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Eléments de microscopie optique et électronique
Marc Landry UFR SDV, Université Bordeaux Segalen
IINS, CNRS UMR 5297
Les échelles de grandeur
Microscope de Hooke (XVIIème siècle)
1. Bases de la microscopie
1.1. Dualité onde-corpuscule 1.2. Eléments d’un microscope
1.3. Formation d’une image en microscopie optique
1.4. Electron et rayonnement
1.1. Dualité onde-corpuscule
• Fréquence: n = c/l
• Energie: E = hn
•Ondes : diffraction, interférences
•Corpuscules : collision
De Broglie
1.2. Eléments d’un microscope Deux catégories de microscopes
Tout microscope est constitué : •d’une source de rayonnement
•d’un échantillon
•d’un détecteur de la vitesse et des directions des particules après collision
•Détecteur loin de l’échantillon: microscopie de champ lointain
•Pas de séparation entre source, échantillon et détecteur (sonde locale): microscopie de champ proche
1.2. Eléments d’un microscope Le microscope optique
•Observation en transmission
•Observation en réflexion
1.3. Formation d’une image en microscopie optique
1.3.1. Interaction onde-matière 1.3.2. Principe d’une lentille convergente
1.3.3. Trajet de la lumière dans un microscope
1.3.4. Limites de résolution 1.3.5. Anomalies des lentilles
1.3.1. Interaction onde-matière Absorption-Emission
1.3.1. Interaction onde-matière Réflexion-Réfraction
•Propagation différentielle selon le milieu traversé (déphasage et déviation)
•Caractérisé par un indice de réfraction n=c/v
•Propagation différentielle selon les longueurs d’onde
1.3.1. Interaction onde-matière Réflexion-Réfraction
1.3.1. Interaction onde-matière Diffraction
Step : Change from ground state S0 to excited state S’1 following light energy absorption hvex
Step : Energy of S’1 is partially dissipated S1 from which fluorescence emission originates
Step : A photon of energy hvem is emitted, returning the fluorophore to its ground state S0. Due to energy dissipation during the excited-state lifetime, the energy of this photon is lower and therefore of longer wavelength than the excitation photon hvex.
S0 = Ground state S’1 S1 = Excited state
Simplified Jablonski diagram
S0
S’1
S1
hvex hvem
Wavelength (nm)
10-1
5 s
10-9
s à 1
0-7s
1.3.1. Interaction onde-matière Fluorescence
immunofluorescence AMCA ; Alexa Fluor 488, Alexa 568, Alexa 647, etc. ; Cy2 (Cyanine2), FITC, Cy3.5, TRITC,
lissamine rhodamine, Texas Red, Cy5
DNA Propidium iodide, YOYO, SYTO16 (vital), chromomycine A3 ou mithramycine (bases GC),
bisbenzimide Hoechst 33342 , DAPI, DRAQ5, YOPRO, TOTO3, TOPRO3
mitochondria Rhodamine123, DiOC6(3), DiOC7(3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (vital; post-fixation
possible)
membranes FM1-43, FM4-64, GFP-tagged probes
Endoplasmic reticulum (non specific) DiOC6(3) high concentrations ; GFP-tagged probes
Golgi apparatus Antibodies, GFP-tagged probes ; NBD-C6-ceramide (not for plants)
Cell wall Acriflavine Feulgen, Calcofluor (UV), aniline blue (sur callose), chromomycine or propidium
iodide(non spécific), FM1-43, FM4-64
pH carboxy-SNARF-1 and derivatives, BCECF
calcium Fluo-3 ou -4 (FF), Fura Red, CalciGreen ; Indo-1, Cameleon
viability fluoresceine di-acetate ; exclusion of propidium iodide ; Fluoro-Jade (Histo-Chem) and
morphology by differential interference contrast (DIC)
autofluorescent proteins BFP, CFP, GFP, YFP, DsRed, DsRed2, HcRed1, etc
miscellaneous
Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophyl
Important fluorochromes used in microscopy
Fluorescent proteins : Green Fluorescent Protein
Aequorea victoria (Shimomura et al., 1962)
Spectral characterization
Specific features
Advantadges Can be fused to other proteins of interest No substrate or cofactor No species specificity Stable (pH, T, denaturation, proteases, aldehydes)
Disadvantadges Non optimal excitation peak for the existing laser sources Cryptic intron in plants Need to obtain spectral variants
