optique et microscopie ... Created with Snap Télécharger 7.5

Franois MICHEL PhD

Rev : 22-05-2013

La microscopie pour dbutants (ou pas) Partie 1

Microscopie en transmission (Plein champs)

et lments doptique

Quelques images de microscopie

1 mm

0.5 mm

0.1 mm

F. Michel 22.05.13


Contraste de phase

Contraste interfrentiel diffrentiel

Illumination standard

Bright field

Phase contrast

Nomarski contrast - DIC

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D.A.B

Cresyl

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Gnralits

Illumination

Dtection

Aberrations et dtrioration de limage

Rsolution et acquisition dimage

Amlioration des contrastes

Ce qui vous attend F. Michel 22.05.13

Gnralits

Buts multiples de la microscopie :

rendre les dtails visibles l'il humain ou par camra

sparer les dtails dans l'image, Mesurer/dtecter un signal lumineux, produire une image agrandie de

l'objet observ.

Souvent, lobservation seffectue en fin de chane aprs lexprience et la prparation des chantillons : Il faut tenir compte du type dobservation prvu ds le dbut du protocole.

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Gnralits Un objet nest observable que par la lumire qui en mane. Cette lumire est gnre :

Par transmission, elle traverse lchantillon Par mission (source secondaire : fluorescence) aprs

excitation (par une source lumineuse primaire ou autres sources dnergie).

Un microscope se dcompose donc en deux parties : Lillumination La dtection

Illumination Dtection

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Gnralits

Camra

Illumination

Dtection

Microscopes droits

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Gnralits

Illumination Diascopique

= transmission

Oculaires

Objectifs

Condenseur

Microscope invers

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Super-rsolution

Gnralits Ordres de grandeur

1 km 10 m 10 cm 1 mm 10 m 100 nm 1 nm 10 pm 100 m 1 m 1 cm 100 m 1 m 10 nm 1

102 103 10 1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

Vision directe Loupe binoculaire

Microscopie photonique Microscope lectronique

10-11

AFM

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Gnralits Nature de la lumire et optique

Loptique est la branche de la physique qui traite de la lumire, de ses relations avec la matire et avec la vision.

Discipline ancienne datant de lantiquit (Grce, Egypte...)

Dans un premier temps base sur loptique gomtrique : propagation rectiligne des rayons lumineux, elle explique rflexions et rfractions (Al-Hazem - Kepler - Snell - Descartes).

Fin XVIIme, dbut des hostilits sur la nature de la lumire entre : La vision corpusculaire qui aboutira loptique quantique au XXme

sicle (Aristote - Euclide - Newton Planck Einstein ; couleur, nergie) Loptique ondulatoire partir du XVIIIme (Huygens - Young - Fresnel

Maxwell ; diffraction, interfrence, polarit) . La dualit onde/corpuscule est reconnue en 1927 par N. Bohr et clos le

dbat donnant naissance llectrodynamique quantique.

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=

Gnralits Nature de la lumire et optique

La lumire est donc compose de photons : qui se propagent de faon rectiligne comme une onde lectromagntique (Maxwell,1870) .

Quantique

Electromagntique

Ondulatoire

Gomtrique

La longueur donde donnant la couleur du rayonnement. Longueur donde (en nm)

400 500 600 700

X UV IR radio

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Physiologie visuelle (rappels ?!?)

Gnralits

Rtine +/- 300 m

La limite de rsolution de lil est due la structure de la rtine : Les images de deux points doivent se former sur deux rcepteurs distincts pour ne pas tre confondues. L'cartement minimal de deux rcepteurs tant de 2,2 m, la limite de rsolution dpend dun grand nombre de facteurs, en conditions normales, elle est denviron 3.10-4 radian = 1' darc soit

Trajet optique : lentille (convergente)

f

Les rayons passant par le centre ne sont pas dvis.

Les rayons parallles laxe optique passent par le foyer image.

Gnralits

Conditions de Gauss : Les rayons traversent le systme, sont peu inclins sur l'axe du systme (rayons paraxiaux)

et proche du centre optique.

