attacks all aerial parts of the

plant leading to yield losses. Conventional means of fighting appeared to be insufficient.

Biotechnology can redirect us toward more efficient means of fighting. Callogenesis has been

used to investigate resistant variants. The interaction between chickpea and the pathogenic fungi

Ascochyta rabiei activates the production of phytoalexins, phenolic compounds involved in

defense mechanisms. The increase of the total phenolic content is generally correlated to plant

resistance. The aim of our work is to study the interaction between Cicer arietinum L. calli and

Ascochyta rabiei mycelium to highlight phenolic compounds production.

Intermodal and leaflets Calli emerged from different chickpea genotypes of Cicer

arietinum L. Their induction media consist on MS salt solution supplemented with growth

regulators (2,4-D, NAA, Kinetin and BAP). We confronted leaflets and intermodal calli (on MS

media) of two genotypes (tolerant and resistant) with two isolates of Ascochyta rabiei (E7 and

H1) mycelium. Total phenols have been extracted by callus maceration in methanol to estimate

their concentration. The quantitative and qualitative analysis has been realized by

spectrophotometer and thin layer chromatography.

Cicer arietinum L. tissue culture allowed callogenesis induction. It is influenced by

growth regulators composition (nature and concentration), genotypes (INRA 199, Twist, FLIP

82-150C) and organs (internodes of stems and leaflets). Ma media (2mg/l 2,4-D and 4mg/l

kinetin) induced an important rate of callogenesis on internodes of INRA 199 and FLIP 82-150C

genotypes. A good percentage is noted on Mh media (3mg/l 2,4-D and 3mg/l BAP) from

internodes and leaflets of Twist and FLIP 82-150C genotypes.

The interaction Cicer arietinum L. calli and Ascochyta rabiei mycelium could point out

quantitative differences in total phenols according to genotype and calli origins. The qualitative

analysis of total phenolic extracts revealed a substance discriminating confronted calli from

untreated calli.

Key words: Cicer arietinum, callogenesis, Ascochyta rabiei, resistance, phenolic compounds

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Tables des matières

Chapitre 1 :

Chapitre 2 :

Chapitre 3 :

Introduction…………………………………………………………………................

I. Revue bibliographique…………………………………………………...................

1. Le pois chiche Cicer arietinum L…………………………………………..............

1.1. Description botanique et systématique…………………………………...............

1.2. Importances de la plante hôte Cicer arietinum L. (pois chiche)…………............

1.2.1. Valeur nutritive………………………………………………………………….

1.2.2. Importance économique…………………………………………………………

1.2.3. Importance agronomique et fertilité……………………………………............

1.3. La culture de tissus in vitro………………………………………………...........

1.3.1. Avantages et inconvénients…………………………………………………….

1.3.2. Culture in vitro chez le pois chiche Cicer arietinum L………………………….

1.4. Les maladies du pois chiche……………………………………………………….

2. Le champignon Ascochyta rabiei……………………………………………………

2.1. Systématique…….….…………………………………………………………….

2.2. Description macroscopique………………………………………………............

2.3. Description microscopique………………………………………………………..

2.4. Cycle biologique………………………………………………………….............

2.5. Pouvoir pathogène d’Ascochyta rabiei……………………………………………

2.6. Symptômes de l’anthracnose sur la plante de pois chiche (Cicer arietinum L.)...

3. Moyens de défense et résistance chez le pois chiche………………………...........

II. Matériel et méthodes………………………………………………………………...

1. Le matériel biologique……………………………………………………………….

1.1. Les génotypes de pois chiche Cicer arietinum L. utilisés………………………..

1.2. Les isolats du champignon Ascochyta rabiei utilisés……………………………

2. Méthodes…………………………………………………………………………….

2.1. Production des plantules …………………………………………………………..

2.1.1. Désinfection des graines………………………………………………………..

2.1.2. Germination des graines et croissance de la plante……………………………..

2.2. Callogenèse……………………………………………………………………….

2.3. Maintien des cals………………………………………………………………….

2.4. Interactions cals de Cicer arietinum L.-mycélium d’Ascochyta rabiei……………

2.4.1. Etude biochimique des interactions cals de Cicer arietinum-mycélium

d’Ascochyta rabiei…………………………………………………………………….

2.4.1.1. Extraction, analyse quantitative et qualitative des phénols totaux des cals

infectés par le mycélium d’Ascochyta rabiei………………………..…………………

1

3

3

3

6

6

6

7

11

11

12

14

16

16

16

16

19

22

23

25

27

27

27

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Chapitre 4 :

Chapitre 5 :

Chapitre 6 :

2.4. Analyse statistique………………………………………………………………..

III. Résultats et discussion……………………………………………………………..

1. Culture de tissus du pois chiche Cicer arietinum L…………………………………

1.1. Résultats…………………………………………………………………………..

1.1.1. Cas du génotype INRA 199…………………………………………………….

1.1.2. Cas du génotype Twist…………………………………………………………...

1.1.3. Cas du génotype FLIP 82-150C………………………………………………..

1.2. Discussion…………………………………………………………………………

2. Le champignon Ascochyta rabiei……………………………………………………

3. Interactions cals de Cicer arietinum L. et mycélium d’Ascochyta rabiei…………

3.1. Développement mycélien………………………………………………………….

3.1.1 Résultats………………………………………………………………………….

3.1.2. Discussion……………………………………………………………………….

3.2. Etude biochimique des extraits phénoliques totaux des cals de Cicer arietinum

infectés par le mycélium d’Ascochyta rabiei…………………………………………...

3.2.1. Analyse quantitative et qualitative des extraits phénoliques totaux……………

3.2.1.1. Résultats………………………………………………………………………..

3.2.1.1.1. Cals d’entre-nœuds et de folioles confrontés à l’isolat E7…………………..

3.2.1.1.2. Cals d’entre-nœuds et de folioles confrontés à l’isolat H1…………………

3.2.1.2. Discussion…………………………………………………………………….

Conclusions et perspectives…………………………………………………………...

Références bibliographiques………………………………………………………….