GFP variants
(Heim et al., 1994, 1995, 1996)
Red Fluorescent Proteins
Coral reef proteins from the Indian and pacific Ocean (Matz et al., 1999) Characteristics similar to GFP except for a slower maturation and the obligatory oligomerization
Mutation to generate fast maturing variants and monomers
18
Broad excitation/emission spectra
In
tens
ité
Longueur d’onde (nm)orange rouge
HcRed
EYFPEGFPECFPEBFP DsRed
0
20
60
80
40
100
350 400 450 500 550 600UV bleu vert
mRFP1
Longueur d’onde (nm)orange rouge
HcRed
EYFPEGFPECFPEBFP DsRed
0
20
60
80
40
100
350 400 450 500 550 600UV bleu vert
mRFP1
HcRed
EYFPEGFPECFPEBFP DsRed
0
20
60
80
40
100
0
20
60
80
40
100
350 400 450 500 550 600350 400 450 500 550 600UV bleu vert
mRFP1
Longueur d’onde (nm)
HcRed
EYFPEGFPECFPEBFP DsRed
0
20
60
80
40
100
400 450 500 550 600 700650UV bleu vert orange rouge IR
mRFP1
Longueur d’onde (nm)
HcRed
EYFPEGFPECFPEBFP DsRed
0
20
60
80
40
100
20
60
80
40
100
400400 450450 500500 550550 600600 700700650650UV bleu vert orange rouge IR
mRFP1
Ex (nm) Em (nm) ε (M-1. cm-1) F brillance (ε . UA) pKa Remarque wtGFP neutre 395 508 25-30 000 0,79 21 600 4,5 Aequorea victoria
wtGFP phénolate 475 503 9,5-14 000 ~9 400 Aequorea victoria
EBFP 380 440 31 000 0,18 5 600 bleu ECFP 434 477 26 000 0,40 10 000 cyan EGFP 488 509 55 000 0,60 33 000 5,5 vert EYFP 515 529 80 400 0,61 49 000 6,9 jaune Venus YFP 510 530 92 000 0,57 52 000 6,0 insensible Cl-1 DsRed ; DsRed2 558 583 57 000 0,79 45 000 4,7 Discosoma striata
mRFP1 584 607 44 000 0,25 11 000 4,5 DsRed monomère HcRed1 ; HcRed-2A 588 618 faible Heteractis crispa
fluorescéine 490 520 80 000 0,90 72 000 6,3
Quantum Dot 405/605 605 2 400 000 0,40 1 000 000 à valider
Epi-fluorescence microscope
Arc lamp
Collector lens
Excitation filter
Objectif lens
Sample
Dichroic mirror
Ocular Lens
Emission filter
Long Pass filter Band Pass filter
Xenon Lamp (XBO) ● power 50 to 150W ● lifetime from 150 to 2000h ● homogenous light for all wavelength ● weak intensity in UV, strong intensity in IR
Light source spectral characteristics
Mercury lamp (HBO) ● power 50 to 100W ● lifetime from 150 to 300h ● good excitation in UV ● peak of intensity in the blue and green light
Reflected light
Transmitted Light Light source
0%
UV IR
Reflect Pass
% R
efl
ect
ion
Dichroïc mirror at 45°
510 Long Pass (LP)
Dichroïc mirror
wavelength
Sample
Detector
% T
rans
mis
sion
100%
100% 0%
Transmitted light Light source
575 nm Short Pass Filter
<575 nm UV IR
block pass
% T
rans
mis
sion
Fluorescence Filters
Light source Transmitted light
520 nm Long Pass Filter
>520 nm
UV IR
block pass
% T
rans
mis
sion
UV
block
pass
block
% T
rans
mis
sion
Transmitted light Light source
630 nm BandPass Filter
620 -640 nm Light IR
1.3.2. Principe d’une lentille convergente
2f>d>f
d>2f
1.3.3. Trajet de la lumière dans un microscope
1.3.4. Limites de résolution Tache d’Airy
D=0,61×l/nsina
Interférences constructives et destructives
La résolution résulte de : •La fonction de défocalisation en z
•La fonction d’étalement du point dans le plan focal (point spread function, PSF)
1.3.4. Limites de résolution Ouverture numérique
Numerical Aperture (NA) = n(sin m)
1.3.4. Limites de résolution Illumination
Focalisation de la lumière sur l’objet Le rôle du condenseur
1.3.5. Anomalies des lentilles
•Anomalie comatique
•Astigmatisme
•Anomalie chromatique (meilleure focalisation des longueurs d’onde courtes)
•Anomalie sphérique
1.3.5. Anomalies des lentilles Correction des objectifs
1.4. Electron et rayonement Longueur d’onde
•Equation de De Broglie
•Energie cinétique (charge e = 1,6.10-19 C; masse m = 9,11.10-28 g;
différence de potentiel V)
1 Joule = 107.cm2.g.s-2
Exemple : si V = 60 kV; alors l = 5.10-3 nm
V l (nm) v (•10-10 cm/sec) v/c
10,000 0.0123 0.593 0.198
50,000 0.0055 1.326 0.442
100,000 0.0039 1.875 0.625
1,000,000 0.0012 5.930 1.977!
