FRÉDÉRICK THERRIEN

EFFET DE L’INHIBITION CHRONIQUE DE LA SYNTHÈSE DU MONOXYDE D’AZOTE SUR LA

PRESSION ARTÉRIELLE ET L’APPARITION DES DOMMAGES CARDIOVASCULAIRES ET RÉNAUX

CHEZ LE RAT HARLAN SPRAGUE-DAWLEY

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en médecine expérimentale pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)

FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2005 © Frédérick Therrien, 2005

RÉSUMÉ L’hypertension et le déclin de la fonction rénale observés en insuffisance rénale sont

associés à une diminution de la biodisponibilité du monoxyde d’azote (NO) et à une

augmentation de la formation d’angiotensine II (AngII). L’objectif de notre première étude

est d’évaluer les altérations cardiovasculaires et rénales causées par l’inhibition chronique

de la synthèse du NO chez le rat Harlan Sprague-Dawley (Hsd : SD) ainsi que le rôle de

l’AngII. La synthèse du NO est inhibée par l’administration d’un analogue de la L-

arginine, le L-NAME (100 mg/kg/jour), administré dans l’eau à boire pendant 3 semaines.

Le rôle de l’AngII est évalué à l’aide d’un antagoniste des récepteurs AT1 de l’AngII, le

losartan (20 mg/kg/jour). À la fin de l’étude, les rats L-NAME ont une pression artérielle

systolique (PAS) élevée par rapport aux animaux témoins. Ils présentent une augmentation

de la créatinine sérique et de la protéinurie indiquant une atténuation importante de la

fonction rénale. Les dommages rénaux sont caractérisés par de l’ischémie glomérulaire, de

l’atrophie tubulaire et de la prolifération myointimale. Les animaux L-NAME présentent

une augmentation de l’expression de l’ET-1 et du TGF-β dans les vaisseaux et les reins.

On observe également une augmentation des taux d’anion superoxide (•O2-), une espèce

réactive de l’oxygène (ROS), dans la paroi des vaisseaux. Le traitement avec le losartan

freine l’élévation de la PAS, atténue l’élévation de la créatinine sérique et de la protéinurie.

Le losartan prévient également les dommages glomérulaires, tubulaires et vasculaires

observés dans le rein. En plus, le losartan normalise l’expression vasculaire et rénale de

l’ET-1 et du TGF-β ainsi que le taux des ROS dans l’aorte thoracique.

Afin de déterminer le rôle de l’ET-1, du TGF-β1 et des ROS chez le rat Harlan traité au L-

NAME, nous avons administré un antagoniste des récepteurs ETA de l’ET-1 (LU135252),

un anticorps monoclonal neutralisant le TGF-β (1D11) et un antioxydant (acide lipoïque).

L’effet de ces traitements sur la PAS, la créatinine sérique, la protéinurie et les dommages

cardiovasculaires et rénaux est évalué après 3 semaines. Malgré l’augmentation au niveau

vasculaire et rénale de l’expression de l’ET-1, du TGF-β et des ROS chez les animaux L-

NAME, le blocage individuel de chacun de ces facteurs avec soit le LU135252, l’anticorps

1D11 ou l’acide lipoïque n’a eu aucun effet sur l’élévation de la PAS, de la créatinine

sérique, de la protéinurie et l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux.

Dans une deuxième étude, nous avons évalué l’influence du degré d’inhibition de la

synthèse du NO sur le développement de l’hypertension et l’apparition des dommages

cardiovasculaires et rénaux chez le rat Hsd : SD et l’implication de l’AngII. L’inhibition de

la synthèse du NO est obtenue par le traitement au L-NAME à différentes doses (100, 30 et

5 mg/kg/jour). Le rôle de l’AngII est évalué à l’aide du losartan (20 mg/kg/jour). L’effet

de ces traitements sur le taux urinaire de nitrates/nitrites, la PAS, la créatinine sérique, la

protéinurie et les dommages histologiques vasculaires et rénaux est évalué après 3, 4 et 12

semaines. Les différentes doses de L-NAME diminuent les taux urinaires de

nitrates/nitrites de 95%, 91% et 80% comparativement aux animaux contrôles. Le L-

NAME aux doses de 100mg et 30mg/kg/jour augmente la PAS (p<0.01), la créatinine

sérique et la protéinurie en 3-4 semaines. Ces animaux présentent des lésions ischémiques

rénales associées à des dommages vasculaires sévères dont de la prolifération myointimale.

Par contre, à la dose de 5mg/kg/jour de L-NAME, l’hypertension se développe de façon

modérée et les dommages cardiovasculaires et rénaux apparaissent tardivement à 12

semaines. Le traitement avec le losartan atténue l’augmentation de la PAS, de la créatinine

sérique, de la protéinurie et des dommages cardiovasculaires et rénaux aux différentes

doses de L-NAME.

En conclusion, mes travaux démontrent l’importance du NO dans le maintien de la fonction

endothéliale. En effet, l’inhibition chronique de la synthèse du NO chez le rat Hsd : SD

cause une hypertension sévère et des dommages cardiovasculaires et rénaux majeurs qui

dépendent du degré d’inhibition. Ces effets pathophysiologiques sont causés, en partie, par

l’action accrue de l’AngII qui peut moduler, entre autres, la production d’ET-1, du TGF-β

et des ROS. Le blocage individuel de chacun de ces facteurs ne parvient cependant pas à

freiner l’élévation de la PAS, le déclin de la fonction rénale et l’apparition des dommages

cardiovasculaires et rénaux lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO à forte dose

(100 mg/kg/jour). Finalement, ces résultats démontrent une relation étroite entre l’AngII et

le NO dans la pathogenèse de l’hypertension et des dommages cardiovasculaires et rénaux.

ABSTRACT Impaired nitric oxide (NO) bioavailability and increased angiotensin II sensitivity has been

implicated in the pathogenesis of hypertension associated with chronic renal failure. The

present study was designed to investigate the cardiovascular and renal damages induced by

chronic NO synthesis inhibition in Harlan Sprague-Dawley rats (Hsd : SD) and the role of

AngII. NO synthesis inhibition is induced by treatment with the L-arginine analogue, L-

NAME (100 mg/kg/day), administered in the drinking water for 3 weeks. The role of

AngII is evaluated with the AT1 receptor antagonist losartan (20 mg/kg/day). At the end of

the study, L-NAME treated rats exhibited increased systolic blood pressure (SBP)

compared to control animals. They also showed increased serum creatinine and proteinuria

indicating a decline in the renal function. These changes were associated with the

development of glomerular ischemia, tubular atrophy and neointimal hypertrophy. L-

NAME treated rats also exhibited increased expression of ET-1 and TGF-β1 in the vessels

and the kidney. They also presented increased formation of superoxide anion, a reactive

oxygen species (ROS), in the thoracic aorta. Treatment with losartan attenuated the

increased in SBP, serum creatinine and proteinuria and prevented the glomerular, tubular

and vascular damages observed in the kidney. Losartan also normalized vascular and renal

expression of ET-1 and TGF-β1 and overproduction of ROS in the thoracic aorta.

To determine the specific role of ET-1, TGF-β1 and ROS in L-NAME treated rats, we

administered respectively an ETA receptor antagonist (LU135252), a monoclonal antibody

neutralizing TGF-β (1D11) and an antioxidant (α-lipoic acid). The effect of these

treatments on SBP, serum creatinine, proteinuria and cardiovascular and renal damages was

evaluated after 3 weeks. Despite increased level of vascular and renal expression of ET-1,

TGF-β and ROS in L-NAME treated rats, treatment with LU135252, the monoclonal

antibody 1D11 and the antioxidant α-lipoic acid taken each alone had no effect on the

elevation of SBP, serum creatinine, proteinuria and cardiovascular and renal damages.

In a second study, we evaluated the effect of different degrees of NO synthesis inhibition

on hypertension and cardiovascular and renal damages in Hsd : SD rats and the implication

of AngII. Chronic NO synthesis inhibition is induced by treatment with L-NAME at

different doses (100, 30, 5 mg/kg/day). The role of AngII is evaluated with losartan (20

mg/kg/day). The effect of these treatments on urinary nitrates/nitrites, SBP, serum

creatinine, proteinuria and vascular and renal damages are evaluated after 3, 4 and 12

weeks. The different L-NAME doses decreased urinary nitrates/nitrites by 95%, 91% and

80% as compared to control animals. L-NAME at a dose of 100 and 30 mg/kg/day

increased SBP (p<0.01), serum creatinine and proteinuria within 3-4 weeks. These animals

showed renal ischemic lesions associated with myointimal proliferation and lumen

obstruction. At a dose of 5 mg/kg/day of L-NAME, SBP increased moderately (p<0.01)

and cardiovascular and renal damages appeared later (week 12). Treatment with losartan

attenuated the increased in SBP, serum creatinine, proteinuria and cardiovascular and renal

damages at all doses of L-NAME utilized.

In conclusion, these studies demonstrate the importance of basal NO release in the maintain

of endothelial function. In fact, chronic NO synthesis inhibition in Hsd : SD rats cause

severe hypertension and cardiovascular and renal damages which depend on the degree of

inhibition. These pathological effects are caused, in part, by the action of AngII which can

modulate the production of ET-1, TGF-β and ROS. However, the individual blockade of

these factors do not attenuate the elevation of SBP, serum creatinine, proteinuria and the

apparition of cardiovascular and renal damages caused by chronic NOS inhibition at a high

dose (100 mg/kg/day). Finally, these results demonstrate a close relationship between NO

and AngII in the pathogenesis of hypertension and cardiovascular and renal damages.

AVANT-PROPOS D’entrée de jeu, il me convient de mentionner que ce travail de maîtrise a été réalisé

dans le cadre du programme de Maîtrise en médecine expérimentale de l’Université Laval.

J’ai la conviction, ô combien profonde, que les connaissances acquises au cours de ce

projet, qu’elles soient fondamentales, techniques ou appliquées, renforceront ma formation

scientifique et guideront la voie de mes projets futurs. Par ailleurs, c’est avec grand intérêt

que je débuterai à l’automne mes études de troisième cycle au Centre de recherche en

néphrologie et hypertension de l’Hôtel-Dieu de Québec.

Dans le cadre de cette étude, j’ai exécuté la majorité des protocoles animaux

comprenant les suivi des paramètres biologiques de même que les analyses biochimiques et

moléculaires subséquentes. Martin d’Amours ainsi que Geneviève Robitaille ont fourni des

résultats complémentaires à l’étude. Le Docteur Mohsen Agharazii a apporté son aide pour

relever et analyser l’ensemble des coupes histologiques. Le Docteur Marcel Lebel a

apporté sa contribution dans l’élaboration du projet, alors que le Docteur Richard Larivière

a dirigé l’ensemble de l’étude. Par ailleurs, j’aimerais souligner que j’ai eu l’immense

privilège de présenter une partie de ces travaux à plusieurs occasions dont à la 14e réunion

scientifique annuelle de la European Society of Hypertension à Paris au mois de juin 2004.

REMERCIEMENTS J’aimerais en tout premier lieu exprimer des remerciements spéciaux à mon

directeur de recherche, le Docteur Richard Larivière, un homme de science enthousiaste,

dévoué et perspicace, ayant à cœur la formation et la réussite de ses étudiants. Il a su voir

le potentiel en moi, y a cru et a permis la réalisation de ce projet. J’apprécie profondément

ses encouragements, son soutien, ses enseignements et ses conseils.

Merci au Docteur Marcel Lebel, au Docteur Darren Richard et au Docteur Mohsen

Agharazii qui ont su s’imposer par leur présence, leur appuie et leur dévouement. Merci

pour tout!

Aux membres de l’équipe : Marie-Ève Rodrigue, Philippe Lavoie, Sébastien Savard,

Patrick Taillon, Mélanie Nadeau, Sonia Lacasse, Nadia Chbinou, Claude Villeneuve et

Danielle Lizotte ainsi qu’à mes complices de tous les jours : Élisabeth Pagé, Guylaine

Soucy, Geneviève Robitaille, Marc-André Déry, Maude Michaud-Dumont et Marie-Claude

Lauzier. Merci pour votre accueil, votre collaboration, et surtout, votre amitié! J’ai

beaucoup de plaisir à travailler avec vous.

Je tiens également à remercier mes merveilleux parents, Renald Therrien et Nicole

Paradis, qui m’ont guidé et m’ont aidé depuis le premier jour ainsi qu’à ma sœur Valérie et

à son époux Hugo.

Finalement, j’aimerais remercier ma copine Marie-Josée Fortin pour son appui

constant, sa présence, ses nombreux encouragements et son amour.

À ceux qui m’entourent, vous êtes la lumière qui me montre le chemin

Impossible is nothing [Muhammad Ali]

TABLE DES MATIÈRES

Résumé.....................................................................................................................................i Abstract................................................................................................................................. iii Avant-propos ..........................................................................................................................v Remerciements.......................................................................................................................vi Table des matières .............................................................................................................. viii Liste des tableaux....................................................................................................................x Liste des figures .....................................................................................................................xi Liste des abréviations........................................................................................................... xii Chapitre 1- INTRODUCTION .............................................................................................13

1.1- Hypertension Artérielle..............................................................................................13 1.1.1- Généralités..........................................................................................................13 1.1.2- Prévalence et liens avec les MCV ......................................................................13 1.1.3- Facteurs de risques .............................................................................................14 1.1.4- Conséquences pathophysiologiques de l’HTA...................................................14 1.1.5- Hémodynamie de la pression artérielle ..............................................................15

A- Le débit cardiaque ...............................................................................................15 B- La résistance périphérique ...................................................................................15

1.1.6- Régulation de la pression artérielle ....................................................................16 A- Système nerveux, barorécepteurs et chimiorécepteurs........................................16 B- Facteurs neuro-humoraux ....................................................................................17 C- Système rénine angiotensine................................................................................18 D- Contrôle rénale de la pression artérielle ..............................................................19

1.2- Dysfonction endothéliale ...........................................................................................21 1.2.1- Généralités..........................................................................................................21 1.2.2- Définitions ..........................................................................................................21

1.3- Monoxyde d’azote......................................................................................................23 1.3.1- Généralités..........................................................................................................23 1.3.2- Biosynthèse et mode d’action du NO.................................................................23 1.3.3- Localisation des NOS.........................................................................................24 1.3.4- Mécanismes de régulation de la eNOS...............................................................24 1.3.5- Implications cardiovasculaires et rénales ...........................................................25 1.3.6- Effets sur la pression artérielle et la fonction rénale ..........................................25

1.4- Angiotensine II...........................................................................................................30 1.4.1- Système rénine angiotensine classique et tissulaire .........................................30 1.4.2- Mécanismes d’actions de l’AngII.......................................................................31

1.5- Endothéline ................................................................................................................37 1.5.1- Synthèse de l’ET-1 .............................................................................................37 1.5.2- Mécanismes d’actions de l’ET-1 ........................................................................37 1.5.3- Implications cardiovasculaires et rénales ...........................................................37

1.6- Transforming Growth Factor-β ..................................................................................39 1.6.1- Synthèse du TGF-β.............................................................................................39 1.6.2- Mécanismes d’action du TGF-β .........................................................................39

1.7- Espèces réactives de l’oxygène..................................................................................40 1.7.1- Biosynthèse.........................................................................................................40 1.7.2- Actions et implications cardiovasculaires ..........................................................40

1.8- Interactions entre les facteurs endothéliaux ...............................................................41 1.8.1- NO et AngII........................................................................................................41 1.8.2- NO et ET-1 .........................................................................................................42 1.8.3- NO et TGF-β.......................................................................................................43 1.8.4- NO et ROS..........................................................................................................43

Chapitre 2- Pertinences et objectifs de recherche.................................................................45 2.1- Hypothèse...................................................................................................................45 2.2- Objectifs de recherche................................................................................................46

Chapitre 3- Article scientifique.............................................................................................47 Chapitre 4- Degré d’inhibition de la synthèse du NO ..........................................................76

4.1- Pertinences et objectifs du projet ...............................................................................76 4.2- Hypothèse...................................................................................................................76 4.3- Objectifs de recherche................................................................................................76 4.4- Matériel et méthodes ..................................................................................................77

4.4.1- Protocole animal .................................................................................................77 4.4.2- Mesure des NO2

-/NO3-........................................................................................77

4.4.3- Analyses statistiques...........................................................................................78 4.5- Résultats .....................................................................................................................79

4.5.1- Effets du degré d’inhibition de la synthèse du NO.............................................79 A- Survie des animaux..............................................................................................79 B- Excrétion urinaire des métabolites du NO...........................................................80 C- Pression artérielle systolique ...............................................................................81 D- Créatinine sérique ................................................................................................82 E- Protéinurie............................................................................................................83 F- Histologie rénale ..................................................................................................84

4.5.2- Effets d’un bloqueur des récepteurs AT1............................................................86 A- Excrétion urinaire des métabolites du NO...........................................................86 B- Pression artérielle systolique ...............................................................................87 C- Créatinine sérique ................................................................................................88 D- Protéinurie ...........................................................................................................89

4.5.3- Effet du losartan sur l’histopathologie rénale.....................................................90 DISCUSSION.......................................................................................................................93 CONCLUSION.....................................................................................................................99 BIBLIOGRAPHIE..............................................................................................................100

LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Prévalence de l'hypertension selon l'âge et le sexe............................................13 Tableau 2 : Régulation hormonale de la pression artérielle..................................................18 Tableau 3 : Effets vasculaires directs de l’AngII..................................................................34

LISTE DES FIGURES Figure 1 : Facteurs vasoactifs de l'endothélium : un équilibre .............................................21 Figure 2 : Voie de signalisation du récepteur AT1................................................................32 Figure 3 : Signalisation du récepteur AT1 ............................................................................33 Figure 4 : Réduction de l’O2 en H2O ....................................................................................41 Figure 5 : Survie des animaux ..............................................................................................79 Figure 6 : Excrétion urinaire des métabolites du NO ...........................................................80 Figure 7 : Pression artérielle systolique................................................................................81 Figure 8 : Créatinémie ..........................................................................................................82 Figure 9 : Protéinurie ............................................................................................................83 Figure 10 : Analyse histopathologique du cortex rénal ........................................................84 Figure 11 : Analyse histopathologique de vaisseaux rénaux................................................85 Figure 12 : Effet du losartan sur l’excrétion urinaire des NO2

-/NO3- ...................................86

Figure 13 : Effet du losartan sur la pression artérielle..........................................................87 Figure 14 : Effet du losartan sur la créatinine sérique ..........................................................88 Figure 15 : Effet du losartan sur la protéinurie.....................................................................89 Figure 16 : Effet du losartan sur les dommages vasculaires et rénaux .................................91 Figure 17 : Effet du losartan sur les dommages vasculaires et rénaux .................................92

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ADH Hormone anti-diurétique AGT Angiotensinogène AngII Angiotensine II ARA Antagoniste du récepteur AT1 de l’angiotensine BH4 Tétrahydrobioptérine DAG Diacylglycérol DS Dahl sensitive EDRF Endothelial derived relaxing factor eNOS Endothelial nitric oxide synthase (enzyme NO synthase endothéliale) ET-1 Endothéline-1 GFR Glomerular filtration rate HSD : SD Harlan Sprague Dawley HTA Hypertension artérielle systolique IECA Inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine iNOS Inducible nitric oxide synthase IP3 Inositol triphosphate IRC Insuffisance rénale chronique L-NAME NG-nitro-L-arginine méthyl ester MCV Maladies cardiovasculaires nNOS Neuronal nitric oxide synthase NO Monoxyde d’azote NO2

- Nitrites NO3

- Nitrates NOS Nitric oxide synthase O2

- Ion superoxyde ONOO- Peroxynitrite PAS Pression artérielle systolique PGC Pression glomérulaire capillaire PKC Protéine kinase C ROS Reactive oxygen species RVR Renal vascular resistance SOD Superoxyde dismutase SNC Système nerveux central SRA Système rénine-angiotensine TGF Transforming growth factor TNF Tumor necrosis factor

Chapitre 1- INTRODUCTION

1.1- Hypertension Artérielle 1.1.1- Généralités

Selon la Société canadienne d’hypertension (2001), l’hypertension artérielle (HTA) est définie

par une tension artérielle égale ou supérieure à 140/90 mmHg. Le diagnostic d’HTA est basé sur

la mise en évidence à plusieurs reprises d’une valeur anormalement élevée de la pression

artérielle (PA) systolique ou diastolique.