Annexe

30

31

31

31

31

33

35

41

44

46

46

46

50

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51

51

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Liste des figures

Figure

Figure

Figure

Figure

Figure

Figure

Figure

1 :

2 :

3 :

4 :

5 :

6 :

7 :

Carte des zones de culture du pois chiche en Algérie

Représentation graphique de proportions de production nationale de pois

chiche de 19 pays en 2008

Représentation graphique comparant la production, les importations et la

superficie des terres cultivées en pois chiche en Algérie entre 2003-2007

Voie de biosynthèse de la phytoaléxine medicarpin

Représentation graphique des pourcentages de cals d’entre-nœuds des

génotypes INRA 199, Twist et FLIP 82-150C après un mois de culture sur

les milieux Ma, M8, Mh et Mn

Représentation graphique des pourcentages de cals de folioles des génotypes

INRA 199, Twist et FLIP 82-150C après un mois de culture sur les milieux

Ma, M8, Mh et Mn

Courbe de régression de la gamme étalon de l’acide gallique

9

9

10

26

38

38

55

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Liste des tableaux

Tableau 1 : Pourcentages des principaux constituants biochimiques d’une graine de pois chiche

(Cicer arietinum L.) 8 Tableau

2 : Nature et concentrations des acides aminés, des minéraux et des vitamines par

100gr de graines de pois chiche (Cicer arietinum L.) 8

Tableau 3 : Concentrations hormonales des milieux de culture M8, Ma, Mh, Mn 28 Tableau 4 : Concentrations de la courbe d’étalonnage de l’acide gallique 30 Tableau

5 :

Pourcentages de cals d’entre-nœuds et de folioles du génotype INRA 199

après un mois de culture en présence des milieux Ma, M8, Mh et Mn 37 Tableau

6 : Pourcentages de cals d’entre-nœuds et de folioles du génotype Twist après

un mois de culture en présence des milieux Ma, M8, Mh et Mn 37 Tableau

7 :

Pourcentages de cals d’entre-nœuds et de folioles du génotype FLIP 82-150C

après un mois de culture en présence des milieux Ma, M8, Mh et Mn 37 Tableau 8 : Analyse de variance des résultats de la callogenèse 39 Tableau 9 : Caractéristiques macroscopique des isolats E7 et H1 d’Ascochyta rabiei

(culture de 15) 44 Tableau

10 :

Concentrations en phénols totaux des cals d’entre-nœuds et de folioles des

génotypes FLIP 82-150C et FLIP 84-92C témoins et traités avec le

mycélium des isolats E7 et H1 d’A. rabiei estimées en mgEAG/gr de cal/ml

d’extrait phénolique 55 Tableau

11 :

Résultats du test t de Student de comparaison des moyennes de la

concentration en phénols totaux des extraits des cals traîtés avec le mycélium

d’A. rabiei et des cals témoins 56 Tableau

12 :

Rf des substances des extraits phénoliques des cals d’entre-nœuds des

génotypes FLIP 82-150C et FLIP 84-92C confrontés aux isolats E7 et H1

d’A. rabiei après migration sur couche mince de silice. Système d’élution:

Toluène/acétate d’éthyle/acide formique (10 :4 :1) 59 Tableau 13 : Rf des substances de l’extrait phénolique des cals de folioles des génotypes

FLIP 82-150C et FLIP 84-92C confrontés aux isolats E7 et H1 d’A. rabiei

après migration sur couche mince de silice. Système d’élution:

Toluène/acétate d’éthyle/acide formique (10 :4 :1) 60

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Liste des planches

Planche

Planche

Planche

Planche

Planche

Planche

Planche

Planche

Planche

Planche

Planche

Planche

Planche

Planche

I :

II :

III :

IV :

V :

VI :

VII :

VIII :

IX :

X:

XI :

XII :

XIII :

XIV :

Description botanique du pois chiche (Cicer arietiunm L.)

Description macroscopique et microscopique du champignon

Ascochyta rabiei

Cycle biologique de l’anthracnose du pois chiche causée par Ascochyta

rabiei

Symptômes de l’anthracnose sur les parties aériennes du pois chiche

(Cicer arietinum L.)

Caractéristiques morphologiques des cals d’entre-nœuds et de folioles

de pois chiche Cicer arietinum L. du génotype INRA 199


de pois chiche Cicer arietinum L. du génotype Twist


de pois chiche Cicer arietinum L. du génotype FLIP 82-150C

Comportement des cals d’entre-nœuds et de folioles de pois chiche

Cicer arietinum L. âgés de 4 mois sur le milieu MS modifié

Aspect macroscopique et microscopique des isolats H1 (à gauche) et

E7 (à droite) du champignon Ascochyta rabiei observés au microscope

optique

Aspect des cals témoins d’entre-nœuds et de folioles des génotypes

FLIP 82-150C et FLIP 84-92C après 72h de culture sur milieu MS½,0

Développement mycélien de l’isolat E7 sur les cals d’entre-nœuds et

de folioles des génotypes FLIP 82-150C et FLIP 84-92C après 72h de

confrontation

Développement mycélien de l’isolat H1 sur cals d’entre-nœuds et de

folioles des génotypes FLIP 82-150 et FLIP84-92 après 72h de

confrontation

Chromatogrammes des extraits phénoliques des cals d’entre-nœuds

confrontés aux isolats E7 et H1 d’A. rabiei après migration sur couche

mince de silice (observé sous UV à =365nm)

Chromatogrammes des extraits phénoliques des cals de folioles

confrontés aux isolats E7 et H1 d’A. rabiei après migration sur couche

mince de silice (observé sous UV à =365nm)

5

18

21

24

32

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Chapitre 1 : Introduction

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1

Introduction

Cicer arietinum L. est le nom scientifique du pois chiche (chickpea en anglais et hommaz

en arabe). Il est consommé par toutes les populations du monde. Les graines de Cicer arietinum

L. sont une source importante d’hydrates de carbone, de sels minéraux et de protéines

remplaçant les apports protéiques de la viande inaccessible de par son prix élevé. Elle forme une

combinaison symbiotique avec Rhizobium enrichissant le sol en azote améliorant ainsi sa

fertilité.

L’importance alimentaire, agronomique et écologique du pois chiche fait qu’il est très

demandé. Cette demande exerce une pression constante sur la production nationale insuffisante.

Le recours à l’importation s’impose alors. Cette faiblesse de rendements est la résultante de

l’action d’un ensemble de facteurs abiotiques (faible pluviométrie, sécheresse, pH et salinité du

sol) et biotiques (mauvaises herbes, ravageurs et maladies dues à des nématodes, champignons,

bactéries, mycoplasmes et virus).

L’anthracnose est la principale maladie fongique du pois chiche causée par Ascochyta

rabiei. L’invasion de toutes les parties aériennes de la plante engendre des dommages majeurs

pouvant causer la perte totale de la récolte.

Les moyens utilisés pour lutter contre Ascochyta rabiei sont, la rotation des cultures,

l’usage des fongicides, la lutte biologique et les croisements entre cultivars résistants. Les plantes

transgéniques résistantes sont une option nouvelle à laquelle les producteurs ont recours

(Cornelissen et Melchers, 1993 ; Davidson et Kimber, 2007).

