LE POLYNUCLEAIRE NEUTROPHILE...en macrophages résidents dans les tissus qui possèdent des...

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LE POLYNUCLEAIRE NEUTROPHILE Jamel El Benna INSERM U1149, CNRS ERL8250, Centre de Recherche sur l’Inflammation (CRI) CHU Xavier Bichat, Université Paris7 Paris, France

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LE POLYNUCLEAIRE NEUTROPHILE Jamel El Benna

INSERM U1149, CNRS ERL8250, Centre de Recherche sur

l’Inflammation (CRI) CHU Xavier Bichat, Université Paris7

Paris, France

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DIFFERENTS TYPES DE REPONSES IMMUNITAIRES Naturelle = innée Adaptative Non spécifique Spécifique

2 3

2

1 1

3 ....

Barrière cutanéo-muqueuse Substances bactéricides pH Equilibre de la flore Interférons Syst. Complément Phagocytes (PN, Monoc…) Cellules NK Cellules dendritiques

Quelques jours Possède une mémoire

+efficace lors du 2ème contact (base des vaccinations)

Lymphos T Lymphos B Anticorps

Immédiate

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DECOUVERTE DES PHAGOCYTES ET DE L’INFLAMMATION

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•  WHITE BLOOD CELLS

neutrophil eosinophil basophil

monocyte lymphocyte

Granulocytes

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Polynucléaires neutrophiles: Cellules à granulations neutro, Noyau polylobé, les 1ères à migrer du sang vers le foyer inflammatoire, Action rapide, phagocytaire, tueuse (bactéries à x extracellulaire, champignons), produisent des médiateurs de l’inflammation, ½ vie courte.

Monocytes: Cellules mononucléées, Noyau en U, 2ème ligne de défense, tuent bactéries à x intracellulaire, produisent de nombreuses cytokines et médiateurs de l’inflammation, C. Présentatrices d’Ag, se transforment en macrophages résidents dans les tissus qui possèdent des caractères dépendants du microenvironnement.

Cellules Natural Killer: Non phagocytaires, Tuent des cellules infectées et malignes (“soi altéré”). Cellules de veille anti-tumorale. Secrètent IFN-g, TNF-a.

Quelques cellules de l’Immunité Innée

Mais aussi poly éosino: anti parasite, poly baso: allergie

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7

Myéloblaste Myélocyte Métamyélocyte Granulocyte

S A N G

0

6

4

2

8

Zon

e m

argi

nale

Myélocyte Métamyélocyte Granulocyte

S A N G

Moelle osseuse

0

6

4

2

8

Zon

e m

argi

nale PM

N X

10 7

Myélocyte Métamyélocyte Granulocyte

S A N G

0 10 5

0

6

4

2

8

Zon

e m

argi

nale

Myéloblaste Myélocyte Métamyélocyte Granulocyte

S A N G

0

6

4

2

8

Zon

e m

argi

nale

Promyélocyte Myélocyte Métamyélocyte Polynucléaire

neutrophile

PN/1

07 /Kg/

h PRODUCTION DES PN OU GRANULOPOIESE

Jours

Pool Tissulaire

Jours?

Heures

2% 5% 12% 22% 20%

10

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LE POLYNUCLEAIRE NEUTROPHILE (PN ou PMN)

- 60-70% des globules blancs (ou leucocytes) - 3000-7000 PN/µl de sang

- Cellule à demi-vie courte (<10 heures dans le sang et <5 jours dans les tissus)

- Au microscope optique: noyau polylobé, cytoplasme granuleux:

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LE POLYNUCLEAIRE NEUTROPHILE (PN): Au microscope électronique:

pg:granules primaires ou azurophiles sg:granules secondaires ou spécifiques

N:noyau; ce: centriole, m:mitochondrie

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CONTENU DES GRANULATIONS DU PN

Azurophiles Spécifiques/Gelatinases

Secrétoires

Myéloperoxydase Lysozyme BPI Défensines α

Elastase Cathepsine G PR3

Cyt-b 558/Rap1a

Lysozyme Collagénases

Gélatinase

Récepteurs: fMLP-R CR3 (CD11b/CD18)