•Correction relativiste
V l (nm) v (•10-10 cm/sec) v/c
10,000 0.0123 0.593 0.195
50,000 0.0055 1.326 0.414
100,000 0.0037 1.875 0.548
1,000,000 0.00087 5.930 0.941
1.4. Electron et rayonnement Vitesse des électrons
2. Elements d’un microscope électronique
2.1. Histoire de la microscopie électronique 2.2. Grands types de microscopes électroniques 2.3. Sources d’électrons
2.4. Lentilles électro-magnétiques
2.5. Détecteurs d’électrons 2.6. Microscopes à transmission et à balayage
2.1. Histoire de la microscopie électronique
2.1. Histoire de la microscopie électronique Comparaison optique-électronique
Similarités: •Système d’illumination: source de rayonnement + condenseur
•Echantillon
•Formation de l’image: lentille objectif + lentille projective
•Détection de l’image Différences: •Lentilles optiques et ferromagnétiques
•Grandissements obtenus par changement de lentilles objectifs ou de la distance focale de la lentille projective
•Profondeur de champ
•Nature du contraste
•Vide et déshydratation
2.2. Grands types de microscopes
Le microscope électronique simplifié
Ruska, 1931
2.3. Sources d’électrons
Source thermo-ionique
Source à effet de champ (Field Emission Gun)
½mv² = e(Vc-Va)
l = h/[2me(Vc-Va)] 1/2
v = [2e(Vc-Va)/m] 1/2 et l = h/(mv)
constantes h = 6,63.10-34 J.s (constante de Planck)
m = 9,11.10-31 kg (masse de l'électron)
e = -1,6.10-19 C (charge de l'électron)
c = 3.108 m/s (vitesse de la lumière)
Va-Vc (kV) v (m/s) l (10-1nm) 100 1,9.108 0,039 200 2,7.108 0,027
Filament de tungstène ou d’hexaborure de lanthane
2.4. Lentilles électro-magnétiques Focalisation des électrons
Le facteur d’excitation modifie l’intensité de la composante radiale du champ, donc la convergence de la lentille K = N2I2/V*
2.4. Lentilles électro-magnétiques Anomalies des lentilles
•Anomalie sphérique (d’ouverture)
•Pouvoir de résolution
2.5. Détecteurs d’électrons
Microscopie à transmission: Détecteur 2D
•Ecran fluorescent
•Emulsion photographique
•Détecteurs CCD et PDA
Microscopie à balayage: Détecteur simple
2.6. Microscopes à transmission et à balayage Colonne du microscope à transmission
2.6. Microscopes à transmission et à balayage Système de vide
2.6. Microscopes à transmission et à balayage Insertion de l’échantillon
2.6. Microscopes à transmission et à balayage Colonne du microscope à balayage
3. Formation des images en microscopie électronique
3.1. Interactions électron-matière 3.2. Contraste dans les structures amorphes 3.3. Contraste dans les structures cristallines
3.4. Contraste en microscopie à balayage
3.1. Interactions electron-matière
Microscopie électronique: Interactions électroniques •Diffusion élastique (contraste)
•Diffusion inélastique (microscopie analytique)
Microscopie optique: Variations d’absorbance
3.2. Contraste dans les structures amorphes Diaphragme de contraste
Contraste d’absorption
3.3. Contraste dans les structures cristallines Diffraction par un réseau
Champ clair Champ noir
3.4. Contraste en microscopie à balayage
P(R) = nZ S = image de la surface
4. Préparation des échantillons et exemples d’applications
4.1. Préparation des échantillons 4.2. Cytologie 4.3. Physiologie cellulaire
4.4. Immunohistochimie
4.5. Hybridation in situ 4.6. Biologie des virus 4.7. Autoradiographie