Toutes ces méthodes de lutte présentent de nombreux inconvénients relatifs à leur coût

(pesticide, lutte biologique et transgénèse) et leur durée d’obtention (cultivars classiques). Les

fongicides polluent l’environnement et sont parfois toxiques pour l’homme. Ils présentent une

efficacité limitée face à l’apparition de nouvelles souches virulentes, de résistance croissante aux

cultivars résistants et aux nouvelles générations de pesticides. Les plantes transgéniques sont

préjudiciables à la diversité biologique.

Le recours à l’usage des techniques de la biotechnologie s’impose. Celles-ci permettent la

callogenèse in vitro, procédé qui génère un cal correspondant à un amas de cellules

indifférenciées à croissance continue (Gautheret, 1983). Le cal est un matériel biologique

intéressant dans la mesure où les conditions qui entourent sa survenue sont propices aux

variations somaclonales. Elles correspondent à des modifications nucléaires et cytoplasmiques

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constituant une source de variabilités génétiques. Ces variabilités seraient à l’origine de

l’apparition de nouveaux génotypes résistants. Cette nouvelle résistance est difficilement

contournée par le pathogène. Le cal peut être utilisé pour interagir avec un agent de pression de

sélection afin de produire une lignée cellulaire résistante. Cette technique permet d’opérer des

sélections sur un grand nombre de cellules tout en écourtant le temps. Les cals sont parfois

utilisés pour l’étude des interactions hôte pathogène pour comprendre les mécanismes mis en

jeux par la plante pour résister. Les interactions engendrent la production de phytoalexines

composés phénoliques chez les variétés résistantes.

Il est important de comprendre les mécanismes régissant cette résistance aux agents

pathogènes chez les plantes. Il convient d’étudier le rôle de molécules intervenant dans le

processus de résistance. Lors des interactions hôte-parasite, les moyens de défense de la plante

sont induits par des éliciteurs et ils correspondent de manière générale à des phytoaléxines,

composés polyphénoliques. Il existerait chez le pois chiche Cicer arietinum L. une corrélation

positive entre la synthèse des polyphénols et la manifestation de la résistance (Weigand et al.,

1986 ; Daniel et al., 1990).

Une étude portant sur l’interaction entre cals de Cicer arietium L. et mycélium

d’Ascochyta rabiei a été envisagée pour étudier l’expression des mécanismes biochimiques de

résistance. L’analyse qualitative et quantitative des phénols totaux a été abordée chez les cals

infectés par Ascochyta rabiei.

La première partie du travail se rapporte à la recherche des conditions favorables à une

bonne callogenèse à partir de folioles et d’entre-nœuds de différents génotypes de pois chiche.

La seconde partie est relative à l’étude des interactions entre les cals de Cicer arietinum

L. et le mycélium des isolats d’Ascochyta rabiei Elle vise à la mise en évidence des phénols par

leur extraction et l‘estimation de leur concentration par spectrophotométrie et leur détermination

qualitative par une chromatographie sur couche mince (CCM).

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Chapitre 2 : Revue bibliographique

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I. Revue bibliographique

1. Le pois chiche Cicer arietinum L.

1.1. Description botanique et systématique

Cicer arietinum L. est une dicotylédone angiosperme et une légumineuse de la famille

des Fabaceae, sous-famille des Papilionoideae (Chadefaud et emberger, 1960)

Sous-embranchement : Angiospermes

Classe : Dicotylédones

Ordre : Rosales

Famille : Fabaceae

Genre : Cicer

Espèce : arietinum

Le pois chiche Cicer arietinum L. est une plante annuelle herbacée à l’aspect d’un petit

buisson à port érigé, parfois arbustive. Elle est constituée par

a. Une tige : de 30 à 60 cm de hauteur habituellement quadrangulaire qui se ramifie dés

la base en 2 ou 3 rameaux secondaires. Elle porte des stipules incisées et dentées

(planche I, fig. 1).

b. Des feuilles : composées imparipennées et comptent 10 à 15 folioles ovales à contour denté (planche I, fig. 2a). Certains cultivars peuvent avoir des feuilles simples

(planche I, fig. 2b). Le feuillage est couvert de poils glandulaires excrétant des

exsudats acides.

c. Des racines : de type pivotant avec une racine principale qui ne dépasse pas les 60cm de profondeur et des racines latérales bien développées atteignant 2m. Les racines

forment des nodosités grâce à la symbiose avec Rhizobium ciceri.

d. Des fleurs : en forme de papillon, caractéristique de la famille des papilionacées (Fabacées). Elles peuvent être blanches, roses et bleues violacées (planche I, fig. 3a,

3b et 3c). Elles sont isolées sur des pédoncules courts avec une corolle dépassant à

peine le calice. Le pétale postérieur est très important : c’est l’étendard, il recouvre les

deux pétales latéraux, recouvrant eux même ceux de la carène donnant ainsi une

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forme de papillon. Le calice est composé de cinq dents égales. Les fleurs sont

hermaphrodites.

e. Des fruits : sous forme de gousses elliptiques de 2,43 à 4,47cm de long. Elles renferment une à deux graines, rarement plus. La gousse est d’abord verte (planche I,

fig. 4a) puis devient jaune à maturité (planche I, fig. 4b).

f. Les graines : peuvent avoir un aspect globuleux avec une surface lisse ou rugueuse. Selon la couleur et la taille des graines à maturité, on distingue deux types de pois

chiche cultivés :

- Le type kabuli à graines larges, arrondies, de couleur blanche à crème avec un

poids de plus de 26gr pour 100 graines (planche I, fig. 5a)

- Le type desi à petites graines angulaires dont la couleur varie du crème au noir en

passant par le marron, le jaune et le vert (planche I, fig. 5b).

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5

1 : www.cilr.uq.edu consulté le 01-11-2010 2 : www.agmrc.org consulté le 01-11-2010 3 : www.virtualsciencefair.org consulté 01-11-2010 4 : www.virtualsciencefair.org consulté le 01-11-2010

Planche I : Description botanique du pois chiche (Cicer arietiunm L.)

Figure 1: Tige1 avec rameaux secondaires Figure 2: Feuilles2 a. composées b. simples

Figure 3: Fleurs a. blanche, b. rose3, c. bleu violacée

Figure 4: Gousses4 a. vertes b. mures Figure 5: Types de graines de pois chiche: a. kabuli, b. desi

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1.2.Importance de la plante hôte Cicer arietinum L. (pois chiche)

1.2.1. Valeur nutritive : C’est une plante destinée à l’alimentation humaine. Sa valeur nutritive est

importante car ses graines sont constituées majoritairement d’un sucre lent

l’amidon (41%), d’un taux appréciable de protéines (23%), de sels minéraux (4%)

et de vitamines (0,003%) (tableau 1).

