DYNAMIQUE CHROMATINIENNE DANS LA RÉPARATION DE … · 2019-06-28 · La structure des chromosomes...

OLIVIER JOBIN-ROBITAILLE

DYNAMIQUE CHROMATINIENNE DANS LA RÉPARATION DE L’ADN

Analyse fonctionnelle du complexe histone acétyltransférase NuA4 dans la réparation des dommages à l’ADN

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)

DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE MÉDICALE FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

SEPTEMBRE 2005 © Olivier Jobin-Robitaille, 2005

RÉSUMÉ La cellule dispose de plusieurs mécanismes de réparation, nécessitant tous l'accès à l'ADN,

afin de prévenir les perturbations occasionnées par l'instabilité génomique. La structure des

chromosomes eucaryotes (chromatine) forme une barrière physique empêchant

l'accessibilité à l'ADN et ainsi les processus biologiques nucléaires tels la transcription,

réplication, recombinaison et réparation des dommages de l'ADN. Dans ce dernier

processus clé, certaines activités reconfigurant la chromatine pourraient donc s’avérer

essentiels en facilitant l’accès à la machinerie de réparation. Nous avons démontré le

recrutement spécifique du complexe histone acétyltransférase NuA4 par

immunoprécipitation de chromatine à une cassure double brin de l’ADN, le type de

dommage le plus dangereux pour la cellule. Des cinétiques ont permis de déterminer à quel

moment NuA4 apparaît au site de cassure en relation avec les modifications de la

chromatine environnante et de vérifier l’apparition subséquente de complexes de

remodelage ATP dépendant. En parallèle, de nouveaux sites de phosphorylation d’histones

qui pourraient être impliqués dans la réparation de dommages sur l’ADN ont été

investigués. En conclusion, nos travaux permettent de lier fonctionnellement des

complexes de modification/reconfiguration de la chromatine avec le processus de

réparation de dommages à l’ADN.

AVANT-PROPOS

Je remercie le Dr Jacques Côté pour la supervision constante de mon travail à la

maîtrise ainsi que de l’opportunité et la chance offerte de travailler dans son laboratoire.

Sa grande motivation, ses connaissances multiples et sa préoccupation à doter le laboratoire

d’équipements à la fine pointe de la dernière technologie (PCR quantitatif, Bioruptor, etc)

furent d’une grande aide et facilitèrent grandement mes recherches. De plus, j’aimerais

remercier tous les membres du laboratoire présents et passés côtoyés depuis mon arrivée

dans le laboratoire pour leur écoute, leur conseils et les services rendus. Un merci spécial

à Stéphane Allard, qui fût mon entraîneur durant mon stage à l’été 2002 et qui travailla

avec moi sur ce projet, pour sa grande disponibilité, son enthousiasme communicatif et son

travail dans l’optimisation des protocoles de ChIPs et de PCR quantitatif. J’aimerais

souligner le travail effectué et l’aide apportée par nos collaborateurs Jessica Downs et Craig

Peterson. Enfin, j’aimerais remercier les organismes subventionnaires que sont les IRSC et

le FRSQ pour l’aide qu’ils m’ont accordée permettant ainsi de financer mes recherches.

TABLE DES MATIÈRES RÉSUMÉ .............................................................................................................................. ii AVANT-PROPOS............................................................................................................... iii TABLE DES MATIÈRES...................................................................................................iv LISTE DES TABLEAUX.................................................................................................. vii LISTE DES FIGURES ..................................................................................................... viii LISTE DES ABRÉVIATIONS............................................................................................x I. INTRODUCTION ............................................................................................................1

A) RÉPARATION DE L’ADN .................................................................................1 1. Dommages à l’ADN ...................................................................................1

a) Sources...........................................................................................1 b) Nature et conséquences..................................................................1

2. Mécanismes de réparation ..........................................................................2 a) Bris mineurs...................................................................................2

i. Réparation par excision de nucléotides (NER)......................3 ii. Réparation par excision de bases (BER)................................3

b) Cassure double brin .......................................................................4 i. Recombinaison homologue (HR) ..........................................4 ii. Réparation par jonction des extrémités non-homologues

(NHEJ) ...................................................................................5 iii. Réparation par appariement des extrémités protubérantes

simple brin (SSA) ..................................................................6 B) CHROMATINE....................................................................................................6

1. Structure et fonction....................................................................................6 2. Activités modifiants la chromatine .............................................................8

a) Variants d’histones ........................................................................9 i. H2A.X....................................................................................9 ii. H2A.Z ....................................................................................9

b) Complexes modifiants les histones..............................................10 i. Types de modification .........................................................10

♦ Phosphorylation ..............................................................10 ♦ Acétylation......................................................................12 ♦ Méthylation.....................................................................12 ♦ Autres modifications.......................................................12

ii. Le complexe NuA4..............................................................12 c) Complexes ATP dépendant .........................................................14

i. Famille SWI2/SNF2 ............................................................14 ii. Familles ISWI et CHD.........................................................15 iii. Famille INO80/SWR1 .........................................................15

C) RÔLE DE LA CHROMATINE DANS LA RÉPARATION DE L’ADN .........16 1. L’histone H2A.X ......................................................................................17 2. Évidences génétiques du rôle de NuA4 dans la réparation.......................18

a) Mutants sensibles aux agents endommageant l’ADN .................18 b) Arrêt cycle cellulaire....................................................................20

v

c) TIP60 ...........................................................................................20 d) Mutants lysine de H4 ...................................................................20 e) Mutants esa1 ................................................................................21 f) Mutant yng2.................................................................................21

3. Évidences génétiques du rôle des complexes SWR1 et INO80 dans la réparation ..................................................................................................21

a) Mutants sensibles aux agents endommageant l’ADN .................21 D) BUTS DU PROJET ............................................................................................23

II. MATÉRIEL ET MÉTHODES ....................................................................................24

A) SYSTÈME HO ...................................................................................................24 B) PLASMIDES ......................................................................................................25 C) SOUCHES DE LEVURES.................................................................................26 D) ANALYSE SOUTHERN ...................................................................................28 E) ChIP (CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION) ........................................29 F) TESTS DE CROISSANCE ................................................................................32

III. RÉSULTATS.................................................................................................................36

A) OPTIMISATION DE L’INDUCTION DE LA CASSURE ...............................36 1. Milieu minimum .......................................................................................36 2. Milieu riche...............................................................................................37

B) S129 DE H2A EST RAPIDEMENT PHOSPHORYLÉE À LA CASSURE.....37 1. Détection de γ-S129 par ChIP en PCR classique......................................37 2. Détection de γ-S129 par ChIP en PCR quantitatif....................................38 3. Le faible niveau de γ-S129 à la cassure n’est pas due à la résection ........39 4. α-P-S129 ne reconnaît pas un mutant S129*............................................40

C) NuA4 EST RECRUTÉ RAPIDEMENT À LA CASSURE ...............................41 1. Détection de la sous-unité Eaf1 à la cassure par ChIP par PCR

quantitatif ..................................................................................................41 2. Un mutant arp4 occasionne une perte de recrutement de NuA4 à la

cassure.......................................................................................................41 3. L’histone H4 est acétylée à la cassure ......................................................42

D) LES COMPLEXES CONTENANT Rvb1 SONT RECRUTÉS TARDIVEMENT À LA CASSURE ..................................................................43

1. Détection de Rvb1 à la cassure par ChIP en PCR quantitatif ...................43 2. Un mutant esa1 cause un retard dans le recrutement des complexes

contenant Rvb1 à la cassure......................................................................44 3. Un mutant arp4 cause un retard dans le recrutement des complexes

contenant Rvb1 à la cassure......................................................................45 4. Swr1 n’est pas recruté à la cassure par ChIP en PCR quantitatif .............46 5. Le recrutement des complexes contenant Rvb1 n’est pas gravement

affecté dans une souche ∆swr1 .................................................................47

vi

E) AUTRES MODIFICATIONS D’HISTONES DANS LA RÉPARATION DE L’ADN................................................................................................................48

1. Détection de la phosphorylation de S1 de l’histone H4 à la cassure par ChIP en PCR quantitatif ...........................................................................48

2. Tests de sensibilité aux agents endommageant l’ADN de mutants de sites de phosphorylation de la queue C-terminale de H2A...............................49

IV. DISCUSSION................................................................................................................51

A) LA PHOSPHORYLATION DE LA S129 DE H2A S’ACCUMULE RAPIDEMENT À LA CASSURE SUITE À UN BRIS DE L’ADN.................51

B) LE COMPLEXE NuA4 EST RECRUTÉ RAPIDEMENT À LA CASSURE SUITE À LA PHOSPHORYLATION DE LA S129 DE H2A ..........................52

C) L’ACETYLATION DE H4 A LA CASSURE EST REQUISE POUR LE RECRUTEMENT EFFICACE DES COMPLEXES CONTENANT Rvb1.......55

D) SWR1 N’EST PAS RESPONSABLE DE LA MAJORITE DU SIGNAL Rvb1 A LA CASSURE ................................................................................................55

E) D’AUTRES MODIFICATIONS CHROMATINIENNES SONT IMPLIQUÉES DANS LA RÉPARATION DE L’ADN .............................................................57

F) MODÈLE DE LA DYNAMIQUE CHROMATIENNE LORS DE LA RÉPARATION DE CASSURE DOUBLE BRIN DE L’ADN ..........................58

V. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES........................................................................60 VI. BIBLIOGRAPHIE........................................................................................................62 VII. ANNEXES ...................................................................................................................70

A) Article « Binding of chromatin modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites »...............................................................................70

B) Article « Regulation of NuA4 HAT activity in transcription and DNA repair by phosphorylation of histone H4 »........................................................................70

LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Les différentes sous-unités de NuA4 et leurs phénotypes................................19 Tableau 2 : Plasmides utilisés pour ces recherches .............................................................33 Tableau 3 : Souches utilisées avec le système HO pour étudier la réparation de l’ADN ...33 Tableau 4 : Souches utilisées pour les gènes codants pour l’histone H2A .........................34 Tableau 5 : Oligonucléotides utilisés en PCR quantitatif et pour le dosage de la coupure en Southern.........................................................................................34 Tableau 6 : Oligonucléotides utilisés pour la mutagenèse dirigée de l’histone H2A, l’ajout de l’épitope HA à Swr1 et la délétion de Swr1 ....................................35

LISTE DES FIGURES Figure 1: Les deux principaux mécanismes de réparation des bris mineurs de l’ADN ......3 Figure 2: Trois mécanismes de réparation des cassures double brin...................................4 Figure 3: Les différents niveaux de condensation de l'ADN...............................................7 Figure 4: La structure du nucléosome .................................................................................8 Figure 6: Les résidus lysines de H4 spécifiquement acétylé par NuA4. ...........................13 Figure 7: Le rôle centrale de la sous-unité Eaf1 dans l’architecture du complexe

NuA4..................................................................................................................13 Figure 8: Struture des quatre classes de facteurs de remodelage de la chromatine

dépendant le l'ATP.............................................................................................14 Figure 9: Les complexes SWR1 et INO80 ........................................................................15 Figure 10: La sérine 139 du motif SQE en C-terminal de H2A.X est phosphorylée

chez l’humain.....................................................................................................18 Figure 11: Système HO .......................................................................................................24 Figure 12: Localisation du site de reconnaissance HO sur le chromosome III. .................25 Figure 13: Résidus mutés à l’extrémité C-terminale de l’histone H2A...............................26 Figure 14: Les deux possibilités pour introduire le gène codant l’endonucléase HO

dans les levures ∆hmr/∆hml...............................................................................26 Figure 15: Étapes de construction de souches mutantes pour un résidu phosphorylable

en région C-terminale de l’histone H2A............................................................27 Figure 16: La technique de ChIP (Chromatin IP)................................................................29 Figure 17: Les quatre jeux d’oligonucléotides choisis et optimisés situés à différentes

distances de la cassure double brin HO. ............................................................30 Figure 18: Traitement des données obtenues avec le PCR quantitatif. ...............................31 Figure 19: Oligonucléotides pour doser la coupure HO en PCR quantitatif. ......................31 Figure 20: Dosage du % de coupure à la cassure avec pGAL-HO en milieu minimum

par analyse Southern ..........................................................................................36 Figure 21: Dosage du % de coupure à la cassure ................................................................37 Figure 22: La sérine 129 de H2A est phosphorylée après 45 min à 1.5 Kb de la cassure

double brin HO. .................................................................................................38 Figure 23: La sérine 129 de H2A est phosphorylée rapidement à la cassure ......................39 Figure 24: Mécanisme de résection. ....................................................................................39 Figure 25: La baisse de Phos-S129 à la cassure n’est pas due à la résection. .....................40 Figure 26: L’anticorps anti-γ-Ser129 de H2A est spécifique. .............................................40 Figure 27: NuA4 est recruté rapidement à moins de 2 Kb de la cassure.............................41 Figure 28: Arp4, une sous-unité de NuA4 présente à la cassure, joue un rôle dans le

recrutement du complexe. ..................................................................................42 Figure 29: La Lys8 de l’histone H4 est acétylée rapidement à moins de 2 Kb de la

cassure transitoirement.......................................................................................43 Figure 30: Les complexes contenant Rvb1 sont recrutés tardivement au site de cassure ...44 Figure 31: Un mutant esa1 ts cause un défaut dans le recrutement des complexes

contenant Rvb1 à HO et à 1.5 Kb ......................................................................44 Figure 32: Un mutant arp4 ts cause un défaut dans le recrutement des complexes

contenant Rvb1 à HO et à 1.5 Kb ......................................................................45 Figure 33: Swr1 n’est pas recruté à la cassure.....................................................................46

ix

Figure 34: Un mutant ∆swr1 n’occasionne pas de retard important dans le recrutement des complexes contenant Rvb1 à HO et à 1.5 Kb..............................................47

Figure 35: La sérine 1 de H4 est phosphorylée tardivement à la cassure............................48 Figure 36: Alignement de séquences de la queue C-terminale de l’histone H2A ...............49 Figure 37: Test de sensibilité aux agents endommageant l’ADN des mutants pour les

résidus phosphorylables en C-terminal de l’histone H2A. ................................50 Figure 38: Sommaire d’apparition temporelle des modifications d’histones et activités

chromatiniennes détectées par ChIPs à 1.5 Kb de la cassure double brin .........54 Figure 39: Modèle de la dynamique chromatinienne lors de la réparation de la cassure

double brin de l’ADN. .......................................................................................59

LISTE DES ABRÉVIATIONS 53BP1 : p53 binding protein 1 α–X : anti-X ou anticorps dirigé contre la protéine X γ–S129 : Phospho-Sérine 129 γ–H2A.X : Phospho-Ser139 de H2A.X Act1 : actin 1 ADA : adaptator ADN : acide désoxyribonucléique anti-X : anticorps dirigé contre la protéine X ARN : acide ribonucléique Arp : actin related protein ATM : ataxia telangiectasia mutated ATR : ATM related ATP : adenosine triphosphate BER : base excision repair (réparation par excision de bases) CENP-A : CENtromeric Protein A ChIP : chromatin immunoprécipitation CPT : Camptothécine DSB: Double-strand break Eaf : Esa1-associated factor Epl1 : enhancer of polycomb like 1 Esa1 : essential SAS2-related acetyltransferase 1 Gcn5 : general control nonderepressible 5 GNAT : Gcn5 N acetyltransferase related Gy ; Gray HAT : histone acetyltransferase HDAC : histone désacétylase HML : homothallic left HMR : homothallic right HMT : histone methyltransferase HO : Homothallic switching endonuclease HR: recombinaison homologue HTA : Histone Two A HU : Hydroxyurée Ino80 : inositol 80 INO80 : complexe inositol 80 IP : Immunoprécipitation IR : ionizing radiation ISWI : imitation SWI/SNF Kb: Kilobase Mec : mitosis entry checkpoint MMR : Mismatch repair (réparation de mésappariements de bases) MMS : methyl methane sulfonate MOZ : monocytic leukemia zinc finger Mre11: Meiotic recombination

xi

MYST : MOZ, Ybf2/Sas3, Sas2 et TIP60 Nbs1 : Nijmegen breakage syndrome 1 NER : nucleotide excision repair (réparation par excision de nucléotides) NHEJ : non-homologous end-joining (réparation par jonction des extrémités non-homologues) NuA3 : nucleosome acetyltransferase of H3 NuA4 : nucleosome acetyltransferase of H4 ORF : open reading frame PCR : polymerase chain reaction P-H2A : Phospho-Sérine 129 de H2A P-H2A.X : Phospho-Ser139 de H2A.X PHD : plant homeodomain PI3K : phosphatidylinositol-3 kinase PIKK : phosphatidylinositol-3 kinase-related kinases Rad : radiation Rpd3 : reduced potassium dependency 3 RSC : remodel the structure of chromatin Rvb: ruvB-like SAGA : Spt, Ada, Gcn5 acetyltransferase SANT : Swi3, Ada2, N-Cor et TFIIIB Sas : something about silencing Sin3 : swi-independent 3 SNF : sucrose non fermenting Spt : suppressor of Ty SSA : single strand annealing (réparation par appariement des extrémités protubérantes simple brin) SSB : Single-strand break STAGA : SPT3-TAF(II)31-GCN5L acetylase Sth1 : Snf2 (two) homolog 1 SWI : mating type switching Swr1 : Swi2/Snf2-related ATPase 1 SWR1 : complexe Swi2/Snf2-related ATPase 1 TAF : TBP associated factor TAP : tandem affinity purification Tel1 : telomere maintenance 1 Tip60 : Tat interacting protein (60kDa) TIP60 : complexe Tat interacting protein (60kDa) TOR : target of rapamycin Tra1 : yeast homolog of TRRAP1 WT : wild type Xrs2 : X-Ray Sensitive 2 Yaf9 : yeast AF-9 Yng : yeast homolog of mammalian ING1 YPD : Yeast Extract-Peptone-Dextrose YPR : Yeast Extract-Peptone-Raffinose YPG : Yeast Extract-Peptone-Galactose UV : Ultraviolet

1

I. INTRODUCTION A) RÉPARATION DE L’ADN

1. Dommages à l’ADN

a) Sources Une cellule doit lutter chaque jour pour protéger l’intégrité de son matériel

génétique. Toute altération de ce précieux matériel nucléaire constitue un dommage à

l’ADN. Les origines de ces bris moléculaires sont aussi différentes que nombreuses.