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A

B

Gnralits

f f O

Optique gomtrique (rappels ?!?)

Lumire A

B

Plus lobjet est proche du foyer plus limage est grande.

Si lobjet est avant le foyer, limage est inverse

Grandissement de la lentille :

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Gnralits

f f O


Image inverse linfinie

A

B

Lumire

Objet au foyer

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Gnralits

f f O


B

A

Image virtuelle dans le sens AB

A

B

Lumire

Objet entre le foyer et la lentille

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Gnralits

Microscope simple (loupe) : image perue par l'il comme si elle tait une distance de 25 centimtres Limage apparat du mme ct de l'objectif que lobjet, et ne peut pas tre projete sur un cran : image virtuelle (droite, non inverse). La lumire transmise travers la tranche entre dans la lentille pour tre rfracte et focalise et produire limage perue par la rtine.

Objet rel

Image virtuelle

Lentille simple (loupe)

25 c

m

Combinaison lentille & il

f

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Gnralits

1 2

n1 n2

n1 > n2

3

n3

n1 < n3

1 n1

n1 sin1 = n2 sin2

Loi de Snell-Descartes

Interfaces et rfraction

Nature 455 p 299 : Farewell to Flatland by Ortwin Hess

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sin1 = n2/n1 (sin2)

Exemple : 1 = 30 nair/nverre =1/1,52 2 = 19,2

1

2

nair nverre

Air Verre

Gnralits

Interfaces et rfraction Valeurs approches de n, lindice optique, pour quelques substances

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c : vitesse de la lumire dans le vide : la vitesse de propagation de l'onde dans le milieu travers

vide = c= 299 792 458 ms-1 Air= 299 704 764 ms-1 Donc nvide=1 et nair=1.0002926

Eau= 224841533 ms-1 donc neau=1.33335 2 = 22.02 Verre= 197603687 ms-1 donc nverre=1.51714 2 = 19,24

n = c/ donc n1

= f(, ) = f(, P, T) 2 = 1

: permittivit dilectrique : permabilit magntique

Gnralits Interfaces et rfraction n : indice optique

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Gnralits Principe du microscope optique

L'objectif (L1) donne de l'objet AB observ une image relle AB renverse et trs agrandie qui joue pour l'oculaire (L2) le rle d'objet rel. L'oculaire donne de cet objet une image virtuelle agrandie, vue par l'observateur linfinie car AB est au foyer F2 de loculaire.

Plan image intermdiaire

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Gnralits

Statif Condenseur Objectifs Oculaires /camra

Concepts importants Ouverture numrique Rsolution Aberrations

Composants du microscope

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Gnralits

Illumination

Dtection





Illumination Sources de lumire

La source de lumire en microscopie de transmission a longtemps t le soleil ou une bougie. Elle est maintenant constitu dune lampe halogne filament de tungstne 12 V. Lillumination par LED blanches devient de plus en plus courante.

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Illumination

La fonction du condenseur est de concentrer la lumire sur lobjet.

Les microscopes d'initiation sont le plus souvent dpourvus de condenseur, auquel est substitu un miroir concave ou des LEDs blanches.

Le champ clair par le condenseur doit tre uniforme.

L'ouverture numrique du condenseur joue sur la qualit de l'illumination de l'objet.

Idalement, elle devrait correspondre celle de l'objectif (il existe des condenseurs immersion pour les objectifs d'ON >1)

Condenseur

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Illumination

Objectif Plan objet Source lumineuse

Lentille collectrice (Miroir concave)

Illumination critique Echantillon

Image de la source

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Illumination

Cest la mthode la plus simple. Elle consiste focaliser la lumire de la source sur lobjet. Linconvnient majeur est que la source nest gnralement pas

homogne et par consquent, lchantillon ne sera pas clair uniformment ce qui induit des aberrations tels que des effets de bords (bords sombres).

Cest la mthode de choix pour les faibles clairements (flamme, soleil, lampe).