1.1.2- Prévalence et liens avec les MCV L’HTA est un facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires (MCV) qu’il est possible de

prévenir. Au Canada, les MCV représentent la première cause de décès expliquant près de 38%

de ceux-ci. Une étude pancanadienne1 réalisée entre 1986 et 1992 chez des individus de 18-74

ans révélait que 22% de la population générale (26% des hommes et 18% des femmes) étaient

hypertendus. La figure 1 présente les résultats de cette étude en fonction de l’âge et du sexe des

individus. On remarque que 57% de la population de 65-74 ans sont hypertendus.

Tableau 1 : Prévalence de l'hypertension selon l'âge et le sexe

Âge Sexe N Hypertension* %

18-34 Homme 5755 11 Femme 6041 2

35-64 Homme 3621 31 Femme 3741 21

65-74 Homme 2000 56 Femme 1971 58

Tous Homme 11 376 26 Femme 11 753 18

Total 23 129 22

Source : The Canadian Heart Health Surveys1 * L’hypertension correspond à des valeurs ≥140/90

14

1.1.3- Facteurs de risques En plus de l’âge et du sexe, les facteurs de risques coexistants pouvant influencer la survenue de

MCV chez les patients hypertendus sont l’ethnicité, la cholestérolémie, le tabagisme, la

sédentarité, l’obésité, le diabète, l’histoire familiale de maladie cardiovasculaire précoce,

l’atteinte des organes cibles et l’histoire personnelle de maladie cardiovasculaire ou rénale 2.

L’impact de ces facteurs de risque sur la morbidité et la mortalité tend à être multiplicateur plutôt

qu’additif. De plus, notons que l’incidence de MCV est augmentée chez les patients ayant une

pression normale élevée (130-139 mmHg) 3.

1.1.4- Conséquences pathophysiologiques de l’HTA L’HTA est associée à de nombreuses pathologies dont la maladie coronarienne, les accidents

cérébrovasculaires, l’athérosclérose, les arythmies, l’insuffisance cardiaque, les

cardiomyopathies, les maladies valvulaires et vasculaires périphériques et la maladie rénale avec

ultimement l’insuffisance rénale chronique 4. La relation entre la pression artérielle et le risque

de développer une MCV est continue, consistante et indépendante des autres facteurs de risques 2.

Ainsi, plus la pression artérielle est élevée, plus grande est la chance de développer une MCV.

Le principal bénéfice à traiter l’HTA consiste à diminuer les risques de complications

cardiovasculaires qui y sont intimement reliés. De fait, plus la PA se rapproche de la normale

(120/80 mmHg), plus les bénéfices sont importants. À long terme, le contrôle médical de l’HTA

prévient et retarde la survenue de la plupart des complications, améliorant la qualité de vie des

patients et diminuant la morbidité et la mortalité.

Au cours des dernières décennies, des succès considérables ont été réalisés dans la prévention de

l’HTA. Le pourcentage de patients hypertendus traités a augmenté et, pour la même période, le

pourcentage de patients ayant une hypertension qui est contrôlée a augmenté. Ces changements

ont eu pour résultat de diminuer la morbidité et la mortalité attribué à l’HTA. Cependant, ces

améliorations n’ont pas été étendues à l’ensemble de la population et le contrôle de l’HTA

demeure toujours insuffisant 5. En effet, dans la population des hypertendus canadiens, les

statistiques récentes indiquent que le diagnostic n’a pas été porté ou confirmé dans 43% des cas,

que le diagnostic a été confirmé mais le traitement n’a pas été initié dans 22% des cas et que le

traitement a été institué mais les valeurs cibles n’ont pas été atteintes dans 21% des cas. Par

conséquent, seulement 13% des hypertendus sont diagnostiqués, traités et ont atteint les valeurs

15

cibles de la pression artérielle (PA). De plus, la maîtrise de l’HTA des patients diabétiques est

atteinte dans seulement 9% des cas. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche afin de

développer de nouvelles approches thérapeutiques et d’obtenir une meilleure maîtrise de cette

maladie 6,7.

1.1.5- Hémodynamie de la pression artérielle Par définition, la pression artérielle est la pression hydrostatique que le sang exerce sur la paroi

d’un vaisseau sanguin. Elle atteint son point le plus élevé dans l’aorte et les grosses artères

systémiques lors de la systole (contraction ventriculaire) et chute à son point le plus bas lors de la

diastole (relaxation ventriculaire). Deux facteurs fondamentaux déterminent la PA selon

l’équation ci-dessous : 1) le débit cardiaque (DC) et 2) la résistance périphérique (RP).

PA = DC × RP

A- Le débit cardiaque Le débit cardiaque est la quantité de sang propulsée par le ventricule gauche en une minute (5,5L

en moyenne). Il équivaut au volume systolique (VS), qui est la quantité de sang expulsée par la

contraction du ventricule gauche à chaque systole (70-80 mL), multiplié par la fréquence

cardiaque (FC), c’est-à-dire le nombre de battements cardiaques par minutes.

DC (mL/min) = VS (mL/battement) × FC (battements/min)

B- La résistance périphérique La résistance périphérique est, quant à elle, la résistance que les vaisseaux sanguins systémiques

opposent à l’écoulement du sang. Les plus petits vaisseaux tels que les artérioles sont ceux qui

offrent le plus de résistance. En changeant de diamètre, ils jouent un rôle important dans la

régulation de la résistance périphérique, de la pression artérielle et du débit sanguin tissulaire 8.

16

1.1.6- Régulation de la pression artérielle En condition physiologique normale, plusieurs mécanismes régissent la pression artérielle en

réglant la fréquence cardiaque, le volume systolique, la résistance périphérique et le volume

sanguin. Certains mécanismes ajustent rapidement la pression artérielle en fonction de

changements soudains, tandis que d’autres, plus lents, assurent la régulation à long terme.

A- Système nerveux, barorécepteurs et chimiorécepteurs Le système nerveux central (SNC) joue un rôle important dans le contrôle de la pression

artérielle. En régulant l’activité du système nerveux autonome et la relâche d’hormones dans le

sang, le SNC modifie rapidement la pression artérielle ainsi que la fréquence cardiaque

maintenant l’homéostasie cardiovasculaire. Le centre réflexe de son contrôle est situé dans le

noyau réticulaire rostral ventro-latéral (RVL) de la medulla oblongata, parfois appelé centre de

contrôle vasomoteur 9.

Réflexes des barorécepteurs : ce sont les barorécepteurs carotidiens et aortiques qui réagissent

aux variations de la pression artérielle pour stimuler ou inhiber la décharge sympathique et/ou

parasympathique du RVL 8. Lorsque la pression artérielle baisse, les barorécepteurs s’étirent

moins et émettent leurs influx nerveux plus lentement vers le RVL. Ce dernier réagit en

diminuant la stimulation parasympathique du cœur et en augmentant la stimulation sympathique.

Cette dernière est associée à la sécrétion d’adrénaline et de noradrénaline dans le sang. Ces

hormones favorisent ainsi l’homéostasie cardiovasculaire en accélérant la fréquence cardiaque, en

augmentant la force de contraction du cœur et en provoquant une vasoconstriction qui augmente

la résistance périphérique. À l’inverse, lorsque les barorécepteurs détectent une augmentation de

la pression dans l’aorte et les artères carotides, le RVL réagit en augmentant la stimulation

parasympathique et en diminuant la stimulation sympathique. S’observe alors une baisse de la

fréquence cardiaque, une diminution de la force de contraction du cœur, une vasodilatation et une

diminution de la résistance périphérique 8.

Chez les patients hypertendus, on observe un phénomène de resetting des barorécepteurs

attribuable à l’adaptation des barorécepteurs à l’élévation persistante de la pression artérielle. À

long terme, ce phénomène limite l’influence du système nerveux sur le maintien de la pression

artérielle 10. Une activation inappropriée du SNC est également observée chez les patients

17

hypertendus. En effet, certaines études ont démontré une élévation des taux de norépinéphrine

plasmatique chez les patients avec HTA essentielle démontrant l’importance du SNC dans le

maintien et la progression de l’HTA 11-13. Par ailleurs, le blocage des récepteurs β-adrénergiques

cardiaque tend à diminuer l’HTA chez ces patients.

Réflexes des chimiorécepteurs : les chimiorécepteurs qui surveillent la composition chimique du

sang peuvent également modifier l’homéostasie cardiovasculaire. Ils sont situés près des

barorécepteurs du sinus carotidien et de l’arc aortique. Ils ont pour fonction de détecter les

variations de la concentration sanguine d’O2, de CO2 et d’ions H+. Ainsi, l’hypoxie (baisse du

taux d’O2), l’acidose (augmentation de la concentration d’ions H+) ou l’hypercapnie (excès de

CO2) stimulent les chimiorécepteurs pour qu’ils transmettent des influx au RVL. Ce dernier

réagit en augmentant la stimulation sympathique du cœur et augmente la pression artérielle par le

fait même 8.

B- Facteurs neuro-humoraux Certains facteurs hormonaux contribuent également à la régulation de la pression artérielle et du

débit sanguin en modifiant le débit cardiaque, la résistance périphérique ou le volume sanguin

total 8. Ces facteurs sont présentés dans le tableau 2.

Adrénaline et noradrénaline : ces deux hormones de la médullosurrénale accroissent le débit

cardiaque en augmentant la fréquence et la force des contractions cardiaques. Elles stimulent

également la vasoconstriction des artérioles de la peau et des viscères abdominaux.

Hormone antidiurétique (ADH) : produite par l’hypothalamus et libérée par la neuro-hypophyse,

l’hormone antidiurétique, nommée également vasopressine, cause la vasoconstriction. À long

terme, elle favorise également la rétention d’eau (antidiurèse), l’augmentation du volume

circulant contribuant ainsi à l’élévation de la PAS.

Peptide natriurétique auriculaire (ANP) : libéré par des cellules dans les oreillettes du cœur, le

peptide natriurétique auriculaire abaisse la pression artérielle en causant une vasodilatation et en

favorisant l’excrétion de sodium et d’eau dans l’urine, ce qui réduit le volume sanguin.

18

Tableau 2 : Régulation hormonale de la pression artérielle

Facteur influant sur la pression artérielle Hormone Effet sur la pression artérielle

Débit cardiaque

Noradrénaline Augmentation Augmentation de la fréquence cardiaque et de la contractilité du coeur Adrénaline

Résistance périphérique

Vasoconstriction Angiotensine II Augmentation

Hormone antidiuéritique

Noradrénaline†

Adrénaline†

Vasodilatation Peptide natriurétique auriculaire Diminution

Adrénaline‡

Monoxyde d'azote

Volume sanguin

Augmentation du volume sanguin Aldostérone Augmentation

Hormone antidiuéritique

Diminution du volume sanguin Peptide natriurétique auriculaire Diminution

† Agit sur les récepteurs α1 dans les artérioles de l'abdomen et de la peau

‡ Agit sur les récepteurs β2 dans les artérioles du muscle cardiaque et des muscles squelettiques ; l'effet vasodilatateur de la noradrénaline est nettement moins élevé.

Source : Principe d’anatomie et de physiologie 8

C- Système rénine angiotensine Le système rénine angiotensine (SRA) est un système autocoïde qui joue un rôle clé dans le

contrôle de la PA. Il comprend un précurseur produit au foie, l’angiotensinogène, qui est clivé

par la rénine, synthétisée par les cellules juxtaglomérulaires rénales, pour conduire à la formation

d’AngI dans le sang. Celle-ci est convertie en AngII dans le poumon par l’action de l’enzyme de

conversion de l’angiotensine (ECA). L’AngII ainsi produite est distribuée aux tissus

périphériques par la circulation pour agir, entre autres, sur les vaisseaux, le cœur et les reins où

elle régule la pression sanguine et maintien l’homéostasie des électrolytes et de l’eau. En effet,

l’AngII cause une vasoconstriction, augmente la sécrétion d’aldostérone et la rétention

hydrosodée au niveau des tubules rénaux et favorise la sécrétion d’ADH. Sur le plan systémique,

le SRA circulant est donc apte à procurer une réponse homéostatique rapide et efficace à un

changement de volume sanguin et de concentration électrolytique détecté dans les reins 14.

19

D- Contrôle rénale de la pression artérielle Le rein est responsable de multiples fonctions de régulation, d’élimination et de synthèse

endogène. Il doit, entre autres, maintenir le volume et la composition ionique du plasma et des

autres fluides corporels en plus de devoir éliminer les déchets métaboliques endogènes et

exogènes. Considérant son rôle majeur dans l’homéostasie hydrosodée et la production de

facteurs vasoactifs comme la rénine, le rein joue un rôle majeur dans la régulation de la pression

artérielle systémique. Par ailleurs, le rein est aussi impliqué dans l’érythropoïèse via la

production d’érythropoïétine, dans l’équilibre acido-basique grâce au métabolisme des

bicarbonates de même que dans le métabolisme phosphocalcique par la synthèse de 1,25 OH-D3,

la vitamine D active 10.

L’unité fonctionnelle du rein est le néphron, lui-même constitué des appareils glomérulaire et

tubulaire. On estime qu’un rein humain en compte entre 0,8 et 1,2 million. Le néphron joue un

rôle crucial dans la filtration glomérulaire, la sécrétion tubulaire et la réabsorption tubulaire.

Physiologiquement, le débit de filtration glomérulaire est de l’ordre de 120 ml/min. Le

glomérule filtre le plasma et produit quotidiennement quelque 180 litres d’ultrafiltrat. Il importe

de savoir que le taux de filtration glomérulaire est directement proportionnel à la pression

intraglomérulaire et au débit sanguin rénal. Ces paramètres sont des déterminants majeurs de

l’hémodynamie rénale et sont modulés par la constriction ou la dilatation des artérioles afférentes

et efférentes du glomérule. L’appareil tubulaire est, quant à lui, formé du tubule proximal, de

l’anse de Henle (descendante et ascendante), du tubule distal et du tubule collecteur. De manière

fort réductrice, sa fonction est de modifier la quantité et le contenu de l’ultrafiltrat glomérulaire

pour conduire à la formation de l’urine. Ainsi, la grande majorité de l’eau sera absorbée avec les

électrolytes, au niveau du tubule proximal, alors que les déchets endogènes et exogènes, qui n’ont

pas été filtrés par le glomérule, y seront sécrétés. L’eau peut également être réabsorbée au niveau

de l’anse de Henle et du tubule distal, mais à un moindre niveau. Finalement, c’est au niveau du

tubule collecteur que l’ADH agit pour favoriser la réabsorption des électrolytes et de l’eau. Ces

actions confèrent à l’appareil tubulaire un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie hydro-

électrolytique et l’élimination des déchets métaboliques.

20

Régulation de la filtration glomérulaire : le rein contribue à la régulation de la pression artérielle

en maintenant un débit sanguin rénal et un volume de filtration glomérulaire (GFR) à un niveau

adéquat. D’un point de vue hémodynamique, 20% du débit cardiaque perfuse les reins. Ceci

représente un débit sanguin d’environ 1000 mL/min 10. En condition physiologique normale,

compte tenu des variations de la pression artérielle systémique, le rein possède de nombreux

mécanismes de régulation de la circulation dans le but de maintenir un débit sanguin et un GFR

adéquat. D’abord, la contraction ou la relaxation des fibres musculaires lisses des artérioles

afférentes et efférentes en réponse à leur distension, permet d’ajuster la pression glomérulaire à

un niveau adéquat. Deuxièmement, l’appareil juxtaglomérulaire, en réponse à une modification

de la composition du liquide tubulaire arrivant à la macula densa, est responsable de la

rétroaction tubulo-glomérulaire. Cette dernière implique la sécrétion de rénine par les cellules

juxtaglomérulaires qui permet une modification du GFR via l’augmentation de la formation

d’AngI et qui conduit ultimement à la formation d’AngII 8.

Régulation neuronale et hormonale de la filtration glomérulaire : Plusieurs facteurs neuro-

humoraux ont également le potentiel d’altérer le débit sanguin rénal et, par le fait même, le GFR.

Ce dernier est réduit par les catécholamines ou encore par la stimulation α-adrénergique des

vaisseaux ainsi que par les vasoconstricteurs rénaux tels que l’AngII, l’ET-1 et la vasopressine

(ADH). À l’inverse, les bradykinines, les prostaglandines et le monoxyde d’azote (NO)

provoquent une vasodilatation 8.

Régulation du volume sanguin : l’appareil tubulaire joue un rôle crucial dans le maintien de

l’homéostasie hydroélectrolytique et l’élimination des déchets métaboliques. En conservant ou

en éliminant l’eau, l’appareil tubulaire ajuste le volume sanguin et, de ce fait, assure la régulation

du volume sanguin. C’est à ce niveau que l’ADH agit pour recruter des canaux à eau et favoriser

la réabsorption d’eau. L’augmentation du volume sanguin qui s’ensuit provoque l’élévation de la

pression artérielle, alors qu’inversement, une diminution du volume sanguin fait baisser la

pression artérielle 8.