Ainsi, ils peuvent provenir de sources autant de l’extérieur de la cellule que de l’intérieur de

la cellule elle-même. Parmi les sources exogènes, on compte les rayonnements, les

radiations ionisantes et les substances chimiques mutagènes. Qu’elles proviennent des

ultraviolets (UV), des radiations ionisantes (IR) ou du rayonnement γ, elles produisent des

lésions sur l’ADN parfois introduites par l’attaque des radicaux libres hydroxyles générés

suite à la scission de l’eau. Des agents extérieurs comme des drogues, des analogues de

base, des inhibiteurs de processus biologiques peuvent, une fois passés la membrane

nucléaire, causer d’importants dégâts à la structure moléculaire même de l’information

génétique. La production de radicaux libres dans une étape du métabolisme cellulaire, des

erreurs introduites lors de la réplication d’ADN simple brin de même que des bris ou

affaissements de fourche de réplication sont autant de sources de problèmes survenant de

manière endogène. Enfin, la méiose, la recombinaison V(D)J et la conversion génique sont

des processus spécialisés susceptibles de connaître des défauts et d’occasionner des bris

génétiques.

b) Nature et conséquences Différents types de dommages peuvent survenir suite à l’exposition à l’une des

sources décrites précédemment. Ainsi, les UV sont connus pour introduire des dimères de

pyrimidines causant des distorsions importantes dans la double hélice. Le renouvellement

de l’ADN peut provoquer la dépurination spontanée de certaines bases à raison de 2 000 à

10 000 sites par cellule humaine quotidiennement (Lindahl, 1993). Il y a aussi les

mésappariements de bases, les modifications covalentes de nucléotides ou l’apparition de

2

cassure simple brin (SSB). Assurément, la cassure double brin (DSB) est la plus

dangereuse éventualité qu’une cellule peut rencontrer car elle peut provoquer la perte d’un

morceau de chromosome ou une translocation chromosomique. On dénombre environ 30

DSBs et 1000 SSBs par cellule exposée à une dose de 1 Gy de radiations ionisantes

(Gulston et al., 2002; Thompson and Limoli, 2003; Tong et al., 2001).

Si une cellule ne peut réparer les quelque 10 000 bris d’ADN qu’elle s’impose à

elle-même quotidiennement (Lindahl, 1993), c’est alors qu’elle s’expose à de graves

problèmes. L’instabilité génomique est l’un des évènements pouvant mener à la

perturbation de la fonction cellulaire. En effet, l'accumulation de dommages peut avoir de

lourdes conséquences. Si ceux-ci surviennent à des endroits critiques dans l'ADN, ils

peuvent mener à la formation de tumeur, l’apoptose ou la mort cellulaire. C’est de cette

façon que se développent des maladies graves et menaçantes comme le cancer (Khanna and

Jackson, 2001), Xeroderma Pigmentosum (XP), Ataxia Telangiectasia (AT) et les

syndromes de Bloom et Cockayne (Lehmann, 2003; Thompson and Schild, 2002). Lorsque

les mécanismes de réparation échouent ou commettent des impairs, il y a l’apparition de

mutations. Si celles-ci sont majeures, elles sont suffisantes pour modifier l’activité d’une

protéine ou la guider vers la dégradation. Dans le cas de suppresseurs de tumeurs, leur

mutation peut priver la cellule de surveillance menant au contrôle du cycle cellulaire et de

la prolifération. Pour contrer ce phénomène, la cellule dispose de plusieurs mécanismes de

réparation. Dans tous les cas, l’accessibilité aux bris sur l’ADN est un élément clé.

2. Mécanismes de réparation

a) Bris mineurs Les bris mineurs ou de moindre importance sont réparés par trois voies principales :

la réparation par excision de nucléotides (NER), la réparation par excision de bases (BER)

ou la réparation de mésappariements de bases (MMR). Ce dernier s’avère davantage utile

lors la réparation de mésappariements de bases.

3

i. Réparation par excision de nucléotides (NER) Le NER est principalement utilisé pour réparer les lésions encombrantes et gênant la

structure de l’ADN comme les dimères de pyrimides et autres modifications causées par les

UV. Il s’agit d’un mécanisme très conservé qui se joue en quatre étapes (en A de la Figure

1) : 1) la lésion sur l’ADN est détectée; 2) l’ADN entourant la région affectée est déroulé

par l’arrivée du complexe TFIIH; 3) des endonucléases (ERCC1-XPF et XPG) génère des

coupures simple brin aux extrémités 5’ et 3’ du site de dommage; 4) finalement l’ADN

polymérase vient combler le site laissé vacant en ajoutant les nucléotides adéquats.

ii. Réparation par excision de bases (BER) La réparation par excision de bases, quant à elle, sert principalement à remplacer les

bases modifiées ou combler les sites vacants laissés par une perte de base (excision de la

base de son nucléotide). Si ce n’est pas déjà le cas, des glycosylases créent un site abasique

(nucléotide dépuriné/dépyrimidiné par hydrolyse du lien N-glycosidique). Puis, dans la

version simple (short-patch), un seul nucléotide est ajouté et ligé alors que dans sa version

plus complexe (long-patch) plusieurs nucléotides viennent remplacer les anciens. Les

Figure 1: Les deux principaux mécanismes de réparation des bris mineurs de l’ADN. (Modifié de (Peterson and Cote, 2004))

4

nucléotides déplacés formant un petit oligonucléotide sont éliminés par l’endonucléase

FEN-1 (voir en B de la Figure 1).

b) Cassure double brin Les deux principaux mécanismes permettant à une cellule de réparer les bris

majeurs que sont les périlleuses cassures double brin sont la recombinaison homologue et le

NHEJ (pour une revue voir (Paques and Haber, 1999)). Cependant, des variations

légèrement différentes existent comme l’appariement par extrémités protubérantes simple

brin (SSA).

i. Recombinaison homologue (HR) La recombinaison homologue est sans doute le moyen le plus sécuritaire de réparer

une cassure double brin. En effet, principal mécanisme utilisé chez la levure et les

Figure 2: Trois mécanismes de réparation des cassures double brin. (Modifié de (Peterson and Cote, 2004))

5

bactéries, il assure la conservation intégrale de l’information génétique. Basé sur l’échange

et l’invasion de brins provenant du chromosome endommagé dans ceux d’un chromosome

homologue intact, il s’agit d’un processus complexe nécessitant l’action de plus d’une

dizaine de protéines (en A de la Figure 2). Au départ, les kinases ATM/ATR ainsi que le

complexe MRN (Mre11, Rad50 et Nbs1/Xrs2) sont recrutés au site de bris. Dans un

second temps, de longues extrémités protubérantes 3’ sont générées par des exonucléases

digérant partiellement les brins 5’. Il y a formation de filaments de protéines Rad51 sur ces

bouts protubérants simple brin de même que l’arrivée des protéines Rad (Rad52. Rad54,

Rad55, Rad57). Puis, après une recherche de séquence homologue d’ADN dans le génome,

l’une de ces extrémités effectue l’invasion du duplex d’ADN partenaire et est extentionnée

par l’ADN polymérase utilisant comme gabarit la séquence homologue appropriée. La

boucle alors créée s’agrandit suffisamment pour le second fragment 3’ puisse s’hybrider et

être polymérisé à son tour. Des protéines hélicases de la famille RUVB-Like assureraient

la migration de cette boucle. Une ligase permet ensuite de rassembler les brins qui ont été

coupés.

ii. Réparation par jonction des extrémités non-homologues (NHEJ) La réparation par jonction des extrémités non-homologues, quant à elle, se passe de

gabarit d’ADN pour mener à bien la réparation de la cassure. Bien qu’utilisé chez les

organismes inférieurs plus simples comme la levure et la bactérie (Pitcher et al., 2005), le

NHEJ est le principal mécanisme utilisé chez les mammifères. Il s’agit d’une ligation

d’extrémité à extrémité d’ADN. Il va sans dire que les pertes de séquences et/ou les

mutations introduites sont courantes, comparativement avec la recombinaison homologue,

et que cette réparation est par conséquent imparfaite. Cependant, elle peut aussi être un

processus fiable. Cela peut sembler périlleux comme mécanisme, mais rappelons que les

mammifères ont deux copies de chaque gène et que la grande majorité du génome humain

est constitué de séquences non codantes. Dans le cas de la levure par contre, il s’agit d’un

mécanisme de réparation rapide lorsqu’il est impossible de faire HR (certaines phases du

cycle cellulaire où il y a absence de séquence homologue dans des cellules haploïdes). Au

début du processus, les protéines Ku (homodimère) et la kinase DNA-PK lient et protègent

de la dégradation les deux extrémités de l’ADN sectionnées (voir en C de la Figure 2).

6

Tout en les maintenant l’une près de l’autre, elles recrutent et activent par phosphorylation

d’autres membres de la machinerie de réparation. Enfin, une ligase, la Ligase IV, lie les

deux bouts pour reformer la double hélice.

iii. Réparation par appariement des extrémités protubérantes simple brin (SSA) Le « single strand annealing » ou appariement par extrémités protubérantes simple

brin peut être utilisé lorsqu’il y a deux séquences répétées séparées par une région

interséquence. Dans ce cas particulier, il en résulte la perte d’une des deux séquences

répétées. De manière plus générale, il s’agit de rechercher de courtes séquences

homologues de part et d’autre de la cassure. Son mécanisme débute comme HR à

l’exception que c’est Rad52 seule qui cherche des microhomologies sur l’extrémité 3’

protubérante opposée (voir en B de la Figure 2). L’endonucléase FEN-1 se débarrasse des

séquences inutiles et la ligation peut se produire. Comme le NHEJ, ce mécanisme conduit

à une perte d’information génétique (Peterson and Cote, 2004).

B) CHROMATINE La régulation transcriptionnelle des gènes est un processus fondamental de la vie

cellulaire. En effet, c'est par l'expression de protéines à des moments clés durant le cycle

cellulaire et au cours de son développement qu'une cellule peut vivre, croître, se diviser et

répondre à son environnement. Lorsqu'il y a dérégulation de cette activité cellulaire, il en

résulte des défauts de fonctionnement dans la cellule, pouvant entraîner sa prolifération

anarchique (cancer) ou sa mort. Il est maintenant évident que la chromatine joue un rôle

dynamique majeur dans la régulation de l’expression des gènes.

1. Structure et fonction La structure des chromosomes eucaryotes permet l'empaquetage du matériel

génétique à l'intérieur du noyau des cellules. Caractérisée par différents niveaux

structuraux (Figure 3), la chromatine permet de compacter tout le génome d’un organisme

dans un compartiment restreint et minuscule, le noyau de la cellule. Chez l’humain les

quelque 6000 Mb d’ADN, mesurant 1.8 mètre sous forme de double hélice linéaire, sont

7

emprisonnées dans un noyau de 6 µm alors que le plus court de nos 46 chromosomes passe

de 14 mm à 2 µm en longueur (Ball, 2003).

Visuellement partagée en deux types en microscopie, la chromatine peut être soit

active transcriptionnellement (euchromatine) ou tellement condensée qu’elle devient

transcriptionnellement inactive (hétérochromatine). La condensation/décondensation

chromatinienne est régulée au cours du cycle cellulaire. Ainsi, lors de la mitose, cette

structure est fortement condensée pour permettre la ségrégation adéquate des

chromosomes. Par contre, dans les autres phases, elle devient diffuse, résultat d’une

décondensation partielle.

C’est d’ailleurs par cette dynamique qu’elle est considérée comme un des très

importants acteurs dans la régulation transcriptionnelle. En effet, cette structure forme une

barrière physique empêchant l'accessibilité à l'ADN et ainsi les processus biologiques

nucléaires tels la transcription, réplication, recombinaison et réparation de l'ADN. En

Figure 3: Les différents niveaux de condensation de l'ADN. (Modifié de (Felsenfeld and Groudine, 2003)

8

jouant sur le niveau d’exposition des promoteurs ou de la séquence codante des gènes, il est

possible de favoriser ou d’inhiber leur transcription et par conséquent leur expression.

L'unité de base de la chromatine est le nucléosome qui enroule environ 150 paires

de bases d'ADN autour d'un octamère de petites protéines basiques hautement conservées

dans l’évolution : les histones. Constituée de deux copies des histones H3 et H4 et de deux

dimères des histones H2A-H2B (Figure 4), la première structure cristallographique du

nucléosome a été déterminée en 1997 (Luger et al., 1997). Puis suivi, quelque années plus

tard, une deuxième structure révisée à 1.9 Å (Davey et al., 2002) confirmant les résultats et

hypothèses antérieurs. Une cinquième histone (H1) assure la compaction de l’ADN à un

niveau supérieur.

2. Activités modifiants la chromatine Les protéines responsables de l’activité reconfigurant la chromatine sont

habituellement partie intégrante de gros complexes multi-protéiques stables et leur action

peut être parfois interpréter comme des chaperonnes d’histones. Deux grandes classes de

ces complexes sont connues et se distinguent principalement par leur mode d’action : les

Figure 4: La structure du nucléosome. (Modifié de (Luger et al., 1997)

9

complexes modifiant de façon covalente les histones et ceux utilisant l’ATP pour

déstabiliser les liens histone-ADN du nucléosome. Une troisième activité est étudiée depuis

peu : l’incorporation d’histone spécialisée dans la chromatine.

a) Variants d’histones L’incorporation de variants d’histone peut, à sa façon, jouer un rôle dans la

reconfiguration de la chromatine ou dans la signalisation des processus biologiques. Il y a

deux variants de l’histone H3 chez les mammifères : H3.3, qui est déposé au promoteur des

gènes transcrits au cours de la division cellulaire; et CENP-A (Cse4 chez la levure),

incorporé spécifiquement dans les nucléosomes centromériques (Ahmad and Henikoff,

2001). Chez les mammifères supérieurs, divers variants de l’histone H2A majeure existent

(H2A.X, H2A.Z, macroH2A…). Le variant macro-H2A est retrouvé seulement dans le

chromosome X inactif des femelles (Ladurner, 2003).

i. H2A.X Chez les mammifères, un variant de l’histone H2A, nommé H2A.X est présent sur

environ 10 % sur génome. Comptant 13 résidus en C-terminal de plus que l’histone H2A

majoritaire, il est phosphorylé sur le résidu S139 dans les minutes suivant un dommage à

l’ADN. Les PIKK (Phosphatidyllinositol-3-Kinase related kinase) du type ATM

reconnaissent le motif SQE en C-terminal de l’histone H2A.X. Fait intéressant, H2A.X

chez la levure est en fait la forme prédominante (95%) H2A (Redon et al., 2003).

ii. H2A.Z Un troisième gène code pour un variant d’histone H2A chez la levure en plus des

gènes usuels (HTA1 et HTA2). Il s’agit de H2A.Z codé par HTZ1. Bien que non essentiel

chez S. cerevisiae, ce variant le devient chez les organismes eucaryotes supérieurs

(drosophile et souris). Comptant pour approximativement 10% des histones H2A

cellulaire, il forme un dimère avec H2B interagissant légèrement plus faiblement avec le

tétramère (H3-H4)2 (Suto et al., 2000). Il semble qu’il soit lié à l’activation

transcriptionnelle puisqu’une localisation accrue est observée aux promoteurs de gènes

transcriptionnellement actifs. Il a aussi une mission aux télomères : celle de délimiter les

10

régions hétérochromatiniennes de celles d’euchromatines (Meneghini et al., 2003). La

présence de ce variant (H2A.Z) en remplacement de l’histone H2A conventionnelle dans

les nucléosomes de plusieurs gènes près des télomères, empêche la condensation

chromatinienne de ces locus.

b) Complexes modifiants les histones Le premier type de complexe joue sur les charges des acides aminés des histones en

modifiant ces dernières de manière covalente à leurs extrémités situées à l’extérieur du

nucléosome (principalement la queue N-terminale). Trois principales modifications post-

traductionnelles sont connues et bien caractérisées : la phosphorylation, l’acétylation et la

méthylation (Figure 5). Avec d’autres modifications moins bien caractérisées, elles

signalent dynamiquement autant l’ouverture que la fermeture de la chromatine (à

l’exception de l’acétylation qui est associé uniquement à l’ouverture). Ce contrôle

épigénétique est facilité par des motifs reconnaissant les histones et présents dans les sous-

unités de ces complexes. Les chromodomaines sont reliés à la reconnaissance des histones

méthylées (Bannister et al., 2001) et les bromodomaines aux queues d’histones acétylées

(Owen et al., 2000). Notons que des combinaisons de ces modifications covalentes sur une

même histone sont étudiées et constituent ce qu’on nomme le code des histones.

i. Types de modification

♦ Phosphorylation À la base de l’activation ou la répression de plusieurs acteurs importants dans les

grands processus de la biologie cellulaire, la phosphorylation est probablement la plus

étudiée des modifications post-traductionnelles. Son rôle sur les histones, plus

particulièrement les résidus sérine et thréonine, ne se résume pas aux extrémités N-

terminale, puisque l’une des modifications les plus caractérisées en réparation de l’ADN se

situe à la queue C-terminale de H2A.X. Caractérisée pour son rôle dans l’apoptose (S14 de

H2B, (Cheung et al., 2003), elle contribue également à l’activation transcriptionnnelle (S10

de H3, (Nowak and Corces, 2004).

