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UE 6 – Immunologie Vendredi 22/02/2019 de 14h à 16h Ronéotypeur : Lola Conti / Ilana Benfredj Ronéoficheur : Lola Conti / Ilana Benfredj

ED 2 Exploration des réponses immunitaires

! sur 10 1Ronéo 5 – UE6 – TD 2 – Ronéo

Sommaire

Rappel I. L’hémogramme

II. Exploration de la réponse immunitaire inée

1. Exploration du complément

2. Exploration des NK a) étude quantitative b) étude fonctionnelle

III. Exploration de la réponse immunitaire adaptative

1. Cytométrie en flux

2. Exploration de la voie humorale a) in vitro b) in vivo

3. Exploration de la voie cellulaire a) in vitro b) in vivo

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Ronéo 6 – UE6 – TD 2 – Ronéo

Le but de l’ED est de connaître les méthodes d’exploration du système immunitaire en pratique clinique.

Rappels :

Une brèche au niveau de la peau va activer les macrophages résidents et les PN, responsables de la phagocytose et du recrutement d’autres cellules qui arrivent par diapédèse, ces cellules de l’immunité innée agissent en association avec le système du complément. Ces cellules phagocytaires vont laisser, au cours de leur action, des corps apoptotiques/Ag reconnus par la cellule dendritique (permettant le lien entre immunité innée et adaptative) qui lie ainsi l’Ag à son CMH. En fonction du CMH, la cellule dendritique va soit activer les lymphocytes T soit les lymphocytes B, qui vont à leur tour se transformer en lymphocytes mémoires ou effecteurs .Les lymphocytes T vont avoir une action d’immunité directe via les lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (ils agissent directement sur la cellule cible à évincer) tandis que les lymphocytes CD4+ ont un rôle de coordination et de régulation d’activation des lymphocytes B. Les lymphocytes B vont agir ultérieurement via la production d’anticorps (après s’être différencié en plasmocytes). Enfin, l’action directe des anticorps va permettre de mettre en jeu d’autres cellules de l’immunité innée. Ceci permet donc une amplification de la réponse immunitaire. Tout ceci est coordonné par les cytokines en fonction du signal initial.

I. L’hémogramme

L’hémogramme est le premier examen à faire pour mettre en évidence une éventuelle dysfonction immunitaire. Il permet d’avoir une quantification des différentes lignées cellulaires de l’immunité innée ET cellulaire.

II. Les différentes explorations de la réponse immunitaire innée

Les différents éléments de l’immunité innée sont : - Les phagocytes (PNN, monocytes) qui peuvent être explorés par la NFS (hémogramme) - Les cellules NK qui peuvent être explorées par immunophénotypage - Les cellules dendritiques : ne sont pas explorées en clinique - Le système du complément qui peut être exploré par un dosage des différentes unités le composant - Les cytokines (interféron)

L’exploration comprend systématiquement quantité et qualité.

1. Exploration du complément

Pour rappel, le complément comprend 3 voies : voie classique (activée par un complexe immun Ag/Ac), voie alterne (activée par Ag) et voie des lectines, et ces voies aboutissent à la formation d’un complexe d’attaque membranaire permettant la lyse des cellules infectées en les perforant.

➢ Exploration quantitative : on peut en effet doser les fractions du complément en quantité. En routine on peut doser C3 et C4 par dosage sanguin. Un taux abaissé des protéines du complément signe une consommation ou un déficit (hémopathies, hémolyse d’anticorps froid

• Leucocytes : 4000 – 10000 /mm3 • Polynucléaires neutrophiles : 1700 – 7000 • Polynucléaires eosinophiles : 50 – 500 • Polynucléaires basophiles : 0 – 50 • Lymphocytes : 1500 – 4000 • Monocytes : 100 – 1000


etc..), un taux augmenté est retrouvé lors d’inflammation.