Il est à signaler que ses protéines renferment une diversité d’acides aminés. Le

plus important étant la lysine suivie de l’arginine, la cystéine et la méthionine. Ses

matières grasses sont composées d’acides gras essentiels dont l’acide linoléique,

oléique et palmique. La concentration en calcium est la plus importante comparée

à celle du phosphore qui est supérieur à celle du fer. Il renferme des vitamines du

groupe B (niacine, thiamine et riboflavine) (tableau 2).

Le pois chiche peut constituer un aliment énergétique et protéique pour le bétail,

car il présente une bonne digestibilité comparé à Phaseolus vulgaris.

1.2.2. Importance économique

La superficie des terres cultivées en Algérie s’élève à 8.265.000 ha soit 3,5% de la

superficie totale du pays. La culture du pois chiche occupe en Algérie seulement

0,3% de la superficie des terres cultivées soit 24.795ha. Les principales zones de

culture de pois chiche sont Sétif, Constantine et Guelma (est du pays) et Sidi Bel-

Abbes, Temouchent, Mascara et Tlemcen (ouest du pays) (fig. 1).

La production nationale se situe entre 12.000 et 19.000 tonnes par an. La

comparaison de la production nationale avec celles des 20 premiers pays

producteurs de pois chiche pour l’année 2008 nous classe au 20ème rang. L’Inde

occupe le premier rang avec 5.748.600 tonnes par an, ce qui dépasse de loin la

somme de production de tous les autres pays réunis (Anonyme, 2010) (fig. 2). La

production nationale ne couvre en moyenne que 30% des besoins de la population.

L’Algérie est contrainte d’importer entre 47000 et 56000 tonnes de pois chiche par

an pour couvrir une demande constante de la population en croissance

démographique continue (fig. 3).

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1.2.3. Importance agronomique et fertilité :

Le pois chiche est une légumineuse présentant des nodosités racinaires hébergeant

des bactéries qui ont la capacité de fixer l’azote atmosphérique et le restituer au sol.

Cette symbiose avec Rhizobium ciceri enrichit le sol en azote, renforçant sa fertilité

et améliorant les rendements. La fertilité des sols va favoriser l’installation d’autres

plantes présentant un intérêt écologique par le recouvrement des zones arides et

semi arides. Cet apport d’azote limite le recours aux engrais chimiques, ce qui

réduit le coût de production et la pollution de l’environnement.

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Constituants Protéines Amidon Matières grasses Minéraux Vitamines

Pourcentages 23 41-50,8 3,8-10,2 4 0,003

Acides aminés (gr) Minéraux (mg) Vitamines (mg)

Arginine Cystéine Lysine Méthionine Calcium Phosphore Fer Riboflavine Thiamine Niacine

4,4-8 3,5-5 5,5-10,3 1,3-1,6 140-440 190-382 5-23,9 0,12-0,33 0.12-1,1 1,3-2,9

Tableau 1: Pourcentages des principaux constituants biochimiques d’une graine de pois chiche (Cicer arietinum L.) (Muehlbauer et Tullu, 1997)

Tableau 2: Nature et concentrations des acides aminés, des minéraux et des vitamines par 100gr de graines de pois chiche (Ramalho et al., 1990 ; Muehlbauer et Tullu, 1997)

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Inde

Turquie

Pakistan

Australie

Ethiopie

Myanmar

Mexique

Iran

Canada

Yémen

USA

Malawi

Maroc

Tanzanie

Syrie

Espagne

Russie

Soudan

Algérie

Figure 1: Carte des zones de culture du pois chiche en Algérie (Saxena et al., 1996)

Figure 2: Représentation graphique de proportions de production nationale de pois chiche de 19 pays en 2008 (Anonyme, 2010)

4000-5000 ha

2000 ha

500 ha

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Figure 3: Représentation graphique comparant la production, les importations et la superficie des terres cultivées en pois chiche en Algérie entre 2003-2007 (Anonyme, 2010)

1910216367

13727 12706 15000

50766 48713 47432

55537

48639

22850 23079 23348 21252 22000

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

2003 2004 2005 2006 2007

production de pois chiche en tonnes

importations de chiche en tonnes

superficies des terres cultivé réservé au pois chiche en ha

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1.3.La culture de tissus in vitro

La culture de tissus in vitro consiste à recréer les conditions essentielles à la croissance et

au développement de cellules végétales artificiellement en dehors de la plante mère dans des

récipients en verre d’où le nom in vitro. Ces conditions se résument ainsi: une certaine

température, humidité, lumière et un milieu nutritif renfermant une source de carbone, sels

minéraux et vitamines sans oublier les hormones de croissance (les auxines, les cytokinines, les

gibbérellines, l’éthylène et l’acide abscissique).

1.3.1. Avantages et inconvénients

La culture de tissus in vitro présente comme tout procédé en biotechnologie des

avantages et des inconvénients, cependant ces derniers peuvent êtres négligés compte-tenu du

bénéfice tiré des premiers.

a. Avantages

- Production de plantules en masses indépendamment des saisons à l’abri des aléas

climatiques

- Obtention de clones génétiquement homogènes par le biais du clonage

- Réduction des surfaces de culture

- Production de plants sains de toutes maladies virales et à l’abri des autres

maladies

- Obtention de plantes résistantes

- Production d’hybrides entre espèces incompatibles

- Outils utilisés en recherche scientifique

- Apparition de nouveaux variants à caractères intéressants par une variation

somaclonal par passage par l’étape cal

b. Inconvénients

- Onéreuse et nécessite un personnel qualifié

- Difficultés inhérentes aux variétés réfractaires à la culture in vitro

- Apparition de pathogènes mutants non observés jusque-là

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1.3.2. Culture in vitro chez le pois chiche Cicer arietinum L.

Le pois chiche a surtout inspiré des travaux de micropropagation clonale étant donné son

importance socio-économique, en vue de sa production rapide à grande échelle. La propagation

clonal privilégie les tissus méristématiques pour leur prédisposition à une organogenèse directe.

Un grand nombre de travaux de régénération et d’organogenèse témoignent toutefois d’un

passage par une étape de callogenèse qui est alors indirect.

L’organogenèse indirecte induit inévitablement certaines variations somaclonals. Ce sont

des modifications nucléaires et cytoplasmiques qui engendrent un nouveau fonctionnement de la

cellule et fait apparaitre de nouveaux phénotypes. Les améliorations qu’elles peuvent apporter

sont avantageuses lorsqu’elles sont maintenues dans la plante régénérée et passe par les organes

de multiplication (Sibi, 1989).