11

Figu

re 5

: Les

diff

éren

tes m

odifi

catio

ns c

onnu

es d

es h

isto

nes.

(Mod

ifié

de U

psat

e.co

m)

12

♦ Acétylation L’acétylation est assurément la plus étudiée des marques chromatiniennes. L’ajout d’un

groupement acétyle, issue de l’acétyl-CoA, à un résidu lysine (résidu basique chargé

positivement) a pour effet de neutraliser la charge portée par cet acide aminé et ainsi,

réduire l’interaction avec l’ADN. Les complexes HAT (Histone Acétyltranferase) assurant

cette activité au noyau sont subdivisés en deux grandes familles : les MYST (MOZ,

Ybf2/Sas3, Sas2 et TIP60) et les GNAT (Gcn5 N-Acetyltransférase related). Plusieurs

complexes existent chez la levure ayant tous leur préférence pour certaines histones, parmi

ceux-ci SAGA (Spt, Ada, Gcn5 et acétyltransférase, H3/H2B), ADA (Adaptator, H3/H2B),

NuA3 (Nucleosome acetyltransfrerase of H3) et NuA4 (Nucleosome acetyltransfrerase of

H4). Les complexes HDAC (Histone Deacetylase) assurent le retour à un résidu non-

acétylé.

♦ Méthylation Tantôt associée à une répression et donc une condensation de la structure

chromatienne (R3 de H4; K4, R17 et K79 de H3) ou alors à l’activation (K20 de H4; K9 et

K27 de H3) (Jenuwein and Allis, 2001; Lacoste and Cote, 2003), la méthylation est menée

par des enzymes portant le nom de HMT (Histone Methyltransférase). Les principaux

résidus pouvant subir l’ajout d’un ou de plusieurs groupements méthyle sont la lysine et

l’arginine.

♦ Autres modifications D’autres modifications post-traductionnelles des histones ont été documentées :

l’ubiquitinylation (Thorne et al., 1987), l’ADP-ribosylation et la sumoylation (Shiio and

Eisenman, 2003). Par exemple, l’ubiquitinylation du résidu lysine 123 de H2B confère à

cette modification un rôle particulier : le contrôle de la méthylation des lysines 4 et 79 de

l’histone H3 (Briggs et al., 2002; Dover et al., 2002; Sun and Allis, 2002).

ii. Le complexe NuA4 Dans ce second groupe, on compte une seule HAT essentielle à la viabilité cellulaire

chez la levure Saccharomyces cerevisiae: le complexe histone acétyltransférase NuA4.

13

Complexe de 1.3MDa contenant 13 sous-unités dont la sous-unité catalytique est Esa1

(Allard et al., 1999), ses substrats sont les extrémités N-terminale des histones H4 (Lysines

5, 8, 12 et 16; Figure 6) et H2A (Lysines 5 et 9) (Ohba et al., 1999).

Dénombrant six sous-unités essentielles à la survie cellulaire, la délétion de

plusieurs de ses sous-unités bloque les levures à la frontière G2/M. Une de ses sous-unités

à domaine SANT, Eaf1, joue un rôle central dans l’architecture du complexe (Figure 7). Il

s’agit d’une sous-unités spécifique, unique et exlusive au complexe NuA4 (A. Auger et al.,

soumis). Enfin ce complexe démontre déjà des interactions génétiques avec le maintien de

l'intégrité du génome (développés plus loin dans ce mémoire). Sa version humaine, le

complexe TIP60 compte davantage de protéines et pratiquement toutes les sous-unités de

NuA4 sont conservées dans la version humaine.

Figure 6: Les résidus lysines de H4 spécifiquement acétylé par NuA4.

Figure 7: Le rôle centrale de la sous-unité Eaf1 dans l’architecture du complexe NuA4. (A. Auger et al., soumis)

14

c) Complexes ATP dépendant Cette deuxième classe assure le remodelage de la chromatine mécaniquement en

enlevant, déplaçant ou reconfigurant des nucléosomes par l’énergie libérée lors de

l’hydrolyse de l’ATP. Quatres grandes familles existent (Figure 8) et seront décrites (pour

revue voir (Tsukiyama, 2002).

i. Famille SWI2/SNF2 En plus du motif ATPase, cette sous famille se caractérise par la présence d’un

bromodomaine. Il s’agit d’un domaine pouvant lier les queues d’histones acétylées qui fait

environ 110 acides aminés. Ainsi, ce motif est retrouvé dans les sous-unités catalytiques,

Swi2 et Sth1 des complexes SWI/SNF (11 sous-unités) et RSC (15 sous-unités)

respectivement, les deux complexes de cette familles connus chez S. cerevisae. Bien

qu’ayant deux sous-unités communes et partageant beaucoup de similarité pour au moins

quatre autres, ils se différencient par le fait que RSC est essentiel à la levure et beaucoup

plus abondant (Cairns et al., 1996). Par contre, ils se rapprochent parle fait qu’ils sont tous

les deux impliqués autant dans l’activation que la répression de gènes. Le complexe

Brahma de drosophile et les complexes humains BRM er BRG1 sont les homologues chez

eucaryotes supérieurs

Figure 8: Structure des quatre classes de facteurs de remodelage de la chromatine dépendant le l'ATP. Les domaines ATPase sont représentés en rouge, les bromodomaines en violet, les chromodomaines en rose, les domaines SANT en bleu et les domaines liant l’ADN en vert. (Modifié de (Tsukiyama, 2002))

15

ii. Familles ISWI et CHD C’est plutôt un domaine SANT (présent chez Sw3, Ada2, N-CoR et TFIIIB) que

partagent quant à elles les sous-unités catalytiques de la famille ISWI (imitation SWI/SNF)

en plus du traditionnel domaine ATPase. Deux petits complexes simples sont connus chez

la levure : Iswi1 (4 sous-unités) et Iswi2 (2 sous-unités) (Tsukiyama et al., 1999). Il semble

qu’ils soient davantage impliqués dans la répression génique. CHRAC, ACF et NURF sont

retrouvés chez la drosophile.

Chd1 est de la famille CHD caractérisée par la présence d’un chromodomaine et

d’un motif liant l’ADN. Cette famille demeure encore peu étudiée jusqu’à maintenant.

iii. Famille INO80/SWR1 Initialement classés dans la famille ISWI, les deux complexes de levures INO80 (12

sous-unités, (Shen et al., 2000) et SWR1 (13 sous-unités, (Kobor et al., 2004; Krogan et al.,

2003; Mizuguchi et al., 2004) partagent aussi avec les deux autres familles une sous-unité à

Figure 9: Les complexes SWR1 et INO80. Parmi les trois complexes de levure (ligne du haut), les sous-unités de NuA4 et SWR1 semblent être évolutivement conservées et rassemblées chez le complexe humain TIP60. (Modifié de (Doyon and Cote, 2004))

16

motif ATPase, respectivement Ino80 et Swr1. Mais ils se classent à part des deux autres

familles. Tout d’abord par leur imposante structure (vs ISWI) et ensuite puisque ce motif

est scindé en deux segments isolés. SRCAP et p400/Domino sont les deux homologues de

Swr1 chez l’humain.

Partageant plusieurs protéines apparentées à l’actine (famille des ARP, actine

related protein), ils se rendent d’autant plus intéressants par la présence des Rvb1/Rvb2.

Ces deux dernières sont des protéines reliées à la protéine ruvB chez les bactéries, une

hélicase hexamérique double migrant le long de la jonction d’Holliday lors de la réparation

des DSB et la recombinaison (West, 1997)). De plus, des protéines homologues, appelées

RUVB Like 1/2 (aussi connu sous le nom de Tip49a/b), sont présentes dans le complexe

humain de NuA4 (TIP60). Il faut savoir qu’évolutivement les complexes de levures NuA4

et SWR1 semblent s’être fusionnés ensemble pour former le complexe TIP60 chez

l’humain (Figure 9) (Doyon and Cote, 2004). Pour surenchérir, la sous-unité Arp4 fait

partie intégrante des trois complexes de levures que sont NuA4 (Galarneau et al., 2000),

INO80 (Shen et al., 2000) et SWR1 (Kobor et al., 2004; Krogan et al., 2003; Mizuguchi et

al., 2004).

Alors que le rôle précis du complexe INO80 (INOsitol) est encore nébuleux, le

complexe SWR1 (Swi2 related), ayant comme sous-unité stable H2A.Z, jouent un rôle

d’échangeur de dimères (histones H2A-H2B pour H2A.Z-H2B) dans la chromatine (Kobor

et al., 2004; Krogan et al., 2003; Mizuguchi et al., 2004).

C) RÔLE DE LA CHROMATINE DANS LA RÉPARATION DE L’ADN Bien que surtout étudié depuis une dizaine d’année pour son rôle dans la régulation

transcriptionnelle, plusieurs évidences semblent lier le contexte chromatinien et ses

activités avec la réparation des dommage à l’ADN (pour revue voir (Allard et al., 2004)

(Peterson and Cote, 2004) et (Green and Almouzni, 2002).

17

1. L’histone H2A.X L’une des marques chromatiniennes, associée très tôt à la réparation de l’ADN, qui

est assurément la plus étudiée et la mieux documentée est la phosphorylation de la sérine

139 de la queue C-terminale de l’histone H2A.X (γ-H2A.X) chez les organismes

supérieurs.

Ce résidu est connu pour être modifié, dans les minutes suivant l’apparition d’une

cassure double brin de l’ADN, sur une région de la chromatine près du bris couvrant des

mégabases Cette modification apparaît aux foci dans la première minute suivant

l’exposition de cellules humaines à des radiations inonisantes (Rogakou et al., 1999). Il a

même été établi qu’elle précède et agit sur le recrutement du complexe de réparation MRN

(Mre11-Rad50-Nbs1) et de la protéine Rad51 (Paull et al., 2000). Des expériences sur des

cellules ES (Embryonic stem) de souris déficientes pour H2A.X (∆/∆) mais viable,

montrèrent une forte sensibilité aux radiations ionisantes et un risque élevé d’instabilité

génomique (Bassing et al., 2002). Par contre, même si cette modification survient très

rapidement après le dommage, il fut déterminé récemment qu’elle n’est pas requise pour le

recrutement précoce de plusieurs protéines de réparation (notamment Nbs1) mais qu’elle

permettait la rétention de ces facteurs aux sites de dommages à l’ADN chez les cellules

humaines (Celeste et al., 2003).

Dans les derniers mois, les grandes lignes d’un modèle d’ancrage impliquant

l’histone H2A.X fut développé afin de permettre l’explication de certains aspects de

l’instabilité génomique. Bassing et Alt ont proposé que la fonction critique de γ–H2AX

durant la réponse aux dommages consisterait à devenir une protéine d’échafaudage, un site

d’appui ou d’ancrage, permettant l’assemblage et le maintien de la machinerie de réparation

(Bassing and Alt, 2004). De cette manière, ce variant d’histone maintiendrait relativement

l’un près de l’autre les deux bouts d’ADN coupés en les attachant ensemble. Il s’agirait

donc d’une fonction beaucoup plus structurale que fonctionnelle.

Ce sont les kinases ATM/ATR, des PIKK, reconnaissant spécifiquement le motif

SQE (Figure 10), qui sont responsables de cette modification. La réaction est

majoritairement catalysée par la kinase ATM en réponse au cassure double brin dans les

18

fibroblastes murins (Burma et al., 2001) et ATR dans le cas d’une exposition aux UV ou un

blocage de réplication (Ward and Chen, 2001).

Comme mentionné précédemment, on retrouve aussi ce motif SQE à la queue C-

terminale de l’histone H2A de levure. L’équipe du laboratoire du Dr Jessica Downs s’est

intéressée à cette possible phosphorylation du résidu S129 de l’histone H2A chez la levure.

Les différents mutants pour le motif SQE testés chez la levure sont sensibles aux agents

endommagent l’ADN. De plus, in vivo la S129 est phosphorylée suite à un traitement à ces

mêmes agents. Ils démontrèrent finalement que cette phosphorylation était dépendante de

Mec1, l’homologue de ATR chez la levure (Downs et al., 2000).

Le lien unissant cette marque chromatienne à la réparation de l’ADN chez la levure

a aussi été démontré par son rôle essentiel dans l’efficacité à réparer les DSB durant la

réplication (Redon et al., 2003).

De plus, le variant H2Av de drosophile est aussi phosphorylé rapidement suite à un

dommage à l’ADN (Madigan et al., 2002). Le motif reconnu dans ce cas est légèrement

différent : SQA au lieu du traditionel SQE.

2. Évidences génétiques du rôle de NuA4 dans la réparation

a) Mutants sensibles aux agents endommageant l’ADN Des mutants de plusieurs sous-unités du complexe HAT sont sensibles aux agents

endommageant l’ADN (Tableau 1). Esa1, sous-unité catalytique, et Epl1 sont sensibles au

méthyl méthanesulfonate (MMS) et la campthotécine (CPT) (Boudreault et al., 2003).

Figure 10: La sérine 139 du motif SQE en C-terminal de H2A.X est phosphorylée chez l’humain. On retrouve le même motif chez H2A de levure.

19

Nous avons identifié le même phénotype (au MMS) pour un mutant de Arp4 (Downs et al.,

2004) pendant que d’autres observaient une sensibilité aux UV et à HU [Hydroxyurée]

(Gorzer et al., 2003). Aussi l’équipe de Stephen J. Kron montra une troisième sous-unité

impliquée dans la réparation de l’ADN particulièrement en phase S : Yng2 (sensibilité aux

UV, à HU et MMS) (Choy and Kron, 2002; Nourani et al., 2001). Un mutant de Yaf9 est

aussi sensible à HU (Kobor et al., 2004). Finalement, de récentes données de notre

laboratoire montrent deux nouvelles sous-unités du complexe sensibles au MMS : Eaf1,

aussi sensible aux radiations γ (Bennett et al., 2001) et Eaf2 aussi sensible à HU (Auger et

al., soumis).

Poids moléculaire

en kDa

Nom de la protéine

Phénotype du mutant

Sensibilité aux agents

endommageant l’ADN

Domaine protéique

Homologue humain

400 Tra1 létal - PI3 kinase/ATM TRRAP

125 Eaf1 Défauts de croissance

MMS, Radiation γ SANT, HSA p400/Domino

105 Epl1 létal MMS, CPT EPC1

59 Eaf2 létal MMS, HU SANT DMAP1

58 Arp4 létal MMS, HU, UV Actin related BAF53

55 Esa1 létal MMS, CPT Chromodomaine, MYST HAT Tip60

49 Eaf7 Viable - MRGBP

47 Eaf3 viable - Chromodomaines MRG15

44 Act1 létal - Actin

36/37 Yng2 Défauts de croissance MMS, HU, UV PHD finger ING3

32a Eaf5 viable -

32b Yaf9 viable MMS, HU YEATS GAS41

16 Eaf6 viable - hEaf6 Tableau 1 : Les différentes sous-unités de NuA4 et leurs phénotypes.

20

b) Arrêt cycle cellulaire La cellule a développé des systèmes efficaces de surveillance et de réparation des

DSB se traduisant par des arrêts du cycle cellulaire à des moments clés : les checkpoints

G1/S et G2/M. Bien que l’abondance des sous-unités du complexe HAT NuA4 ne soit pas

régulée au cours du cycle cellulaire, des mutants des certaines d’entre elles montrent des

défauts de croissance ainsi que des arrêts dans le cycle cellulaire à ces moments critiques.