21

1.2- Dysfonction endothéliale 1.2.1- Généralités

L’endothélium vasculaire peut-être considéré comme le plus important « organe » endocrine du

corps humain. En effet, les cellules endothéliales vasculaires produisent de nombreux facteurs

vasoactifs qui jouent un rôle crucial dans la régulation du tonus vasculaire. Parmi les agents

vasodilatateurs produit par l’endothélium, on identifie le monoxyde d’azote (NO), les

prostacyclines et le facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium (EDHF). En contrepartie, les

vasoconstricteurs d’origine endothéliale comprennent l’ET-1, l’anion superoxide (•O2-), la

thromboxane A2 (TXA2) et l’AngII 15. Son dysfonctionnement est relié à de nombreuses MCV

dont l’HTA, le diabète, les maladies coronariennes, les maladies vasculaires périphériques,

l’insuffisance cardiaque et l’insuffisance rénale chronique 16.

1.2.2- Définitions En condition physiologique normale, il existe un équilibre entre la production des facteurs

vasoconstricteurs et vasodilatateurs locaux tel qu’illustré à la figure 1 ; la résultante détermine

alors le tonus vasculaire. Le concept de la dysfonction endothéliale réfère à un état où il y a

déficit de la relâche d’une substance vasodilatatrice ou excès de la relâche d’un vasoconstricteur.

La résistance à un vasodilatateur ou l’hypersensitivité à un vasoconstricteur est également mise

en cause.

Figure 1 : Facteurs vasoactifs de l'endothélium : un équilibre

Schéma représentant l’équilibre des facteurs vasoactifs endothéliaux observé en condition normale : (ET-1) endothéline-1, (Ang II) angiotensine II, (•O2

-) anion superoxide, (TXA2) thromboxane A2 ; (NO) monoxyde d’azote, (PGI2) prostacycline, (EDHF) facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium.

AngII, ET-1, TXA2, O2- NO, PGI2, EDHF

Vasoconstricteurs Vasodilatateurs

22

Initialement, la dysfonction endothéliale a été démontrée chez les patients avec une hypertension

essentielle. Chez ces sujets, on observait une diminution de la vasorelaxation endothélium

dépendante suite à une stimulation à l’acétylcholine (Ach) 17. Puisque l’Ach conduit à

l’augmentation de la production vasculaire de NO, il a été suggéré que la biodisponibilité du NO

puissent jouer un rôle crucial dans le maintien de la fonction endothéliale. De fait, la diminution

de la relâche de NO observée en hypertension est associée à l’augmentation de la production

d’inhibiteurs endogènes des NOS comme l’analogue méthylé de la L-arginine (ADMA) 18 et à

l’inactivation rapide du NO par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) tel que l’anion

superoxide (•O2-).

L’AngII participe également à la dysfonction endothéliale en augmentant la production de

l’endothéline-1 (ET-1), des espèces réactives de l’oxygène et de cytokines tel que le transforming

growth factor-β (TGF-β). L’implication de ces facteurs dans la dysfonction endothéliale sera

cependant discutée dans une section ultérieure.

Plus récemment, le rôle de l’anion superoxide a été examiné en relation avec la dysfonction

endothéliale. Puisque que le NO peut réagir avec le •O2- pour former du peroxynitrite (ONOO-)

19, cette réaction contribue à la réduction de la biodisponibilité du NO et par le fait même au

développement des MCV. Des évidences récentes ont également démontré que la production

excessive d’•O2- stimule l’oxydation de la tétrahydrobioptérine, un cofacteur de la eNOS,

conduisant au découplage de la eNOS, qui réduit ainsi la production de NO et augmente la

production excessive d’•O2- par cette enzyme 20.

23

1.3- Monoxyde d’azote 1.3.1- Généralités

Depuis la découverte en 1980 par Furchgott et Zawadski 21 de l’endothelial derived relaxing

factor (EDRF), caractérisé ultérieurement par Palmer et al. 22 et Ignarro et al. 23 comme étant le

NO, l’intérêt suscité par cette molécule autocoïde capable de réguler de multiples fonctions

physiologiques n’a cessé de grandir. Parmi les différentes fonctions contrôlées par le NO, son

rôle significatif a été reconnu dans le maintien de la pression artérielle, la neurotransmission,

l’activité des macrophages, la thrombose, l’homéostasie et la fonction rénale 24.

Une fois généré, le NO est un gaz liposoluble capable de diffuser rapidement et librement à

l’intérieur, comme à l’extérieur, des cellules. Sa demi-vie est estimée entre 1 et 5 secondes étant

donné qu’il réagit rapidement avec le fer des noyaux hèmes, les dévirés de l’oxygène et les

groupements thiols. Sa réaction la plus importante est celle avec la guanylate cyclase soluble

(GCs) dont l’activation subséquente conduit à la conversion du guanosine triphosphate (GTP) en

guanosine monophosphate cyclique (GMPc). L’augmentation intracellulaire du GMPc, qui est le

second messager du NO, conduit à de nombreux effets tissus spécifiques incluant la relaxation

des cellules musculaires lisses et l’inhibition de l’agrégation plaquettaire 24.

1.3.2- Biosynthèse et mode d’action du NO Le NO est produit par l’enzyme nitric oxide synthase (NOS) qui possède une forte homologie

avec la famille des enzymes du cytochrome P450. Il existe trois isoformes de la NOS. Ces

isoformes utilisent l’acide aminé L-arginine, l’oxygène et le NAD(P)H comme substrats pour

synthétiser le NO et son coproduit, la L-citrulline. C’est dans l’extrémité C-terminale de

l’enzyme que se présente l’homologie avec la P450 25 et que les cofacteurs essentiels aux

processus catalytiques se lient. Parmi les cofacteurs essentiels, on note la tétrahydrobioptérine

(BH4), la Ca2+/calmoduline, le FAD et le FMN.

Parmi les trois isoformes de la NOS, deux sont retrouvés de façon constitutive, la forme

endothéliale et neuronale (eNOS et nNOS), alors que la troisième est inductible (iNOS). Les

formes constitutives sont Ca2+/calmoduline dépendante, continuellement exprimées et produisent

du NO en faible concentration. Contrairement, la iNOS est Ca2+-indépendante et est régulée de

façon transcriptionnelle. Son expression est stimulée par certains médiateurs inflammatoires dont

24

l’IL-1, le TNF-α, l’INF-γ et certaines endotoxines comme le LPS 26. Une fois induite, la iNOS

demeure active durant 4-24h, produisant près de 100 fois plus de NO que les NOS constitutives.

L’augmentation massive de NO produit suite à la stimulation de la iNOS expliquerait, en partie,

l’hypotension observée lors du choc septique 26.

1.3.3- Localisation des NOS Puisque le NO est un médiateur paracrine de courte durée d’action, le site d’expression des NOS

est étroitement relié à l’endroit où le NO exerce ses effets. La eNOS est présente dans toutes les

cellules vasculaires périphériques où elle joue un rôle crucial dans la régulation du tonus

vasculaire systémique. On la retrouve également dans la paroi des vaisseaux corticaux et

médullaires de tous les segments du rein ainsi que dans les cellules endothéliales glomérulaires

avec prééminence à la macula densa et au tubule collecteur. Sa localisation confirme son rôle

majeur dans le contrôle du débit sanguin rénal et dans l’excrétion rénale du sodium. Initialement

observée dans les tissus nerveux, l’expression de la nNOS a aussi été démontrée dans les cellules

épithéliales tubulaires et dans l’appareil juxtaglomérulaire du rein où elle participe à la régulation

du feedback tubuloglomérulaire. Quant à la iNOS, elle est retrouvée dans pratiquement tous les

segments du rein bien que son rôle précis dans la régulation de la fonction rénale n’ait pas encore

été précisé. On la retrouve cependant dans divers types cellulaires dont les macrophages et les

granulocytes où elle exerce un rôle dans les réactions immunitaires 24,27.

1.3.4- Mécanismes de régulation de la eNOS L’activité de la eNOS et la relâche subséquente de NO des cellules endothéliales vasculaires est

modulée par de nombreux stimuli physiques et humoraux. Parmi les stimuli physiques,

l’augmentation des forces de cisaillements et d’étirements, exercée par le flot sanguin, est le

principal régulateur de la synthèse du NO qui permet de maintenir un tonus vasculaire adéquat.

Plusieurs stimuli humoraux augmentent également la relâche du NO via l’activation de différents

récepteurs membranaires et par l’entrée intracellulaire du Ca2+. Parmi ceux-ci, on note les

catécholamines (α2-adrénorécepteurs) et la vasopressine qui, dans certains lits vasculaires

(circulation coronaire et cérébrale), favorisent la distribution du sang vers ces tissus. La

vasoconstriction excessive de l’AngII et de l’ET-1 est contrecarrée par la relâche respective du

NO via les récepteurs AT2 et ETB. La stimulation de la relâche du NO, par l’histamine et la

substance P, est responsable de la vasodilatation locale causant la rougeur de la peau lors d’une

25

réaction allergique. La sérotonine (récepteur 5-HT1D) et la thrombine, relâchées lors de

l’agrégation plaquettaire, provoqueraient une production locale massive de NO dont la

vasodilatation subséquente facilite l’élimination des microaggrégats, en plus d’inhiber l’adhésion

plaquettaire et d’empêcher la formation du thrombus. Finalement, la bradykinine, via le

récepteur β2, augmente la production du NO qui favorise la vasodilatation 28.

1.3.5- Implications cardiovasculaires et rénales Il est reconnu que le NO joue un rôle crucial dans divers processus physiologiques et

pathophysiologiques. Le développement de ces concepts a largement été établi par des évidences

obtenues suite à l’inhibition de la synthèse du NO. Ainsi, il est maintenant reconnu que le NO

joue un rôle majeur et irremplaçable dans le maintien de l’intégrité fonctionnel et structurale des

vaisseaux, du cœur et des reins.

Les actions cardiovasculaires du NO sont nombreuses. Dans la cellule endothéliale, le NO inhibe

la production d’ET-1, l’oxydation des LDL, l’expression de molécules d’adhésion et par

conséquent, l’adhésion des plaquettes et des leucocytes. Il favorise également la relaxation des

fibres musculaires lisses des vaisseaux, inhibe l’agrégation plaquettaire, empêche la prolifération

des cellules du muscle lisse en plus de moduler la perméabilité vasculaire de même que les

mécanismes inflammatoires 28. Dans le rein, le NO contrôle le débit sanguin rénal en s’opposant,

entre autres, à l’effet vasoconstricteur de l’AngII et de l’ET-1 sur l’artériole afférente 29. De plus,

il régule le volume de filtration glomérulaire, l’excrétion rénale de sodium et la relâche de la

rénine par les cellules juxtaglomérulaires 30.

1.3.6- Effets sur la pression artérielle et la fonction rénale En 1989, Rees et al. 31 ont démontré que l’inhibition aiguë de la synthèse du NO, avec un

analogue de la L-arginine, le L-NG-monométhyl arginine (L-NMMA), augmente de façon

significative la pression artérielle chez le lapin. D’autres investigateurs ont par la suite confirmé

le rôle crucial du NO dans la régulation du tonus vasculaire 32,33. Or, puisque l’hypertension

n’était pas complètement renversée suite à l’infusion de L-arginine ou à l’arrêt du traitement au

L-NAME, il a été suggéré que des altérations de types humorales ou structurales aient

contribuées à l’élévation de la pression artérielle dans ce modèle. De fait, la baisse de la

26

biodisponibilité du NO peut être en partie responsable de l’élévation de la résistance périphérique

et du maintien de l’hypertension artérielle 34.

En ce sens, les souris knock-out pour le gène de la eNOS sont hypertendus et développent de

l’hypertrophie néointimale caractérisée par la prolifération de cellules musculaires lisses. De

plus, elles ont un temps de saignement allongé et montrent plus d’interactions leucocytes-

endothélium que des souris wild-type, confirmant le rôle in vivo de la eNOS pour supprimer ces

interactions 35. Ces multiples fonctions confèrent au NO une influence majeure sur la fonction et

l’intégrité de l’endothélium.

En plus de l’élévation de la pression artérielle, l’inhibition chronique de la synthèse du NO par le

L-NAME (5 mg/kg/jour) conduit à l’apparition de dommages cardiovasculaires et rénaux

majeurs. En effet, Baylis et al. 33 ont démontré que l’inhibition chronique de la synthèse du NO

durant 8 semaines conduit à l’augmentation de la résistance vasculaire rénale en association avec

une élévation de la pression glomérulaire capillaire (PGC) et d’une réduction du GFR. En réponse

à cette modification profonde de leur hémodynamie rénale, les rats L-NAME développent de la

protéinurie ainsi que des dommages rénaux majeurs qui contribueraient au maintien de

l’hypertension artérielle. Dans le même ordre d’idées, Ribeiro et al. 32 ont démontré que

l’inhibition chronique de la synthèse du NO, avec une dose plus élevée de L-NAME

(65 mg/kg/jour vs 5 mg/kg/jour) mène à une élévation supérieure de la PAS et de la PGC. De

plus, ces résultats sont observés après deux semaines de traitement comparativement à 8

semaines pour le groupe de Baylis. L’élévation progressive de la PAS, de la résistance vasculaire

rénale, le déclin du GFR et le développement de la protéinurie se développeraient donc de façon

dose dépendante lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO. Ces effets dépendraient

cependant de la susceptibilité génétique aux dommages cardiovasculaires et rénaux.

En effet, les résultats obtenus par ces deux groupes contrastent avec ceux obtenus auparavant

dans notre laboratoire démontrant que le traitement des rats Sprague-Dawley avec le L-NAME à

la dose de 0.1% (~100mg/kg/jour) cause une HTA sévère sans dommages cardiovasculaires et

rénaux après 6 semaines de traitement 36. En ce sens, Van Dokkum et al. 37 ont reporté que la

sévérité des dommages cardiovasculaires et rénaux associée à l’hypertension induite par le L-

NAME est reliée à des variables génétiques plutôt qu’au degré d’hypertension.

27

Les effets de l’inhibition chronique de la synthèse du NO pourraient également être modulés par

l’activation SRA bien que cette relation soit controversée. En effet, l’activité de la rénine

plasmatique a été reportée comme étant élevée 32, inchangée 38, ou réduite 39 dans ce modèle

d’hypertension. Certaines études in vitro ont par ailleurs démontré que le NO agit à titre

d’inhibiteur de la relâche de la rénine 40 alors que d’autres suggèrent que le NO stimule la

synthèse et/ou la sécrétion de cette dernière 41. En fait, la dépendance à l’AngII lors de

l’inhibition chronique du NO serait associée à des taux normaux ou élevés d’AngII tissulaires 42,

à une sensitivité accrue à l’AngII 43 et/ou à l’interaction entre l’AngII et le SNC 44.

L’évidence que le SNC contribue à l’HTA lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO a

été démontrée par l’élévation des taux plasmatiques de catécholamines et la réduction marquée de

l’HTA suite à l’administration d’un bloqueur α-adrénergique. De façon intéressante, la

combinaison des bloqueurs des récepteurs α-adrénergiques et AT1 de l’AngII réduit de beaucoup

l’élévation de la pression artérielle alors que leur utilisation seule a un effet moindre. Ainsi, le

SRA et le SNC contribueraient tous deux à l’HTA induite par l’inhibition chronique de la

synthèse du NO 45.

L’implication de facteurs vasoactifs autres a également été démontrée dans l’hypertension induite

par le L-NAME. Notre laboratoire a effectivement mis en évidence l’implication de l’ET-1 dans

ce modèle : les taux plasmatiques et tissulaires d’ET-1 étant élevés suite à l’inhibition chronique

de la synthèse du NO 36. Cependant, la relation entre l’ET-1 et l’inhibition chronique de la

synthèse du NO reste toujours controversée. Certains auteurs ont démontré un effet bénéfique du

blocage des récepteurs ETA de l’ET-1 sur le développement de l’hypertension et l’apparition des

dommages cardiovasculaires et rénaux tandis que d’autres auteurs n’ont montré aucun effet

bénéfique du blocage des récepteurs ETA de l’ET-1 30. C’est pourquoi, l’implication

physiopathologique de l’ET-1 dans la pathogenèse de l’hypertension induite par l’inhibition

chronique de la synthèse du NO demeure toujours à élucider. La relation entre le NO, l’ET-1 et

l’AngII sera discutée à la section 1.8.2.

L’hypertension observée dans ce modèle pourrait également refléter un défaut dans le

métabolisme intracellulaire du calcium. En effet, certaines études ont démontré un effet positif

des inhibiteurs des canaux calciques lors de l’inhibition de la synthèse du NO 46. Des résultats

28

similaires obtenus par Ribeiro et al. 47 ont également démontré que la nifédipine prévenait non

seulement le développement de l’hypertension, mais aussi l’apparition des dommages

cardiovasculaires et rénaux chez les rats recevant du L-NAME pendant 4 semaines.

Contrairement, Erley et al. 48 ont démontré une atténuation de l’élévation de la pression artérielle

sans amélioration de la fonction rénale par le traitement à la félodipine chez le rat recevant du L-

NAME pendant 12 semaines.

Le NO en soi contribue également à la prévention de l’hypertension en régulant le débit sanguin

médullaire, la natriurèse et l’excrétion du sodium. En effet, la synthèse de NO est

particulièrement riche dans la médullaire rénale et ces taux de production sont de beaucoup

supérieurs à ceux retrouvés dans le cortex. Or, l’inhibition de la synthèse du NO conduit à des

changements importants du débit sanguin médullaire et modifie considérablement l’excrétion du

sodium et de l’eau. De fait, certaines études ont démontré chez le rat conscient, que le traitement

avec le L-NAME réduit de 30-70% le débit sanguin médullaire, provoquant la rétention de

sodium et d’eau et contribuant ainsi à l’élévation de la PAS. 49,50.

À ce niveau, la synthèse du NO servirait de mécanismes compensatoires importants. En effet, les

rats Dahl sensibles au sel (DS) ne réussissent pas à augmenter leur production de NO lorsqu’ils

reçoivent une diète riche en sel et développent, en conséquence, de l’HTA, des dommages

rénaux, de l’hypertrophie ventriculaire gauche et de l’hypertrophie vasculaire. Contrairement,

une diète riche en sodium, chez les rats Dahl résistants au sel, stimule la production de NO et

empêche le développement de l’HTA, l’apparition des dommages rénaux, l’hypertrophie

ventriculaire gauche et le remodelage vasculaire 51.

Par ailleurs, nous avons mis en évidence que la diminution de la biodisponibilité du NO, chez le

rat urémique avec néphrectomie 5/6, contribue au développement de l’hypertension et à la

progression de l’insuffisance rénale chronique 29. Or, le transfert adénoviral du gène de la eNOS

augmente la synthèse du NO chez l’animal urémique et freine l’aggravation de l’hypertension

artérielle et la progression de l’insuffisance rénale. On note également, suite au transfert

adénoviral du gène de la eNOS, une diminution marquée de la protéinurie et de la créatinine

sérique associée à une nette réduction des dommages rénaux vasculaires, glomérulaires,

interstitiels et tubulaires. Par ailleurs, nous avons également démontré des effets

29

cardioprotecteurs et rénoprotecteurs semblables, dans le même modèle animal, suite à une

supplémentation en L-arginine 29. En somme, ces études démontrent que l’augmentation de la

biodisponibilité du NO permet de corriger la dysfonction endothéliale observée en insuffisance

rénale et permet de préserver l’hémodynamie cardiovasculaire.