La callogenèse est un processus de dédifférenciation des cellules qui retrouvent leurs

propriétés méristématiques. Ces cellules se divisent plus au moins activement pour former un

tissu relativement homogène appelé cal (Margara, 1984).

L’organogenèse indirecte des tissus méristématiques est récurrente dans la culture de

tissus in vitro chez le pois chiche. Les travaux de Jaiswel et Singh (2001) signalent une

régénération indirecte à partir d’axes embryonnaires de même qu’Arora et Chawla (2005) à

partir d’embryons immatures. Zare Mirakabad et al. (2010) par contre ont utilisé les nœuds

cotylédonaires pour réaliser une organogenèse indirecte tandis que Huda et al. (2003) l’ont induit

à partir de cotylédons.

La méthode indirecte ne fait pas l’unanimité car elle peut créer des variations

somaclonals qui risqueraient de modifier le génotype de la plante mère. Les chercheurs se sont

donc appliqués à mettre au point des protocoles de régénération directe. Chetuverdi et Chand

(2001) ont induit une organogenèse directe à partir d’embryons alors que Chakraborti et al.

(2006) en plus des embryons ont utilisé des cotylédons. L’hypocotyle est également un excellent

explant pour la régénération directe du pois chiche puisque Kiran et al. (2005) l’ont utilisé à cette

fin. D’après Sarker et al. (2005) les nœuds cotylédonaires régénèrent beaucoup mieux que les

embryons. Brandt et Hess (1994) tout comme Sujatha et al. (2007) induisirent une organogenèse

directe à partir de nœuds cotylédonaires ou de méristèmes apicaux. Les cotylédons ont

également été choisis par Arora et Chewla (2005), Chakraborti et al. (2006) ou Anwar et al.

(2008) pour une régénération directe.

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L’embryogenèse somatique est une autre voie de la régénération du pois chiche (Cicer

arietinum L.). Elle consiste à obtenir des embryons à partir d’explants juvéniles ou différenciés

avec ou sans passage par callogenèse (Huyghe, 1990).

L’embryogenèse somatique indirecte a été obtenue à partir d’organes jeunes comme les

embryons et les cotylédons immatures (Sagare et al., 1993 ; Hita et al., 1997) et d’axes

embryonnaires (Chauhan et Singh, 2002). Kumar et al. (1994) par contre l’ont initié à partir d’un

organe différencié, la foliole. L’embryogenèse somatique directe d’un autre coté a été réalisée

avec succès par Kiran Ghanti et al. (2010) à partir d’embryons immatures mais aussi à partir

d’hypocotyle (Naz et al., 2008b) et nœuds cotylédonaire de pois chiche Cicer arietinum (Kumar

et al., 1994).

La rhizogenèse à partir de jeunes pousses et de racines est réalisée en milieux solide

semi-solide et liquide (Brandt et Hess, 1994 ; Chetuverdi et Chand, 2001 ; Islam et al., 2005 ;

Sujatha et al., 2007).

La transgénèse sert à transformer le patrimoine génétique d’une plante afin d’y introduire

des caractères intéressants du point de vue agronomique ou pathologique. Le pois chiche a fait

l’objet de travaux de transformations génétiques suivi d’une régénération des tissus transformé

par culture in vitro (RafiulIslam, 1991 ; Khawar et Ozcan, 2004 ; Ignacimuthu et Prakash, 2006 ;

Singh et al., 2009).

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1.4.Les maladies du pois chiche

Les maladies pouvant affecter le pois chiche regroupent plus de cinquante espèces (Nene

et al., 1991). Les règnes viral et bactérien sont peu représentés alors que la dominance du règne

fongique est indéniable (Kaiser, 1981 ; Nene et al., 1996 ; Hawar, 1990 ; Trapero-Casas, 1999).

a. Les virus :

- La maladie virale la plus dévastatrice est causée par le virus CCDV (Chickpea

Chlorotic Dwarf Virus) du rapetissement chlorotique du pois chiche (Horn et al.,

1995).

- Le virus de l’enroulement des feuilles de pois

- Le virus de la mosaïque d’alfalfa

- Prolifération du virus de la mosaïque du concombre

b. Les bactéries : - Parmi les maladies bactériennes, on peut citer l’anthracnose bactérienne causée

par Xanthomonas campestris pv. cassiae (Nene et al., 1996).

- Pseudomonas andropogonis (Smith) Stapp

c. Les mycoplasmes :

- Prolifération excessive causée par Phyllody

d. Les nématodes :

- Le nématode des nœuds racinaires provoqué par Meloidogyne incognita

- Pratylenchus thornei

e. Les champignons

- Le flétrissement dû à Fusarium oxysporum f. sp. ciceri (Singh, 1990).

- Les pourritures racinaires provoquées par Rhizoctonia solani.

- Sclerotium rolfsii est l’agent de la pourriture du collet chez le pois chiche

- Botrytis cinerea agent de la pourriture grise de la partie aérienne (Maurya et al.,

2008).

- Anthracnose à Alternaria alternata

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- Anthracnose à Phoma causée par Phoma medicaginis

- Anthracnose à Colletotrichum dematium (pers. ex Fr.)

- Rouilles dûes à Uromyces ciceri-arietini (Gogn.) Jacz et Bayer

- Le mildiou à Oidiopsis taurica (Lev.) Salmon

- Pourriture de la tige dûe à Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary

- Ascochyta rabiei affecte toutes les parties végétatives du pois chiche dont les

feuilles, la tige, la gousse et la graine. Les pertes évaluées peuvent être de 100%

ce qui en fait une maladie très dangereuse pour la production de pois chiche.

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2. Le champignon Ascochyta rabiei

2.1. Systématique

Formes Anamorphe ou forme asexué Téléomorphe ou forme sexué

Embranchement

Classe

Ordre

Famille

Genre

Espèce

Deutéromycètes

Coelomycètes

Sphaeropsidales

Sphaerioïdacés

Ascochyta

rabiei

Ascomycètes

Loculoascomycètes

Dothideales

Didymellacées

Didymella

rabiei

2.2.Description macroscopique

In vitro A. rabiei peut croître sur le milieu pois chiche dextrose agar, pois chiche glucose

agar et pomme de terre dextrose agar. Son aspect macroscopique montre une alternance de

cercles concentriques clairs et foncés correspondant à la phase de production des pycnides

(planche II, fig. 1). Le mycélium est généralement de couleur crème pâle alors que la couleur des

colonies varie du brun clair au noir en passant par le gris et le vert. La production de cirrhes peut

être observée sur certaines colonies.