Ainsi un mutant thermosensible esa1 poussé à température non-permissive bloquera les

cellules à la frontière G2/M. Cet arrêt implique le checkpoint Rad9, protéine senseur de

l’intégrité génomique (Clarke et al., 1999).

c) TIP60 Dans le cas de l’homologue humain de NuA4, le complexe TIP60, plusieurs

évidences suggèrent une fonction dans la réparation de l’ADN. L’expression de mutant de

l’activité HAT Tip60 dans les lignées cellulaires provoque une accumulation de cassures

double brin suite à un traitement au rayonnement γ. De plus, la voie apoptotique

normalement induite par une absence de réparation n’est pas fonctionnelle. (Ikura et al.,

2000). En effet, la capacité de la cellule à signaler à la machinerie de l’apoptose les

dommages à l’ADN semble affectée.

d) Mutants lysine de H4 Il est connu que des mutations pour les quatre résidus lysines acétylables de la

queue N-terminale de l’histone H4 de levure occasionnent de sérieux problèmes dans le

maintien de l’intégrité du génome (Bird et al., 2002; Megee et al., 1995). NuA4 étant

responsable de la modification de ces résidus, cela nous suggère donc un lien avec cette

maintenance. Le quadruple mutant de ces lysines par des glutamines est hypersensible

autant au MMS qu’à la CPT alors qu’il est pratiquement insensible aux UV. Le retour d’un

seul des quatre résidus sauvages rétablit le phénotype résistant pour les résidus lysines 5 8

et 12. Plus surprenant, l’ajout d’une lysine ectopique, soit en amont de la Lys5 ou tout

juste devant la Lys16 élimine la sensibilité. Enfin, l’acétylation in vivo de ces deux lysines

ectopiques a été confirmée. Enfin, seule l’histone H4 comportant seulement le site Lys16

21

intact ne réussit pas cette complémentation. Cela s’explique probablement par le fait que

NuA4 n’acétyle que les lysines 5, 8 et 12 de H4 in vivo et pas Lys16 (Suka et al., 2001).

e) Mutants esa1 La même équipe de recherche a investigué l’effet de mutations de la sous-unité

responsable de l’acétylation de H4, Esa1 (Bird et al., 2002). Après tout, si un mutant 4K-

>Q de H4 est défectif dans la réparation, un mutant Esa1 devrait aussi l’être. Comme

attendus, ils démontrèrent que l’un des deux mutants testés (esa1-1851) est très sensible au

MMS et à la CPT. L’hypoacétylation de H4 dans ce mutant a été confirmé in vivo par

analyse western anti-H4 acétyle.

f) Mutant yng2 Le phénotype de ce mutant a été décrit précedemment (UV, HU, CPT et MMS alors

qu’il est résistant aux IR). Il accuse un délai d’entrée en phase S (intra-S) en condition

MMS 0.03%. Des essais sur gel montrent qu’un mutant yng2 est incapable de compléter la

réparation de DSB si l’on compare au génotype sauvage (YNG2) (Choy and Kron, 2002).

3. Évidences génétiques du rôle des complexes SWR1 et INO80 dans la réparation

a) Mutants sensibles aux agents endommageant l’ADN Bien que leur découverte soit récente, tour à tour ces deux complexes ont montré

des intéractions génétiques avec la réparation de l’ADN (pour un apercu voir (Cairns,

2004).

INO80 est hypersensible aux dommages de l’ADN (MMS, HU, UV et IR) (Shen et

al., 2000; van Attikum et al., 2004). Ses mutants de sous-unités Arp8 (Auger et al.,

soumis) et Arp5 (van Attikum et al., 2004) sont sensibles aux dommages. De plus, son

orthologue chez Arabidopsis est utilisé dans le mécanisme de réparation de l’ADN par

recombinaison homologue (HR) (Fritsch et al., 2004).

SWR1 est hypersensible aux dommages de l’ADN (MMS) alors que la sous-unité

H2A.Z est sensible au MMS, UV, HU et CPT (Auger et al., soumis; (Downs et al., 2004;

22

Shen et al., 2000). Chez la drosophile, l’orthologue du complexe SWR1, Domino/p400,

effectue l’échange de l’histone variant H2Av de sa forme phosphorylée vers sa forme non-

phosphorylée (Kusch et al., 2004). Il est possible que chez la levure SWR1 puisse faire de

même avec γ-H2A aux sites de bris d’ADN qu’il remplacerait par H2A.Z, son variant non-

phosphorylable.

23

D) BUTS DU PROJET

Comme présentée en introduction, la chromatine forme une barrière physique

empêchant l'accessibilité à l'ADN et ainsi les processus biologiques nucléaires tels la

transcription, réplication et réparation de l'ADN. Dans un processus clé comme la

réparation des dommages à l’ADN, certaines activités reconfigurant la chromatine

pourraient donc s’avérer essentielles en facilitant l’accès à la machinerie de réparation.

Étant donné les nombreuses évidences (interactions génétiques) semblant impliquer le

complexe acétyltransférase NuA4, nous nous sommes donc proposés d’investiguer

l’implication physique direct de NuA4 aux sites de bris de l’ADN.

En utilisant un système introduisant un unique site de cassure double brin à un locus

spécifique et connu, nous pourrons :

• Vérifier l’implication directe de NuA4 aux sites de bris de l’ADN : observer sa

cinétique de recrutement, largage ou rétention de même que mesurer son activité

fonctionnelle, acétylation de H4, à cet endroit précis;

• Étudier sa relation avec d’autres modifications de la chromatine aux sites de

dommages à l’ADN : précède-t-il les modifications? Interagit-il avec la

phosphorylation de H2A? Son activité est-elle requise pour l’apparition d’autres

modifications ultérieures en réponse aux dommages? pour le recrutement d’autres

activités reconfigurant la chromatine de manière ATP-dépendante?

• Rechercher d’autres activités et modifications chromatiniennes impliquées dans

la réparation de l’ADN.

Ces travaux permettront de lier fonctionnellement un complexe de modification de

la chromatine avec un processus nucléaire autre que la transcription. Les résultats obtenus

auront assurément un impact important sur notre compréhension des mécanismes de

préservation du matériel génétique à travers les eucaryotes.

II. MATÉRIEL ET MÉTHODES

A) SYSTÈME HO

Le système HO est l’outil qui a été choisi pour générer un site unique de cassure

double brin dans le génome entier de la levure. Il s’agit d’induire l’endonucléase HO sous

contrôle du promoteur GAL10 par l’ajout de galactose au milieu de culture liquide.

L’induction se déroule en trois phases (Figure 11): 1) une préculture de la souche de levure

en milieu liquide en présence de glucose réprime la transcription; 2) un passage en raffinose

permet de lever cette répression; 3) finalement, l’ajout de galactose active la transcription

du gène de la nucléase. Le passage en milieu raffinose est nécessaire afin de lever

complètement la répression sur le promoteur GAL10 et ainsi activer fortement

l’endonucléase HO dans un délai très court suite à l’ajout de galactose.

Il faut savoir que cette endonucléase existe naturellement chez la levure. En effet,

elle possède son unique site de reconnaissance dans le locus MAT. Situé sur le 3e

chromosome, ce locus détermine le «Mating Type» i.e. le sexe de la levure. Chez cet

organisme, il existe deux sexe : le MATa et le MATα. C’est par l’introduction de la

cassure double brin au locus MAT par l’endonucléase HO qu’une levure peut changer de

sexe. Elle y arrive par recombinaison homologue avec les séquences situées de part et

Figure 11: Système HO

25

d’autre aux extrémités du même chromosome, c’est-à-dire HMR et HML (Haber, 1998).

Une fois la conversion génique effectuée, elle peut échanger son matériel génétique avec

une levure de sexe opposé par le biais de son 2e mode de reproduction après le

bourgeonnement : la conjugaison en cellule diploïde suivi de la sporulation.

Afin de s’assurer de conserver le même sexe et connaître ainsi parfaitement leur

génotype, les souches haploïdes utilisées communément en laboratoire sont mutées pour

l’endonucléase HO. Par conséquent, il suffit donc de réintroduire le gène codant

l’endonucléase HO dans n’importe laquelle des souches haploïdes pour générer un site

unique de bris double brin de l’ADN.

B) PLASMIDES

Les constructions plasmidiques utilisées et construites sont détaillées dans le

Tableau 2. Le plasmide parental pJHA2 (HIS3) a servi à effectuer les mutations

ponctuelles de l’extrémité C-terminale de l’histone H2A (pOJR1 à pOJR8). Construits par

mutagenèse dirigée avec l’ensemble «Quick Change site-directed mutagenesis»

(Stratagene), les oligonucléotides employés pour générer les mutants des résidus S122,

T126 et S129 (Figure 13) ainsi que la délétion des 12 derniers acides aminés (∆C121-132)

Figure 12: Localisation du site de reconnaissance HO sur le chromosome III. Une souche délétée pour les séquences homologues HMR et HML ne peut pratiquement pas effectuer de recombinaison homologue. Alors, c’est principalement le NHEJ qui assurera la réparation du bris.

26

sont énumérés au Tableau 6 (no. 1 à 14). La vérification par séquençage des plasmides

permit de confirmer les mutations.

C) SOUCHES DE LEVURES

Toutes les souches utilisées pour cette recherche ont un génotype dérivé de la

souche S288C et sont répertoriées dans les Tableaux 3 et 4 selon leur utilisation.

Dans le cas préçis des souches utilisées avec le système HO, elles sont toutes

MATα. Dans le but de pouvoir doser le pourcentage de coupure et de défavoriser le

changement de sexe, ces souches sont délétées pour les séquences homologues HMR et

HML. Il n’y a alors que très peu de recombinaison homologue possible sous induction

continuelle de l’endonucléase (uniquement dans le cas où un seul des deux sites est

sectionné suite à la réplication). Le mécanisme de réparation de l’ADN alors étudié sera

majoritairement le NHEJ. Pour introduire le gène codant l’endonucléase HO dans ces

levures, il y a deux possibilités (Figure 14): 1) sous forme plasmidique (pGAL-HO) ; 2)

sous forme intégrée dans le génome.

Figure 13: Résidus mutés à l’extrémité C-terminale de l’histone H2A.

Figure 14: Les deux possibilités pour introduire le gène codant l’endonucléase HO dans les levures ∆hmr/∆hml.

27

La souche employée (FY406) pour tester les phénotypes des différents mutants de

résidus phosphorylables en C-terminal de H2A est double délétante pour les copies

génomiques des gènes codants pour les histones H2A (HTA1 et HTA2) et H2B (HTB1 et

HTB2). Cependant, une copie de chacune des deux histones délétées est présente de

manière épisomale (HTA1 et HTA2 sur pSAB6 [URA3]). Les versions mutées en C-

terminal de l’histone H2A furent générées par transformation de la souche parentale

(FY406) avec les plasmides HIS3 obtenus par mutagénèse dirigée (Figure 15). Ensuite, le

plasmide portant la copie sauvage est chassé en sélectionnant avec le 5’FOA (Acide 5-

Fluorotique ; Sigma). En effet, ce composé chimique est métabolisé en un produit toxique

lorsque le gène URA3, encodant un enzyme dans la biosynthèse de l’uracil, est présent et

force donc la levure a expulser le plasmide porteur de ce gène.

L’ajout de l’épitope HA à la protéine Swr1 (Swr1-HA) a été effectué par

transformation et recombinaison homologue d’un produit PCR (comprenant le gène codant

pour la résistance à la kanamycine enchâssé entre deux régions d’homologies suivant le

codon STOP du gène SWR1) amplifié avec les amorces no. 15 et 16 du Tableau 6 sur le

plasmide pFA6a-3HA-kanMX6 (Longtine et al., 1998). Une sélection positive par

résistance à la drogue G418 (Généticine, 200µg/mL, Gibco) et une confirmation par PCR

ont permis d’isoler le clone d’intérêt. De plus, une analyse Western, dont le protocole a

Figure 15: Étapes de construction de souches mutantes pour un résidu phosphorylable en région C-terminale de l’histone H2A.

28

déjà été présenté (Allard et al., 1999), en incubant l’anticorps monoclonal (anti-HA.11

[souris] 1/2500, Babco) dans une solution PBS, 1% lait écrémé et 0.1% Tween-20 a

confirmé la présence de la protéine Swr1-HA.

La délétion de la protéine Swr1 (∆Swr1) a été effectuée par transformation et

recombinaison homologue d’un produit PCR (comprenant le gène codant pour la résistance

à la nourseotricine emboîté entre des séquences d’homologies en aval et et en amont du

gène SWR1) amplifié avec les amorces no. 17 et 18 du Tableau 6 sur le plasmide p4339,

dérivé de pAG25 (Goldstein and McCusker, 1999; Tong et al., 2001). Une sélection

positive par résistance à la drogue clonNAT (100µg/mL, Werner BioAgents) et une

confirmation par PCR ont permis d’isoler le clone d’intérêt.

Le mutant S129stop (S129*) de l’histone H2A utilisé avec le système HO (QY338)

résulte de la transformation du plasmide pGAL-HO dans une souche obtenue par

collaboration avec J. Downs (JDY68). La mutation fut introduite aux deux locus

génomiques codant pour H2A (Downs et al., 2000).

D) ANALYSE SOUTHERN

L’ADN a été isolé, selon les protocoles standards, de plusieurs 40 mL de culture

prélevé à intervalles déterminés suite à l’induction HO d’une culture (QY331, phase semi-

logarithmique) en milieu minimum (ura-) galactose 2%. L’utilisation de ce dernier milieu

de culture était dans l’objectif de conserver la sélection pour le plasmide pGAL-HO, La

moitié de l’ADN extrait a ensuite été digéré toute une nuit par l’enzyme StyI (Gibco) à

37˚C et séparé sur gel d’agarose 1% puis transféré sur membrane Nylon Hybond

(Amersham Biosciences). La sonde a été produite en incorporant de nucléotides radioactifs

à partir de la technique exploitant la polymérisation d’amorces dégénérées (« Megaprime™

DNA Labeling System », Amersham). La séquence ayant servi de gabarit était un fragment

PCR (amplifié en ulitisant les oligonucléotides 12 et 13 du Tableau 5) couvrant la région de

291 à 964 pb de la cassure HO (Distal CEN) (Voir Figure 20). La quantification du signal

radioactif a été faite à l’aide du logiciel ImageQuant suite à l’exposition avec le système

PhosphorImager.

29

E) ChIP (CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION)

Afin de quantifier des modifications sur la chromatine ou le recrutement de protéine

à un locus spécifique (dans mon cas la cassure au site HO), la technique de ChIP ou

chromatine immunoprécipitation fût employée selon les protocoles déjà décrits (Kuo and

Allis, 1999; Nourani et al., 2001) avec quelques modifications. Brièvement, elle consiste à

immunoprécipiter des protéines fixées à des segments d’ADN (Figure 16). Plus

techniquement, pour les besoins de la présente recherche, il suffisait de mettre les cultures

en milieu liquide raffinose 2% (Sigma) pendant 12 à 16 heures après les avoir

préalablement fait croître en préculture dans le glucose 2% (J.T. Baker) et plusieurs

lavages à l’eau stérile. Puis, en pleine phase exponentielle (DO600nm 1.0), on induit la

cassure par ajout de galactose 20% (Sigma) à une concentration finale de 2% selon la

cinétique désirée. La chromatine est ensuite figée par l’ajout de formaldéhyde (Sigma) 1%

final (Pontage Protéine-Protéine et Protéine ADN) pendant 20 minutes; qu’on arrête par la

suite avec la glycine (ICN Biomedicals) 125mM final. La chromatine est extraite par lyse

mécanique (+ 1 volume de billes de verre et vortexer 6 à 8 fois trois minutes avec pauses de

Figure 16: La technique de ChIP (Chromatin IP).

Anticorps

30

deux minutes) après avoir lavé les cellules à l’eau stérile glacée et au TBS 1X glacée. Le

lysat est centrifugé et le culot de chromatine est lavé plusieurs fois. La chromatine est

soniquée aux ultrasons pour obtenir des fragments de 250-500 pb (11 fois 10 secondes sur

sonicateur Fisherbrand [setting env. 70 et output 0,5] avec pause de 15 secondes sur glace

sèche ou 11 fois 30 sec ON/ 60 sec OFF sur Bioruptor Diagenode paramètré à HIGH). Une

centrifugation de 30 minutes permet de récupérer la chromatine soniquée dans le

surnageant. On passe alors à l’immunoprécipitation proprement dite : à une fraction de

cette chomatine soniquée (100 µL ,1/10, dilué dans 450 µL total), on ajoute l’anticorps.

Les anticorps employés sont les suivants : 3 μl anti-H2A P-Ser129 (Downs et al.,

2000), anti-Eaf1 (3 μl; A. Auger et al., soumis), anti-Arp4 (5 μl; Galarneau et al., 2000),

anti-Rvb1 (3 μl; Makino et al., 1999), anti-AcK8H4 (0.5 μl, Upstate), anti-H2A (acidic

patch) (1 μl, Upstate) et anti-H4 P-Ser1 (3 μl; Upstate). On va alors aller littéralement

pêcher le segment de chromatine d’intérêt qui est plus tard lié à des billes sépharose-Protein

A (Amersham Biosciences) pendant quelques heures à 4˚C. Après plusieurs lavages (FA

Lysis buffer 140 mM NaCl; FA Lysis buffer 500 mM NaCl; Nasmyth/Kuo & Allis Wash

Buffer #2; TE) et élution avec détergent TE/SDS 1%, on incube toute une nuit à 65°C pour

renverser le pontage. L’ADN est finalement purifié par extraction phénol/chloroforme

après une étape de digestion protéique avec la protéinase K. La quantification des segments

d’ADN recueillis suite à leur précipitation au NaCl avec éthanol 95% et resuspension dans

100 µL de NTE est effectuée par PCR quantitatif (avec 1/50e volume, 2 µL).