Illumination critique

Objectif Diaphragme douverture

Condenseur

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Illumination

Mauvais rglages du diaphragme douverture du condenseur : A) la pupille dentre de lobjectif nest pas entirement couverte (perte de

rsolution) ou B) toute la lumire nentre pas (perte de luminosit et de contraste).

Illumination critique

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A

B

Illumination

Diaphragme douverture Objectif

Diaphragme de champs Illumination de Khler

Condenseur Rglage essentiel:

- assure un clairage homogne de la prparation - contribue lobtention de la meilleure

rsolution latrale - intervient sur la profondeur de champ et le

contraste de limage August Khler

(1866-1948)

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Illumination

Condenseur

Diaphragme douverture

Filtres gris (densits

neutres) et/ou colors

Diaphragme de champ

Botier lumire transmise

lampe halogne

Vis de centrage du condenseur

Mise au point axiale du

condenseur

Disposition des diaphragmes

Microscope invers

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1) Mettre au point sur une prparation faible grossissement, les deux diaphragmes grands ouverts.

2) En dehors de lchantillon, fermer le diaphragme de champ pour visualiser une tache lumineuse polygonale, floue et non centre.

Illumination Rglages de Khler ( faire pour chaque objectif)

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3) Rendre nette cette tche en jouant sur la hauteur du condenseur (bords polygonaux)

4) Centrer ce polygone dans le champ laide des vis de centrage du condenseur

Illumination Rglages de Khler

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5) Ouvrir le diaphragme de champ jusqu la limite de perception dans loculaire (tangentiel) pour vrifier le centrage puis louvrir un peu plus.

6) Fermer lgrement le diaphragme douverture si

besoin est, pour contraster.

ferm mdian ouvert

Illumination Rglages de Khler

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Rglage optimal de lampe + collecteur diaphragmes condenseur objectif oculaires

illum

inat

ion

dte

ctio

n Illumination

Trajet optique

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Gnralits

Illumination

Dtection





Dtection

Objet

Lamelle

Huile

Lame

60x 1.4 NA

Objectifs

Milieu de montage

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Dtection Objectifs

Objet complexe, fragile et couteux (de 500 plus de 20 000 ), central dans la chane optique, sa qualit (sa propret) et ses caractristiques influent

directement sur limage obtenue.

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Dtection Caractristiques techniques des objectifs

Marques : incompatibles entre elles (vissage, optiques, corrections)

Grandissement : de 2.5 150X fates votre choix (code couleur, zoom)

Ouverture numrique : rsolution, luminosit

Milieu(x) dimmersion : sec, eau, huile (ONmax respective : 0.95 1.2 1.47)

Type (corrections des aberrations) : planit, chromaticit

Proprits optiques spciales : contraste de phase, DIC

paisseur de lamelle : normalement 170 m (rglable quelquefois, attention

aux microscopes inverss (ptri = plastique pais))

Distance de travail : de la lentille dentre de lobjectif au point focal

(de 150 m plusieurs millimtres) *

Profondeur de champs : paisseur de la "coupe optique", dpend de lON*

* Non indiqu sur lobjectif

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LOuverture Numrique : ON=n.sin() o n est lindice optique et le demi-angle du cne de dtection (Numerical Aperture : NA).

LON nest pas lie au grandissement, il y a des ON fortes faible grandissement comme le 20X sec Zeiss de 0,8 ou des 20X immersion eau Olympus 0,95 et plus rcemment Zeiss et Leica de 1,05 dON.

Plus lON est grande, meilleure est la rsolution (Res(nm) = 0.61 /ON) Une mauvaise illumination induit une ON dgrade.

Dtection Ouverture numrique

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Objectif

n=1.52

n = 1.52

n = 1.52

Objet

Lamelle

Huile

n=1.33

n = 1.52

n = 1.0

n = 1.52

n=1.52

Air

Eau

L'inhomognit des indices rduit le pouvoir rsolutif du microscope et peu induire des aberrations chromatiques ou autres (n=f(..))

Dtection Milieux dimmersions : n dans la pratique

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Profondeur de Champ

Dtection

Distance entre le point le plus haut et le point le plus bas de la prparation qui donne une image nette (paisseur de la tranche optique).