2.3. Description microscopique

Ascochyta rabiei (Pass.) [teleomorph Mycosphaerella rabiei Pass.], le stade

asexué de l’anthracnose du pois chiche est caractérisé par :

a. Un mycélium : hyalin et septé (planche II, fig. 2)

b. Des pycnides : à parois fines, densément agrégés de couleur marron clair à brun foncé. Ils ont une forme aplatie ou lentiforme de 90-150µm de diamètre et

s’ouvrent par un pore circulaire de 25µm de diamètre appelé ostiole (planche

II, fig. 3) (Lutz, 1948 ; Barnett et Hunter, 1972)

c. Les spores : sont des conidies à 90% unicellulaires qui font 8-15µm de long sur 4-6µm de large et sont hyalines, oviformes ou allongées, cylindriques ou

hélicoïdales et parfois légèrement étroites vers une extrémité mais pour la plus

part, les côtés sont arrondis (planche II, fig. 4a). A faible pourcentage les conidies

peuvent être bicellulaires avec un septum excentrique (planche II, fig. 4b).

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Le stade sexué (téléomorphe) Didymella rabiei est hétérothallique. Il se

différencie du stade asexué par ses fructifications qui sont :

a. Le pseudothèce : dont le lumen développe des hyphes fins disposés en paquets compacte. A maturité le pseudothèce bituniqué (planche II, fig. 5) produit

plusieurs asci cylindriques et incurvés.

b. Les ascospores : Chaque asque contient 8 ascospores hyalines et divisées en deux cellules inégales (planche II, fig. 6).

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Planche II : Description macroscopique et microscopique du champignon Ascochyta rabiei

Figure 1: Colonie du champignon sur milieu pois chiche

Figure 2: Mycéliums septé observés au microscope optique G×400

Figure 3: Pycnides observées au microscope optique G×400

Figure 4: Spores a. unicellulaire, b. bicellulaire observées au microscope optique G×1000

Figure 5: Pseudothèce de Didymella rabiei ouvert avec plusieurs asci observés au microscope optique

G×400 (Rhaïem et al., 2006)

Figure 6: Ascospores de Didymella rabiei dans asque observés au microscope optique

G×400 (Rhaïem et al., 2006)

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2.4.Cycle biologique (planche III)

Ascochyta rabiei est spécifique à Cicer arietinum ou les espèces du même genre et ne

peut induire la maladie à d’autres légumineuses comme les lentilles (Peever, 2007). Son cycle

biologique alterne un stade sexué, Didymella rabiei et un stade asexué Ascochyta rabiei :

- La source de l’inoculum primaire est représenté par les deux formes asexué et

sexué que sont les pycnidiospores (planche III fig. 1) et les ascospores (planche

III fig. 2) issus de débris infectés ou d’une graine infectée. La contamination

d’une plante saine est un processus infectieux où le pathogène peut pénétrer aussi

bien par la feuille que par la tige (Pandey et al., 1987).

- L’initiation de l’infection débute par la germination d’une spore à une température

optimale de 22°C et un taux d’humidité de 98 à 100% (Chauhan et Sinha, 1973).

Le gonflement de la spore libère un tube germinatif qui s’allonge et différencie à

son extrémité un appressorium non mélanisé (Höhl et al., 1990 ; Köhler et al.,

1995 ; Ilarslan et Dolar, 2002). L’exsudat mucilagineux secrété par ce dernier

permet de l’encrer au site d’infection (Höhl et al., 1990).

- La pénétration peut se faire au niveau des jonctions, entre cellules épidermiques

sans les envahir (Pandey et al., 1987 ; Höhl et al., 1990) ou par les stomates

(Ilarslan et Dolar, 2002). La pénétration à travers la cuticule s’accompagne de

synthèse d’enzymes de dégradations tels que la cutinase et la xylanase

(Khouaidjia-Daoudi, 2000 ; Jayakumar, 2005).

- La propagation du champignon est intercellulaire, il rejoint la tige à partir de la

foliole via le pétiole puis il pénètre dans l’espace intracellulaire entre la lamelle

moyenne et la paroi primaire. Le phloème est l’espace privilégié du champignon,

le xylème étant un tissu rarement colonisé (Köhler et al., 1995).

- Le champignon en croissance produit des pycnides avec des spores qui sont

responsables de l’apparition des différents symptômes sur les différents organes

de la plante à commencer par les feuilles (planche III fig.3 et 4), les tiges (planche

III fig. 5) et la gousse (planche III fig. 6).

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- Le stade sexué Didymella rabiei survit dans les débris infectés restés sur le sol ou

enfouis juste sous la surface (planche III fig. 7). Cette forme se manifeste lors des

conditions défavorables (température basse en hiver).

- La formation des pseudothèces débute en automne et les ascospores sont libérés

dés la fin de l’hiver jusqu’au printemps. Une température entre 5 et 15°C et une

humidité relative de 100% sont requises pour la maturation et la sporulation des

pseudothèces (Jhorar et al., 1998 ; Navas-Cortéz et al., 1998).

- Le stade sexué de l’anthracnose préserve l’inoculum durant l’hiver, permettant

ainsi sa dissémination à longue distance pour entamer de nouveaux cycles. Il

contribue à la variabilité génotypique adaptative du pathogène, véritable vecteur

de l’accroissement de sa virulence et de sa résistance envers les fongicides

(Peever, 2004).

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Figure 1: Pycnidiospores résultant de la reproduction asexuée

Figure 2: Ascospores résultant de la reproduction sexuée (www.saskapulse.com

consulté février 2010)

Figure 3: Premières lésions sur feuillage montrant des chloroses

(www.agr.sk.ca consulté février 2010)

Figure 4: Lésions sur folioles portant les pycnides

(www.saskapulse.com consulté février 2010)

Figure 6: Lésions avec cercles concentriques

sur gousses

Figure 5: Lésion allongée sur tige avec cercles concentriques

Figure 7: Résidu de pois chiche ayant persisté durant l’hiver (www.agr.sk.ca

consulté février 2010)

Planche III : Cycle biologique de l’anthracnose du pois chiche causé par Ascochyta rabiei

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2.5.Pouvoir pathogène d’Ascochyta rabiei

Les symptômes et les lésions de l’anthracnose sont le résultat de l’action combinée de

toxines et d’enzymes de dégradations synthétisées lors de la colonisation des tissus (Höhl et al.,

1990 ; Khouaidjia-Daoudi, 2000).