Figure 17: Les quatre jeux d’oligonucléotides choisis et optimisés situés à différentes distances de la cassure double brin HO.

31

Pour quantifier les IPs, le PCR quantitatif (LightCycler, Roche), outil précis et

rapide, fut utilisé. Sommairement, il s’agit d’une réaction PCR avec du SYBR Green, un

agent fluorescent intercalant de l’ADN, qui est dosé à chaque phase d’élongation de chaque

cycle PCR. Les réactifs utilisés sont contenus dans l’ensemble « LightCycler – FastStart

DNA Master SYBR Green I » (Roche). Les réactions PCR ont été effectuées au minimum

en duplicata dans des volumes de 10 ou 20 µL à 3 mM final en MgCl2. Pour étudier la

localisation des modifications chromatiniennes et des protéines d’intérêts à différentes

distances de la cassure double brin, quatre jeux d’amorces (Tableau 5) situées à des

distances différentes de la cassure (Figure 17) ont été choisis et optimisé pour le PCR

quantitatif: HO (no. 1 et 2), tout près de la cassure ; à 0,5 Kb (no. 3 et 4) ; à 1,5 Kb (no. 5 et

6) et à 10 Kb (no. 7 et 8).

Une fois les données obtenues du PCR quantitatif, on calcule un % IP (faisant

intervenir un facteur d’efficacité spécifique à la paire d’amorces utilisées) représentant

l’efficacité à immunoprécipiter la protéine d’intérêt. Le % IP du bruit de fond ou

«background» (IP sans anticorps) est ensuite soustrait du % IP avec anticorps qui est par la

suite normalisé par rapport à un locus contrôle: InterV, une longue région entre 2 gènes du

chromosome V. On obtient alors un % IP normalisé. Le ratio entre % IP Norm à t=x est

divisé par % IP Norm à t=0 pour réfléter le changement d’occupation au site étudié par

Figure 18: Traitement des données obtenues avec le PCR quantitatif.

Figure 19: Oligonucléotides pour doser la coupure HO en PCR quantitatif.

32

rapport à une condition non-induite (Le temps 0 fixé à 1). La combinaison des

oligonucléotides no. 2 et 11 du Tableau 5 a permis de doser le pourcentage de coupure de

la cassure au site HO en PCR quantitatif en quantifiant la perte du produit de 529 pb

amplifié corrigé sur un locus contrôle (InterV).

F) TESTS DE CROISSANCE

Pour tester les différents phénotypes et sensibilités aux agents endommageant

l’ADN des mutants H2A, des aliquotes de dilutions en série d’un facteur 10 de cultures

liquides en phase exponentielle aux concentrations uniformisées ont été dépsosés (5µL) sur

des milieux solides contenant des drogues. Le MMS (Méthyl méthane-sulfonate, Sigma

Aldrich) à une concentration finale de 0.03%, un agent alkylant l’ADN, cause des cassures

simple et double brin. Utilisé à 130 mM, l’hydroxyurée (HU, Sigma), un inhibiteur de la

synthèse des nucléotides, occasionne l’effondrement de la fourche de réplication, et donc

des bris dans l’ADN, lors de la synthèse de l’ADN en phase S.

33

Tableau 3 : Souches utilisées avec le système HO pour étudier la réparation de l’ADN. Lesplasmides sont indiqués entre crochets et décrits au Tableau 2.

Tableau 2 : Plasmides utilisés pour ces recherches.

Nom du plasmide Description Rˇfˇrence

pSAB6 ARS/CEN, URA3, HTA1/HTB1 (Hirschhorn et al. , 1995)

pJHA2 ARS/CEN, HIS3, HTA1/HTB1 (Downs et al. , 2000)

pJHA3 ARS/CEN, HIS3, hta1-S129A/HTB1 (Downs et al. , 2000)

pJHA8 ARS/CEN, HIS3, hta1-S129E/HTB1 (Downs et al. , 2000)

pOJR1 ARS/CEN, HIS3, hta1-S122A/HTB1 cette ˇtude

pOJR2 ARS/CEN, HIS3, hta1-S122E/HTB1 cette ˇtude

pOJR3 ARS/CEN, HIS3, hta1-T126A/HTB1 cette ˇtude

pOJR4 ARS/CEN, HIS3, hta1-T126E/HTB1 cette ˇtude

pOJR5 ARS/CEN, HIS3, hta1-S122A, T126A, S129A/HTB1 cette ˇtude

pOJR6 ARS/CEN, HIS3, hta1-S122E, T126E, S129E/HTB1 cette ˇtude

pOJR7 ARS/CEN, HIS3, hta1-ĘC(121-132)/HTB1 cette ˇtude

pGAL-HO ARS/CEN, URA3, LEU2, GAL10-HO (Jensen et al., 1984)

Nom de la souche Description Rˇfˇrence

JKM115MATα, Ęho, Ęhml::ADE1, Ęhmr::ADE1, ade1, leu2-3,112 lys5, trp1::hisG, ura3-52

(Moore et al. , 1996)

QY331 idem JKM115 sauf <pGAL-HO> (Downs et al. , 2004)

JDY68idem JKM115 sauf hta1-S129*/hta2-S129*, INO80-Myc

(collaboration J. Downs)

QY338 idem JDY68 sauf <pGAL-HO> cette ˇtude

JKM179 idem JKM115 sauf ade3::GAL-HO (Moore et al. , 1996)

QY359 idem JKM179 sauf arp4-12 ts::NatR (Downs et al., 2004)

QY360 idem JKM179 sauf esa1L254P ts::NatR (Downs et al. , 2004)

QY1020-7 idem JKM179 sauf swr1-HA::KAN cette ˇtude

QY1019-7 idem JKM179 sauf Ęswr1::NatR cette ˇtude

34

Nom de la souche Description Rˇfˇrence

FY406MATα, his3Ę200, trp1Ę63, lys2-128d, ura3-52,leu2Ę1 hta1/htb1::LEU2, hta2/htb2::TRP1, <pSAB6>

(Hirschhorn et al. , 1995a)

JHY2 idem FY406 sauf <pJHA2> au lieu de <pSAB6> (Downs et al. , 2000)



QY1000 idem FY406 sauf <pOJR1> au lieu de <pSAB6> cette ˇtude







Tableau 4 : Souches utilisées pour les gènes codants pour l’histone H2A. Les plasmides sont indiqués entre crochets et décrits au Tableau 2.

Tableau 5 : Oligonucléotides utilisés en PCR quantitatif et pour le dosage de la coupure en Southern.

No. Nom de l'oligonuclˇotidePosition (CEN Distal)

�par rapport la cassure

Facteur d'efficacitˇ

en PCR quantitatif

Sˇquence

1 HO LIGHT FOR 68 GTGGTGACGGATATTGGGAA

2 HO LIGHT REV 211 GGGAACAAGAGCAAGACGAT

3 0.5KB FROM HO FOR 604 TGCCTCCACAGTAGAGGTTA

4 0.5KB FROM HO REV 721 GAGAAGACTTGTGGCGAAGA

5 TAF2 (+2470)-F 1494 GGCATAAGACTCGCGGCGTGCGAAG

6 TAF2 (+3049)-R 1803 GCTGCGGACGTACGCATCATCACTG

7 BUD23 (+307)-F 10057 GGGATACCGTTCCGGGCGGGCT

8 BUD23 (+635)-R 10391 TCACCTGCTCCTCCCCCTGCGG

9 INTERGENIC V-1 (chromosome diffˇrent) GGCTGTCAGAATATGGGGCCGTAGTA

10 INTERGENIC V-2 (chromosome diffˇrent) CACCCCGAAGCTGCTTTCACAATAC

11 HO-MATALPHA1+97-F -317 - GCTGAGCATGTGAGGCCAAGCTGC

12 HO-CUT-F 291 - CTCAGACTCAAGCAAACAATC

13 HO-CUT-R 964 - AAGTGGTCATTACGTCGATG

1.843

1.932

1.628

1.897

2.000

35

Tableau 6 : Oligonucléotides utilisés pour la mutagenèse dirigée de l’histone H2A, l’ajout de l’épitope HA à Swr1 et la délétion de Swr1.

No. Nom Sˇquence

1 S122A-HTA1-F CCATCAAAACTTGTTGCCAAAGAAGGCTGCCAAGGCTACCAAGGCTTCTCAAG

2 S122A-HTA1-R CTTGAGAAGCCTTGGTAGCCTTGGCAGCCTTCTTTGGCAACAAGTTTTGATGG

3 S122E-HTA1-F CCATCAAAACTTGTTGCCAAAGAAGGAGGCCAAGGCTACCAAGGCTTCTCAAG

4 S122E-HTA1-R CTTGAGAAGCCTTGGTAGCCTTGGCCTCCTTCTTTGGCAACAAGTTTTGATGG

5 T126A-HTA1-F GTTGCCAAAGAAGTCTGCCAAGGCTGCCAAGGCTTCTCAAGAATTATAAGATCGG

6 T126A-HTA1-R CCGATCTTATAATTCTTGAGAAGCCTTGGCAGCCTTGGCAGACTTCTTTGGCAAC

7 T126E-HTA1-F GTTGCCAAAGAAGTCTGCCAAGGCTGAGAAGGCTTCTCAAGAATTATAAGATCGG

8 T126E-HTA1-R CCGATCTTATAATTCTTGAGAAGCCTTCTCAGCCTTGGCAGACTTCTTTGGCAAC

9S122A-T126A-S129A-HTA1-F

CAAAACTTGTTGCCAAAGAAGGCTGCCAAGGCTGCCAAGGCTGCTCAAGAATTATAAGATCGGTTCTGG

10S122A-T126A-S129A-HTA1-R

CCAGAACCGATCTTATAATTCTTGAGCAGCCTTGGCAGCCTTGGCAGCCTTCTTTGGCAACAAGTTTTG

11S122E-T126E-S129E-HTA1-F

CAAAACTTGTTGCCAAAGAAGGAGGCCAAGGCTGAGAAGGCTGAGCAAGAATTATAAGATCGGTTCTGG

12S122E-T126E-S129E-HTA1-R

CCAGAACCGATCTTATAATTCTTGCTCAGCCTTCTCAGCCTTGGCCTCCTTCTTTGGCAACAAGTTTTG

13 ĘC(121-132)-HTA1-F CATCCATCAAAACTTGTTGCCAAAGTAGTCTGCCAAGGCTACCAAGGCTTCTC

14 ĘC(121-132)-HTA1-R GAGAAGCCTTGGTAGCCTTGGCAGACTACTTTGGCAACAAGTTTTGATGGATG

15 SWR1-F2 CGAGTACATGATCAGGTTTATTGCCAACGGTTATTATTATCGGATCCCCGGGTTAATTAA

16 SWR1-R1 ATTATGGCTATATATCATTAAAATATTCACAATAGGTATAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC

17 KO Swr1 NATR 5' CTGCTCTTTGCATTTTCCAAGTTATTGCATTACAAGAATATACATGGAGGCCCAGAATACCC

18 KO Swr1 NATR 3' CGATTTGGACAACTAAGGCAGCGGTGAAGAGTAGAACCTGGTCCTTCAGTATAGCGACCAGCATTCAC

III. RÉSULTATS

A) OPTIMISATION DE L’INDUCTION DE LA CASSURE

1. Milieu minimum

Dans un premier temps, le système HO dut être mis au point. En effet, afin de

connaître la cinétique de l’induction de l’endonucléase HO et l’introduction de la cassure

double brin, le système a été optimisé. L’objectif était d’obtenir un haut rendement de

cassure dans un délai assez court. Pour ce faire, le dosage du pourcentage de coupure fût

effectué.

Des premiers essais avec pGAL-HO en milieu minimum (pour conserver la

sélection sur le plasmide) semblait donner un faible rendement. Effectivement, une analyse

Southern (Figure 20A) montre à peine un début de coupure suite à une heure d’induction.

Observant l’apparition d’un fragment d’ADN de 700 pb avec une sonde radioactive (Figure

20B), il est possible de quantifier 40% de coupure au site HO après 3h avec le logiciel

ImageQuant (Figure 21, en vert). Nous avons alors émis l’hypothèse que le milieu de

culture ralentissait le métabolisme de la cellule et ainsi l’induction de la nucléase HO.

Figure 20: Dosage du % de coupure à la cassure avec pGAL-HO en milieu minimum par analyse Southern (A). La localisation de la sonde radioactive utilisée est décrite en plus bas en B.

A B

37

2. Milieu riche

En induisant la même souche (QY331) en milieu riche, on note une différence

significative. La proportion de cassure est plus élevée et apparaît plus précocement. Dosé

avec l’aide du PCR quantitatif (calcul de la perte d’un produit PCR de 529 pb, voir Matériel

et Méthodes p. 30), on obtient plus de 40% de coupure passées les 15 premières minutes

d’induction suivi d’une augmentation progressive plafonnant à 95% (Figure 21, en bleu).

Étant donné que la sélection du plasmide n’est plus assurée en milieu riche, le

deuxième système fut exploité: GAL-HO intégré. Comme on le voit dans l’histogramme

aux bandes jaunes de la Figure 21, l’emploi de second système d’induction en milieu riche,

génère 80% de coupure après seulement 30 minutes. Par conséquent, les résultats de ChIPs

présentés dans cette étude sont obtenus avec le second système.

B) S129 DE H2A EST RAPIDEMENT PHOSPHORYLÉE À LA CASSURE

1. Détection de γ-S129 par ChIP en PCR classique

Dans la littérature, il a été démontré que Mec1, une kinase de la famille ATM, est

recrutée aux sites de dommage à l’ADN (Rouse and Jackson, 2002). Puisque Mec1 peut

phosphorylé la sérine 129 de l’histone H2A, il est intéressant de vérifier si H2A est

phosphorylée sur son 129e résidu au site de cassure. Le premier résultat concluant de ChIP

Figure 21: Dosage du % de coupure à la cassure. À gauche, avec pGAL-HO en milieu minimum par Southern et ImageQuant (Vert) ou en milieu riche par PCR quantitatif (Bleu). À droite, avec la version intégrée de GAL-HO en milieu riche (Jaune).

38

anti-γ-Ser129, obtenu en PCR classique (Figure 22A), montre une augmentation évidente

de la phosphorylation de la sérine 129 de l’histone H2A à 1.5 Kb de la cassure suite à 45

minutes d’induction. Notons que très près de la cassure (HO) et au locus contrôle (InterV),

aucune accumulation majeure de γ-Ser129 est détectée. Le taux de coupure, analysé par

PCR classique (Figure 22A) et PCR quantitatif (Figure 22B), confirme une très bonne

induction et action de l’enzyme (95%) dans cette exprérience. La taille de la chromatine

utilisée dans cette expérience est inférieure à 0.5 Kb comme souhaité et uniforme entre les

différents temps d’induction. Signalons que les prochains résultats de ChIP décrits par la

suite sont tous analysés par PCR quantitatif.

2. Détection de γ-S129 par ChIP en PCR quantitatif

Dans une cinétique plus longue, on observe que cette phosphorylation de la S129 de

H2A à la cassure augmente rapidement dans le temps puis diminue (Figure 23). Elle atteint

son niveau le plus élevé à environ 45 minutes. De plus, cette modification post-

traductionnelle couvre une large région de chromatine puisqu’elle est présente à 10 Kb de

la coupure et peut-être même davantage. Dernièrement d’autres équipes ont montré la

phosphorylation de la S129 dans la région située entre 2 et 25 Kb de la coupure (Shroff et

Figure 22: La sérine 129 de H2A est phosphorylée après 45 min à 1.5 Kb de la cassure double brin HO. (A) ChIP anti-P-Ser129 de H2A et dosage de la coupure en PCR classique. (B) Dosage de la coupure en PCR quantitatif. (C) Taille de la chromatine soniquée pour cette cinétique sur gel d’agarose 2 % coloré au bromure d’éthidium (0.5 µg/mL).

0.4- 0.3- 0.2- 0.15

-

39

al., 2004). Ces résultats montrent que la phosphorylation de l’histone H2A survient à la

chromatine près du dommage à l’ADN, tout comme H2A.X de mammifère.

3. Le faible niveau de γ-S129 à la cassure n’est pas due à la résection

Curieusement, un faible signal P-Ser129 H2A est détecté très près de la cassure

(<0.5 Kb). Une hypothèse pouvant expliquer ce phénomène, serait une perte de

nucléosomes, davantage accentuée tout près de la cassure qu’à plusieurs milliers de paires

de bases, occasionné par le processus de réparation lui-même. En particulier, la résection

est l’une des premières étapes dans le mécanisme de réparation. Il s’agit de la phase au

cours de laquelle les extrémités 5’ des brins d’ADN de chaque côté d’une cassure double

brin sont progressivement digérées par une exonucléase (Figure 24) (Lee et al., 1998).