➢ Exploration fonctionnelle : pour explorer la fonction du complément on va l’activer et mesurer son action c’est à dire le complexe d’attaque, la lyse. Mesure du complément hémolytique CH50 correspond à la mesure de l'activité fonctionnelle de la voie classique et alterne du complément. Cette exploration revient à mesurer le taux de lyse engendré par l’action du complément. Cela revient à mesurer le taux de Hémoglobine libérée (marqueur de la lyse des globules rouges) dans le sérum. On va prendre en pratique des GR de moutons qu’on va mettre dans un sérum de mouton pour former des complexes immuns (Ag/Ac) chargés de l’activation de la voie classique. On met ces complexes immuns avec le sérum du patient et on regarde si les GR sont lysés en mesurant l’Hb libéré par la lyse. On veut identifier la quantité minimum de sérum qui permet de détruire 50% des globules rouges (DO = densité optique). Pour la voie alterne (activée par Ag) on utilise des GR de lapin qu’on introduit simplement dans le sérum du sujet. Plus le taux de CH50 est élevé, plus les GR sont lysés et donc plus la voie du complément est efficace.

L’augmentation de l’activité du complément signe un processus inflammatoire et la diminution de l’activité du complément signe une consommation ou un déficit de ce système.

2. Exploration des cellules NK

Rappel : la cellule NK lyse les cellules qui ne portent pas de CMHI et sécrète des cytokines.

a) Etude quantitative : la cytométrie en flux

L’exploration des cellules NK se fait par le biais de la cytométrie en flux. A la surface des cellules existent des cluster de différenciation et des antigène de surface. Ces cluster/antigènes de surface sont reconnus par des anticorps spécifiques. Les protéines/antigènes de surface du NK connues sont les CD16 et CD56. Ce sont donc des cibles pour la cytométrie. On prend les cellules du sang, on les incube avec des Ac spécifiques des déterminants antigéniques qu’on veut étudier : pour le NK, CD16 (récepteur à la fraction constante de l’IgG) et CD56, qui sont couplés à un fluorochrome qui est une substance anorganique qui émet de la lumière naturelle, surtout si elle est excitée par un laser, cette lumière est captée par des capteurs dans un cytomètre, grâce à un système fluidique il fait en sorte que les cellules passent une à une devant les lasers (différents lasers de différentes couleurs), puis des capteurs vont capter la lumière émise et vont la transformer en un signal électrique, matérialisé sous la forme d’un histogramme (même principe qu’un potentiel d’action).

C’est à partir de ce graphique qu’on va pouvoir analyser les caractéristiques des cellules cibles. Ici, les pointillés représentent les cellules NK mesurées par le cytomètre. On a en abscisse le taux de CD16 et en ordonnée celui de CD56. .Le cercle avec des pointillés le plus à gauche représente un groupe de cellule exprimant fortement le CD56 (CD56 + et CD16 -). Celui à droite représente un groupe de cellules exprimant CD56 et CD16 (CD56 + et CD16+). Plus l’amas de pointillé est dense, plus il y a de cellules. Ainsi la cytométrie en flux permet de compter les cellules et de les caractériser.

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b) Etude fonctionnelle : mesure de la cytotoxicité

L’étude fonctionnelle des NK consiste à mesurer la cytotoxicité par relarguage de Chrome radioactif. On marque des cellules cibles (qui interagissent avec les cellules NK) avec du

Na2

51CrO

4. . On ajoute les cellules NK (également réalisable avec les LT cd8 cytotoxiques) aux

cellules cibles marquées. Les cellules tuées (par les NK) vont libérer du chrome radioactif. La radioactivité mesurée est proportionnelle au nombre de cellules détruites.

III. Les différentes explorations de l’immunité adaptative

Rappel de l’ontogenèse : Dans la moelle osseuse il y'a des cellules souches hématopoïétiques. Ce sont les progéniteurs communs naïfs des lymphoïdes : LT et LB. Ils vont sortir de la moelle et passer par le thymus pour les LT où ils maturent pour ensuite rejoindre les organes lymphoïdes secondaires (MALT, ganglions, rate, muqueuses digestives…) Quant aux LB ils maturent dans la moelle osseuse et ils rejoignent directement organes lymphoïdes secondaires. C’est ici qu’ils deviennent fonctionnels et donc matures.