30

1.4- Angiotensine II 1.4.1- Système rénine angiotensine classique et tissulaire

Depuis sa découverte et jusqu’à tout récemment, on considérait le SRA à l’image d’un système

uniquement endocrine qui contrôle la pression sanguine et l’homéostasie des électrolytes et de

l’eau. C’est pourquoi on confère au SRA un rôle majeur dans le développement et l’entretien de

l’HTA et des MCV 52.

Plus récemment, il a été décrit que l’AngII pouvait être synthétisée localement dans de nombreux

tissus dont le cerveau, le poumon, l’hypophyse, les artères, le cœur, les surrénales, les reins, les

gonades, l’utérus, le pancréas et la peau 53, arborant une action autocrine, paracrine et

possiblement intracrine 54. Les taux d’AngII tissulaires étant souvent plus élevés que ceux du

plasma, il est permis de croire que le SRA tissulaire serait régulé indépendamment du SRA

circulant.

Cette synthèse locale implique que les composantes nécessaires pour la synthèse de l’AngII

soient présentes dans différents organes. En ce qui concerne l’angiotensinogène (AGT), son

expression a été décelée dans plusieurs tissus et peut donc être produit localement ou provenir du

foie, son lieu de synthèse majeur 55. Le rein est, quant à lui, la source majeure de la synthèse et

de la sécrétion de la rénine bien qu’elle soit exprimée dans plusieurs tissus, mais à des niveaux

plus faibles 56. Par ailleurs, il a été postulé que l’AGT et la rénine circulante puissent traverser

l’endothélium vasculaire par diffusion contribuant ainsi à la génération d’AngII tissulaire 57.

Pour ce qui est de l’ECA, elle est exprimée dans la lumière des vaisseaux avec une forte

concentration aux poumons et certaines cellules épithéliales auraient des concentrations encore

plus grandes, dont la bordure en brosse du tubule proximal du rein 58.

Parmi les organes cibles où agit l’AngII, on note, entre autres, les vaisseaux, le cœur et les reins.

Dans les vaisseaux, toutes les composantes moléculaires et cellulaires nécessaires à la synthèse

d’AngII sont présentes dans les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses 59.

Comme les vaisseaux sanguins, le tissu cardiaque possède toutes les composantes du SRA bien

que la majorité de son AngII soit produite par l’activité de chymases plutôt que par l’ECA. En

effet, au niveau tissulaire, l’AngII peut être synthétisée via d’autres protéases locales tel que la

tonine, la chymase et la cathepsine dépendamment de l’espèce 60. D’ailleurs, la distribution

31

relative de la chymase et de l’ECA laisse croire que la première produit la plus grande partie de

l’AngII cardiaque et la seconde, celle des vaisseaux. Toutes les composantes du SRA sont

également présentes dans les cellules mésangiales ainsi que dans les cellules du tubule proximal,

permettant une formation intrarénale importante 59.

Contrairement au SRA circulant, le SRA tissulaire procure une action plus tonique et localisée 14.

Son implication a été démontrée dans de nombreux processus physiopathologiques dont l’HTA,

l’athérosclérose, l’inflammation, la thrombose, l’hypertrophie ventriculaire et l’insuffisance

rénale 59. D’ailleurs, les effets bénéfiques des IECA et des ARA sont observés dans plusieurs

conditions pathologiques ou l’activité de la rénine plasmatique est normale ou même réduite.

1.4.2- Mécanismes d’actions de l’AngII L’AngII agit sur ses cellules cibles par l’intermédiaire de récepteurs à sept domaines

transmembranaires dont il existe deux types, AT1 et AT2 qui présentent une affinité égale pour

l’AngII. Ces récepteurs diffèrent de par leur distribution, leur signalisation et médient des effets

physiologiques différents.

Mécanisme d’action du récepteur AT1 : Le récepteur AT1 est le sous-type responsable de la

plupart des effets classiques attribués à l’AngII et est sélectivement bloqué par les antagonistes

des récepteurs de l’angiotensine (ARA), dont le losartan. Le récepteur AT1 fait partie de la

grande famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G (classe

Gq/11). On le retrouve principalement dans les cellules musculaires lisses, les reins, les

surrénales, le cœur, le foie et le cerveau 52. Sa stimulation provoque l’activation de la

phospholipase C (PLC), résultant en une production accrue d’inositol triphosphate (IP3) et de

diacylglycérol (DAG), impliqués dans la mobilisation intracellulaire du Ca2+ et l’activation de la

PKC 61. L’augmentation du Ca2+ intracellulaire produit divers effets physiologiques dont

l’activation d’une kinase responsable de la phosphorylation de la myosine et par conséquent de la

contraction. En plus de la PLC, l’AngII stimule la phospholipase A2 et la production subséquente

de tromboxane A2 (TXA2) ainsi que la phospholipase D qui agit sur la phosphatidylcholine, une

source encore plus abondante de DAG qui active à son tour la PKC 62. Tous ces éléments

conduisent entre autres à la contraction, la prolifération et l’hypertrophie des cellules musculaires

lisses. Les voies de signalisation de l’AngII sont illustrées à la figure 2.

32

Figure 2 : Voie de signalisation du récepteur AT1

Tiré de «Recent advances in angiotensin II signalling in hypertension»63

La liaison de l’AngII au récepteur AT1 affecte aussi la transcription de gènes et l’activation de

protéines passant par la régulation de tyrosines kinases. Le récepteur AT1 possède des propriétés

semblables aux récepteurs de cytokines comme l’IL-2, IFN-γ et INF-α. À la manière de ces

récepteurs, l’AT1 stimule la phosphorylation de tyrosines et active la voie MAP kinase. On

rapporte 5 voies tyrosine kinases majeurs activées par l’AngII dans les cellules musculaires

lisses : (1) c-Src, (2) FAK, (3) des tyrosines kinases calcium dépendantes (Pyk2), (4) Janus

kinases JAK et TYK et (5) des récepteurs tyrosine kinase tels que EGF, PDGF et IGF, tel

qu’illustré à la figure 3. En définitive, l’activation de MAP kinase, de la PKC et l’élévation du

calcium intracellulaire induisent la transcription de gènes inductibles dont c-fos, c-myc et c-jun

qui conduisent à la croissance et à la prolifération cellulaire.

33

Figure 3 : Signalisation du récepteur AT1

Source : Touyz RM, Recent advances in intracellular signaling in hypertension 63

34

Effets physiologiques médiés par le récepteur AT1 : La plupart des actions aiguës médiées par

l’AngII visent à maintenir le tonus vasculaire et le volume sanguin circulant. Ces actions

incluent une vasoconstriction, une sécrétion d’aldostérone, une rétention hydrosodée et une

relâche d’ADH. De surcroît, l’AngII augmente l’activité du système nerveux sympathique et la

contractilité cardiaque en plus de stimuler la soif et la réabsorption intestinale d’eau 62. Au niveau

vasculaire, l’AngII contribue à l’épaississement, à la rigidité et au processus complexe qu’est

l’athérosclérose en plus d’être responsable, en partie, de la dysfonction endothéliale et du stress

oxydatif qui sont responsables du développement de l’HTA 52. L’AngII est également impliquée

dans la pathophysiologie de l’hypertrophie, du remodelage et de l’insuffisance cardiaque.

Tableau 3 : Effets vasculaires directs de l’AngII

Effet vasculaire Mécanisme Vasoconstriction Activation du récepteur AT1 Production d'ET-1, de norépinéphrine et de l'ADH Réduction de la biodisponibilité du NO par la production de radicaux libres Inflammation Activation de la NAD(P)H oxydase et production de superoxydes Induction de facteurs pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6) Activation de monocytes/macrophages Remodelage Stimulation de la migration, de l'hypertrophie et de la prolifération cellulaire Induction de PDGF, TGF-β Thrombose Stimulation de PAI-1 Activation de l'agrégation/adhésion plaquettaire par la diminution du NO

Source : Tissue angiotensin and pathobiology of vascular disease 64

En ce sens, il a été démontré que l’AngII induisait la production du transforming growth facteur

β (TGF-β), de la fibronectine et du collagène de type 1, tous impliqués dans l’expansion de la

matrice extracellulaire et de l’hypertrophie cardiovasculaire. Or, l’administration d’un ARA

freine l’élévation de l’ARNm du TGF-β, du collagène de type I et de la fibronectine, suggérant

que ces effets sont médiés par le récepteur AT1 65. C’est pourquoi, on attribue aux ARA et aux

IECA un effet cardioprotecteur et néphroprotecteur indépendamment de leur action sur la

pression sanguine.

35

De plus, l’AngII est le plus puissant stimulateur de la synthèse et de la relâche d’endothéline-1 66.

À ce niveau, l’ET-1 peut jouer non seulement un rôle dans les effets hémodynamique exercés par

l’AngII, mais contribue également à l’apparition des dommages cardiovasculaires. En effet,

l’ET-1 induit la vasoconstriction, réduit le débit sanguin rénal, participe à l’élévation de la

protéinurie ainsi qu’à l’hypertrophie des cellules musculaires lisses 67. Nous avons d’ailleurs

démontré que l’activation du SRA rénal module l’expression ainsi que la production de l’ET-1

chez l’animal urémique avec masse rénale réduite 68. Or, les effets cardioprotecteurs et

néphroprotecteurs des IECA et des ARA seraient dus, en partie, à la réduction de la formation et

de l’action de l’ET-1 et de l’AngII chez l’animal urémique.

Mécanisme d’action du récepteur AT2 : Le récepteur AT2 appartient à la classe des récepteurs

couplés à une protéine G (Classe Gi). La liaison de l’AngII à ce récepteur active trois cascades

intracellulaires majeures : activation de phosphatases, stimulation du système NO-GMPc par la

synthèse accrue de bradykinine 69 et la relâche d’acide arachidonique 70. De surcroît, l’activation

du récepteur AT2 mène à l’ouverture de canaux K+ et à l’inhibition du courant calcique,

contribuant à l’hyperpolarisation et à la diminution de la pression artérielle, contrant ainsi les

effets de l’AngII médiés par le récepteur AT1 62.

Effets physiologiques médiés par le récepteur AT2 : Il a été récemment établi que le récepteur

AT2 possédait un rôle dans les fonctions cardiovasculaires et rénales, dans le SNC et dans les

processus du développement 70. En effet, le récepteur AT2 est exprimé en grande concentration

lors du développement fétal, mais après la naissance, ses taux déclinent rapidement. Ainsi, chez

l’adulte normal, on ne le retrouve qu’à de faibles niveaux dans le cerveau, les reins, le cœur,

l’endothélium vasculaire, la surrénale et l’utérus 61. L’activation du récepteur AT2 est reconnue

pour antagoniser les effets médiés par le récepteur AT1. Son activation médie la relaxation des

cellules musculaires lisses via la production de bradykinine, de NO et de GMPc. D’ailleurs, il a

été démontré que les souris knock-out pour le gène du récepteur AT2 ont une pression artérielle

élevée 71. De plus, ces souris présentent une hypersensibilité à la natriurèse et à l’effet presseur

de l’AngII suggérant un rôle important du récepteur AT2 dans la contre régulation des effets

pathophysiologiques médiés via le récepteur AT1 72,73. Finalement, en stimulant la

déphosphorylation de protéines, le récepteur AT2 antagonise non seulement les effets

36

vasoconstricteurs du récepteur AT1, mais aussi ces effets prolifératif, hypertrophique et anti-

apoptotique 62.

37

1.5- Endothéline 1.5.1- Synthèse de l’ET-1

Découverte par Yanagisawa en 1988, l’endothéline-1 est un peptide fortement vasoconstricteur

composé de 21 acides aminés produit principalement par les cellules endothéliales 74. Il existe 3

isoformes d’endothéline : ET-1, ET-2 et ET-3. Toutes sont produites à partir d’un précurseur, la

préproendothéline, transformée en big-ET inactif puis en endothéline par l’enzyme de conversion

de l’endothéline 75. L’endothéline sécrétée par l’endothélium est l’ET-1 dont la production est

augmentée par plusieurs stimuli, tels que les forces de cisaillement et l’hypoxie de même que par

nombre de facteurs neuro-humoraux et de cytokines incluant l’AngII, la vasopressine, les

catécholamines et le TGF-β 76. L’ET-1 est sécrétée majoritairement du côté abluminal et exerce

ses effets de façon autocrine et/ou paracrine. Sa production par l’endothélium est contrebalancée

par la libération de NO et de prostacycline.

1.5.2- Mécanismes d’actions de l’ET-1 Il existe deux récepteurs, nommés ETA et ETB, qui médient les effets de l’ET-1. Ce sont des

récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G. Chaque récepteur active

les mêmes protéines G, donnant cependant des réponses différentes suivant le type cellulaire sur

lesquels ils sont exprimés. Leur voie de signalisation cellulaire implique l’activation de la

phospholipase C, la mobilisation du calcium intracellulaire, l’activation de la protéine kinase C,

la stimulation de l’anti-porteur Na+/K+ et l’alcalinisation intracellulaire 76.

1.5.3- Implications cardiovasculaires et rénales Les récepteurs de l’endothéline participent tous deux au maintien du tonus vasculaire, à la

pression artérielle ainsi qu’à l’hémodynamie rénale et au maintien du volume de filtration

glomérulaire. Sur les cellules musculaires lisses et les cellules mésangiales glomérulaires, le

récepteur ETA induit une puissante contraction qui contribue à l’augmentation du tonus

vasculaire, à la réduction du flot rénal et à la diminution du GFR 77. À long terme, l’ET-1 peut

induire la prolifération et l’hypertrophie cellulaire 76 puisqu’elle est un puissant agent pro-

fibrosant qui stimule la synthèse de la matrice extracellulaire via l’expression du TGF-β 78.

L’ET-1 stimule également la production de cytokines comme le tumor necrosis factor (TNF) de

même que l’interleukine-1 et 6 par les monocytes lui conférant une action dans le mécanisme de

38

l’inflammation 79. Le récepteur ETB, quant à lui, se retrouve principalement sur les cellules

endothéliales. Son activation conduit à la production de NO et de prostacycline, prévient

l’apoptose et augmente la clairance de l’ET-1 80. Le récepteur ETB est également retrouvé dans

les tubules distaux rénaux où il participe à la natriurèse et par le fait même à la diminution du

volume extracellulaire et de la pression artérielle 77. Les actions antagonistes des récepteurs ETA

et ETB suggèrent que l’ET-1 joue un rôle important dans le maintien du tonus vasculaire et la

pression artérielle en condition physiologique normale.

L’ET-1 joue également un rôle crucial dans le développement de l’hypertension artérielle et la

progression de l’insuffisance rénale chronique 68,81. L’utilisation d’un bloqueur des récepteurs

ETA freine la progression de l’hypertension et le déclin de la fonction rénale, démontrant

clairement l’implication de l’ET-1 dans ces processus pathologiques 81. Bien que les mécanismes

responsables de l’augmentation vasculaire et rénale d’ET-1 ne soient pas complètement

identifiés, nous avons démontré que l’AngII module l’expression ainsi que la production de l’ET-

1 dans ces tissus. D’ailleurs, le traitement avec un IECA ou un ARA prévient l’augmentation de

l’expression et de la production d’ET-1 chez l’animal urémique 68 On suggère également que le

récepteur ETB est exprimé en plus faible quantité en insuffisance rénale chronique contribuant à

l’élévation de la résistance vasculaire périphérique et à la diminution du flot sanguin rénal.

D’ailleurs, les souris knock-out pour le récepteur ETB ont une pression artérielle élevée 80.

39

1.6- Transforming Growth Factor-β 1.6.1- Synthèse du TGF-β

Trois isoformes du TGF-β ont été identifiés (TGF-β1, TGF-β2 et TGF-β3). Sa forme

prédominante est sans contredit le TGF-β1. Il s’agit d’un homodimère de 25 KDa associé de

manière non covalente à une protéine latente appelée latency-associated protein (LAP). Le LAP

agit comme un inhibiteur du TGF-β puisqu’il occupe les zones de haute affinité du TGF-β pour

ses récepteurs. Le clivage du LAP est l’étape régulatrice déterminante de la biodisponibilité et de

l’activité du TGF-β. Bien que plusieurs protéases puissent conduire à la libération de sa forme

active, la thrombospondine-1, une glycoprotéine de la matrice extracellulaire, est sans contredit

l’activateur majeur du TGF-β 78.

1.6.2- Mécanismes d’action du TGF-β Il existe deux récepteurs par lesquels agissent le TGF-β que l’on nomme TβR-I et TβR-II et qui

sont des récepteurs à activité sérine/thréonine kinase. En résumé, le TGF-β actif se lie au TβR-II

qui recrute et phosphoryle le TβR-I. Le complexe ligand-récepteur phosphoryle alors une série

de protéines appartenant à la famille des SMAD. Généralement, Smad 2 et Smad 3 se lient à la

Smad 4 et stimulent la transcription des gènes cibles dans le noyau alors que Smad 6 et Smad 7

agissent à titre de régulateur négatif 78,82.

Le TGF-β est reconnu pour stimuler la synthèse de la matrice extracellulaire en augmentant la

production du collagène de type I et IV et la fibronectine en plus d’inhiber sa dégradation. Il est

considéré comme étant un joueur majeur dans l’action pro-fibrosante de plusieurs peptides

vasoconstricteurs tels que l’AngII et l’ET-1. Le TGF-β est aussi reconnu comme un important

facteur hypertrophique au niveau des cellules musculaires lisses vasculaires contribuant ainsi à

l’augmentation de la résistance périphérique et à la progression de l’hypertension artérielle 78. De

plus, le TGF-β favorise la transformation des fibroblastes en myofibroblastes et participe à la

transdifférenciation des cellules épithéliales tubulaires en myofibroblastes 83. Ces phénomènes

contribuent à la production et à l’expansion de la matrice extracellulaire et à la fibrose rénale.

40

1.7- Espèces réactives de l’oxygène 1.7.1- Biosynthèse

L’anion superoxide (•O2-) est une espèce chimique instable qui possède un électron non apparié

produit par la réduction d’un électron sur la molécule d’oxygène 25. Il peut être produit dans les

mitochondries, dans le réticulum endoplasmique et dans la membrane de plusieurs types

cellulaires dont les macrophages et les cellules endothéliales. Ses sources principales incluent la

NADPH oxydase, la xanthine oxydase, la cyclooxygénase et la eNOS découplée 84. Dans le tissu

vasculaire, la NADPH oxydase est la source principale d’•O2-. La NADPH oxydase est formée

de plusieurs sous-unités membranaires (p22phox et gp91phox) et cytosoliques (p40phox, p47phox et

p67phox) qui, une fois phosphorylées, transloquent vers la membrane pour se lier aux sous-unités

membranaires. L’AngII est sans contredit l’activateur majeur de la NADPH oxydase vasculaire

et l’expression des ses différentes sous-unités est stimulée par celle-ci 84.