Pour vérifier cette hypothèse, les IPs de la Figure 23 ont été normalisé sur un second IP

contre H2A non-phosphorylée. Cependant, même en corrigeant pour une éventuelle perte

Figure 23: La sérine 129 de H2A est phosphorylée rapidement à la cassure. ChIP anti-P-Ser129 de H2A en PCR quantitatif. % de coupure : 48%, 79%, 79%, 83%, 90% et 91% respectivement.

Figure 24: Mécanisme de résection.

40

de nucléosome et donc d’histones, on observe toujours une faible accumulation très près de

la cassure (Figure 25).

4. α-P-S129 ne reconnaît pas un mutant S129*

Pour confirmer les modifications P-H2A observées à la cassure, on devait

déterminer la spécificité de l’anticorps utilisé en ChIP. Une cinétique à intervalle régulier

jusqu’à 4 heures montre que l’anticorps anti-P-SerS129 est incapable de reconnaître un

mutant S129* (*= codon STOP) de H2A alors que la cloche de phosphorylation est observé

dans une souche sauvage (Figure 26). L’anticorps choisi est donc spécifique à la

phosphorylation de S129 de H2A.

Figure 25: La baisse de Phos-S129 à la cassure n’est pas due à la résection. ChIP anti-P-Ser129 de H2A normalisé sur histone H2A totale en PCR quantitatif.

Figure 26: L’anticorps anti-γ-Ser129 de H2A est spécifique.

41

C) NuA4 EST RECRUTÉ RAPIDEMENT À LA CASSURE

1. Détection de la sous-unité Eaf1 à la cassure par ChIP par PCR quantitatif Étant donné le grand nombre de mutants de sous-unités du complexe NuA4

sensibles aux agents endommageant l’ADN, on a étudié le rôle que pourrait jouer NuA4 en

réponse aux bris de l’ADN. Dans un premier temps, nous devions démontrer que le

complexe était recruté au site de bris. Des IPs anti-Eaf1 sur la même chromatine que la

cinétique de P-H2A de la Figure 23, montrent la détection de NuA4 au site de dommage et

ce à moins de 2 kb de la cassure (Figure 27). Tout comme la phosphorylation de la S129,

le recrutement de NuA4 augmente rapidement dans le temps. Par contre, à la différence de

γ-S129, NuA4 persiste jusqu’aux inductions les plus longues et est absent à 10 Kb.

2. Un mutant arp4 occasionne une perte de recrutement de NuA4 à la cassure

Une des sous-unités de NuA4 dont le mutant est très sensible aux agents

endommageant l’ADN, est Arp4. Commune aux complexes NuA4, INO80 et SWR1, elle

pourrait jouer un rôle très important dans le recrutement de ces complexes. Des ChIPs anti-

Arp4 mené aux temps 2 et 4 heures de la cinétique démontrent le recrutement de ces

complexes à la cassure (Figure 28A). Sa détection est observée majoritairement au site de

bris lui-même. Cela concorde avec les résultats obtenus précédemment à savoir que NuA4

est concentré à moins de 2 Kb de la coupure (Figure 27). Nos expériences ont récemment

suggéré que Arp4 était la sous-unité impliquée dans le recrutement du complexe via une

Figure 27: NuA4 est recruté rapidement à moins de 2 Kb de la cassure. ChIP anti-Eaf1 en PCR quantitatif.

42

interaction directe avec la P-Ser129 in vitro

(Downs et al., 2004). Pour vérifier les

résultats obtenus avec Eaf1 et déterminer

quelle importance Arp4 a dans l’association

de NuA4 in vivo, des ChIPs anti-Eaf1 sur un

mutant arp4 ts comparativement à une

souche sauvage ont été faits. Le mutant

thermosensible arp4 ts affecte la fonction de

NuA4 mais pas son intégrité lorsqu’il est

induit à 22˚C (Galarneau et al., 2000). Les

données obtenues (Figure 28B) suggèrent

clairement une perte de recrutement de

NuA4 dans le mutant pour la protéine Arp4

si l’on compare à une protéine sauvage. À la

lumière des résultats récoltés par les IPs

anti-Eaf1 et anti-Arp4, nous retrouvons

deux sous-unités de NuA4 au site HO;

démontrant donc la présence de NuA4 à la

cassure. Une troisième évidence de cette

affirmation serait de mesurer son action au site de bris.

3. L’histone H4 est acétylée à la cassure

Le complexe NuA4 a comme substrat principal et spécifique l’histone H4 qu’il

acétyle sur les résidus 5, 8 et 12 in vivo. La détection de cette activité acétyltransférase à la

cassure double brin, par quantification directe par ChIP par les marques chromatiniennes,

confirmerait de la présence et le rôle fonctionnel de NuA4 à la cassure. Des ChIPs anti-

Lys8 de H4 normalisés à H2A montrent que l’acétylation de la Lys8 de H4 survient

rapidement à < 2Kb de la cassure (Figure 29). La cinétique d’apparition de NuA4 et de

l’acétylation semble concorder. Tout comme la phosphorylation de la S129,

l’accumulation de cette seconde marque chromatienne, AcLys8 de H4, augmente

Figure 28: Arp4, une sous-unité de NuA4 présente à la cassure, joue un rôle dans le recrutement du complexe. (A) ChIP anti-Arp4 en PCR quantitatif suite une induction de 45 min (>90% de coupure) (B) Un mutant arp4 ts produit une perte de recrutement de NuA4 à la cassure. ChIP anti-Eaf1 en PCR quantitatif suite une induction de 45 minutes (80% et 50% de coupure au site HO pour WT et mutant respectivement).

43

rapidement puis diminue. Elle atteint son maximum à 30 minutes post-induction. Il s’agit

ici de la troisième évidence de cette recherche que NuA4 est fonctionnellement actif dans la

réparation des cassure double brin.

D) LES COMPLEXES CONTENANT Rvb1 SONT RECRUTÉS TARDIVEMENT À LA CASSURE

1. Détection de Rvb1 à la cassure par ChIP en PCR quantitatif

Comme décrit précédemment, la sous-unité Arp4 est d’une grande importance pour

que NuA4 puisse exercer son rôle à la cassure double brin. Cependant, il ne s’agit pas

d’une sous-unité exclusive puisqu’elle est aussi partagée avec les complexes INO80 et

SWR1. Dans le but de vérifier si ces deux complexes chromatiens ATP-dépendants sont

aussi recrutés à la cassure, nous avons utilisé un anticorps anti-Rvb1 en ChIP. Rappelons

que cette sous-unité est commune à INO80 et SWR1 et absente de NuA4.

Des IPs anti-Rvb1 montrent que les complexes contenant Rvb1 sont recrutés plus

tardivement que NuA4 à la cassure (Figure 30). Le recrutement est faible pendant les

premières 60 minutes, puis augmente rapidement dès 2 heures d’induction. Tout comme

NuA4, les complexes contenant Rvb1 sont recrutés davantage à < 2 Kb.

Figure 29: La Lys8 de l’histone H4 est acétylée rapidement à moins de 2 Kb de la cassure transitoirement. ChIP anti-Ac-Lys8 de H4 en PCR quantitatif.

44

2. Un mutant esa1 cause un retard dans le recrutement des complexes contenant Rvb1 à la cassure

Comme le complexe HAT NuA4 arrive avant les complexes contenant Rvb1, nous

avons vérifié si son activité acétyltransférase affecte le recrutement de INO80 et SWR1.

Esa1 est la sous-unité enzymatique essentielle de NuA4 qui est responsable de l’acétylation

des lysines sur H4. Nous avons testé l’implication de son activité acétyltransférase sur le

recrutement tardif des complexes contenant Rvb1. Un mutant esa1 ts est défectif pour le

recrutement des complexes contenant Rvb1 à HO et HO + 1.5 Kb à température semi-

permissive (28˚C, pour accentuer le phénotype sans provoquer la mort cellulaire). Ce

mutant thermosensible réduit l’activité du complexe in vivo (nulle à 37˚C) et l’abolit in

vitro à température restrictive (Boudreault et al., 2003; Clarke et al., 1999). En effet, des

Figure 30: Les complexes contenant Rvb1 sont recrutés tardivement au site de cassure. ChIP anti-Rvb1 en PCR quantitatif.

Figure 31: Un mutant esa1 ts cause un défaut dans le recrutement des complexes contenant Rvb1 à HO et à 1.5 Kb. ChIP anti-Rvb1 en PCR quantitatif après une induction à 28˚C (82%, 95%, 95% et 95% de coupure pour ESA1 et 79%, 87%, 93% et 95% pour esa1).

45

IP anti-Rvb1 pour une souche ESA1 sauvage montre un bon recrutement progressif tout au

long de la cinétique (Figure 31, en bleu). Alors qu’il y a un recrutement moins efficace des

complexes que sont SWR1 et INO80 dans un mutant esa1 ts tout au long de la cinétique.

Cela nous porte à croire que l’acétylation de H4, c’est-à-dire l’action préalable de NuA4, à

la cassure est requise pour le recrutement efficace des complexes contenant Rvb1.

3. Un mutant arp4 cause un retard dans le recrutement des complexes contenant Rvb1 à la cassure

Arp4 étant une sous-unité impliquée

dans le recrutement de NuA4 à la cassure,

nous avons investigué la possibilité que cela

puisse s’appliquer aussi pour le recrutement

des deux autres complexes contenant Arp4 :

INO80 et SWR1.

Des IPs anti-Rvb1 montrent, suite à

une induction de quatre heures à 26˚C, qu’un

mutant arp4 ts affecte le recrutement des

complexes contenant Rvb1 à la cassure

(Figure 32). Bien que l’expérience mérite

d’être effectuée à nouveau, le phénomène est

davantage observable à 1.5 Kb de la coupure

que tout près de la cassure (HO). Comme

nous l’avons démontré à la section

précédente, l’acétylation de H4 par NuA4 est

requise pour le recrutement subséquent des

complexes contenant Rvb1. Il est alors possible que l’effet observé à la Figure 32 soit peut-

être partiellement attribuable à un défaut de liaison de NuA4 au site de cassure. Dans ce

mutant arp4 ts, NuA4 a davantage de difficulté à être recruté puisque sa sous-unité

interagissant avec P-H2A est affectée.

Figure 32: Un mutant arp4 ts cause un défaut dans le recrutement des complexes contenant Rvb1 à HO et à 1.5 Kb. ChIP anti-Rvb1 en PCR quantitatif après une induction pendant quatre heures à 26˚C (90% et 86% de coupure respectivement pour ARP4 sauvage (WT) et arp4 ts).

46

4. Swr1 n’est pas recruté à la cassure par ChIP en PCR quantitatif

Les protéines Rvb1 et Rvb2 sont présentes chez les complexes SWR1 et INO80. Pour

distinguer la proportion respective responsable du signal Rvb1 à la cassure, la protéine

Swr1 à été marqué d’un épitope 3HA. Alors que des IPs anti-P-Ser129 de H2A présentent

la cloche de phosphorylation habituelle et que des IPs anti-Rvb1 montrent le recrutement

tardif attendu de Rvb1 à la cassure, aucun signal n’est détecté en immunoprécipitant Swr1-

HA (Figure 33). Ce premier résultat préliminaire laisse croire que le complexe SWR1 n’est

pas présent à la cassure. Une interrogation peut subsister à savoir si la protéine est

vraiment produite en fusion avec l’épitope 3HA. Pourtant, un Western Blot anti-HA (non-

montré) a confirmé la production de la protéine de fusion in vivo. De plus, l’anticorps

employé en ChIP a été testé et utilisé avec succès dans d’autres expériences de ChIP.

D’autres hypothèses peuvent être posées : soit le tag HA brise le complexe et son activité,

soit SWR1 ne contribue pas de façons majoritaires au recrutement de Rvb1 observé à

quatre heures.

Figure 33: Swr1 n’est pas recruté à la cassure. ChIP anti-P-Ser129-H2A, anti-Rvb1 et anti-HA en PCR quantitatif (90%, 96% et 96% de coupure après 1, 2 et 4 heures respectivement).

47

5. Le recrutement des complexes contenant Rvb1 n’est pas gravement affecté dans une souche ∆swr1

Pour continuer de déterminer à quel(s) complexe(s) est imputable le signal Rvb1,

i.e. INO80 et/ou SWR1, une souche dans laquelle SWR1 est délété (∆swr1) a été construite.

Des IP anti-Rvb1 préliminaires dans une cinétique à intervalles réguliers s’échelonnant sur

quatre heures, montrent que Δswr1 ne cause pas de retard important dans le recrutement de

Rvb1 (Figure 34). Comme on peut le voir à HO et à 1.5 Kb, il n’y a pas de différence

marquante entre le SWR1 sauvage et le mutant à l’exception peut-être du léger retard à HO

au temps de deux heures. La perte de Swr1 ne défait pas le complexe et les autres sous-

unités sont recrutées dont Rvb1. Finalement, il semble donc que SWR1 ne soit pas le joueur

majoritaire responsable du signal Rvb1 à la cassure double brin et que ce soit plutôt INO80.

Pour appuyer cette hypothèse, nous avons détecté INO80 à la cassure (Downs et al., 2004).

Figure 34: Un mutant ∆swr1 n’occasionne pas de retard important dans le recrutement des complexes contenant Rvb1 à HO et à 1.5 Kb. ChIP anti-Rvb1 en PCR quantitatif (>95% de coupure pour SWR1 et ∆swr1à 1, 2 et 4 heures).

48

E) AUTRES MODIFICATIONS D’HISTONES DANS LA RÉPARATION DE L’ADN

1. Détection de la phosphorylation de S1 de l’histone H4 à la cassure par ChIP en PCR quantitatif

Tout dernièrement, notre équipe de recherche a présenté une modification

chromatiennne régulant l’activité du complexe NuA4. La phosphorylation de la sérine 1 de

l’histone H4 agit comme inhibiteur de la fonction histone acétyltransférase de NuA4

((Utley et al., 2005), voir Annexe B). Par conséquent, cela se traduit par une chute

d’acétylation dans les régions chromatiniennes P-S1. Comme nous observons ce même

phénomène dans un contexte de réparation de cassure double brin, est-ce que la

Figure 35: La sérine 1 de H4 est phosphorylée tardivement à la cassure. ChIP anti-P-Ser1 de H4 en PCR quantitatif.

49

phosphorylation du premier résidu de l’histone H4 serait impliquées dans la réparation des

dommages à l’ADN? Il semble bien que ce soit le cas puisque la sérine 1 de l’histone H4

est phosphorylée tardivement à la cassure, comme le montrent des IPs anti-P-Ser1 (Figure

35). Comparativement à l’accumulation précoce (en 30 minutes) de phosphorylation de la

S129 de H2A, celle sur Ser1 de H4 survient plus tard (des heures après l’induction) alors

que l’acétylation est absente.

2. Tests de sensibilité aux agents endommageant l’ADN de mutants de sites de phosphorylation de la queue C-terminale de H2A

Dans la recherche de nouveaux résidus d’histones dont les modifications post-

traductionnelles seraient impliquées dans la réparation des bris à l’ADN (autres sites de

liaison pour Arp4 par exemple), de nombreuses évidences supportent le caractère essentiel

de l’histone H2A en réparation. Déjà par l’important rôle de la S129 de son extrémité C-

terminale, elle s’avère intéressante à étudier étant donné la présence de deux autres sites

phosphorylables à cette extrémité (S122 et T126). De plus, ces deux résidus sont

conservés chez le variant H2A.X humain alors que la S122 est conservée pour la majorité

des espèces (Figure 36). Des mutants pour ses trois sites de H2A (identifiés en rouge à la

Figure 36), des combinaisons de ces mutations ponctuelles ainsi qu’une troncation des 12

derniers acides aminés C-terminal de H2A ont été générés. Pour vérifier leur sensibilité

aux agents endommageant l’ADN, des aliquotes de dilutions en série d’un facteur 10 de

cultures de levures furent déposés sur des milieux solides contenant des drogues (Figure

Figure 36: Alignement de séquences de la queue C-terminale de l’histone H2A. Les résidus mutés pour H2A de levure sont identifiés en rouge. Les résidus phosphorylables T126 et S129 sont conservés chez le variant H2A.X humain alors que la S122 est conservée chez l’histone H2A majeure dans la majorité des espèces.

50

37). Le MMS (Méthyl méthane-sulfonate) et HU (Hydroxyurée) sont déjà connus pour

causer des cassures double brin. Des études avaient déjà démontré la légère sensibilité du

mutant S129A au MMS et que S129E rétablissait le phénotype sauvage (Downs et al.,

2000). Le résultat surprenant est celui de S122A qui est plus sensible que le résidu S129A

en MMS. De plus, son équivalent muté en glutamate ne restaure pas le phénotype sauvage.

S122A et S122E sont aussi légèrement sensibles à HU. Pour leur part, les mutants T126A

et T126E ne semblent pas présenter de sensibilité que ce soit au MMS ou à HU. En

combinant les 3 mutations (S122A+T126A+S129A) on observe un phénotype aussi sévère

en MMS et HU que S122A qui lui même est aussi sensible qu’une délétion complète du C-

terminal de l’histone H2A (3 panneaux du bas de la Figure 37). C’est donc dire que le

résidu S122 pourrait être un acteur important dans la réparation de l’ADN. De plus, comme

le mutant arp4 ts est plus sensible que le mutant hta1-S129A, il est probable que d’autres

sites puissent être liés par Arp4.