Comme pour l’immunité innée, la NFS est le premier examen quantitatif à réaliser. La NFS peut mettre en évidence une lymphopénie ou une lymphocytose. Néanmoins elle ne nous renseigne pas sur les caractéristiques qualitatives de l’anomalie.

Voici les différents tests qu’on peut faire pour explorer l’activité et les caractéristiques des lymphocytes : • L’hémogramme/NFS • Pour les lymphocytes B : - On peut mesurer la production d’Anticorps - On peut faire une cytométrie en flux : Immunophénotypage des lymphocytes B et T (lesquels sont CD4+ lesquels sont CD8+) / en exploitant des marqueurs d’activation lymphocytaire spécifiques ou des marqueurs spécifiques aux cellules naïves et d’autres aux cellules mémoires. • Pour les lymphocytes T : - On va surtout explorer leur prolifération et leur cytotoxicité. - On procède à des tests fonctionnels afin d’évaluer leurs capacités de prolifération et de production

de cytokines. On va aussi faire des tests de cytotoxicité (à l’image de ceux décrits précédemment pour les NK) et des tests mesurant la production d’Ac (mais plus spécifique à l’étude les LB)

1. La cytométrie en flux : exploration générale

Expliqué précédemment, même principe, la prof a dit que c’était pas important à retenir

Avant de placer les cellules dans le cytomètre, on les isole. Pour cela, on récupère un culot de sang qu’on centrifuge sur un milieu de densité Ficoll-Hypaque. La centrifugation et le Ficoll permettent de créer des gradients de densité. On récupère l’anneau cellulaire contenant monocytes et lymphocytes.

Ensuite, on place les lymphocytes et monocytes dans le cytomètre. Cet examen va permettre de les classer en fonction de leurs tailles et de leurs granulations. On différencie lors de cette première étape les lymphocytes des monocytes/polynucléaires. Puis, on différencie les lymphocytes entre eux par la fluorescence qu’ils émettent (selon le marqueur lié à l’anticorps spécifique de l’ antigène de surface).

Exemple : on commence par classer les différentes cellules en fonction de leur antigène de surface CD3 / CD19 (1). Les cellules CD3 + sont les lymphocytes T et celles CD 19+ sont les lymphocytes B.


Puis, on procède au ciblage de la cassette. On paramètre le cytomètre afin de ne pouvoir étudier que les CD3+ : c’est le ciblage de la cellule d’intérêt. On souhaite distinguer les CD3+ ayant l’antigène de surface CD8 à celles ayant CD4 (2). Cela met en évidence les deux populations de lymphocytes T : les LT CD4+ e les LT CD8+.

Grâce à la cytométrie en flux on peut évaluer la proportion de chaque type lymphocytaire:

•Lymphocytes T: CD3+: 50 - 80% 900 – 3000/mm3

• Ly T4: CD3+ CD4+: 32 - 52% 450 – 1500/mm3

• Ly T8: CD3+ CD8+: 20 – 40% 300 – 1000/mm3

• Lymphocytes B: CD19+: 5 – 20% 100 – 450/mm3

2. Exploration de l’immunité humorale

a) Les explorations in vitro

• La cytométrie en flux détermine le nombre de lymphocytes B mais aussi le type de lymphocyte. Or selon leur niveau de différenciation, les LB perdent ou acquièrent des marqueurs d’intérêt. On utilise donc ces marqueurs de surface en cytométrie afin de distinguer les différentes populations:

- LB naïfs: CD27-/ IgM+/ IgD+ - LB mémoire avant commutation: CD27+/IgM+/IgD+ - LB mémoire après commutation: CD27+/IgM-/IgD-

• L’éléctrophorèse des protéines plasmatiques (EPP) permet de doser les Ig sériques. Sur l’électrophorèse on retrouve les groupes protéiques tel que l’albumine, l’alpha 1, l’alpha 2, beta 1, beta 2 globuline et les gammaglobulines. Les gammaglobulines correspondent aux anticorps(=immunoglobuline).