Récepteurs: CR1

CR3 (CD11b/CD18)

Hydrolases acides

Fibronectine-R

Cytokines

TNF-R

Lactoferrine

H+-ATPase Mb

Gélatinase hCAP18

M a t r i c e

PR3 Azurocidine Phosphatase alcaline

Azurocidine

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LES FONCTIONS DES NEUTROPHILES

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II- Les différentes fonctions des neutrophiles:

1- Adhérence

2-Chimiotactisme ou migration tissulaire

3-Phagocytose

4-Production des Formes réactives de l’Oxygène (FRO/ROS)

5-Dégranulation ou libération des enzymes et des peptides

6-Libération des NETs (Neutrophil Extracellular Traps)

7-Synthèse et libération de cytokines

8- Apoptose, Nécrose, Netose.

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Soehnlein, Blood2009

Les PN sont les premières cellules à migrer de la circulation au niveau du site inflammatoire

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endothélium

Gradient de substances chimioattractantes

Tissus

IL-8 C5a,LTB4 PAF,fMLP

Flux sanguin

Sang(PN60%)

Le polynucléaire neutrophile: De l’état « repos » à l’activation

FMLP: Formyl-Met-Leu-Phe PAF: Platelets Activating Factor LTB4: leukotriène B4 C5a: Facteur 5 du complément IL-8: Interleukine 8

1)-Adhérence PN-C.Endothéliale

2)-Migration

3)-Phagocytose Agent pathogène

0)-Repos

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MIGRATION TRANS-ENDOTHELIALE DES PN

Roulement liaison de forte affinité

IL- 1, IL-17, TNF, LPS....

IL- 8 PAF

L- Sélectine: PN

E et P- Sélectines: Endothélium

CD11b/CD18

FOYER INFLAMMATOIRE

L-sélectine soluble

L-Sélectine

Gradient de chimioattractants

Sialyl-LeX

ICAM

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PN

Matrice extra-cellulaire

CIBLES

GRADIENT DE CHIMIOATTRACTANTS C5a, LTB4, PAF, fMLP, IL-8….

Adhérence et Chimiotactisme

Migration orientée du PN vers sa cible

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PRINCIPAUX FACTEURS CHIMIOATTRACTANTS

•  Peptides signaux des protéines bactériennes: N-formyl-peptides : fMLP

•  C5a produit par activation du complément •  Médiateurs produits par les cellules du foyer inflammatoire:

- PAF (PN, monocytes, C. endothéliales,) - Leucotriène B4 (PN, monocytes, mastocytes) - Chimiokines : IL-8, GRO, NAP-2..

(PN, mono/macroφ, CE, fibroblastes, lymphocytes...

amplification de la migration phagocytaire

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LA PHAGOCYTOSE: !Différentes étapes de la phagocytose!

1-Reconnaissance et attachement! 2-Englobement de la particule!

3-Fusion des lysosomes avec le phagosome : formation du

phagolysosome!4-Bactericidie et digestion du

microorganisme!

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Reconnaissance de l’agent pathogène par les neutrophiles pivôt de l’immunité innée

II-1 Pattern Recognition Receptors = PRR: récepteurs de reconnaissance de •  Motifs d’agents pathogènes conservés au cours de l ’évolution: Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) •  Signaux de dangers émis par cellules endogènes stressées ou abimées (DAMPS)

Ex: TLR4 = B. gram-, LPS, Mycobacterium tuberculosis, glycolipides TLR2 = B. gram+, mycobactéries,

lipoarabinomannan, lipoteichoic acid, lipoprotéines, glycolipides, HSP60, zymosan, c. nécrotiques

II-1

Par ex:

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RECONNAISSANCE DES PAMPS ET DAMPS PAR LES « TOLL-LIKE-RÉCEPTORS » ET « NOD-LIKE RECEPTORS »