Figure 37: Test de sensibilité aux agents endommageant l’ADN des mutants pour les résidus phosphorylables en C-terminal de l’histone H2A.

IV. DISCUSSION

A) LA PHOSPHORYLATION DE LA S129 DE H2A S’ACCUMULE RAPIDEMENT À LA CASSURE SUITE À UN BRIS DE L’ADN

Très clairement la S129 de l’histone H2A est phosphorylée suite à un dommage à

l’ADN chez la levure, comme chez les mammifères et la drosophile. Sa distribution au site

de bris couvre une région de 60 à 10 000 pb jouxtant la cassure double brin. Bien que

n’ayant pas testé son accumulation à plus de 10 Kb, il est raisonnable de croire qu’elle peut

se maintenir sur encore plusieurs milliers de paires de bases. Dernièrement une autre

équipe a montré la phosphorylation de la S129 dans la région située entre 2 et 25 Kb

(Shroff et al., 2004). La région couverte par cette modification chez les mammifères est

estimée à plusieurs mégabases (Redon et al., 2002; Rogakou et al., 1999; Rogakou et al.,

1998).

Étant donné que notre système n’implique que la γ-S129 de H2A en NHEJ, on peut

se demander si elle spécifique à ce mécanisme ou si elle est présente dans les autres

mécanismes de réparation des DSB notamment HR et SSA. À ce sujet, il a été suggéré que

la phosphorylation de l’histone H2A est davantage impliquée dans le mécanisme de

réparation de l’ADN NHEJ plutôt que HR (Downs et al., 2000).

Un fait particulier concerne la presque absence du signal à moins de 250 pb.

Normalement, on se serait attendu à retrouver le plus haut niveau de phosphorylation très

près de la cassure. Comment expliquer cette observation inattendue? Dans un premier

temps, nous avons pensé à une perte de nucléosomes, phénomène amplifié à courte distance

de la coupure, étant donné le relâchement infligé à la structure chromatienne par la

résection. Cependant, même en compensant pour une possible perte de nucléosome

(Normalisation sur l’histone H2A), nous observons la même perte de signal directement à

la cassure, cela confirmé aussi par une autre recherche (Shroff et al., 2004). Il a ensuite été

proposé que la multitude de protéines impliquées dans la réparation et recrutées

spécifiquement à l’endroit même du bris (< de 1 Kb) puissent masquer le signal Phospho-

H2A et compliquer, voir rendre difficile, son immunoprécipitation et conséquemment sa

détection. Pour appuyer cette hypothèse, la protéine MRE11 du complexe MRN à été

52

retrouvé jusqu’à plus de 5 Kb de la coupure avec un ratio de changement d’occupation

atteignant pratiquement 50 à quelques centaines de paires de bases de la cassure (Shroff et

al., 2004). D’autres protéines ont aussi démontré une interaction pour la γ-H2A.X : Nbs1

(Kobayashi, 2004) et 53BP1 (Ward et al., 2003). De plus, ce type de distribution de la P-

H2A n’est pas particulier du locus MAT puisque qu’il est aussi observé aux DSB induites

ailleurs dans le génome (Shroff et al., 2004). Il est aussi possible de l’expliquer par une

déphosphorylation ou remplacement de l’histone H2A tardive dans le processus de

réparation.

B) LE COMPLEXE NuA4 EST RECRUTÉ RAPIDEMENT À LA CASSURE SUITE À LA PHOSPHORYLATION DE LA S129 DE H2A

Au même moment où apparaît la phosphorylation de S129 sur H2A, le complexe

HAT NuA4 est rapidement recruté à la cassure (Figure 36). En fait, on observe

principalement sa sous-unité Eaf1 présente à moins de deux kilobases de la DSB. Ces

données semblent indiquer un possible lien entre cette marque chromatinienne spécifique et

le recrutement de NuA4.

De premiers résultats par spectroscopie de masse nous avaient aiguillé sur cette

piste : nous avions identifié la sous-unité de NuA4 Eaf3 (Eisen et al., 2001) comme

protéine associée à la Phospho-Ser129 de H2A. Esa1 démontrait aussi des intéractions

avec cette modification.

Récemment, des travaux ont décrit par ChIP la présence de Arp4 au site de cassure

(Bird et al., 2002). Sachant que cette sous-unité est partagée avec au moins deux autres

complexes impliqués dans la réparation des cassure double brin, il n’était pas possible

d’affirmer que NuA4 était au site. La présente étude le démontre par sa sous-unité

spécifique Eaf1 pour la première fois. Mais nous avons aussi été en mesure d’observer le

recrutement de Arp4 à la coupure (voir section Résultats, Figure 28). De même un mutant

arp4 ts cause une perte de recrutement de NuA4 au site étudié.

53

En collaboration avec le Dr J. Downs, nous avons démontré que c’est bien par sa

sous-unité Arp4, dont le mutant est hypersensible au MMS, que le complexe HAT NuA4

s’accumule au site de bris (Downs et al., 2004). Des tests d’interaction in vitro en utilisant

des peptides de l’histone H2A phophorylée en position S129 déterminèrent une interaction

importante avec Arp4 alors qu’inexistante avec le peptide sauvage autant avec des protéines

purifiées (Complexe NuA4 purifié, Arp4 recombinant seul) que des extraits cellulaires

complets. L’interaction obtenue avec seul le complexe NuA4 purifié montre bien que Arp4

lie directement et sans autre facteur de liaison la marque de phosphorylation de H2A. Dans

un complexe NuA4 purifié contenant un mutant arp4 ts, il y a perte de cette interaction.

Enfin, Arp4 recombinant reconnaît spécifiquement la S129 phosphorylé sur un peptide

H2A.

Si cette interaction NuA4-P-H2A est véritable, comment expliquer la présence de

NuA4 à moins de 2 kb de la cassure alors que la marque P-S129 est détectée davantage à

plus de 10 Kb? Il faut savoir que le modèle privilégié pour le moment est celui de

l’accumulation/rétention de NuA4 à la coupure par son interaction via Arp4 avec la P-S129

de H2A plutôt que du recrutement initial. Ce dernier serait assumé par un autre mécanisme

et expliquerait pourquoi les complexes contenant Arp4, dont le recrutement initial serait

indépendant de P-Ser129, ne sont pas distribués uniformément sur la région chromatinienne

phosphorylée. D’ailleurs, Celeste et al. ont montré que la γ-H2A.X n’est pas requise pour la

formation des foci mais plutôt pour leur durée (Celeste et al., 2003). Comme le démontrent

mes résultats sur milieu solide avec drogue, un mutant arp4 est plus sensible qu’un mutant

hta1-S129A. Pour ces raisons, il est possible que la P-Ser129 de H2A ait un rôle redondant

avec d’autres modifications chromatiniennes aux dommages.

D’autres résultats publiés par notre équipe montrent des enrichissements à la

coupure HO des sous-unités Esa1 (ChIPs anti-Esa1) et Epl1 (ChIPs Epl1-TAP)

comparativement aux locus contrôles (Downs et al., 2004).

Concernant l’activité de NuA4, c’est-à-dire l’acétylation des histones, elle est

détectée à la coupure dans la même région que NuA4 (< 2 Kb). Comme on s’y attend, elle

augmente au fur et à mesure que Eaf1 s’accumule au site de bris, mais chute après 45 à 60

54

minutes (Figure 38). Cela peut s’expliquer par un début de réassemblage de la chromatine

suite à une réparation complétée. Une baisse d’acétylation de la lysine 16 de l’histone H4,

due à l’arrivée du complexe HDAC Sin3/Rpd3, est remarquée suite à l’induction de HO

(Jazayeri et al., 2004). Une autre possibilité est le masquage du signal par le complexe

SWR1 via sa sous-unité Bdf1, contenant deux motifs bromodomaines liant les histones

acétylées (particulièrement l’histone H4) (Kobor et al., 2004; Krogan et al., 2003;

Matangkasombut and Buratowski, 2003; Mizuguchi et al., 2004).

L’importance de l’acétylation de NuA4 à la cassure est aussi supportée par d’autres

évidences. La délétion des substrats de NuA4, les queues N-terminale des histone H4 et

H2A, confère un phénotype sensible au MMS (Downs et al., 2004). Les mutants des trois

sous-unités indispensables à l’acétylation des histones H4 et H2A sur la chromatine (Esa1,

Epl1 et Yng2), réunies sous le vocable complexe Picollo NuA4, sont sensibles aux agents

causant des bris à l’ADN. Le mutant arp4-S23A (Gorzer et al., 2003), n’affectant pas la

fonction de NuA4 donc l’acétylation (S. Allard, L. Galarneau, U. Wintersberger et J.

Côté, données non-publiées), n’est pas hypersensible au MMS (Downs et al., 2004)

confirmant la corrélation entre l’activité de NuA4 et les dommages à l’ADN.

Figure 38: Sommaire d’apparition temporelle des modifications d’histones et activités chromatiniennes détectées par ChIPs à 1.5 Kb de la cassure double brin. (Résultats modifiés pour refléter la tendance générale observée, P-Ser1 de H4 sur l’axe des ordonnés secondaires).

55

C) L’ACETYLATION DE H4 A LA CASSURE EST REQUISE POUR LE RECRUTEMENT EFFICACE DES COMPLEXES CONTENANT Rvb1

Les complexes ATP dépendant contenant Rvb1 sont recrutés au site de DSB, mais

ils le sont plus tardivement (Figure 38). Tout comme NuA4, ils se concentrent dans les

premières kilobases adjacentes à la cassure. Cela laisse croire à une activité de NuA4

précédente et requise à l’arrivée des complexes contenant Rvb1. En effet, un mutant esa1,

NuA4 ne pouvant plus être acétylé à la cassure, occasionne aussi un défaut dans le

recrutement des complexes Rvb1. Cela souligne le rôle essentiel de l’acétylation de H4 par

NuA4 pour le recrutement subséquent des complexes Rvb1.

Comment expliquer alors que la surexpression de la protéine Arp4 permet un retour

partiel au phénotype résistant du quadruple mutant pour les lysines 5, 8, 12 et 16 de la

queue N-terminale de l’histone H4 (Bird et al., 2002). Notre hypothèse est que les

complexes contenant Rvb1 et Arp4 se lient directement à la P-Ser129 H2A en absence de

l’acétylation de NuA4.

C’est par une protéine commune à plusieurs complexes reconfigurant la chromatine,

Arp4, que la cellule peut coordonner la réparation du bris à l’ADN. Son homologue

humain, Baf53 (Doyon and Cote, 2004; Ikura et al., 2000; Zhao et al., 1998), est aussi

présent dans plusieurs complexes dotés d’activités chromatiniennes. Cependant, comme

nous le montrons, il y a un ordre à respecter.

D) SWR1 N’EST PAS RESPONSABLE DE LA MAJORITE DU SIGNAL Rvb1 A LA CASSURE

Nos résultats semblent indiquer une fonction prépondérante d’INO80 à la cassure

plutôt que SWR1. Autant nos tentatives préliminaires d’immunoprécipiter la protéine Swr1

(en exploitant un épitope HA) au site de coupure que le possible effet sur le recrutement des

complexes Rvb1 de la délétion de Swr1 ne semblent pas permettre d’impliquer SWR1 à la

coupure. Du moins, SWR1 n’est pas responsable de la majorité du signal Rvb1 à la cassure

double brin. Pourtant, nous avons été en mesure de montrer une interaction entre Swr1 et

P-Ser129 H2A (Downs et al., 2004).

56

La présence des protéines Rvb1, protéines ressemblant à ruvB de bactérie, dans ces

complexes pourrait les amener à jouer un rôle prépondérant dans le mécanisme de

réparation d’ADN de recombinaison homologue. Effectivement, durant le processus

d’ouverture de la chromatine par INO80 ou SWR1 à la cassure, elle servirait d’hélicase en

ouvrant le duplex d’ADN et facilitant la migration des structures d’Holliday sur la

chromatine. Donc, INO80 pourrait jouer un rôle après NuA4 au site de bris lui-même en

ouvrant la chromatine, mais aussi plus tard dans la recombinaison.

Trois articles publiés simultanément, dont le nôtre, présentent les évidences que

INO80 est recruté dans les premières heures suivant une DSB générée avec le système HO.

(Cairns, 2004; Downs et al., 2004; Morrison et al., 2004; van Attikum et al., 2004).

Comme nous l’observons nous aussi pour Rvb1, le recrutement d’Ino80 atteint son

maximum à quatre heures (dans les quatre temps testés : 0, 1, 2 et 4 heures) et apparaît

donc tardivement à moins de 2 Kb du bris. Le recrutement d’une seconde sous-unité du

complexe, Arp8, avec cette même dynamique est aussi décrite par les deux autres équipes,

alors que van Attikum présente aussi des ChIPs anti-Arp5. Les trois équipes démontrent

que la phosphorylation de S129 est nécessaire à l’arrivée du complexe INO80 : des mutants

de Mec1, Tel1 ou de H2A (S129A) échouent à la tâche. Étonnamment, bien que le

complexe contienne Arp4, ce serait plutôt sa sous-unité Nhp10 qui serait en cause pour

l’interaction avec P-H2A et le recrutement du complexe. De notre côté, nous avons montré

une interaction entre Ino80 et P-Ser129 H2A (Downs et al., 2004). Van Attikum et al.

suggèrent même un rôle de facilitateur de résection au complexe en enlevant/déplaçant les

nucléosomes des extrémités d’ADN endommagées (van Attikum et al., 2004).

Au mois de mai 2005, un complexe remodelant la chromatine d’une autre famille

fut associé à la réparation des cassure double brin : le complexe de levure RSC de la

famille Swi2/Snf2. En utilisant le système HO et les ChIPs, Shim et al. ont décrit le

recrutement de sa sous-unité Sth1 à moins de 1 kb de chaque côté de la cassure lors d’une

cinétique de trois heures. Son accumulation est dépendante des protéines Mre11, Rsc30 et

yKu80 alors que deux autres de ses sous-unités (Rsc1p et Rsc2p) interagissent

physiquement avec les protéines de réparation yKu80 et Mre11 (Shim et al., 2005).

57

E) D’AUTRES MODIFICATIONS CHROMATINIENNES SONT IMPLIQUÉES DANS LA RÉPARATION DE L’ADN

La présente recherche a démontré que deux nouveaux résidus phosphorylables

participent à la réparation des dommages à l’ADN. Tout d’abord la S1 de l’histone H4 qui

est présente tardivement à la cassure en ChIP et ensuite la S122 de l’histone H2A qui est

hypersensible au MMS. Des mutants pour la S1 de H4 (S1A et S1E), que j’ai construits

lors de mon stage de l’été 2002, ne présentent cependant pas de sensibilité aux agents

endommageant l’ADN. Par contre, la phosphorylation de la S1 en condition de dommages

à l’ADN a été démontrée par analyse western sur extraits cellulaires ((Utley et al., 2005),

voir Annexe B; (Cheung et al., 2005)).

Récemment, des travaux de notre équipe de recherche ont démontré le rôle de la

phosphorylation de la sérine 1 de l’histone H4 sur la régulation de l’activité de NuA4

((Utley et al., 2005), voir Annexe B). Ainsi, cette modification diminue sévèrement la

capacité de NuA4 à acétyler les résidus lysines de la même histone H4. Cela est en accord

avec les ChIPs présentés dans la présent mémoire. Effectivement, nous avons détecté des

marques mutuellement exclusives : lorsque que Phospho-Ser1 apparaît à la cassure,

l’acétylation de K8 H4 diminue. Il est intéressant de noter que ce n’est pas le seul résidu

phosphorylable à moduler une seconde modification covalente sur la même histone. La

phospho-sérine 10 de H3 a le potentiel d’agir sur l’acétylation de sa lysine 14 voisine (Lo et

al., 2000). Enfin, la casein kinase 2 (CK2), associée avec le complexe HDAC Sin3/Rpd3,

est la kinase responsable de la phosphorylation de S1 sur H4 ((Utley et al., 2005), voir

Annexe B; (Cheung et al., 2005)). Tout semble parfaitement s’emboîter puisque ce

complexe est associé à la fermeture/condensation de la chromatine caractérisée par une

hypoacétylation de H4. CK2 est donc aussi impliquée dans la réparation des dommages à

l’ADN.

Dans le cas de la phospho-sérine 122 de H2A, nos collaborateurs ont déjà identifié

un rôle à ce résidu dans la réparation de l’ADN chez la levure (Harvey et al., 2005). Ils

proposent que cette seconde modification (la première étant de P-S129) de la queue C-

terminale de H2A hypersensible au MMS, participerait davantage à la recombinaison

homologue. Étonnamment, une levure sans S122 H2A n’a pas la capacité de sporuler. De

58

plus, un mutant S122A ne présente pas d’arrêt cellulaire en G2/M lors de dommages et

n’affecte pas la phosphorylation de Rad53, une protéine normalement hyperphosphorylée

dans la cascade de réponses aux dommages.