Lors de la pénétration chez l’hôte Ascochyta rabiei utilise la cutinase pour dégrader la

cutine, puis les xylanases et polygalacturonases pour décomposer les parois cellulaires (Köhler et

al., 1995 ; Khouaidjia-Daoudi, 2000). Les solanapyrones A, B et C sont les premières toxines a

avoir été identifiées chez ce champignon (Alam et al., 1989 ; Höhl et al., 1991) suivis de la

cytochalasine D (Latif et al., 1993) et la toxine protéique de 7,5 KDa (Chen et Strange, 1994).

Parmi les cinq toxines, la solanapyrone A est la plus virulente, suivie par les solanapyrones B et

C (Shahid, 2004). Les symptômes qu’elles induisent sont pratiquement semblables et consistent

en une épinastie des folioles, dessiccation des pétioles qui se contractent, rétrécissent et cassent,

provoquant une perte de turgescence des tiges qui flétrissent (Latif et al., 1993 ; Latif, 2002 ;

Shahid, 2004).

La dégradation des substances de défense contribue à la pathogénicité des champignons

(Morrissey et Osbourn, 1999). En effet Ascochyta rabiei a la capacité de contourner la résistance

de la plante en dégradant les phytoaléxines qu’elle produit. Kraft et Barz (1985) démontrent

qu’Ascochyta rabiei catabolise l’isoflavone biochanine A en pratensein et genistein ainsi que ses

dérivés glycosylés. Le pathogène est également capable de dégrader les phytoaléxines

pterocarpan medicarpin et maackiain pour les convertir respectivement en vestitol, acide 3,9-

dihydroxybenzoïque et en 1 -hydroxy-maackiain (Kraft et al., 1987 ; Tenhaken et al., 1991).

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2.6.Symptômes de l’anthracnose sur la plante de pois chiche (Cicer arietinum L.)

Ascochyta rabiei attaque toutes les parties aériennes de l’hôte. Il en résulte des

symptômes sur :

a. Les folioles : les premiers symptômes sont des taches arrondies jaunes qui

s’élargissent pour ensuite brunir au bout de 3 à 4 jours et forment des cercles

concentriques portant les pycnides (planche IV, fig. 1) (Weigand et al., 1986 ;

Ilarslan, 2002). Ces lésions nécrotiques mènent à une défoliation plus au moins sévère

(Porta-Puglia, 1990).

b. Les graines : surviennent des lésions nécrotiques montrant des cercles concentriques (Akem, 1999) (planche IV, fig. 2)

c. Les gousses : les lésions sont arrondies formant des cercles concentriques portant les pycnides (planche IV, fig. 3)

d. La tige : les lésions de 3 à 4cm, de couleur jaune à brun pâle sont allongées en forme de flamme puis brunissent et deviennent des taches nécrotiques (planche IV, fig. 4)

(Nene et al., 1991 ; Khan et al., 1999). Dans des conditions climatiques favorables,

des pycnides se forment abondamment au niveau des lésions provoquant un

étranglement de la tige, qui occasionne le flétrissement des parties supérieures à la

lésion et entraine la cassure de la tige ou de la branche (Weigand et al., 1986 ; Porta-

Puglia, 1990 ; Ilarslan et Dolar, 2002 ; Jayakumar et al., 2005).

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Figure 1 : Symptômes sur folioles montrant cercles concentriques (www.sardi.sa.gov.au

consulté le 13 juin 2010)

Figure 2 : Symptômes sur graine montrant cercles concentriques (www.pir.sa.gov.au

consulté le juin 2010)

Figure 4: symptômes sur tige avec lésions de formes allongées

Figure 3 : symptômes sur gousse avec cercles concentriques

Planche IV : Symptômes de l’anthracnose sur les parties aériennes de pois chiche (Cicer arietinum L.)

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3. Moyens de défense et de résistance chez le pois chiche

Les premiers moyens de défense des plantes lors d’une attaque parasitaire sont d’ordre

structural correspondant à la cuticule et la paroi secondaire (Agrios, 1970; Mehrotra, 1983). Il

s’en suit un échange de molécules exogènes ou endogènes de nature protéique ou

oligosaccharidique appelée éliciteurs (LePoivre, 2003 ; Angelova et al., 2006). Cette interaction

moléculaire est l’expression d’une activité biochimique intense (Ebel et Thöfer, 1998) et

caractérise dans le cas des plantes résistantes une réaction hypersensible spécifiant une

interaction incompatible (Rouxel, 1989 ; Hopkins, 2003). Chez le pois chiche, cette résistance

associe protéines PR et composés phénoliques phytoalexines, maackiain et medicarpin (Daniel et

al., 1990 ; Barz et Mackenbrock, 1994).

Cicer arietinum produit principalement deux types de protéines PR, la chitinase et la -

1,3-glucanase, dont l’activité double et quadruple respectivement lors d’une infection par

Fusarium oxysporum f. sp. ciceri (Saikia et al., 2005). Les enzymes d’oxydation comme la

peroxydase et la polyphénoloxydase voient leur activité doubler en cas d’infection (Arfaoui et

al., 2005 ; Raju et al., 2008). L’activité des inhibiteurs de protéases augmente aussi chez le pois

chiche mais atteint un seuil maximal deux fois plus importante chez les cultivars résistants

comparés aux cultivars sensibles (Raju et al., 2009).

Les flavonoïdes, composés phénoliques sont les principaux constituants des

phytoaléxines. Ces derniers sont subdivisés en plusieurs groupes dont les isoflavones et les

pterocarpans (Dixon et Paiva, 1995). Ces derniers ont été répertoriés chez le pois chiche et

permettent de distinguer les lignées résistantes des lignées sensibles (Weigand et al., 1986 ;

Kessman et Barz, 1987). Les isoflovones formononetin et biochanin A sont constitutivement

accumulés dans la vacuole. Ils sont libérés en cas d’élicitation pour être ensuite convertis en

phytoaléxines ptérocarpans maackiain et medicarpin (fig. 4) (Grotewold, 2006 ; Chérif et al.,

2007). Ces composés sont synthétisés dans les tissus sains entourant la zone infectée mais sont

accumulés dans les tissus infectés (Jiménez-González et al., 2008).

Les études de Weigand et al. (1986) et de Bachir (1999) montrent qu’après une infection

par A. rabiei les phytoaléxines maackiain et medicarpin s’accumulent plus rapidement et plus

abondamment chez un cultivar de pois chiche résistant. Le cultivar sensible ne produit pas de

maackiain. Ils décèlent aussi dans l’extrait phénolique des cultivars infectés la présence

concomitante des phytoalexines medicarpin et maackiain ainsi que de leur précurseurs

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formononetin, biochanin A et daidzein. Ces résultats sont également notés par Kessman et Barz

(1987) sur suspension cellulaire de pois chiche. Kessman et Barz (1987) ajoutent que ces

derniers sont accumulés en quantité équivalente chez les deux cultivars laissant penser que la

différence quantitative en phytoaléxines s’exprime en aval de leur voie de biosynthèse. Cette

hypothèse est confirmée par Daniel et al. (1990) qui démontrent chez le cultivar résistant une

augmentation importante de l’Isoflavone oxydoreductase (IFR) et la ptérocarpan synthèse (PTS)

enzymes clés de la voie de biosynthèse des ptérocarpans après élicitation, alors que le cultivar

sensible n’en révèle qu’une faible activité (fig. 4).