Ex. 488 nm : 5,4 m pour un objectif sec x10 (ON 0,3) 0,378 m lobjectif x63 immersion huile (ON 1,4)

Dpend de louverture numrique : la profondeur de champ diminue lorsque louverture numrique augmente.

2ONnPdC =

LON dun microscope en transmission dpend des ON de lobjectif mais aussi du condenseur : le diaphragme douverture limite le cne dillumination et donc lON.

Ferm (fort contraste) Ouvert (forte rsolution)

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Gnralits

Illumination

Dtection





Aberrations monochromatiques Sphrique Coma Astigmatisme Courbure de champs Distorsion

Aberrations chromatique Longitudinale Latrale

Aberrations et dtrioration de limage Les aberrations optiques sont des carts aux conditions de Gauss

Limage dun point nest pas un point ! On y reviendra plus tard

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Sphriques

Les rayons lumineux qui passent la priphrie ne convergent pas au mme endroit que les rayons qui passent au voisinage de laxe.

Aberrations et dtrioration de limage F. Michel 22.05.13

Coma

Limage dun point lorsque la lentille nest pas perpendiculaire laxe optique (tilt) apparat comme une comte.


Astigmatisme

Limage dun point hors axe apparat comme un btonnet; Il y a deux foyers dus lasymtrie du montage.


Gomtriques / courbure de champs

Limage dun plan nest pas un plan, mais une surface sphrique concave (lentille convergente)

ou convexe (lentille divergente).


Chromatiques (axiales et latrales)

La distance focale dune lentille dpend lindice optique n et donc de .


Correction des aberrations : limitation des bords des lentilles (diaphragme de champs, Gauss) lentilles non sphriques (difficiles usiner, optique adaptative) association de lentilles de courbures diffrentes (doublet, triplet).

Toutes ces aberrations peuvent tre corriges par associations de lentilles et/ou traitement des surfaces :

Les objectifs de microscope sont compliqus, fragiles et coteux.

Type dobjectifs

Aberrations Sphriques

Aberrations Chromatique

Courbure de champs

Achromat 1 Couleur 2 Couleurs Non Plan Achromat 1 Couleur 2 Couleurs Oui

Fluorite 2-3 Couleurs 2-3 Couleurs Non Plan Fluorite 3-4 Couleurs 2-4 Couleurs Oui

Plan Apochromat 3-4 Couleurs 4-5 Couleurs Oui


Gnralits

Illumination

Dtection





Quantique

Electromagntique

Ondulatoire

Gomtrique

Interfrences

Chaque onde est caractrise par une phase et une amplitude. Deux ondes peuvent se superposer si elles ont la mme direction de

propagation et le mme plan de vibration, elles vont crer des interfrences.

Rsolution et acquisition dimage F. Michel 22.05.13

Diffraction La lumire est diffracte quand elle rencontre un obstacle sa propagation

(exemple une ouverture), cela va changer sa phase et/ou son amplitude.

La diffraction de la lumire est variable en fonction de la taille de louverture et de la longueur donde.


Limage dun point nest pas un point !

Tout systme optique dgrade limage source travers une Fonction de Dispersion dun Point (PSF)

Systme

Optique

Plan focal

source

Tche dAiry

X

Z

X

Y


2 1 0 1 2

PSF

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La rsolution optique est la capacit dobtenir limage de deux points distincts en deux objets (PSF) individualisables.

)()(22,1

condONobjONd

+

Les deux tches de Airy apparatront comme spares uniquement si la

diffrence de niveau entre leurs courbes d'nergie est suffisamment

grande pour tre discerne par le dtecteur (il, camra) donc

spars d'une distance au moins gale au rayon du disque d'Airy :

Critres de Rayleigh

ONONR fluo 61,0

222,1

==


ON =0,12 ON =0,34 ON =0,87

La PSF et la rsolution sont fonction de lON

A 488nm 5X sec ON= 0.15 10X sec ON= 0.3

20X sec ON=0.8

40X huile ON=1.3

60X eau ON=1.2

60X huile ON=1.4

Rsolution XY en m 1.984 0.992 0.372 0.229 0.248 0.212

La rsolution dpend de lON et non du grandissement


Construction de limage

1 point

2 points

5 points

Source PSF

N points


Rsolution axiale (thorique)