1.7.2- Actions et implications cardiovasculaires Les ions superoxyde (•O2

-) comme les autres radicaux libres de l’oxygène influencent la

signalisation cellulaire, l’expression de gènes et stimulent des changements structuraux tels que la

prolifération, l’hypertrophie et le remodelage de certains tissus 85. Au niveau vasculaire, les ROS

contribuent à la dysfonction endothéliale 34 et au maintien de l’hypertension par plusieurs

mécanismes dont l’inactivation du NO 86 et la déplétion du cofacteur BH4 conduisant au

découplage de la eNOS. De plus, ils conduisent à l’oxydation des lipides, des protéines et de

l’ADN contribuant aux dommages cellulaires 84. En condition physiologique normale, de

nombreux mécanismes existent pour permettre l’élimination des ROS et pour prévenir leurs

effets délétères. L’un de ces mécanismes, représenté à la figure 4, consiste à la réduction

complète des radicaux libres de l’oxygène en eau. La présence de nombreuses enzymes, dont les

SOD, la catalase et les peroxydases, laisse croire que la majeure partie des ions superoxydes sont

éliminés par cette voie métabolique 34.

41

Figure 4 : Réduction de l’O2 en H2O

Cascade de réduction de l’oxygène en eau par la voie du cytochrome. (e-) électron, (SOD) superoxyde dismutase. Tiré de « Endothelial function in hypertension : the role of superoxide anion »34

1.8- Interactions entre les facteurs endothéliaux L’endothélium vasculaire participe à la régulation du tonus vasculaire en contrôlant la relâche de

facteurs vasoactifs et de cytokines comme le NO, l’AngII, l’ET-1, les ROS et le TGF-β. En plus

de leur rôle sur le tonus vasculaire, ces agents peuvent modifier l’agrégation plaquettaire, la

thrombogénicité du sang, l’inflammation vasculaire et, à long terme, la migration et la

prolifération cellulaire contribuant ainsi au développement des maladies cardiovasculaires 15.

1.8.1- NO et AngII Au niveau de l’endothélium vasculaire, des cellules musculaires lisses vasculaires et des cellules

mésangiales, le NO et l’AngII peuvent être soit bénéfiques ou délétères ; les deux influençant le

tonus vasculaire, le volume circulant ainsi que le remodelage. D’ailleurs, la dysfonction

endothéliale se caractérise par le déséquilibre entre la production de NO et d’AngII et constitue

un facteur clé des maladies cardiovasculaires et rénales 87.

De nombreuses études ont confirmé que l’inhibition chronique de la synthèse du NO élève la

pression artérielle et altère la fonction rénale 32,33. En effet, l’inhibition de la synthèse du NO

mène à la contraction des cellules mésangiales, à la diminution du GFR et du débit plasmatique

rénale ainsi qu’à l’augmentation de la fraction de filtration et de l’excrétion urinaire du sodium

qui contribuent à l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux 24. L’administration

concomitante d’un antagoniste des récepteurs AT1 de l’AngII (ARA), le losartan, chez le rat traité

chroniquement au L-NAME, a prévenu à la fois l’hypertension et l’apparition des dommages

42

rénaux associés à ce modèle, suggérant un rôle majeur du système rénine angiotensine (SRA).

De plus, il a été démontré que le traitement avec un ARA renverse non seulement l’HTA établie 39 mais réduit également l’HTA persistante observée suite à l’arrêt du traitement au L-NAME 88.

Ces données suggèrent que le SRA joue un rôle causal et/ou permissif dans l’hypertension induite

par le L-NAME et ce même après l’interruption de son traitement.

D’ailleurs, De Nicola et al. 89 ont démontré que le NO antagonise les effets de l’AngII au niveau

glomérulaire et tubulaire en condition physiologique normale. Ces résultats confirment que

l’équilibre retrouvé entre la production de NO et d’AngII constitue un aspect critique pour le

maintien de la fonction rénale et du tonus vasculaire. D’ailleurs, le blocage du SRA prévient

l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux associés à l’inhibition de la synthèse du

NO 90. Finalement, la potentialisation des effets de la bradykinine expliquerait en partie les effets

vasodilatateur et cardioprotecteurs des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine

(ECA).

En plus d’inhiber les effets presseurs de l’AngII, l’administration à long terme d’un donneur de

NO contribue à diminuer le nombre de récepteur AT1 de l’AngII dans les cellules musculaires

lisses vasculaires, suggérant que le NO régule l’expression du récepteur AT1 91. Or, Katoh et al. 92 ont démontré que l’inhibition chronique de la synthèse du NO augmente le nombre de

récepteurs AT1 et l’expression de son ARNm dans le cœur de rats traités au L-NAME,

contribuant aux effets hémodynamiques de l’AngII lorsque que la synthèse du NO est inhibée.

1.8.2- NO et ET-1 Différents travaux sont également en faveur d’une interaction entre le NO et l’ET-1 dans des

modèles in vitro et in vivo. Plusieurs auteurs croient que la balance NO/ET-1 est l’élément

crucial dans le maintien de l’homéostasie cardiovasculaire et que son dérèglement serait à la base

de la dysfonction endothéliale 93.

L’ET-1 et le NO sont deux facteurs vasoactifs dérivés de l’endothélium vasculaire qui possèdent

des effets opposés sur l’hémodynamie systémique et rénale 21,74. En condition physiologique

normale, la relâche d’ET-1 conduit à la contraction des cellules musculaires lisses vasculaires et

des cellules mésangiales, contribuant ainsi à l’élévation de la pression artérielle et à la diminution

du GFR – des effets opposées à ceux du NO 74. Il a d’ailleurs été démontré que la production

43

continue de NO, par les cellules endothéliales, inhibe la synthèse et les effets vasoconstricteurs de

l’ET-1 94,95. Confirmant ce rôle, l’hypertension induite par le traitement avec le L-NAME est

bloquée de façon spécifique par un antagoniste des récepteurs de l’endothéline suggérant que les

effets de l’ET-1 sont potentialisés dans ce modèle d’hypertension 96. Le rôle précis de l’ET-1

dans ce modèle reste cependant à élucider puisque certaines études ont démontré que les taux

circulants d’ET-1 demeurent inchangés lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO et que

le traitement avec un antagoniste des récepteurs de l’endothéline n’a aucun effet sur l’élévation

de la pression artérielle 97.

1.8.3- NO et TGF-β Le TGF-β est une cytokine pro-fibrosante jouant un rôle majeur dans le processus de la fibrose

tissulaire. En regard de sa relation avec le NO, il a été démontré que l’expression du TGF-β et la

synthèse de la matrice extracellulaire sont augmentés dans des fibroblastes cardiaques de rats

traités au L-NAME, suggérant que le NO contrecarre les effets du TGF-β 92. Les mécanismes

conduisant à l’augmentation de la production de TGF-β dans le modèle L-NAME semblent

impliquer l’activation locale du système rénine angiotensine puisque le traitement avec un ARA

prévient l’augmentation non seulement du TGF-β, mais aussi du collagène de type I et IV et de la

fibronectine 92. En effet, l’infusion d’AngII in vivo conduit à l’augmentation de l’expression du

TGF-β dans le cœur et les vaisseaux 98,99. De plus, nous avons démontré la production

endothéliale accrue de TGF-β chez le rat urémique et que le traitement avec le losartan prévient

l’augmentation de la production endothéliale vasculaire accrue du TGF-β.

1.8.4- NO et ROS Les interactions entre le NO et les ROS sont importantes dans la pathophysiologie de l’HTA.

L’effet vasoconstricteur des ROS est imputable au fait qu’ils inactivent le NO. De plus, le NO

réagit avec l’•O2- pour former du peroxynitrite (ONOO-) qui induit des dommages oxydatifs à

l’ADN, aux lipides et aux protéines des cellules vasculaires. Entre autres, la formation des ROS

semble être causée par l’AngII qui stimule la production de radicaux libres de l’oxygène via la

stimulation de la NAD(P)H oxydase membranaire 100. Suite à l’infusion d’AngII, on observe une

augmentation de la NAD(P)H oxydase et de ses différentes sous-unités dans des aortes de rats

hypertendus. Le rôle critique de l’•O2- dans l’hypertension causé par l’AngII a été confirmé dans

de nombreuses études démontrant que la SOD membranaire mène à une baisse de la pression

44

artérielle. De plus, les souris knock-out pour le gène de la p47phox, une sous-unité critique de la

NAD(P)H oxydase, montre une diminution de la pression artérielle suite à l’infusion chronique

d’AngII. Ces données démontrent l’importance de l’•O2- dérivé de la NAD(P)H oxydase dans

l’hypertension induite par l’AngII 101. À long terme, la relâche et l’action de l’AngII entraînent

une diminution de la biodisponibilité du NO et de son effet.

45

Chapitre 2- Pertinences et objectifs de recherche L’hypertension artérielle et ses complications cardiovasculaires et rénales associés sont des

facteurs majeurs de morbidité et de mortalité chez les patients hypertendus. Encore aujourd’hui,

les mécanismes responsables du développement de l’HTA ne sont pas clairement définis.

Cependant, le déséquilibre de la relâche des facteurs vasoactifs de l'endothélium constitue un

mécanisme majeur conduisant à l'hypertension. Nos travaux récents suggèrent que la dysfonction

endothéliale observée en IRC est reliée à une diminution de la biodisponibilité du NO et constitue

une cause majeure menant à l’élévation de la pression artérielle et à la diminution de la fonction

rénale. Ces effets peuvent être mimés, en partie, par l’inhibition chronique de la synthèse du NO

qui provoque non seulement une élévation de la pression artérielle mais également l’apparition de

dommages cardiovasculaires et rénaux majeurs. Cependant, de tels effets semblent dépendre de

la susceptibilité génétique des animaux aux dommages cardiovasculaires et rénaux.

2.1- Hypothèse Nous avons émis l’hypothèse que l’inhibition chronique de la synthèse du NO chez le rat Harlan

Sprague Dawley (Hsd : SD) provoque l’élévation de la pression artérielle systolique et

l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux majeurs. Ces effets peuvent être médiés,

en partie, par l’activation de l’AngII qui stimule à son tour la production d’ET-1, du TGF-β et des

ROS.

46

2.2- Objectifs de recherche

Les objectifs de ce travail pour valider l’hypothèse sont comme suit :

♦ Déterminer l’effet de l’inhibition chronique de la synthèse du NO sur la pression

artérielle, les paramètres sanguins et urinaires associés à la fonction rénale et

l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux chez le rat Harlan Sprague-

Dawley (Hsd:SD).

♦ Évaluer l’effet d’un antagoniste des récepteurs AT1 de l’AngII, le losartan, sur la

progression de la PAS, le déclin de la fonction rénale et l’apparition des dommages

cardiovasculaires et rénaux lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO.

♦ Mesurer la concentration et/ou l’expression tissulaire de l’ET-1, du TGF-β et des ROS

chez le rat Hsd : SD traités au L-NAME et le rôle causal de l’AngII sur ces facteurs.

♦ Finalement, vérifier l’effet du blocage de l’ET-1, du TGF-β et des ROS à l’aide d’un

antagoniste des récepteurs ETA de l’ET-1, le LU135252, d’un anticorps monoclonal

neutralisant le TGF-β (1D11) et d’un antioxydant, l’acide lipoïque, sur l’évolution de

la pression artérielle et l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux chez le

rat Hsd : SD traités au L-NAME.

47

Chapitre 3- Article scientifique

Nous présentons ici un article scientifique qui a été soumis récemment pour publication à la revue

Journal of Hypertension et intitulé « Nitric oxide synthesis inhibition in Harlan Sprague-Dawley

rats : A model of malignant hypertension ».

Contribution des auteurs Pour cette étude, j’ai effectué la majorité des protocoles animaux comprenant le suivi des

paramètres biologiques, de même que les analyses biochimiques, moléculaires, et histologiques

subséquentes. J’ai colligé tous les résultats, procédé à leur analyse scientifique et statistique de

même qu’à la rédaction du manuscrit. Martin d’Amours ainsi que Geneviève Robitaille ont

fourni des résultats complémentaires à l’étude. Le Docteur Mohsen Agharazii a apporté son aide

pour relever et analyser l’ensemble des coupes histologiques. Le Docteur Marcel Lebel a apporté

sa contribution dans l’élaboration du projet, alors que le Docteur Richard Larivière a supervisé

l’ensemble des travaux en plus de réviser le manuscrit.

48

OCTOBER 12, 2005

NITRIC OXYDE SYNTHESIS INHIBITION IN HARLAN SPRAGUE-DAWLEY RATS :

A MODEL OF MALIGNANT HYPERTENSION

Frédérick Therrien, Geneviève Robitaille, Martin D’Amours,

Mohsen Agharazii, Marcel Lebel and Richard Larivière

CHUQ Research Centre, Division of Nephrology & Hypertension, L’Hôtel-Dieu de Québec

Hospital and Department of Medicine, Université Laval, Quebec, Canada

Short title: L-NAME induces malignant hypertension

Key words: Hypertension, Nitric oxide, Blood vessels, Renal damage, Angiotensin II,

Endothelin-1, TGF-β1, Reactive oxygen species.

Correspondence and requests for reprints:

Richard Larivière, Ph.D. Tel: (418) 525-4444, ext. 15587 CHUQ Centre de recherche Fax: (418) 691-5562 L’Hôtel-Dieu de Québec Email: richard.lariviere@crhdq.ulaval.ca 9, rue McMahon Québec (Québec) Canada G1R 2J6

49

ABSTRACT

Objective Different genetic susceptibility to hypertension induced by chronic nitric oxide

synthase (NOS) inhibition with L-NAME has been reported in Sprague-Dawley (SD). The

present study was designed to characterized cardiovascular and renal damage associated with

NOS inhibition in Harlan SD rats and the related mechanisms.

Design SD rats were divided into 3 groups and received; 1) no treatment; 2) L-NAME 0.1%; or

3) L-NAME + the angiotensin II (Ang II) AT1 receptor antagonist losartan (20mg/kg/day), for 3

weeks.

Results Systolic blood pressure (SBP) increased rapidly in L-NAME-treated SD rats, up to

207±5 mmHg at week 3, and was associated with increased serum creatinine, proteinuria and

endothelin-1 (ET-1) and transforming growth factor (TGF)-β excretion (p<0.01). Severe

myointimal proliferation and obliteration of small renal arteries and focal necrosis of glomeruli

were observed in L-NAME rats. L-NAME treatment also increased vascular and renal

expression of ET-1 and TGF-β1 and aortic reactive oxygen species (ROS) formation. Losartan

attenuated the rise in SBP in L-NAME rats and prevented the renal damage and the increase in

ET-1, TGF-β1 and ROS. The involvement of the latter factors was assessed using the ETA

receptor antagonist LU135252, the TGF-β neutralizing antibody 1D11 or the antioxidant α-

lipoic acid. Individually, these drugs had no cardiovascular nor renal protective effects in L-

NAME rats.

Conclusions Chronic NOS inhibition in Harlan SD rats causes malignant hypertension with renal

artery and glomerular damage. These adverse effects are mediated, at least in part, by Ang II

and, possibly, downstream mediators such as ET-1, TGF-β1 and ROS production. However,

blockade of the latter, individually, is ineffective suggesting a synergistic role.

50

INTRODUCTION

A major role for NO has been documented in the control of vascular tone and structure, and renal

function. In blood vessels, NO is a potent local vasodilator that counteracts the effects of

vasoconstrictor and growth promoting factors such as catecholamines, angiotensin II (Ang II) and

endothelin-1 (ET-1) 1-3. The role of NO in this vascular function has been confirmed in mice

lacking the endothelial NO synthase (eNOS), which develop hypertension and vascular

hypertrophy 4. On the other hand, the renal vasculature is highly sensitive to NO regulating renal

blood flow and glomerular filtration rate 5,6. NO is a potent vasodilator of afferent and efferent

arterioles where it counteracts the vasoconstrictor effects of Ang II and ET-1 7,8. Moreover, NO

release in the renal medulla increases sodium and water excretion attenuating, thereby, volume

expansion and the blood pressure 9.

Impaired NO release has been reported in a large number of diseases, if not all, with

cardiovascular components such as chronic renal failure 10. In patients with chronic renal failure,

the reduction in NO release has been associated, in part, with the accumulation in plasma of

asymmetric dimethyl-arginine (ADMA), an endogenous inhibit of eNOS 11. In the rat remnant

kidney model of chronic renal failure, improvement of NO release was shown to attenuate the

aggravation of hypertension and the progression of renal failure and damage; an effect that was

associated with a reduction in renal ET-1 production 12. Similarly, NOS inhibition with the L-

arginine analogue Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) in normal animals can induce

hypertension with cardiovascular and renal damage 13,14. However, the latter may depend on the

rat strains, which may have different genetic susceptibility to renal damage 15. For example, we

documented that treatment of intact and uninephrectomized Sprague-Dawley CD rats with L-

NAME at a dose of 0.1 % for 6 weeks induced hypertension, but no cardiovascular and renal

damage 16. In contrast, the hypertensive and renal hemodynamic responses to L-NAME have

51

been reported to be exaggerated in Harlan Sprague-Dawley rats suggesting a different genetic

susceptibility, which may lead to renal damage 17,18.

In the present study, we investigated whether long-term inhibition of NOS induces hypertension

with vascular and renal injuries in Harlan Sprague Dawley rats, and whether these effects are due

to the unopposed actions of Ang II. We also investigated the role of ET-1, TGF-β1 and reactive

oxygen species (ROS), which may be induced by Ang II, and participate, at different degrees, in

the pathogenesis of hypertension and renal insufficiency induced by L-NAME.

MATERIALS AND METHODS

Animal experiments All animals experiments were approved by the Animal Care Committee of

Laval University and were performed on 250g male Harlan Sprague-Dawley (SD) rats (Hsd:SD;

Harlan, Indianapolis, IN, USA). The animals were allowed free access to standard laboratory rat

chow and tap water, and were housed under controlled humidity and temperature conditions with

a 12-hour light-dark cycle. In a preliminary study, SD rats were divided into 2 groups; one group

of controls (n = 10) receiving tap water, and the second (n = 12) was given the NOS inhibitor L-

NAME 0.1 % (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in drinking water. Unexpectedly, L-

NAME treated rats rapidly developed severe hypertension and most animals died or underwent

hind-limb paralysis due to cerebrovascular lesions between weeks 3 to 4. This contrast with our

previous study in Sprague-Dawley CD rats, where all animals were still alive after 6 weeks of

treatment with L-NAME at the same dose 16. Thus, this confirms that Harlan Sprague-Dawley

rats are highly susceptible for cardiovascular and possibly renal damage. Based on these

findings, in the following experiments, the animals were studied at week 3. In the first series of

experiments, SD rats were divided into 3 groups; 1) control rats receiving tap water (n = 16); 2)

52

L-NAME-treated rats (n = 24); and 3) L-NAME rats treated with the AT1 receptor antagonist

losartan 20 mg/kg/day (n = 18; Merck & Co., Rahway, NJ, USA) given in drinking water.