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EPP : Ici, on a une EPP anormale avec une quantité de gamma diminuée. Un aspect monoclonal est une epp marquant un pic sur une des ces gammaglobuline (IgA OU IgM OU IgG). Un aspect polyclonal marque une élévation globale de ces gammaglobulines On fait une EPP lors de : hyperprotidémie, (ex: anémie normocytaire avec hyprotidémie => myélome) ,suspicion de déficit immunitaire (infections à répétition),infection chronique (bilan d’hypergammaglobunémie),etc.. chaque pic correspond à un type de protéine. Le premier pic correspond à l’albumine, c’est la plus grosse protéine et majoritaire du sang. Le pic est grand et étroit. Plus le pic est haut plus la protéine est représentée dans le sang. Plus il est étroit et moins il y a de diversité. 2ème pic correspond à alpha 1, le 3eme alpha 2, le 4eme

beta, le 5 eme gamma (il est plat car il y a des ig de poids très différents et plusieurs types car elles ont des structures différentes).

• Dosage des Immunoglobulines : on peut doser les classes d’ Ig (IgM, IgG, IgA) et leurs sous classes uniquement s’il existe une anomalie du nombre d’immunoglobuline. (ex : hypergammaglobunémie à IgM + adénopathies + hyperprotidémie => maladie de Waldenstrom (lymphome)/ myélome à hypergammaglobunémie IgA/IgG)

b) Les explorations in vivo : la réponse vaccinale

La réponse vaccinale permet d’évaluer la capacité à produire des anticorps. On injecte un pathogène (diphtérie haemophilus pneumocoque tétanos..) et on vérifie qu’il y a production d’anticorps. On procède donc à la comparaison entre la sérologie pré-vaccinale et la sérologie post vaccinale. La réponse vaccinale permet ainsi de savoir si l’organisme peut fournir une réponse adaptée lors de la présence d’un pathogène. C’est un test fonctionnel.

3. Exploration de l’immunité humorale

a) Exploration in vitro

Immunophénotypage/cytométrie en flux : (même principe que précédemment ..) • phénotypage lymphocytaire T: CD3, CD4, CD8 • marqueurs d’activation lymphocytaire: HLA-DR • marqueur de différenciation • LT naïfs: CD45RA+/CD62L+ • LT central mémoire: CD45RA- ou RO+/CD62L+ • LT effecteur mémoire: CD45RA- ou RO+/

CD62L- • LT revertant: CD45RA+ ou RO-/CD62L- Utilisé ++ pour le VIH : L’immunophénotypage est un marqueur de la profondeur de la maladie (car le VIH touche les LTCD4+ et induit une immunodépression) mais aussi de l’efficacité des traitements (avec correction des taux de CD4+ au cours du traitement). Aussi utilisé en suivi post thérapeutique chez un patient immunodéprimé

• Étude de la prolifération : le principe de cette étude est d’introduire des inducteurs de prolifération en présence de lymphocytes. Si on introduit des mitogènes, la prolifération sera polyclonale (= non spécifique et globale) Si on introduit des activateurs spécifiques, la prolifération sera spécifique cad orientée....

Exemple de mitogène : phytohémagglutinine ou PHA: lymphocytes T Concanavaline ou ConA lymphocytes T pokeweed mitogen ou PWM: lymphocytes T (et B) Exemple d’activateurs spécifiques : Antigène de vaccination: tuberculine, anatoxine tétanique /antigène de l’environnement: streptocoque, CMV


Plusieurs méthodes : (avec présence d’activateurs de la prolifération) - la méthode par incorporation de thymidine tritiée (radioactive), on place de la thymidine