Pour 488 nm

5X sec ON= 0.15

10X sec ON= 0.3

20X sec ON=0.8

40X huile ON=1.3

60X eau ON=1.2

60X huile ON=1.4

Rsolution XZ en m 43.378 10.844 1.525 0.878 0.901 0.757

8.6 17.5 53.1 58.8 64.5 67.1

2

2sin

2ONn

ONRxz

==

Pour mmoire

=

nON1sin


Dtection

Dans un microscope limage que lon observe est un agrandissement de limage virtuelle issue de lobjectif (2 tapes).


Essentiellement une fonction de lentille de projection avec un grossissement de

5x 20x.

On ajuste la distance inter-pupillaire sa morphologie, de mme chaque oculaire

doit tre rgl sa propre vue.

L'image est nette +/- 1 cm de la lentille de sortie (les illetons en caoutchoucs

servent crer cet espace et viter de

salir la lentille).

On peut ajouter dans le trajet optique des filtres ou des grilles de

positionnement ou de comptage.

Oculaires Rsolution et acquisition dimage

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Camras CCD (Charged Coupled Device)

Caractristiques dune camra La rsolution spatiale La rsolution temporelle : Sensibilit, architecture du transfert, binning Le rendement quantique (q

Echantillonnage spatial

Lum

Exemple pour un 100X 1.4 dON 488 nm Rsolution 212 nm

taille du pixel optimum 92 nm Taille relle 6.45 m /100 donc 64.5 nm

Taille du pixel optimal (Nyquist-Shannon) = rsolution/2,3 : Cela permet davoir un minima entre les maximas quelque soit la position des pixels (cadre de lecture).


Ratio S/B et Dynamique Bruits de fond :

Bruit de Photon: d aux caractristiques de la lumire incidente

Bruit dobscurit : gnration de- par effet thermique

Bruit de lecture : gnr par llectronique de la camra

La dynamique : lie au bruit de fond et la capacit des puits de potentiels (binning) (ex : 5 105 e-/10 e- soit 5000:1 adapte une image 12 bits 4096 niveaux de gris)


Gnralits

Illumination

Dtection





Fond noir Contraste de phase

Contraste Interfrentiel Diffrentiel (DIC)

Autres mode dIllumination F. Michel 22.05.13

Fond noir Autres mode dIllumination

Surfaces rflchissantes Filtres

occultants

Combinaison dimages en fond noir et d illumination polarise Avec lautorisation du Dr Steve Edgley

http://www.pdn.cam.ac.uk/groups/edgleylab/index.html

Seul les photons diffracts/diffuss par lchantillon sont transmis et capts par lobjectif

du fait de lillumination structure.

Condenseur spcial

Photons diffuss

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Contraste de phase

Fritz Zernicke, Prix Nobel (1953).

Inventeur du contraste de phase

- Lil humain est uniquement capable de voir des diffrences dintensit (amplitude) ou de couleur ().

- Les objets biologiques microscopiques sont souvent trs transparents et donc peu contrasts car le flux lumineux transmis par les diffrentes parties des cellules est similaire.

- Par contre, lindice optique des diffrents compartiments cellulaires est trs variable ce qui induit des diffrences de vitesse des ondes donc des retards de phase des ondes.

- But : transformer des diffrences de phase en diffrences dintensit


Longueur donde ()

+ =

Dphasage de /4

Echantillon

Interfrences

Contraste de phase

En moyenne un chantillon biologique entraine un dphasage de /4 (/2 en cosinus).

les interfrences sont trop faibles pour induire un contraste dcelable.

Lumire directe

Lumire diffracte /2

3/4

0-2


Echantillon Lame de phase

Dphasage de /4 supplmentaire =

Contraste de phase

Ondes en opposition de

phase (/2)

Pour obtenir un contraste maximal, il faut crer linterfrence en dphasant la lumire diffracte uniquement de /2.