Before the end of the study, 6 L-NAME rats died or underwent hind-limbs paralysis and were

discarded. The doses of losartan was selected according to our previous studies in uremic

hypertensive rats where it normalization of blood pressure and proteinuria 19,20.

In an additional study, SD rats were divided into 5 groups (n = 10 in each group); 1) control rats

receiving tap water; 2) L-NAME-treated rats (0.1 % for 3 weeks); and 3) L-NAME rats treated

with the endothelin ETA receptor antagonist LU135252 (50 mg/kg/day in drinking water; Knoll

AG, Ludwingshafen, Germany); 4) the pan-specific TGF-β neutralizing antibody 1D11 (0.5

mg/kg, 3 times/week, i.p.; Genzyme Corporation, Framingham, Massachusetts, USA); 5) the

antioxidant α-lipoic acid (30 mg/kg/day as food admix; Sigma). The doses of LU135252, 1D11

and α-lipoic acid were selected according to the antihypertensive and cardiovascular and renal

protective effects previous documented in uremic and hypertensive rats 21-23.

Systolic blood pressure was measured before the initiation of treatments and, thereafter, every

week by the tail-cuff method as described elsewhere 16,19-22. At week 3, the rats were placed in

metabolic cages and 24-hour urine samples were collected and stored at -20°C. The animals

were then anesthetized with pentobarbital (50 mg/kg, i.p.; MTC Pharmaceuticals, Cambridge,

ON, Canada) and exsanguinated by an abdominal aortic puncture. The thoracic aorta segment,

from the diaphragm to aortic arch, and the complete mesenteric vascular bed, from the aorta to

the intestinal border, were removed, cleaned of blood and surrounding adipose tissue, frozen

quickly and stored at -80°C. The heart was removed, cleaned of blood and weighed. The

kidneys were harvested, weighed and cut in halves longitudinally. One half was fixed in buffered

formalin solution (formaldehyde 3.7 % in phosphate buffer saline, pH 7.4) for histological

53

analysis, whereas the papilla and the medulla were dissected from the other half and the

remaining renal cortex was frozen quickly for mRNA expression studies.

Biochemical analyses Serum was obtained from 1-ml blood samples, incubated for 1 hour at

room temperature, and centrifuged for 2 min in a microcentrifuge. Serum creatinine and urinary

sodium, protein and creatinine were measured with an auto-analyzer system (Ilab 1800;

Instrumentation Laboratory, Lexington, MA, USA). Plasma renin activity was measured using a

radioimmunoassay kit for Ang I purchased from DuPont NEN. Urinary TGF-β1 concentrations

were assessed by an enzyme-linked immunoasorbant assay (ELISA) with the TGF-β1 Emax

Immunoassay system (Promega, Madison, Wisonsin, USA) after sample acidification.

Histological analysis Tissues were fixed for 48 hours, then dehydrated and embedded in

paraffin. 5 μm-thick sections were mounted on glass slides. After deparaffinization and

rehydration, the sections were stained with Masson trichrome, dehydrated and coverslipped.

Renal section preparation and analysis were performed in a blind manner.

Plasma, urine and tissue ET-1 One thoracic aorta segment was utilized per extraction tube and

assayed individually as previously described 19-21,24. Frozen tissues were weighed, homogenized

twice with a Tissue-Tearor (Biospec Products, Bartlesville, OK, USA) in 2 ml ice-cold extraction

solution containing 1 N HCl, 1 % acetic acid, 1 % trifluoroacetic acid (TFA) and 1 % NaCl, and

centrifuged at 3,000 g for 30 min at 4ºC. The supernatants were extracted on a C18 Sep-Pak

column (Waters, Milford, MA, USA). Similarly, plasma and urine (2 ml) were acidified with

TFA, and extracted on a C18 Sep-Pak column 25. ET-1 in the sample extracts was measured by a

specific radioimmunoassay and the concentrations were corrected for losses in the extraction and

54

purification steps using small amounts of 125I-ET-1 (~1000 cpm; DuPont NEN, Boston, MA,

USA).

Northern blot analysis Total RNA from the thoracic aorta and the mesenteric arterial bed was

isolated using a standard guanidine isothiocyanate-phenol-choroform method 19,22. Total RNA

samples (20 µg) were separated by electrophoresis in 1% agarose gel in denaturing conditions,

transferred onto a Hybond N membrane (Amersham Biotech, Piscataway, NJ, USA) and baked at

80°C for 2 hours. For the ET-1 probe, blots were prehybridized 1 hour at 60°C in 50 %

formamide, 400 mM NaPO4 (pH 7.2), 1 mM EDTA, 5 % SDS, 0.1 % BSA and hybridized

overnight. For the TGF-β1 and 18S probes, membranes were prehybridized 1 hour at 42°C in 50

% formamide, 10 % Denhart's solution, 50 mM NaPO4 (pH 7.0), 1 % SDS, 5X SSC, 100 µg/ml

yeast tRNA and 100 µg/ml denatured sheared salmon sperm DNA, and hybridized overnight.

The membranes were washed 3 times for 30 minutes at 68°C for the ET-1 probe, 62°C for the

TGF-β1 probe and 42°C for the 18S probe in 0.1X SSC and 0.1 % SDS. Blots were then

exposed to Biomax MS films (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA) with an intensifying screen

at -80°C. Experiments were carried on three different blots for each probe.

The rat ET-1 complementary RNA probe, which correspond to a 319 bp fragment of the rat ET-1

cDNA previously prepared by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) from

rat lung, was labeled using α[32P]-UTP (DuPont NEN) and the SP6 RNA polymerase Riboclone

Gemini II system (Promega, Madison, WI, USA). TGF-β1 cDNA probe (kindly provided by Dr

T. Nakamura) 26 was labeled using α[32P]-dCTP and the random oligonucleotide priming Ready-

to-go system (Amersham Biotech). The 18S ribosomal RNA antisense oligonucleotide probe

was labeled with [γ32P]-ATP (DuPont NEN) using the polynucleotide kinase (Amersham

Biotech).

55

Measurement of superoxide anions Some thoracic aorta were immersed in Optimal Cutting

Temperature Embedding Medium (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), quickly

frozen and stored at –80°C. Then, 30-µm transversal sections were obtained and mounted onto

glass slides. Tissue sections were washed in phosphate-buffered saline (PBS), then

dihydroethidium (2 X 10-6 M) was topically applied for 30 min at 37°C in a light-protected and

humidified chamber. Dihydroethidium freely enters cells where it reacts with superoxide anions,

which releases ethidium molecules that intercalate DNA and fluoresces upon excitation at 488

nm (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). After rinsing in PBS, tissue slices were mounted on

coverslipped. The fluorescence was detected and localized by confocal microscopy (MRC-1024

Confocal System, Bio-Rad, CA, USA) with the Laser Sharp image acquisition software 3.2.

Fluorescent images in the different experimental groups were obtained with a 585-nm long-pass

filter using the same conditions of laser exposure.

Analysis of data The results are expressed as means ± SEM. Mean values were compared by

ANOVA followed by Student-Newman-Keul’s test for multiple comparisons. Differences were

considered significant at a value of p < 0.05.

56

RESULTS

Effect of L-NAME and AT1 receptor blockade in SD rats

Blood pressure Systolic blood pressure increased rapidly after the initiation of L-NAME

treatment in SD rats (Figure 1), up to 207 ± 5 mmHg after only 3 weeks (Table 1). In fact, in a

preliminary study, we found that survival of L-NAME-treated rats dramatically dropped between

week 3 to 4. As depicted in Figure 1, treatment with the AT1 antagonist losartan significantly

attenuated the rise of systolic blood pressure in L-NAME rats suggesting a role for Ang II.

Blood and renal parameters Serum creatinine and plasma ET-1 levels were higher in L-NAME-

treated rats as compared to the controls (p < 0.01; Table 1), whereas plasma renin activity was

similar in the two groups of rats. However, urinary volume, proteinuria and ET-1 and TGF-β1

excretion were greater in L-NAME rats as compared to the controls, whereas creatinine clearance

and sodium excretion were reduced indicating a significant alteration of the renal function (Table

2). Renal insufficiency was significantly attenuated by the AT1 receptor blockade losartan

preventing the rise of serum creatinine, proteinuria, renal ET-1 and TGF-β1 excretion as well as

sodium retention and the decline in creatinine clearance (Table 1 and 2). However, losartan had

no significant effect on plasma ET-1, whereas it increased plasma renin activity as expected.

Cardio-renal hypertrophy At week 3, L-NAME-treated animals had lower body weight than the

controls (p < 0.01; Table 3), which was prevented by losartan. In contrast, the heart weight to

body weight ratio and the kidney weight to body weight ratio were increased in L-NAME rats as

compared to the controls (p < 0.01; Table 3), and these changes were also prevented by losartan.

57

However, since heart and kidney weights were similar in the three groups of rats (Table 3).

Therefore, the apparent cardio-renal hypertrophy may be related to weigh loss in L-NAME rats.

Renal morphology Although no significant structural change was seen in large renal vessels,

there was moderate medial hypertrophy of medium sized arteries in L-NAME rats as compared to

the controls (Figure 2). We also found extensive and severe myointimal proliferation leading to

focal partial or total obliteration of small arteries and preglomerular arterioles. Focal areas of

vascular fibrinoid necrosis was also seen in L-NAME animals. The glomerular capillary lumina

were narrowed or obstructed because of marked mesangial and endothelial cell swelling and

hypertrophy (glomerular capillary endotheliosis) associated with intraglomerular fibrin thrombi

(Figure 2), and focal and segmental necrosis of some glomeruli. Mild areas of striped fibrosis

was seen in the tubulointerstitium. Treatment of L-NAME rats with losartan significantly

attenuated the vascular and glomerular damage (Figure 2).

ET-1 and TGF-β1 expression Compared to the controls, the expression of both ET-1 and TGF-

β1 was significantly higher in the thoracic aorta, the mesenteric arterial bed and the renal cortex

of L-NAME rats (Figure 3). The heightened expression of ET-1 in L-NAME rats was associated

with increased ET-1 concentrations in the thoracic aorta as compared to the controls (0.61 ± 0.04

vs. 0.16 ± 0.02 pg/mg of tissue, p < 0.01). Treatment with losartan prevented vascular and renal

ET-1 and TGF-β1 overexpression in L-NAME rats (Figure 3) and reduced the thoracic aorta ET-

1 concentrations (0.42 ± 0.04, p < 0.05).

58

Superoxide anion prodcution Fluorescence confocal microscopy analysis with dihydroethidium

showed a significant increase in superoxide anion production in endothelial and smooth muscle

cells of thoracic aorta from L-NAME rats as compared to the controls (Figure 4). Superoxide

anion overproduction was prevented by losartan.

ET-1, TGF-β and ROS blockade in L-NAME-treated SD rats

Similarly as in the above experiment, treatment of SD rats with L-NAME significantly increased

systolic blood pressure and serum creatinine as well as urinary volume and proteinuria, and

reduced creatinine clearance (p < 0.01; Table 4), which were associated with marked renal

vascular and glomerular damage (not shown). Treatment of L-NAME rats with either the ETA

receptor antagonist LU135252, the TGF-β neutralizing antibody 1D11 or the antioxidant α-lipoic

acid had no effect on systolic blood pressure, blood and renal parameters (Table 4) and renal

morphological changes.

DISCUSSION

In the present study, we show that chronic NO synthesis inhibition with L-NAME in Harlan

Sprague-Dawley rats leads, within only 3 weeks, to malignant hypertension with renal

insufficiency and damage. The renal damage induced by L-NAME comprises extensive and

severe myointimal proliferation and focal obliteration of small arteries and preglomerular

arterioles as well as glomerular capillary narrowing and focal and segmental necrosis of some

glomeruli.

59

Similar lesions of small arteries, as found in the kidney, may also occur in other target organs

such as the heart and brain leading to heart failure and stroke leading to animal death. Indeed, in

a preliminary study we found that all animals treated with L-NAME died from week 3 to 4.

Among them, several underwent hindlimb paralysis as a consequence of cerebrovascular lesions.

This observation contrasts with our previous study in normal and uninephrectomized Sprague-

Dawley CD rats, purchased from Charles River Laboratories, showing that treated with L-NAME

for 6 weeks at the same dose induced hypertension, but no cardiovascular and renal damage 16.

Together, these observations indicate that Harlan Srague-Dawley rats are highly sensitive to

vascular and renal damage, due possibly to a different genetic susceptibility. In keeping with this

hypothesis, van Dokkum et al. 15 revealed that genetic susceptibility to renal damage in response

to L-NAME is determined by two genes, RF-1 and RF-2. As in the present study, treatment of

Fawn Hooded rats, which are homozygous for RF-1 and RF-2, with L-NAME induces severe

hypertension with renal insufficiency and glomerular damage with premature death. In contrast,

August Copenhagen Irish rats were resistant to renal damage following the same L-NAME

treatment 15. Similarly as in our former study 16, Pollock et al. 27 reported that treatment of

Sprague-Dawley rats with L-NAME induced no renal dysfunction. Thereafter, this group

showed that L-NAME treatment induced more severe hypertension in Harlan Sprague-Dawley

SD rats as compared to Sprague-Dawley CD rats indicating that NO may play a more significant

role in the former strain of rat 17. Consistently, L-NAME-induced hypertension in Harlan

Sprague-Dawley rats was associated with altered renal hemodynamics 17,18, which may lead to

the renal vascular and glomerular damage found in the present study. L-NAME-induced renal

damage has also been documented in Wistar and Wistar Kyoto rats 13,14,28,29.

60

Of note, the vascular and renal injuries present in Harlan Sprague-Dawley rats treated with L-

NAME were largely different to those normally observed in chronic renal failure conditions.

Histological alterations in chronic renal failure include cardiac and large and small arteries media

hypertrophy, focal and segmental glomerular sclerosis, tubular epithelial cell atrophy and renal

interstitial fibrosis 22,30. None of these structural changes were apparent in L-NAME-treated

Harlan Sprague-Dawley rats. Instead, small blood vessels predominantly presented myointimal

proliferation and focal obliteration of small arteries and preglomerular arterioles with evidence of

thrombosis. These vascular alterations resemble those seen in malignant hypertension rather than

in chronic renal failure. Similarly, the absence of glomerular sclerosis and tubular epithelial cell

atrophy with mild areas of tubulo-interstitial fibrosis contrast with the marked changes normally

seen in chronic renal failure 22. Taken together, these findings suggest that the vascular and renal

structural changes are related to different mechanisms. In L-NAME rats, the vascular and

glomerular damage appears to be related to the rapid rise in systemic and, possibly, renal blood

pressure leading within only 3 weeks to malignant hypertension, which has a significant impact

on blood vessel structure.

In the present study, we also report that AT1 receptor blockade with losartan significantly

attenuated the aggravation of hypertension, the decline in renal function and all renal vascular,

glomerular and tubular injuries. This is in agreement with studies documenting a role for Ang II

in the pathogenesis of hypertension induced by chronic NOS inhibition in different rat strains

suggesting that Ang II is a common contributing factor 27,31,32. Since plasma renin activity is

normal in L-NAME SD rats, the direct effects of Ang II on vascular tone and renal

hemodynamics as well as the vascular and renal structural changes are likely unopposed during

NOS inhibition 33,34. The effects of Ang II could be mediated, in part, by ET-1, TGF-β1 and

61

superoxide anion. In fact, the enhanced vascular and renal expression of ET-1 and TGF-β1 and

aortic formation of superoxide anion were prevented by AT1 receptor blockade in L-NAME rats.

However, treatment of L-NAME animals with an ETA receptor antagonist, a TGF-β neutralizing

antibody or an antioxidant was ineffective in even attenuating hypertension and renal failure and

damage. This indicates either a minor role for these factors or that blockade of these factors

individually is not sufficient. In fact, blockade of the AT1 receptor attenuated the pathological

effects of Ang II, as well as those related to the increased production of ET-1, TGF-β1 and ROS,

suggesting the possibility of synergistic effects of these factors. The lack of cardiovascular and

renal protective effects of ETA receptor antagonist, the TGF-β neutralizing antibody and the

antioxidant contrast, however, with recent studies showing beneficial effects of similar treatments

in other rat strains treated with L-NAME 31,35-38. This discrepancy may be related to a number of

experimental factors such as the genetic background of the rat strains, the dose of L-NAME and

the duration of the treatment, which remain to be investigated.

In conclusion, long-term NOS inhibition in Harlan Sprague-Dawley rats causes a rapid rise in

blood pressure leading to severe hypertension associated with renal vascular and glomerular

damage. These pathological effects are due, at least in part, to unopposed actions of Ang II,

which modulate the local production of ET-1, TGF-β1 and ROS. However, blockade of the latter

factors, individually, is ineffective suggesting a synergistic role.

62

ACKNOWLEDGMENTS

The authors thank Danielle Lizotte and Claude Villeneuve for their technical assistance. This

study was supported by a grant from The Kidney Foundation of Canada and the Canadian

Institutes of Health Research (MOP-57683) to RL. RL holds a research scholarship from the

Fonds de la Recherche en Santé du Québec.

63

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90.

67

Table 1 Systolic blood pressure and blood parameters in control rats, L-NAME-treated rats and L-NAME-treated rats receiving losartan

Group

Systolic blood pressure (mmHg)

Serum creatinine (μmol/l)

Plasma ET-1 (pg/ml)

Plasma renin ctivity(ng Ang I/ml/hr)

Control 124 ± 4 49 ± 1 2.5 ± 0.1 27 ± 4 L-NAME 207 ± 5* 90 ± 9* 7.9 ± 0.9* 28 ± 8 L-NAME + losartan

177 ± 6*† 54 ± 1† 6.9 ± 0.5* 79 ± 9*†

Values are means ± SEM from 14 to 16 animals per group. ET-1, endothelin-1; Ang I, angiotensin I. *, p < 0.01 vs. control; †, p < 0.01 vs. L-NAME.

68

Table 2 Urine parameters in control rats, L-NAME-treated rats and L-NAME-treated rats receiving losartan

Group

Urinary volume (ml/day)

Urinary protein

(mg/day)

Creatinine clearance (ml/min)

Urinary sodium

(mmol/day)

Urinary ET-1

(pg/day)

Urinary TGF-� (pg/day)

Control 13.1 ± 0.7 32 ± 3 1.65 ± 0.05 2.6 ± 0.1 30 ± 2 3.8 ± 0.3 L-NAME 26.5 ± 2.4* 184 ± 16* 0.96 ± 0.11* 1.4 ± 0.2* 65 ± 8* 5.0 ± 0.3* L-NAME + losartan

14.3 ± 1.3† 59 ± 8† 1.45 ± 0.08† 2.4 ± 0.2† 28 ± 2† 4.2 ± 0.2‡

Values are means ± SEM from 14 to 16 animals per group. *, p < 0.01 vs. control; ‡, p < 0.05 and †, p < 0.01 vs. L-NAME.