(nécessaire à la production d’ADN) dans le milieu. Celle-ci est ensuite incorporée dans les cellules lors de leur prolifération. Comme la thymidine est radioactive on peut réaliser un comptage de cette radioactivité et mettre en évidence la prolifération des cellules. Le résultat du test s’exprime en cpm et en index de stimulation (cpm test/cpm control négatif) par rapport à sujets sains témoins. (peu réalisé en pratique clinique)

- la méthode de la cytométrie en flux après marquage à la CFSE.On incorpore le marqueur CFSE fluorescent dans le milieu où sont les cellules. Le CFSE a la particularité de rentrer dans le cytoplasme. Ainsi, lors de la division cellulaire, le CFSE (donc la fluorescence) réduit car se répartit dans les nouvelles cellules produites. Donc, à chaque division cellulaire, la fluorescence diminue de moitié dans chaque cellule fille.

• Mesure des capacités de production de cytokines : (rappel :l’orientation du type de réponse immunitaire est en fonction de l’environnement cytokinique et de la cellule cible).

Technique :

1ere technique : on active les cellules productrices de cytokines qu’on a mises en culture , on récolte le surnageant de culture après 24 à 48h puis : on procède à un dosage immunoenzymatique = DOSAGE ELISA ou une cytométrie en flux du surnageant afin de d’évaluer la quantité de cytokines produites. Explication du schéma (test elisa) : On prélève le sérum contenant les cytokines (après activation des cellules). On ajoute dans le sérum les anticorps spécifique à la cytokine d’intérêt et des anticorps secondaires (conjugués à une enzyme) qui vont se fixer à l‘anticorps de la cytokine. Enfin, on ajoute un substrat qui va réagir avec l’enzyme de l’anticorps secondaire. Cette réaction entraine une coloration des puits. L’intensité de couleur des puits est le reflet de la quantité d’anticorps secondaire qui s’est fixée aux anticorps de la cytokine, donc, indirectement, le reflet de la quantité de cytokines.

2eme technique : ELISPOT on fixe dans un puit des anticorps spécifiques aux cytokines qu’on étudie. On place les cellules productrices de cytokines dans ce même puit. On introduit des molécules (peptides de 9 aa pr les LT CD8+ spécifiques/ Ag ou peptides de 20 aa pr les LT CD4+ spécifiques) qui vont stimuler les cellules productrices. Ces cellules vont donc produire des cytokines qui, une fois relarguées, vont être captées par les anticorps. Enfin on ajoute un réactif qui reconnaît le complexe cytokine/anticorps et va permettre de le colorer : formation de spot colorés qu'on va pouvoir compter (petits points sur le shéma) Exemple : quantification de la réponse des LT (en mesurant le taux d’IFNγ produit) après stimulation

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Production de cytokines

Activation de cellules en culture (non spécifique ou spécifique)

Récolte du surnageant de culture après 24-48h

Dosage ELISA ou en CMF

Autre technique : le quantiféron, on prend des cellules qu’on les met en contact avec des germes de la tuberculose. Puis, on regarde s’il y a une production d’INFg. S’il y a production cela signifie que l’organisme a déjà été en contact avec la tuberculose (donc qu’il est probablement infecté). Cette technique est une méthode diagnostic pour les individus asymptomatique de la tuberculose. (issu de la ronéo de l’année dernière)

b) Explorations in vivo

• Hypersensibilité retardée avec l'exemple du test à la tuberculine (spécifique à l'immunité cellulaire) Injection intra-dermique de tuberculine (extrait de Mycobactérium tuberculosis) 72h après, on étudie la réponse locale si papule rouge indurée à : - <5mm: réaction négative: réaction normale si pas de

contact antérieur avec BK ou BCG OU déficit immunitaire si contact antérieur

- >5mm: réaction positive: contact antérieur phlycténulaire ou nécrotique: suspicion d’infection

On complète le test par un quantiféron (vu au dessus) et par étude histologique (biopsie) : si présence de nombreux macrophages monocytes et de lymphocytes T = granulome.


dédicace à nos deux seules autres potes elles se reconnaîtront (nd)

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