Figure 4: Voie de biosynthèse de la phytoalexine medicarpin (Farag et al., 2008)

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Chapitre 3 : Matériel et méthodes

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II. Matériel et méthodes

1. Le matériel biologique

1.1.Les génotypes de pois chiche Cicer arietinum L. utilisés

INRA 199 de type desi, résistante à Ascochyta rabiei

Twist de type kabuli, tolérante à Ascochyta rabiei

FLIP 82-150C de type kabuli, tolérante à Ascochyta rabiei

FLIP 84-92C de type kabuli, résistante à Ascochyta rabiei

Les graines de ces génotypes ont été fournies par l’INRA de Sidi Bel Abbes.

1.2.Les isolats du champignon Ascochyta rabiei utilisés

Les deux isolats (H1 et E7) d’Ascochyta rabiei testés ont été isolés par Mme

Khouadjia-Daoudi M. maître assistante en microbiologie et appartiennent au laboratoire

de phytopathologie de l’université d’Oran Es-sénia.

La description macroscopique des isolats H1 et E7 est notée sur la base de leur

développement sur le milieu culture pois chiche, glucose agar. Elle tient compte de la

couleur de la colonie, la vitesse de croissance, l’aspect du mycélium et l’abondance des

pycnides. L’aspect microscopique est exploré par des observations au microscope optique

après préparation de lames colorées au bleu de coton.

2. Méthodes

2.1. Production des plantules

2.1.1. Désinfection des graines

Les graines des variétés INRA 199, Twist, FLIP 82-150C et FLIP 84-92C sont

désinfectées dans un bain d’hypochlorite de sodium à 5% pendant 5mn suivis de trois

lavages à l’eau distillée stérile.

2.1.2. Germination des graines et croissance de la plante

Les graines désinfectées sont placées dans des boites de pétri contenant deux

disques de papier filtre stérilisés. Les graines sont réparties à raison de 10 par boite

puis humidifiées avec de l’eau distillée stérile. Elles sont ensuite incubées à

l’obscurité à 24°C pendant 3 à 4 jours.

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Les graines germées sont repiquées dans des pots de terreau stérilisé. Les

conditions de culture correspondent à une température ambiante de 26±2°C et une

photopériode de 16h.

2.2.Callogenèse

Le milieu de base utilisé est le milieu Murashige et Skoog, (MS) (1962)

(composition en annexe). Il est additionné de quatre combinaisons hormonales dont les

concentrations sont présentées dans le tableau 3. Deux auxines dont l’une forte l’acide

2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) et l’autre faible l’acide naphtalène acétique (ANA)

et deux cytokinines, la kinétine et la benzylaminopurine (BAP) ont été utilisées.

Milieux 2,4-D

(mg/l)

Kinétine

(mg/l)

ANA

(mg/l)

BAP

(mg/l)

M8 2 1 4 -

Ma 2 4 - -

Mh 3 - - 3

Mn 1 - 0,5 0,5

Les explants concernent des entre-nœuds (0,5cm de long) et des folioles

prélevés sur des plantes de pois chiche âgées de 21 jours. Ils sont désinfectés à

l’hypochlorite de sodium à 5% pendant 3mn puis à l’éthanol 70° pendant 30s. Ils sont

mis en culture à raison de 10 explants par boite et déposés dans un phytotron à une

température de 23°C et une photopériode de 14h.

2.3.Maintien des cals

Les cals sont entretenus par des repiquages successifs sur milieu de culture toutes

les 4 semaines. A la suite de leur brunissement au troisième repiquage leurs milieux sont

modifiés. La concentration des macroéléments du milieu de base MS a été réduite de

moitié et celle du saccharose à 10%. A ce milieu MS½ nous ajoutons du charbon actif

(10g/l) pour pallier au brunissement des cals. L’incubation a lieu à l’obscurité à une

température de 23°C.

Tableau 3: Concentrations hormonales des milieux de culture M8, Ma, Mh, Mn

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2.4.Interactions cals de Cicer arietinum L. - mycélium d’Ascochyta rabiei

Le milieu utilisé pour la confrontation est un milieu MS½ sans hormones (MS½,0)

pour éviter leur influence.

Des cals des génotypes FLIP 82-150C et FLIP 84-92C âgés de 45 et 60 jours sont

confrontés avec des disques de mycélium de 3mm de diamètre. Ces derniers sont prélevés

à la périphérie de colonies âgées de 15 jours des isolats E7 et H1 d’Ascochyta rabiei. Les

antagonistes sont incubés à 26°C et une photopériode de 16h pendant 7 jours.

2.4.1. Etude biochimique des interactions cals de Cicer arietinum L. - mycélium d’Ascochyta rabiei

2.4.1.1.Extraction, analyse quantitative et qualitative des phénols totaux des

cals infectés par le mycélium d’Ascochyta rabiei

Les cals d’entre-nœuds et de folioles des deux génotypes FLIP 82-150C et

FLIP 84-92C sont extraits par la méthode biochimique de macération. Les cals

sont d’abord débarrassés de l’excès de mycélium. Les deux sortes de cals infectés

et témoins non traités sont pesés pour déterminer leur poids frais. La macération

se fait par l’immersion des cals pendant 48h dans le méthanol acidifié à 80% (HCl

0,1N) à raison d’1ml par 100mg de cal frais. La concentration des phénols totaux

est estimée par la méthode du réactif de Folin ciocalteu.

a) Analyse quantitative des phénols totaux des cals

A 100µl d’échantillon (témoins et confrontés), 500µl de réactif de Folin

ciocalteu (dilué au 1/10 dans de l’eau distillée) sont ajoutés. Le mélange est

vigoureusement agité puis incubé pendant 5mn à l’obscurité à température

ambiante. Après incubation, nous rajoutons 1,5ml de carbonate de sodium à 2%

(2g de Na2CO3 dissout dans 100ml d’eau distillée). Le tout est vigoureusement

secoué puis incubé pendant une heure à l’obscurité à température ambiante.

L’absorbance (A) est lue à la longueur d’onde =760nm à l’ai

Etude biochimique de l’interaction entre les cals de pois ...Les cals d’entre-nœuds et de...

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