69

Table 3 Body weight, heart and kidney weight to body weight ratio in control rats, L-NAME-treated rats and L-NAME-treated rats receiving losartan

Body Heart weight Heart weight/ Kidney weight Kidney weight/ Group weight

(g) (g) body weight

(10-3) (g) body weight

(10-3)

Control 372 ± 6 1.21 ± 0.02 3.25 ± 0.05 1.26 ± 0.03 3.35 ± 0.06 L-NAME 306 ± 12* 1.29 ± 0.04 4.14 ± 0.08* 1.18 ± 0.03 3.69 ± 0.06* L-NAME + losartan

378 ± 5† 1.29 ± 0.02 3.40 ± 0.07† 1.24 ± 0.06 3.31 ± 0.06†

Values are means ± SEM obtained from 14 to 16 animals per group. *, p < 01 vs. control; †, p < 0.01 vs. L-NAME.

70

Table 4 Systolic blood pressure and blood and renal parameters in control rats, L-NAME-treated rats and L-NAME-treated rats receiving the ETA receptor antagonist LU135252, the TGF-β neutralizing antibody 1D11 or the antioxidant lipoic acid

Group

Systolic blood pressure (mmHg)

Serum creatinine (μmol/l)

Urinary volume (ml/day)

Proteinuria (mg/24h)

Creatinine clearance (ml/min)

Control 125 ± 2 39 ± 2 10 ± 1 37 ± 4 2.13 ± 0.11 L-NAME 204 ± 5* 67 ± 5* 30 ± 3* 87 ± 11* 1.11 ± 0.12* L-NAME + LU135252

199 ± 5* 76 ± 6* 25 ± 3* 174 ± 22* 1.13 ± 0.12*

L-NAME + 1D11

199 ± 2* 70 ± 5* 30 ± 3* 115 ± 16* 0.92 ± 0.10*

L-NAME + Lipoic acid

203 ± 10* 73 ± 8* 33 ± 2* 107 ± 10* 0.93 ± 0.22*

Values are means ± SEM from 8 to 10 animals per group. *, p < 0.01 vs. control.

FIGURE LEGENDS Figure 1 : Time course of systolic blood pressure in control Harlan Sprague Dawley rats,

L-NAME-treated SD rats and in L-NAME rats treated with the AT1 receptor antagonist

losartan. *, p < 0.01 vs. control; +, p < 0.05 and ++, p < 0.01 vs. L-NAME rats.

Figure 2 : Representative photographs of renal sections stained with Masson-Trichrome

from control Harlan Sprague Dawley rats, L-NAME-treated SD rats and L-NAME rats

treated with the AT1 receptor antagonist losartan, at the week 3. Arrows in photographs on

the left column shows a small renal artery of similar size in kidneys from the different

groups of rats. Photographs on the middle and the right columns depict a glomerulus and a

tubular area, respectively. Magnification: left and middle photographs, 40X; right

photographs, 20X.

Figure 3 : Representative Northern blots show expression of ET-1 and TGF-β1 in the

thoracic aorta, the mesenteric arterial bed (MAB) and the renal cortex of control Harlan

Sprague Dawley rats (C), L-NAME-treated SD rats (N) and L-NAME rats treated with the

AT1 receptor antagonist losartan (N+L), at week 3.

Figure 4 : Representative confocal microscopy photographs show superoxide anion levels

measured with the fluorescent dye dihydroethidium in the thoracic aorta from control

Harlan Sprague Dawley rats, L-NAME-treated SD rats and L-NAME rats treated with the

AT1 receptor antagonist losartan, at week 3. Magnification: 40X.

72

Figure 1 : Time course of systolic blood pressure

* P <0.01 vs control; + p<0.05 and ++ p<0.01 vs L-NAME rats.

0 1 2 3100

125

150

175

200

ControlL-NAME

L-NAME + Losartan

+

*

*

*++

+

*

*

*

Time (weeks)

Sys

tolic

bloo

dpr

essu

re (m

mH

g)

0 1 2 3100

125

150

175

200

ControlL-NAME

L-NAME + Losartan

+

*

*

*++

+

*

*

*

Time (weeks)

Sys

tolic

bloo

dpr

essu

re (m

mH

g)

73

Figure 2 : Histological Analysis

A), B), C) Control; D), E), F) L-NAME; G), H), I) L-NAME+losartan.

A B C

D E F

G H I

A B C

D E F

G H I

74

Figure 3 : ET-1 and TGF-β expression

TGF-β1

Aorta MAB Renal Cortex

ET-1

18S

NC N+L NC N+L NC N+L

TGF-β1

Aorta MAB Renal Cortex

ET-1

18S

NC N+L NC N+L NC N+L

75

Figure 4 : Dihydroethidium Fluorescence

Control L-NAME L-NAME + LosartanControl L-NAME L-NAME + Losartan

76

Chapitre 4- Degré d’inhibition de la synthèse du NO

4.1- Pertinences et objectifs du projet L’étude précédente a démontré que l’inhibition chronique de la synthèse du NO avec le L-

NAME à la dose de 0.1% (~100 mg/kg/jour) provoque une augmentation très rapide de la

pression artérielle et qu’après seulement 3-4 semaines, les animaux décèdent, possiblement

dû à des complications cardiovasculaires majeures. En effet, à la semaine 3, des dommages

vasculaires et rénaux importants ont été observés. Toutefois, les dommages rénaux sont

différents de ceux observés en insuffisance rénale et sont associés à l’hypertension sévère et

des dommages aigus causés principalement dans les petits vaisseaux. Ces résultats

suggèrent une inhibition de la synthèse du NO trop importante.

4.2- Hypothèse Nous avons donc émis l’hypothèse que l’inhibition chronique de la synthèse du NO en

utilisant de plus faibles doses de L-NAME chez le rat Hsd : SD provoque une élévation

plus modérée de la pression artérielle et l’apparition des dommages cardiovasculaires et

rénaux semblables à ceux observés dans le cas d’insuffisance rénale chronique.

4.3- Objectifs de recherche

Le degré d’inhibition de la synthèse du NO sera évaluée avec différentes doses de

L-NAME (100, 30 et 5 mg/kg/jour) et ces effets seront évalués en fonction de :

♦ La pression artérielle systolique et la fonction rénale.

♦ Les dommages histologiques vasculaires et rénaux dans des coupes de cortex

rénal.

♦ Finalement, les effets protecteurs du blocage du récepteur AT1 avec le losartan

seront évalués.

77

4.4- Matériel et méthodes 4.4.1- Protocole animal

Les études ont été réalisées sur des rats mâles Sprague-Dawley Hsd : SD de 250g.

L’inhibition chronique de la synthèse du NO est induite par le traitement avec le L-NAME

aux doses de (100, 30 et 5 mg/kg/jour dans l’eau à boire pendant 3, 4 et 12 semaines. Pour

chaque dose de L-NAME, un groupe de rats reçoit en combinaison du L-NAME et du

losartan (20 mg/kg/jour). Un groupe d’animaux ne recevant aucun traitement est utilisé

comme groupe témoin.

La PAS est mesurée hebdomadairement de façon non invasive au niveau de la queue du rat

conscient et la moyenne de trois mesures différentes est enregistrée. À la fin du traitement,

une collecte des urines sur 24h est effectuée pour mesurer la créatininurie et la protéinurie.

Par la suite, les animaux sont anesthésiés au phénobarbital et exsanguinés par ponction de

l’aorte abdominale. Le sang recueilli est conservé pour déterminer la créatinine sérique.

Le rein est prélevé, nettoyé et pesé puis disséqué longitudinalement. Une section est

conservée dans une solution de formaldéhyde 4% puis fixée dans la paraffine pour

coloration et analyses histo-pathologiques. Des coupes de tissus de 5 μm sont montées sur

lames de verre puis colorées à l’aide d’une coloration Masson Trichrome qui permet de

mettre en évidence la fibrose rénale. Le rein restant est congelé sur glace sèche.

4.4.2- Mesure des NO2-/NO3

- Les métabolites du NO (NO2

-/NO3-) sont mesurés dans l’urine selon une méthode

colorimétrique. Les échantillons sont dilués dans un volume égal de tampon phosphate (pH

7.4) et déprotéinés par ultrafiltration dans des tubes Centrisart avec un potentiel filtrant de

20 000 Dalton (Sartorius, Goettingen, Allemagne) centrifugés à 3000rpm pendant 45

minutes à 4°C. 25μL d’ultrafiltrat pour un animal témoin et 50μL d’ultrafiltrat pour un

animal L-NAME sont ensuite dilués et complétés à 250μL à l’aide du tampon phosphate.

Les échantillons sont ensuite incubés dans la noirceur en présence de 0.4U/mL de nitrate

réductase, 150μg/mL de NADPH et 3μg/mL de FAD (Roche Diagnostics) pendant 30

minutes à 37°C afin de réduire les nitrates en nitrites. 150μL de cette solution est ensuite

78

incubé 5 minutes en présence d’un volume égal du réactif de Greiss préparé en combinant

une solution de sulfanilamide 1% dans HCl 10N et de N-(1-naphthyl)éthylènediamide 0.1%

dans H3PO4 5% selon une proportion 1:1. L’absorbance est mesurée à 550 nm et la

concentration de nitrites est déterminée à l’aide d’une courbe standard linéaire de 1.25 à

80μM.

4.4.3- Analyses statistiques À la fin des études, les données sont analysées à l’aide du logiciel GraphPad InStat

(graphPad Software, Mobile, CA, USA) et les résultats sont exprimés selon moyenne ±

SEM. Les moyennes sont traitées et comparées par analyse de variance ANOVA suivie du

test de comparaison multiple de Student-Newman-Keul. Le seuil α de signification

statistique est posé à 0,05.

79

4.5- Résultats 4.5.1- Effets du degré d’inhibition de la synthèse du NO

A- Survie des animaux La figure 5 représente le pourcentage de survie des animaux en fonction du temps pour les

différents doses de L-NAME utilisée. Ainsi, on observe 33% de décès à la fin de la 3e

semaine de traitement à la dose de 100 mg/kg/jour de L-NAME. La survie des animaux

L-NAME à la dose de 30 mg/kg/jour peut se prolonger jusqu’à 4 semaines de traitement où

l’on observe 38% de décès. À la dose de 5 mg/kg/jour de L-NAME, la survie des animaux

est de 100% après 4 semaines de traitement et peut se prolonger jusqu’à 12 semaines où

l’on observe 33% de décès (non montré).

Figure 5 : Survie des animaux

0 1 2 3 4 50

60

70

80

90

100

Control5 mg30 mg

Temps (Semaine)

100 mg

Pourcentage de survie (%)

80

B- Excrétion urinaire des métabolites du NO On constate une diminution marquée de 95% de l’excrétion urinaire des métabolites du NO

chez les animaux L-NAME 100 mg/kg/jour lorsque comparé aux animaux témoins. On

observe une réduction similaire (90%) de l’excrétion urinaire des nitrates/nitrites chez les

animaux L-NAME 30 mg/kg/jour. Cette diminution est beaucoup moindre (15%) à la dose

de 5 mg/kg/jour de L-NAME. La figure 6 présente l’excrétion urinaire des nitrates/nitrites

pour les différents groupes étudiés après 3-4 semaines de traitement.

Figure 6 : Excrétion urinaire des métabolites du NO

Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,01 et vs témoins ; † p<0,01 vs L-NAME 5 mg/kg/jour

Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0

25

50

75

100

125

††*

*

L-NAME

Nitr

ates

/Nitr

ites

(%)

Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0

25

50

75

100

125

††*

*

L-NAME

Nitr

ates

/Nitr

ites

(%)

81

C- Pression artérielle systolique On remarque une élévation marquée de la pression artérielle chez les animaux L-NAME

100 mg/kg/jour lorsque comparée aux animaux témoins (205±5 mmHg versus 125±2

mmHg ; p<0.001). Cette élévation de la PAS est similaire et atteint 212±3 mmHg

(p<0,001) chez les animaux L-NAME 30 mg/kg/jour. Finalement, on remarque une

élévation significative mais modérée de la PAS (165±3 mmHg ; p<0,001) chez les animaux

L-NAME 5 mg/kg/jour comparativement aux animaux témoins. La figure 7 montre

l’évolution de la PAS après 3-4 semaines de traitement pour les différents groupes étudiés.

Figure 7 : Pression artérielle systolique

Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0

50

100

150

200

250

300

†* †*

*

L-NAME

Pres

sion

arté

rielle

sys

toliq

ue (m

mH

g)

Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0

50

100

150

200

250

300

†* †*

*

L-NAME

Pres

sion

arté

rielle

sys

toliq

ue (m

mH

g)

Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,01 et vs témoins ; † p<0,01 vs L-NAME 5 mg/kg/jour

82

D- Créatinine sérique On constate une élévation marquée de la créatinine sérique chez les animaux L-NAME 100

mg/kg/jour lorsque comparé aux animaux témoins (66±4 μmol/l versus 39±2 μmol/l,

p<0.01). La créatinine sérique s’élève de façon similaire et atteint 71±4 μmol/l (p<0,001)

chez les animaux L-NAME 30 mg/kg/jour. Cependant, aucun changement significatif des

taux de créatinine sérique n’est détecté (40±1 μmol/l) chez les animaux L-NAME 5

mg/kg/jour pour cette période de traitement. La figure 8 illustre l’élévation de la créatinine

sérique après 3-4 semaines de traitement pour les différents groupes étudiés.

Figure 8 : Créatinémie

Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,01 vs témoins et L-NAME 5 mg/kg/jour

Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0

25

50

75

100

**

L-NAME

Cré

atin

ine

sériq

ue (u

mol

/l)

Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0

25

50

75

100

**

L-NAME

Cré

atin

ine

sériq

ue (u

mol

/l)

83

E- Protéinurie On constate une élévation significative de la protéinurie chez les animaux 100 mg/kg/jour

(87±11 mg/24h versus 21±2 mg/24h, p<0.01) comparativement aux animaux témoins. La

protéinurie s’élève de façon similaire et atteint 101±18 mg/24h (p<0,001) chez les animaux

L-NAME 30 mg/kg/jour. Cependant, aucun changement significatif de la protéinurie n’est

détecté (25±4 mg/24h) chez les animaux L-NAME 5 mg/kg/jour pour cette période de

traitement. La figure 9 illustre l’élévation de la protéinurie après 3-4 semaines de

traitement pour les différents groupes étudiés.

Figure 9 : Protéinurie

Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,01 vs témoins et L-NAME 5 mg/kg/jour

Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0

25

50

75

100

125

150

*

*

L-NAME

Prot

éinu

rie (m

g/24

h)

Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0

25

50

75

100

125

150

*

*

L-NAME

Prot

éinu

rie (m

g/24

h)

84

F- Histologie rénale Les images suivantes présentent l’analyse morphologique des coupes de cortex rénal

colorées au Trichrome de Masson. On remarque que les doses de 100 mg/kg/jour et 30

mg/kg/jour provoquent l’apparition de lésions tubulo-interstitielles et glomérulaires

importantes caractérisées par de l’atrophie tubulaire et de l’ischémie glomérulaire après 3-4

semaines de traitement. De plus, on note une déformation de la membrane basale et une

hypertrophie néointimale chez les animaux L-NAME (Figure 11). Les reins des animaux

L-NAME 5 mg/kg/jour ne montrent cependant pas de dommages vasculaires et rénaux

significatifs après 4 semaines de traitement.

Figure 10 : Analyse histopathologique du cortex rénal

(A) Témoins ; (B) L-NAME 5 mg/kg/jour ; (C) L-NAME 30 mg/kg/jour ; (D) L-NAME 100 mg/kg/jour. Grossissement 40X.

A

D C

B

85

Figure 11 : Analyse histopathologique de vaisseaux rénaux

(E) Témoins ; (F) L-NAME 5 mg/kg/jour ; (G) L-NAME 30 mg/kg/jour ; (H) L-NAME 100 mg/kg/jour. Grossissement 40X.

E

H G

F

86

4.5.2- Effets d’un bloqueur des récepteurs AT1 A- Excrétion urinaire des métabolites du NO

Le traitement avec le losartan prévient, en partie, la diminution excessive de l’excrétion

urinaire des métabolites du NO aux doses de 100 et 30 mg/kg/jour de L-NAME.

Cependant, à la dose de 5 mg/kg/jour de L-NAME, l’excrétion urinaire des métabolites du

NO demeure inchangée suite au traitement avec le losartan. Or, lorsque le traitement est

prolongé jusqu’à la 12e semaine, les taux de nitrates/nitrites diminuent de 80% si l’on

compare aux animaux témoins. Le losartan atténue la diminution exagérée de l’excrétion

urinaire des métabolites du NO à la fin de la période de traitement à la dose de 5

mg/kg/jour.

Figure 12 : Effet du losartan sur l’excrétion urinaire des NO2-/NO3

-

Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,001 vs témoins et ‡ p<0,05 vs L-NAME (4) 4 semaines de traitement (12) 12 semaines de traitement

L-NAME

L-NAME + losartan

100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0

25

50

75

100

125

150

**

*

‡

L-NAME

Nitr

ates

/Nitr

ites

(%)

TémoinsL-NAME

L-NAME + losartan

100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0

25

50

75

100

125

150

**

*

‡

L-NAME

Nitr

ates

/Nitr

ites

(%)

Témoins

87

B- Pression artérielle systolique Le traitement avec le losartan atténue de façon significative l’élévation de la PAS aux doses

de 100, 30 et 5 mg/kg/jour de L-NAME (175±3 mmHg, 168±3 mmHg et 144±2 mmHg,

p<0.001) après 3-4 semaines de traitement. On remarque également l’élévation modérée et

progressive de la PAS de la 4e semaine de traitement (165±3 mmHg) à la 12e semaine

(184±9 mmHg) chez les animaux L-NAME 5 mg/kg/jour. Le losartan atténue de façon

significative l’élévation de la PAS (148±6 mmHg) à la fin de la 12e semaine de traitement à

cette dose. Finalement, on constate que le losartan atténue de façon plus prononcée

l’élévation de la PAS lorsque la dose de L-NAME utilisée est faible.

Figure 13 : Effet du losartan sur la pression artérielle

Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,001 vs témoins et † p<0,001 vs L-NAME (4) 4 semaines de traitement (12) 12 semaines de traitement

100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)50

100

150

200

250

* *

*

*†

†

††

L-NAME

Pres

sion

Arté

rielle

(mm

Hg)

L-NAME

L-NAME + losartan

Témoins

100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)50

100

150

200

250

* *

*

*†

†

††

L-NAME

Pres

sion

Arté

rielle

(mm

Hg)

L-NAME

L-NAME + losartan

Témoins

88

C- Créatinine sérique Le traitement avec le losartan prévient l’élévation marquée de la créatinine sérique aux

doses de 100 et 30 mg/kg/jour de L-NAME (50±3 μmol/l et 57±2 μmol/l, p<0.05) après 3-4

semaines de traitement. Or, aucun changement dans les taux de créatinine sérique n’est

observé pour cette période de traitement à la dose de 5 mg/kg/jour de L-NAME.