Signalisation Activation de kinases Synthèse de cytokines

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ADHÉRENCE FACILITÉE PAR LES OPSONINES

A- Les Immunoglobulines de classe G (IgG1 et IgG 3)

B Fc

Fc γ RI Fc γ RII, Fc γ RIII

B C3b C3bi

CR1

CR3= CD11b/CD18

B- Les protéines dérivés du C3 du Complément

CR3

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III- ADHERENCE ET ENGLOBEMENT

CIBLE IgG 1 et 3

C3bi C3b

PAMPS et TLR

Adhérence Signalisation •  Englobement •  Fin de la dégranulation •  Activation des fonctions effectrices

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PHAGOCYTOSE ET BACTERICIDIE

LPS ********* ******* ****** ***** **** *** ** *

Bactéries

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ACTIVITÉ TUEUSE (OU BACTÉRICIDIE):

I)-Reconnaissance et Englobement de la cible: TLR, IgG, C3b et C3bi II)-Activité Bactéricide (Avant 2004):

1-dépendante de l’Oxygène: (FRO/ROS) 2-Indépendante de l’Oxygène: pH acide, Lyzosyme, Protéases, Peptides

toxiques…

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DESTRUCTION DE L’AGENT PATHOGENE

1- Phénomènes indépendants de l’oxygène A- Dégranulation dans le phagosome

Peptides cationiques à activité bactéricide: - BPI : (bactericidal/ permeability increasing protein) - Défensines α (HNP 1-4) -Azurocidine -Cathelicidine (LL37)

B- Dégranulation à la membrane expression des récepteurs (fMLP, CD11b/CD18)

Enzymes glycolytiques et protéolytiques - Lysosyme - Sérine protéases (élastase, PR3, cathepsine G..)

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Principales protéines microbicides des granules!

Lysozyme (primary and secondary granules): !!Hydrolyze peptidoglycan of bacteria cell wall.!

Phospholipase A2 (primary granule): !!Hybrolyze phospholipids in bacteria membrane.!!!

BPI (bactericidal permeability-increasing protein, primary granule): !!Disrupt bacterial membrane.!

Defensins (primary granule):!!Disrupt bacterial membrane.!

Serprocidins (primary granule, a family of serine proteaes):!!Disrupt membrane and proteolysis.!

Lactoferrin (Secondary granule): Chelate iron !

Components of the primary granules are released into the infection site by degranulation.!

cathelicidin (Secondary granule): antibiotic protein !

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PRODUCTION DES FORMES RÉACTIVES DE L’OXYGÈNE

(FRO OU ROS) PAR LES NEUTROPHILES

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Après assemblage, la NADPH-oxydase est accessible aux substrats des deux versants de la membrane : au NADPH par son versant cytosolique et à l’oxygène moléculaire par son versant externe.

phagocytosis

Oxidative burst

La phagocytose déclenche l’activation de la NADPH-oxydase!

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O2 O.-2 H2O2 HOCl

OH. 1O2

NADPH Oxydase

(SOD ou) Spontanée en+H+ MPO

NADPH NADP - + H + Fe2+ / Cu2+

LES FORMES REACTIVES DE L’OXYGENE (FRO)

O.-2 anion superoxyde; H2O2 péroxyde d’hydrogène ou eau oxygénée; OH.radical hydroxyl; HOCl

acide hypochloreux; 1O2 oxygène singulet, SOD superoxyde dismutase, MPO myélopéroxydase

Les radicaux libres: atomes ou molécules ayant un électron non apparié ou célibataire

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Guanosine 8-hydroxy 2-deoxyguanosine

ADN

Mutation génétique

Altération de l’expression génique

PROTEINES

Oxydation des protéines

Altération des activités enzymatiques

LIPIDES

Peroxydation lipidique

Altération de la fonction membranaire

INFLAMMATION NON CONTROLEE/TRANSFORMATION/APOPTOSE/… (BACTERICIDIE/SIGNALISATION)

Une production excessive où inappropriée de ROS peut entraîner des dommages tissulaires