Si l'échantillon est inorganique •Polissage électrolytique (métaux et alliages) •Polissage chimique (presque tous les types de matériaux) •Amincissement sous bombardement d'ions primaires (presque tous les types de matériaux) •Polissage mécanique très doux sur un système dit "tripode" •Coupe par ultramicrotomie
Si l'échantillon est organique •Traitement de fixation (processus chimique ou physique). •Déshydratation par substitution à température ambiante de solvants organiques (alcool ou acétone) à l'eau. •Imprégnation dans différents types de résines, choisies en fonction de l'observation recherchée (polymérisation). •Le matériau est suffisamment résistant pour être débité sous forme de lames minces de 0,5 à 0,05 µm d'épaisseur en moyenne. (ultramicrotome : couteau de verre ou en diamant). •Pour améliorer le contraste entre les différents organites cellulaires, on expose souvent l'échantillon à un produit contenant des atomes lourds (acétate d'uranyle et citrate de plomb), afin que ces derniers, en diffusant à la surface des différentes structures cellulaires, les rendent visibles.
4.1. Préparation de l'échantillon
Préparation des échantillons en microscopie à transmission
Coupes ultra-fines
Cryofractures
Comparaison des images
Microscopie à transmission Microscopie à balayage
Visualisation 3D en microscopie électronique
• Tomographie électronique ou cellulaire
Organisation tridimensionnelle des épines
• Visualisation 2D
• Tomogramme
pccor10_img
• Visualisation 3D
• Reconstitution 3D
Réseau pré-synaptique
• Réticulation des vésicules synaptiques
• Vésicules “dockées”
4.2 Cytologie 4.2.1. Organelles 4.2.2. Cytosquelette 4.2.3. Noyau
4.2.4. Situations pathologiques 4.2.5. Artéfacts 4.2.6. Cryométhodes
4.2.1. Organelles
Synapse
Mitochondrie
Polyribosomes
Muscle
4.2.2. Cytosquelette
Coupe de cil
Coupes de microtubules
Coupes de microtubules
4.2.3. Noyau
Fuseau mitotique
Empreinte d’ADN
4.2.5. Artéfacts Artéfacts d’observation
Confronting cisterns
Membranes accolées
4.2.5. Artéfacts Artéfacts de fixation
Corps multivésiculé
Myelin-like body
4.2.6. Cryométhodes
4.3. Physiologie cellulaire Trafic intracellulaire
Pinocytose
Vésicules recouvertes de clathrine
4.3. Physiologie cellulaire Biologie du développement: Gastrulation
4.3. Physiologie cellulaire Biologie du développement: Neurogénèse
Tube nerveux Cône de croissance
Filopodia
4.3. Physiologie cellulaire Reconstructions tridimensionnelles
Mitochondries confluentes
Reticulum
4.4. Immunocytochimie Localisation
Marqueur enzymatique: Microscopie optique
Microscopie électronique
4.4. Immunocytochimie Localisation
Or colloïdal: Microscopie électronique
4.4. Immunocytochimie Physiologie cellulaire
Secrétion peptidergique Rôle de neurotransmetteur, Libération extrasynaptique
Pow and Morris, 1989
4.4. Immunocytochimie Marquages multiples
Différentes tailles de particules
4.4. Immunocytochimie Trafic intracellulaire
Bernard et al., 2003
4.5. Hybridation in situ Détection radioactive
4.5. Hybridation in situ Protocoles non radioactifs
ARNm Gal
4.6. Biologie des virus
4.7. Autoradiographie
Recapture de noradrénaline H3
Division cellulaire Thymidine H3
Conclusions
Sources d’informations irremplaçables Autres développements: microscopie analytique Préservation des structures Résolution améliorée: microscopie à force atomique