Cependant, lorsque le traitement est prolongé jusqu’à la 12e semaine, la créatinine sérique

s’élève progressivement pour atteindre 55 μmol/l. Le losartan atténue l’élévation de la

créatinine sérique après 12 semaines de traitement, bien que de façon non significative.

Figure 14 : Effet du losartan sur la créatinine sérique

Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,05 vs témoins et † p<0,05 vs L-NAME (4) 4 semaines de traitement (12) 12 semaines de traitement

100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0

25

50

75

100

††

**

L-NAME

Cré

atin

ine

sériq

ue (u

mol

/l)

L-NAME

L-NAME + losartan

Témoins

100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0

25

50

75

100

††

**

L-NAME

Cré

atin

ine

sériq

ue (u

mol

/l)

L-NAME

L-NAME + losartan

Témoins

89

D- Protéinurie Le traitement avec le losartan prévient l’élévation de la protéinurie aux doses de 100 et 30

mg/kg/jour de L-NAME (46±6 mg/24h et 28±3 mg/24h, p<0.05) après 3-4 semaines de

traitement. Or, aucun changement dans la protéinurie n’est observé pour cette période de

traitement à la dose de 5 mg/kg/jour de L-NAME. Cependant, lorsque le traitement est

prolongé jusqu’à la 12e semaine, la protéinurie s’élève progressivement pour atteindre

78±23 mg/24h. Le losartan atténue l’élévation de la protéinurie après 12 semaines de

traitement lorsque comparé aux animaux témoins (27±5 mg/24h versus 26±4 mg/24h,

p<0.05).

Figure 15 : Effet du losartan sur la protéinurie

Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,05 vs témoins et † p<0,05 vs L-NAME (4) 4 semaines de traitement (12) 12 semaines de traitement

100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0

25

50

75

100

125

150

*

*

*

†

† †

L-NAME

Prot

éinu

rie (m

g/24

h)

L-NAME

L-NAME + losartan

Témoins

100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0

25

50

75

100

125

150

*

*

*

†

† †

L-NAME

Prot

éinu

rie (m

g/24

h)

L-NAME

L-NAME + losartan

Témoins

90

4.5.3- Effet du losartan sur l’histopathologie rénale Pour évaluer l’implication de l’AngII dans les altérations cardiovasculaires et rénales

induites par l’inhibition de la synthèse du NO, nous avons préparé des coupes histologiques

de cortex rénal colorées à la coloration au Trichrome de Masson. Les reins des animaux L-

NAME 100 et 30 mg/kg/jour présentent des dommages vasculaires et rénaux majeurs

similaires après 3-4 semaines de traitements (figure 16). Ceux-ci se caractérisent par de

l’atrophie tubulaire et de l’ischémie glomérulaire. De plus, on remarque de l’hypertrophie

néointimale. Pour la même période de traitement, les animaux L-NAME 5 mg/kg/jour

montrent des dommages vasculaires et rénaux mineurs. Or, lorsque le traitement est

prolongé jusqu’à 12 semaines, les dommages vasculaires et rénaux progressent et

ressemblent à ceux induits par les doses plus fortes de L-NAME (figure 17). Le traitement

avec le losartan prévient l’apparition des dommages vasculaires et rénaux aux différentes

doses de L-NAME.

91

Figure 16 : Effet du losartan sur les dommages vasculaires et rénaux

Figure 16 : Spécimens provenant de rats L-NAME 100 mg/kg/jour

Images histopathologiques de cortex rénaux avec coloration au Trichrome de Masson. Les dommages rénaux comprennent de l’atrophie tubulaire, de l’ischémie glomérulaire (gauche) et de l’hypertrophie néointimale (droite). Grossissement 40X. (A et B) Témoins ; (C et D) L-NAME 100 mg/kg/jour ; (E et F) L-NAME+losartan.

A

DC

B

FE

92

Figure 17 : Effet du losartan sur les dommages vasculaires et rénaux

Figure 17 : Spécimens provenant de rats L-NAME 5 mg/kg/jour après 12 semaines

Images histopathologiques de cortex rénaux avec coloration au Trichrome de Masson. Les dommages rénaux comprennent de l’atrophie tubulaire et de l’ischémie glomérulaire (haut) et de l’hypertrophie néointimale (bas). (A et C) L-NAME 5 mg/kg/jour ; (B et D) L-NAME+losartan. Grossissement de 40X.

A B

C D

93

DISCUSSION Ces travaux démontrent que l’inhibition chronique de la synthèse du NO chez le rat Harlan

Sprague Dawley (Hsd : SD) provoque l’augmentation de la PAS, confirmant le rôle majeur

du NO dans l’homéostasie de la pression artérielle. Nous avons également démontré que

l’inhibition chronique de la synthèse du NO est associée à une augmentation significative

de la créatinine sérique et de la protéinurie indiquant une insuffisance rénale. Or, le déclin

de la fonction rénale est associé à des dommages histologiques majeurs des petits

vaisseaux, des glomérules et des tubules. Ceux-ci se caractérisent par de l’inflammation

vasculaire et de l’hypertrophie néointimale et de l’ischémie glomérulaire et tubulaire. Par

ailleurs, l’hypertension et les lésions vasculaires et rénales se développent d’autant plus

rapidement que l’inhibition de la synthèse du NO est prononcée.

L’apparition des dommages vasculaires et rénaux chez le rat Harlan Sprague Dawley

contraste avec nos résultats précédents démontrant que le traitement des rats Charles River

Sprague Dawley avec le L-NAME cause une HTA sans dommages vasculaires et rénaux 36.

Il existerait donc une susceptibilité génétique au développement des dommages vasculaires

et rénaux associés à l’HTA induite par le L-NAME. En ce sens, Van Dokkum et al.37 ont

démontré que les rats Fawn Hooded (FHH), porteur des gènes Rf-1 et Rf-2 (pour renal

failure), développent des altérations rénales, structurelles et fonctionnelles, majeures si l’on

compare aux rats August&Copenhagen Irish (ACI). Par ailleurs, les rats F1, issus du

croisement des ces deux souches de rat, et qui sont hétérozygotes pour les gènes Rf-1 et Rf-

2, sont plus vulnérables aux dommages vasculaires et rénaux induits par le L-NAME que

les rats ACI, mais moins que les rats FHH. En accord avec nos résultats, Pollock et al.102

ont démontré que la réponse hypertensive induite par le L-NAME diffère chez les rats

Sprague Dawley obtenus de deux différents fournisseurs, soit en l’occurence Charles

Rivers et Harlan. En plus de présenter une pression artérielle basale supérieure, les rats

Harlan ont des taux de nitrates/nitrites urinaires inférieurs à ceux retrouvés chez les rats

Charles River, suggérant un défaut ou une altération dans la production du NO. Ainsi, il est

94

possible que la dysfonction endothéliale associée au traitement avec le L-NAME soit plus

importante chez le rat Harlan que chez le rat Charles River.

En condition physiologique normale, le NO joue un rôle crucial dans le maintien de la

pression artérielle. Il favorise la relaxation des fibres musculaires lisses 28 et maintient un

tonus vasculaire adéquat en s’opposant à l’effet vasoconstricteur de l’AngII et de l’ET-1 29.

Le NO empêche également la prolifération des cellules du muscle lisse 28. Confirmant le

rôle du NO dans l’homéostasie de la pression artérielle, les souris knock-out pour le gène de

la eNOS ont une pression artérielle élevée. Elles présentent également une hypertrophie

néointimale caractérisée par la prolifération et la migration de cellules musculaires lisses

vasculaires 35. Chez le rat Harlan Sprague Dawley, le traitement avec le L-NAME

augmente la pression artérielle en plus de causer une hypertrophie néointimale importante

et l’occlusion subséquente de certains petits vaisseaux. L’ischémie tissulaire qui s’ensuit

provoque la paralysie des membres inférieurs et le décès rapide des animaux, dû

probablement à des accidents vasculaires cérébraux. Au niveau rénal, l’inhibition de la

synthèse du NO et l’ischémie rénale réduisent le débit sanguin, le volume de filtration

glomérulaire et l’excrétion du sodium, contribuant ainsi à l’élévation de la pression

artérielle et au déclin de la fonction rénale 30.

Les effets pathophysiologiques de l’inhibition chronique de la synthèse du NO semblent

être associés à une sensibilité accrue à l’AngII 43. En effet, l’AngII provoque une puissante

vasoconstriction périphérique vasculaire et contribue à l’épaississement et à la rigidité

artérielle. L’AngII est également responsable, en partie, de la dysfonction endothéliale

causant l’hypertension 52. Or, le traitement avec le losartan atténue l’élévation de la PAS et

prévient l’apparition des dommages vasculaires et rénaux chez le rat Hsd : SD traités au L-

NAME. Dans le rein, l’AngII altère la fonction rénale en provoquant l’augmentation de la

résistance vasculaire rénale, l’élévation de la pression glomérulaire capillaire (PGC) et la

réduction du GFR. Ces effets observés lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO

sont médiés, en partie, par l’action de l’AngII puisque le traitement avec le losartan

prévient le déclin de la fonction rénale et les dommages vasculaires et rénaux induits par le

L-NAME 32,33.

95

Les effets pathophysiologiques de l’AngII peuvent également être modulés via

l’augmentation de la production de l’ET-168, des ROS 34 et du TGF-β 78. En effet, nous

avons observé l’augmentation de l’expression de l’ET-1 et du TGF-β dans les vaisseaux et

les reins d’animaux traités au L-NAME. Nous avons également observé une augmentation

des ROS dans la paroi des vaisseaux. Or, le traitement avec le losartan normalise

l’expression vasculaire et rénale de l’ET-1 et du TGF-β ainsi que le taux des ROS dans

l’aorte thoracique, confirmant l’implication majeure de l’AngII dans la production locale de

ces facteurs vasoactifs.

L’ET-1 jouerait non seulement un rôle dans les effets hémodynamique exercés par l’AngII,

mais contribuerait également à l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux.

Tout comme l’AngII, l’ET-1 induit la vasoconstriction, réduit le débit sanguin rénal,

participe à l’élévation de la protéinurie ainsi qu’à l’hypertrophie des cellules musculaires

lisses 67. Les ROS influencent, quant à eux, la signalisation cellulaire, l’expression de

gènes et stimulent les changements structuraux tels que la prolifération, l’hypertrophie et le

remodelage 85. De plus, ils contribuent à la dysfonction endothéliale en inactivant le NO 34.

Finalement, le TGF-β joue un rôle important dans l’action pro-fibrosante de plusieurs

peptides vasoconstricteurs, dont l’AngII et l’ET-1, et contribue ainsi à l’augmentation de la

résistance périphérique et à la progression de l’hypertension artérielle.

Or, malgré l’augmentation au niveau vasculaire et rénale de l’expression de l’ET-1, du

TGF-β et des ROS chez les animaux L-NAME, le traitement avec le LU135252, l’anticorps

1D11 et l’acide lipoïque n’ont eu aucun effet sur l’élévation de la PAS, de la créatinine

sérique, de la protéinurie et l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux.

Puisque le traitement avec le losartan prévient l’élévation de la production et de

l’expression de ces facteurs, l’AngII serait le facteur primaire responsable de l’élévation de

la pression artérielle et du déclin de la fonction rénale. Le blocage individuel de l’ET-1, du

TGF-β et des ROS ne serait donc pas suffisamment efficace pour contrer les actions

cardiovasculaires et rénales de l’AngII.

96

L’inefficacité du blocage des récepteurs ETA sur l’élévation de la pression artérielle peut

également s’expliquer par l’action accrue de l’AngII lors du traitement avec le L-NAME.

En effet, le NO pallie les effets constricteurs à la fois de l’ET-1 et ceux de l’AngII 81,103.

De plus, le blocage des récepteurs ETA détourne les effets de l’ET-1 sur le récepteur ETB,

mais puisque la synthèse du NO est inhibée, les effets bénéfiques du récepteurs ETB sur le

tonus vasculaire et la natriurèse77 ne peuvent avoir lieu.

Dans un autre ordre d’idées, nous avons démontré au laboratoire l’augmentation de

l’expression et de l’excrétion urinaire du TGF-β chez l’animal urémique par néphrectomie

5/6. Les dommages vasculaires et rénaux comprennent de l’hypertrophie vasculaire, de la

glomérulosclérose, de l’atrophie et de la dilatation tubulaire avec déposition de matrice

extracellulaire au niveau interstitiel. Les dommages vasculaires et rénaux observés chez le

rat Hsd : SD traité au L-NAME se caractérisent plutôt par de l’hypertrophie néointimale

avec oblitération complète de la lumière de certains vaisseaux causant de l’ischémie

glomérulaire et tubulaire. L’augmentation de l’expression et de l’excrétion urinaire du

TGF-β dans le modèle L-NAME pourrait résulter, en partie, de l’hypertension sévère et de

l’action accrue de l’AngII. Or, la même dose d’anticorps 1D11 utilisée chez l’animal

urémique ne procure aucun effet bénéfique chez le rat Hsd : SD traité au L-NAME. La

sévérité et la vitesse d’apparition des dommages vasculaires observés et qui sont typiques

chez le rat Hsd : SD limiteraient probablement l’influence du TGF-β dans cette souche de

rat. Kashiwagi et al.104 ont également démontré l’augmentation de l’expression et de

l’excrétion du TGF-β chez le rat Wistar traité au L-NAME (20-30 mg/kg/jour) pendant 12

semaines. Or, les dommages vasculaires, glomérulaires et tubulaires observés dans le rein

de cette souche ressemblent étrangement à ceux retrouvés chez l’animal urémique. En

utilisant une dose similaire de L-NAME chez les rats Hsd : SD, les animaux décèdent

rapidement en moins de 3 semaines, dû à des accidents vasculaires cérébraux résultant de

l’hypertrophie néointimale observée et de l’occlusion de certains petits vaisseaux. Dans ces

conditions, l’action pro-fibrosante du TGF-β pourrait ne pas avoir d’impact majeur sur

l’élévation de la pression artérielle et l’apparition des dommages vasculaires et rénaux.

97

Bien que l’impact du traitement avec l’acide α-lipoïque sur le stress oxydatif n’a pas été

directement mesuré dans ce protocole, les effets biologiques observés permettent de croire

que ses taux absolus n’influencent pas l’apparition de l’hypertension et les dommages

cardiovasculaires et rénaux. En effet, malgré l’augmentation des ROS dans l’aorte

thoracique, le traitement avec l’acide α-lipoïque n’a eu aucun effet sur l’élévation de la

PAS, le déclin de la fonction rénale et l’apparition des dommages cardiovasculaires et

rénaux, suggérant que la balance NO – ROS soit plus importante que leur niveau absolu 34.

À priori, l’acide α-lipoïque a été choisie parce qu’elle est un antioxydant puissant qui peut

traverser la membrane plasmique et qui a un effet protecteur sur d’autres antioxydants

endogènes dont la vitamine C et E 105. De plus, il a été démontré que l’acide α-lipoïque

atténue l’élévation de la PAS à des doses comparables utilisées chez les rats DOCA-sel 106,107 et SHR 108.

Nous avons vérifié l’effet du degré d’inhibition de la synthèse du NO sur la pression

artérielle et l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux chez le rat Hsd : SD

traité au L-NAME. Les doses de 100 et 30 mg/kg/jour de L-NAME diminuent les taux

urinaires de nitrates/nitrites de 95% et 91% comparativement aux animaux contrôles. Ils

augmentent la PAS, la créatinine sérique et la protéinurie. Ces animaux présentent des

lésions ischémiques rénales associées à des dommages vasculaires sévères, dont de

l’hypertrophie néointimale. On observe le décès des animaux en moins de 3-4 semaines,

probablement dû à des accidents vasculaires cérébraux. À la dose de 5 mg/kg/jour de

L-NAME, on observe une diminution de 15% de l’excrétion urinaire des nitrates/nitrites

après 4 semaines de traitement. Or, lorsque le traitement est prolongé jusqu’à la 12e

semaine, les taux de nitrates/nitrites diminuent de 80% si l’on compare aux animaux

témoins. Ces résultats peuvent être expliqués par l’étude de Ujiie et al.27 qui suggèrent que

le L-NAME inhibe l’activité de la eNOS à deux niveaux soit : (1) en inhibant directement

son activité, (2) en régulant à la baisse l’expression son ARNm. L’hypertension à la dose

de 5 mg/kg/jour se développe de façon plus modérée et les dommages cardiovasculaires et

rénaux apparaissent tardivement à 12 semaines. Le traitement avec le losartan prévient

l’augmentation de la pression artérielle, de la créatinine sérique, de la protéinurie et

prévient l’apparition des dommages vasculaires et rénaux aux différentes doses de

98

L-NAME utilisée. De plus, l’effet antihypertenseur du losartan est associé à une élévation

des taux de nitrates/nitrites urinaires, suggérant que le losartan ait un effet protecteur sur

l’activité de la eNOS ou bien qu’il empêche la formation excessive de ROS responsable de

l’inactivation du NO 45. Toutefois, puisque le losartan ne parvient pas à corriger totalement

la hausse de la pression artérielle, l’établissement de l’HTA pourrait également être

imputable à la diminution de la biodisponibilité du NO. L’équilibre entre la production du

NO et de l’AngII constituerait donc un aspect critique pour le maintien du tonus vasculaire

et de la fonction rénale. En ce sens, l’effet antihypertenseur du losartan est plus prononcé

lorsque le degré d’inhibition de la synthèse du NO est faible. De plus, une dose plus

élevée de losartan pourrait avoir un effet anti-hypertenseur plus efficace que la dose utilisée

dans cette étude.

99

CONCLUSION

En conclusion, cette étude démontre l’importance du NO dans le maintien tonus vasculaire

et de la fonction rénale. L’inhibition chronique de la synthèse du NO chez le rat Hsd : SD

cause une hypertension sévère et des dommages cardiovasculaires et rénaux majeurs qui

dépendent du degré d’inhibition. Ces effets pathophysiologiques sont causés en partie par

l’action de l’AngII qui module la production d’ET-1, du TGF-β et des ROS. Cependant, le

blocage seul de ces facteurs ne parvient pas à freiner l’élévation de la PAS, le déclin de la

fonction rénale et l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux lorsque la

synthèse du NO est inhibée à forte dose (100 mg/kg/jour). Ces résultats démontrent

l’importance de facteurs vasoactifs majeurs tels que l’AngII et le NO dans le modèle L-

NAME.

100

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