/2

3/4

0-2


Contraste de phase Condenseur

Anneau de phase Lame de phase

Objectif

Lumire diffracte Lumire

directe transmise

La lumire directe transmise (annulaire - jaune) est fortement attnue par le cercle de la lame de phase et va interfre avec la lumire diffracte (grise sur le

schma) par lchantillon pour former un contraste en noir et blanc (interfrences destructive (+/4) ou constructive (-/4) ).

On obtient donc un dphasage diffrentiel de /2.


Contraste interfrentiel diffrentiel :DIC (Nomarski) Les prismes de Wollaston sparent la lumire en deux faisceaux de polarisations

perpendiculaires (birfringence). Lorsquils sont recombins par le deuxime Wollaston, il y a des interfrences entre les deux rayons en fonction de la diffrence de leurs chemins

optiques. Il en rsulte une lumire grise si le trajet optique a t le mme, et blanche ou noire sil a t diffrent, donnant lillusion dun clairage rasant. Ce type de contraste donne un

effet de relief sur des prparations paisses (idal pour le patch-clamp).

Polariseur (45) Prpare la lumire

pour le premier Wollaston.

Prismes de Wollaston Spare la lumire incidente

en deux faisceaux de polarisation croise

Prismes de Wollaston Recombine les deux faisceaux de polarisation croise en un seul polarisation unique crant des interfrences et du contraste.

la position latrale du prisme influx sur lamplitude du contraste.

Condenseur Objectif Echantillon

Analyseur (135) Bloque la lumires transmise directe


Phase Compatible avec lutilisation de boite

plastique Sensible au chemin optique parcouru Halos (contraste noir/blanc) autour

des objets Insensible lorientation des

structures (contraste isotrope)

DIC Limit au verre

Sensible des variations dindice Pas de halos autour des objets Utilisation optimale de louverture numrique donc meilleure rsolution Sensible lorientation des

structures (effet pseudo-ombrage) Plus cher

Comparaison contraste de phase /DIC


Fin du premier round

Merci davoir tenu jusque l, Prochaine tape : la microscopie de fluorescence

Commentaires, remarques, amliorations : [email protected]

Quantique

Electromagntique

Ondulatoire

Gomtrique

F. Michel 22.05.13

WEB divers Molecular expressions http://micro.magnet.fsu.edu/index.html

Microscopy U (Nikon) : http://www.microscopyu.com Microscopy resource system (Olympus): http://www.olympusmicro.com/index.html

A whole world of microscopy knowledge (Zeiss): http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html Wikipdia

Plate-formes dimagerie

PICSL http://www.picsl.univ-mrs.fr/ : MICROSCOPIE OPTIQUE (PDF indisponible) BIC http://www.bic.u-bordeaux2.fr/ : Microscopie pi-fluorescence et microscopie confocale (PDF) Membres du GDR2588 CNRS (microscopie fonctionnelle des systmes vivants) et

du RTmfm (Rseau technique de microscopie de fluorescence multidimensionnelle).

Cours Arnaud Serg (universit de la Mditerrane Marseille II) Yves Husson (Universit Joseph Fourrier Grenoble) Serge Monneret (Institut Fresnel, Marseille)

Maxime Dahan (Laboratoire Kastler Brossel, ENS) Franois Waharte (institut Curie, UMR144)

Handbooks

Fondamentaux doptique et dimagerie numrique lusage des microscopistes (C Cibert, ed. Cpadus) Handbook of biological confocal microscopy, third edition (JB. Pawley ed. Springer) Fundamentals of light microscopy and electronic imaging (DB. Murphy, ed Wiley-liss)

Sources et Ressources F. Michel 22.05.13

http://micro.magnet.fsu.edu/index.htmlhttp://www.microscopyu.com/http://www.olympusmicro.com/index.htmlhttp://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.htmlhttp://www.picsl.univ-mrs.fr/http://www.bic.u-bordeaux2.fr/http://www.gdr2588.cnrs.fr/http://rtmfm.ibl.fr/

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