•OH

N

NHN

N

O

NH2O

OH HHH

H H

HOCH2 N

NHN

N

O

NH2O

OH HHH

H H

HOCH2

HO

•OH

N

NHN

N

O

NH2O

OH HHH

H H

HOCH2N

NHN

N

O

NH2O

OH HHH

H H

HOCH2 N

NHN

N

O

NH2O

OH HHH

H H

HOCH2N

NHN

N

O

NH2O

OH HHH

H H

HOCH2

HO

R-SH

ROS

R-SOHAcide sufénique

(réversible)

R-SO2H

Acide sufinique(irréversible)

R-S-S-RPont disulfure

(réversible)

ROSROS

• -CH2- + OH• à -CH- + H2O

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LA NADPH OXYDASE DES PHAGOCYTES / NOX2

L’explosion oxydative

FAD

2e-

NOX2/gp91phox p22phox

NADPH

p40phoxRac2

p67phox p47phoxppp

p pp

pp

2 O2 2O2°-

NOX2 phagocytaire:

EXPRESSION DE NOX2:

P. Eosinophiles > Neutrophiles > Monocytes > Macrophages > C.Dendritiques

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Rac GDP

Rho GDI

p47-phox p67-phox

p40-phox

gp91PHOX/ NOX2

R

cytosol

p22PHOX

Membrane Stimulus

p p p

p p

p

p47PHOX

p67PHOX p40PHOX

Rac GTP

p p p

p

O2 O2.-

NADPH NADP+

Cytochrome b558

NADPH OXIDASE ACTIVATION

Fe Fe

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GRANULOMATOSE SEPTIQUE CHRONIQUE

Déficit immunitaire d’origine génétique des différents composants de la NADPH oxydase:

infections graves et/ou répétées à bactéries et champignons

Composant Transmission Fréquence affecté génétique

gp91phox X 65% p22 phox AR <5%

p47 phox AR 25% p67 phox AR 5%

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SIGNES CLINIQUES DE LA CGD Déficit immunitaire avec infections graves et/ou répétées à bactéries et champignons (S Aureus, P. aeruginosa , Salmonelle Serratia, Nocardia, Aspergillus..) . Abcès cutanés, hépatiques, pulmonaires, ostéomyélites . Lymphadénopathie, hépatomégalie, splénomégalie . Atteintes granulomateuses intestinales

ΔG : Déficit de production de l’O2° + Western Blot. Diagnostic génétique . Développement de lignées B-EBV déficitaires dans les composants de l’oxydase

Service d’immunologie biologique du CHU Bichat-Cl. Bernard Centre de référence de Diagnostic des dysfonctionnements

phagocytaires

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Neutrophil extracellular traps (NETs) kill bacteria. Brinkmann et al, Science 2004,303:1532.

Formation de NETs par les PN: les PN activés se désintègrent et émettent des filets extracellulaires qui piègent les bactéries et les

tuent: Moyen de défense post-mortem

Staph. Salm. Shig.

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Anti-Elastase Anti-ADN Anti-Histone-ADN

M. confocal

Anti-elastase marqué à l’or

Les filets capturent les bactéries et maintiennent une concentration élevée de protéines bactéricides libérées des granulations.

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INDUCTION DES NETS PAR LE LPS (marquage Elastase et ADN)

Kaplan et Radic, J.Immunol.2012

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Scanning electron micrograph of Shigella flexneri trapped in a NET

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.

Cytokines proinflammatoires TNFα, IL-1α et β, G-CSF, GM-CSF

TNF-related molecules CD95L, TRAIL

Anti-inflammatoires IL-1ra, TGFβ, TNF-Rs

Remodelage tissulaire VEGF, HGF, protéases…

Immunorégulation IL-12, IFNγ

Blys/BAFF

Chimiokines: PN, PE, PB monocytes C. dendritiques LT, LB, NK

LTB4, PAF..

Les monocytes/macroph (PN) régulent les réponses immunitaires innées et adaptatives: Production de cytokines et chimiokines

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BIBLIOGRAPHIE

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