Ce résidu est conservé chez l’histone H2A de drosophile (Thr119) et la kinase

responsable de sa phosphorylation durant la mitose est connue : NHK-1 (Aihara et al.,

2004). En effet, la localisation cellulaire de cette kinase change durant le cycle cellulaire :

alors qu’elle est exclusivement cytoplasmique au cours de la synthèse de l’ADN, elle

rejoint la chromatine en mitose.

En janvier 2005, plusieurs mutants de l’histone H2A furent impliqués dans la

régulation transcriptionnelle du gène CUP1, relié à la régulation du cuivre chez la levure,

par l’histone acétyltransférase Spt10. Dans une souche délétante pour spt10, le mutant

S122A s’est caractérisé par une défaillance à réguler négativement le gène CUP1 après une

induction de celui-ci (Kuo et al., 2005). Ce résidu sérine aurait donc son rôle

transcriptionnel en plus de celui dans la réparation des bris à l’ADN.

F) MODÈLE DE LA DYNAMIQUE CHROMATIENNE LORS DE LA RÉPARATION DE CASSURE DOUBLE BRIN DE L’ADN

Avec les résultats obtenus, il est possible d’élaborer un modèle de la dynamique

chromatinienne chez la levure durant la réparation de cassure double brin (Figure 39).

Suite à l’introduction d’une cassure double brin, il se produit dans un premier temps une

phosphorylation du résidu sérine 129 de l’histone H2A par les kinases Mec1/Tel1. Cette

modification s’accumule rapidement sur des kilobases de chromatine chez la levure.

Ensuite, il y a recrutement de complexe modifiant la chromatine, comme NuA4, pour

permettre une première phase de relâchement de la chromatine. Dans le cas de NuA4, son

accumulation s’effectue en partie via l’interaction entre sa sous-unité Arp4 et la S129

phosphorylée à l’étape précédente. Un fois présent au site de bris, NuA4 exerce sa

fonction : l’acétylation de l’histone H4. Nous avons montré l’acétylation de la lysine 8 à la

cassure et son importance pour la suite des choses. En effet, ce premier relâchement de la

structure condensée créé par l’acétylation est requis pour le recrutement des complexes

59

ATP dépendants contenant Rvb1 (INO80 et SWR1). Afin de favoriser l’accès de la

machinerie de réparation au site critique, ces complexes effectuent la balance du travail en

remodelant la chromatine à ce site de manière ATP dépendante. Une fois l’ouverture de la

chromatine effectuée par les différents complexes présents et l’accès à la cassure double

brin possible, il y a réparation par la machinerie spécialisée. Finalement la restauration de

la chromatine est effectuée par le complexe HDAC Sin3/Rpd3, déacétylant l’histone H4,

après le retrait de la marque ou de l’histone γ-Ser129 de H2A. Conjointement à cette chute

d’acétylation, c’est à ce moment qu’apparaît une dernière marque de phosphorylation : P-

Ser1 de H4. Cette dernière, imputable à la kinase CK2 associé à Sin3/Rpd3, réprime par la

suite une éventuelle activité de NuA4 au même endroit.

Figure 39: Modèle de la dynamique chromatinienne lors de la réparation de la cassure double brin de l’ADN.

V. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Ces travaux permettent de lier fonctionnellement un complexe de modification de la

chromatine (NuA4) à un processus nucléaire autre que la transcription. Les résultats

obtenus constituent un pas de plus dans notre compréhension des mécanismes de

conservation de l’information génétique à travers les eucaryotes.

Par ailleurs, de nouvelles questions qui mériteraient davantage d’investigation sont

soulevées par les informations recueillies dans la présente étude. Ainsi, maintenant que

l’on sait que NuA4 est recruté à la cassure double brin, nous aurions avantage à pousser

l’étude de sa régulation à ce site : tout particulièrement vérifier si ce rôle de NuA4 en

réparation est modulé au cours du cycle cellulaire. Des résultats préliminaires obtenus par

blocage au nocodazole auxquels j’ai participé, montrent une meilleure activité de NuA4 à la

cassure double brin en G2/M. En effet, une augmentation significative d’environ 45% est

observée autant au site HO lui-même qu’à 1.5 Kb de celui-ci dans des cellules bloquées

comparativement aux cellules asynchrones. Puis, par quel autre mécanisme NuA4 est

directement recruté au site de bris de l’ADN si son interaction avec P-H2A est seulement

responsable de son accumulation/rétention? Tra1, sous-unité de NuA4 homologue à la

protéine reliée à ATM TRRAP chez l’humain, pourrait interagir avec le complexe MRX

(MRE11, Rad50 et Xrs2) (Falck et al., 2005). Est-ce que NuA4 peut constituer un substrat

pour Mec1/Tel1, les kinases homologues de ATM/ATR? Peut-être existe-t-il d’autres

motifs SQ phosphorylés qui seraient reconnus par NuA4.

Ensuite, cette chorégraphie dynamique de modifications chromatiniennes et

recrutement d’activités à la cassure pourrait être observée par immunolocalisation en

microscopie à fluorescence in vivo chez des levures diploïdes. En plus de colocaliser les

activités reconfigurant la chromatine à d’autres protéines de réparation connues, cela

s’avèrerait une seconde voie de déterminer la cinétique de ce processus in vivo.

Pour aborder le rôle de NuA4 dans la réparation par une approche plus biochimique,

la mise au point d’un système reconstitué in vitro afin d’étudier la mécanique séquentielle

de la réparation de l’ADN dans un contexte chromatinien sera intéressant.

61

L’imputabilité encore incertaine du signal Rvb1 à la cassure nécessite la poursuite

de l’investigation afin de déterminer définitivement quel(s) complexe(s) ATP dépendants

contenant Rvb1 apparaît (ent) à la cassure tardivement. Discerner lequel des deux

complexes, INO80 ou SWR1, serait une avancée notable dans l’étude des activités

recrutées par et suivant l’action de NuA4. Toujours en lien avec cette activité ATP

dépendante, le complexe SWR1 possède une fonction échangeur d’histone. L’étude du

patron de localisation/distribution du variant à H2A.Z à la coupure pourrait fournir la

preuve manquante confirmant le recrutement de ce complexe aux sites de bris. De plus,

nous avons démontré des interactions fonctionnelles entre H2A.Z et la P-SerS129 : une

sensibilité accrue du triple mutant htz1/H2A-S129A à la CPT par rapport aux simples

mutants (htz1 ou H2A-S129A) (Downs et al., 2004). Le complexe SWR1 contient aussi une

autre cible intéressante : Bdf1, une protéine à bromodomaines reliée à NuA4 par

l’acétylation chez les eucaryotes supérieurs.

Finalement, la découverte d’une nouvelle marque chromatienne hypersensible aux

agents endommageant l’ADN offre une nouvelle avenue à explorer. Bien que tout comme

Harvey et al. nous observons cette sensibilité du mutant S122A de l’histone H2A, il serait

majeur de démontrer la phosphorylation de la S122 au site de cassure double brin par ChIP.

Un anticorps, montrant la phosphorylation de la S122 en condition de dommages (MMS)

par analyse Western , est déjà disponible auprès de la compagnie Abcam. Pour ce faire et

pour comparer sa distribution dans la chromatine entourant le bris, il faudrait transférer nos

mutants de H2A dans le système HO. Sa relation avec le recrutement du complexe HAT

NuA4 ou avec la principale et bien caractérisée phosphorylation de la S129 de H2A

mériterait d’être expérimentée.

VI. BIBLIOGRAPHIE

Ahmad, K., and Henikoff, S. (2001). Centromeres are specialized replication domains in heterochromatin. J Cell Biol 153, 101-110.

Aihara, H., Nakagawa, T., Yasui, K., Ohta, T., Hirose, S., Dhomae, N., Takio, K., Kaneko, M., Takeshima, Y., Muramatsu, M., and Ito, T. (2004). Nucleosomal histone kinase-1 phosphorylates H2A Thr 119 during mitosis in the early Drosophila embryo. Genes Dev 18, 877-888.

Allard, S., Masson, J. Y., and Cote, J. (2004). Chromatin remodeling and the maintenance of genome integrity. Biochim Biophys Acta 1677, 158-164.

Allard, S., Utley, R. T., Savard, J., Clarke, A., Grant, P., Brandl, C. J., Pillus, L., Workman, J. L., and Cote, J. (1999). NuA4, an essential transcription adaptor/histone H4 acetyltransferase complex containing Esa1p and the ATM-related cofactor Tra1p. Embo J 18, 5108-5119.

Ball, P. (2003). Portrait of a molecule. Nature 421, 421-422.

Bannister, A. J., Zegerman, P., Partridge, J. F., Miska, E. A., Thomas, J. O., Allshire, R. C., and Kouzarides, T. (2001). Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410, 120-124.

Bassing, C. H., and Alt, F. W. (2004). H2AX may function as an anchor to hold broken chromosomal DNA ends in close proximity. Cell Cycle 3, 149-153.

Bassing, C. H., Chua, K. F., Sekiguchi, J., Suh, H., Whitlow, S. R., Fleming, J. C., Monroe, B. C., Ciccone, D. N., Yan, C., Vlasakova, K., et al. (2002). Increased ionizing radiation sensitivity and genomic instability in the absence of histone H2AX. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 8173-8178.

Bennett, C. B., Lewis, L. K., Karthikeyan, G., Lobachev, K. S., Jin, Y. H., Sterling, J. F., Snipe, J. R., and Resnick, M. A. (2001). Genes required for ionizing radiation resistance in yeast. Nat Genet 29, 426-434.

Bird, A. W., Yu, D. Y., Pray-Grant, M. G., Qiu, Q., Harmon, K. E., Megee, P. C., Grant, P. A., Smith, M. M., and Christman, M. F. (2002). Acetylation of histone H4 by Esa1 is required for DNA double-strand break repair. Nature 419, 411-415.

Boudreault, A. A., Cronier, D., Selleck, W., Lacoste, N., Utley, R. T., Allard, S., Savard, J., Lane, W. S., Tan, S., and Cote, J. (2003). Yeast enhancer of polycomb defines global Esa1-dependent acetylation of chromatin. Genes Dev 17, 1415-1428.

Briggs, S. D., Xiao, T., Sun, Z. W., Caldwell, J. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F., Allis, C. D., and Strahl, B. D. (2002). Gene silencing: trans-histone regulatory pathway in chromatin. Nature 418, 498.

63

Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., and Chen, D. J. (2001). ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. J Biol Chem 276, 42462-42467.

Cairns, B. R. (2004). Around the world of DNA damage INO80 days. Cell 119, 733-735.

Cairns, B. R., Lorch, Y., Li, Y., Zhang, M., Lacomis, L., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Du, J., Laurent, B., and Kornberg, R. D. (1996). RSC, an essential, abundant chromatin-remodeling complex. Cell 87, 1249-1260.

Celeste, A., Fernandez-Capetillo, O., Kruhlak, M. J., Pilch, D. R., Staudt, D. W., Lee, A., Bonner, R. F., Bonner, W. M., and Nussenzweig, A. (2003). Histone H2AX phosphorylation is dispensable for the initial recognition of DNA breaks. Nat Cell Biol 5, 675-679.

Cheung, W. L., Ajiro, K., Samejima, K., Kloc, M., Cheung, P., Mizzen, C. A., Beeser, A., Etkin, L. D., Chernoff, J., Earnshaw, W. C., and Allis, C. D. (2003). Apoptotic phosphorylation of histone H2B is mediated by mammalian sterile twenty kinase. Cell 113, 507-517.

Cheung, W. L., Turner, F. B., Krishnamoorthy, T., Wolner, B., Ahn, S. H., Foley, M., Dorsey, J. A., Peterson, C. L., Berger, S. L., and Allis, C. D. (2005). Phosphorylation of histone H4 serine 1 during DNA damage requires casein kinase II in S. cerevisiae. Curr Biol 15, 656-660.

Choy, J. S., and Kron, S. J. (2002). NuA4 subunit Yng2 function in intra-S-phase DNA damage response. Mol Cell Biol 22, 8215-8225.

Clarke, A. S., Lowell, J. E., Jacobson, S. J., and Pillus, L. (1999). Esa1p is an essential histone acetyltransferase required for cell cycle progression. Mol Cell Biol 19, 2515-2526.

Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., and Richmond, T. J. (2002). Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. J Mol Biol 319, 1097-1113.

Dover, J., Schneider, J., Tawiah-Boateng, M. A., Wood, A., Dean, K., Johnston, M., and Shilatifard, A. (2002). Methylation of histone H3 by COMPASS requires ubiquitination of histone H2B by Rad6. J Biol Chem 277, 28368-28371.

Downs, J. A., Allard, S., Jobin-Robitaille, O., Javaheri, A., Auger, A., Bouchard, N., Kron, S. J., Jackson, S. P., and Cote, J. (2004). Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell 16, 979-990.

Downs, J. A., Lowndes, N. F., and Jackson, S. P. (2000). A role for Saccharomyces cerevisiae histone H2A in DNA repair. Nature 408, 1001-1004.

64

Doyon, Y., and Cote, J. (2004). The highly conserved and multifunctional NuA4 HAT complex. Curr Opin Genet Dev 14, 147-154.

Eisen, A., Utley, R. T., Nourani, A., Allard, S., Schmidt, P., Lane, W. S., Lucchesi, J. C., and Cote, J. (2001). The yeast NuA4 and Drosophila MSL complexes contain homologous subunits important for transcription regulation. J Biol Chem 276, 3484-3491.

Falck, J., Coates, J., and Jackson, S. P. (2005). Conserved modes of recruitment of ATM, ATR and DNA-PKcs to sites of DNA damage. Nature 434, 605-611.

Felsenfeld, G., and Groudine, M. (2003). Controlling the double helix. Nature 421, 448-453.

Fritsch, O., Benvenuto, G., Bowler, C., Molinier, J., and Hohn, B. (2004). The INO80 protein controls homologous recombination in Arabidopsis thaliana. Mol Cell 16, 479-485.

Galarneau, L., Nourani, A., Boudreault, A. A., Zhang, Y., Heliot, L., Allard, S., Savard, J., Lane, W. S., Stillman, D. J., and Cote, J. (2000). Multiple links between the NuA4 histone acetyltransferase complex and epigenetic control of transcription. Mol Cell 5, 927-937.

Goldstein, A. L., and McCusker, J. H. (1999). Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 15, 1541-1553.

Gorzer, I., Schuller, C., Heidenreich, E., Krupanska, L., Kuchler, K., and Wintersberger, U. (2003). The nuclear actin-related protein Act3p/Arp4p of Saccharomyces cerevisiae is involved in transcription regulation of stress genes. Mol Microbiol 50, 1155-1171.

Green, C. M., and Almouzni, G. (2002). When repair meets chromatin. First in series on chromatin dynamics. EMBO Rep 3, 28-33.

Gulston, M., Fulford, J., Jenner, T., de Lara, C., and O'Neill, P. (2002). Clustered DNA damage induced by gamma radiation in human fibroblasts (HF19), hamster (V79-4) cells and plasmid DNA is revealed as Fpg and Nth sensitive sites. Nucleic Acids Res 30, 3464-3472.

Haber, J. E. (1998). Mating-type gene switching in Saccharomyces cerevisiae. Annu Rev Genet 32, 561-599.

Harvey, A. C., Jackson, S. P., and Downs, J. A. (2005). Saccharomyces cerevisiae Histone H2A Ser122 facilitates DNA repair. Genetics.

Hirschhorn, J. N., Bortvin, A. L., Ricupero-Hovasse, S. L., and Winston, F. (1995). A new class of histone H2A mutations in Saccharomyces cerevisiae causes specific transcriptional defects in vivo. Mol Cell Biol 15, 1999-2009.

65

Ikura, T., Ogryzko, V. V., Grigoriev, M., Groisman, R., Wang, J., Horikoshi, M., Scully, R., Qin, J., and Nakatani, Y. (2000). Involvement of the TIP60 histone acetylase complex in DNA repair and apoptosis. Cell 102, 463-473.

Jazayeri, A., McAinsh, A. D., and Jackson, S. P. (2004). Saccharomyces cerevisiae Sin3p facilitates DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 1644-1649.

Jensen, R. E., and Herskowitz, I. (1984). Directionality and regulation of cassette substitution in yeast. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 49, 97-104.

Jenuwein, T., and Allis, C. D. (2001). Translating the histone code. Science 293, 1074-1080.

Khanna, K. K., and Jackson, S. P. (2001). DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet 27, 247-254.

Kobayashi, J. (2004). Molecular mechanism of the recruitment of NBS1/hMRE11/hRAD50 complex to DNA double-strand breaks: NBS1 binds to gamma-H2AX through FHA/BRCT domain. J Radiat Res (Tokyo) 45, 473-478.

Kobor, M. S., Venkatasubrahmanyam, S., Meneghini, M. D., Gin, J. W., Jennings, J. L., Link, A. J., Madhani, H. D., and Rine, J. (2004). A protein complex containing the conserved Swi2/Snf2-related ATPase Swr1p deposits histone variant H2A.Z into euchromatin. PLoS Biol 2, E131.

Krogan, N. J., Keogh, M. C., Datta, N., Sawa, C., Ryan, O. W., Ding, H., Haw, R. A., Pootoolal, J., Tong, A., Canadien, V., et al. (2003). A Snf2 family ATPase complex required for recruitment of the histone H2A variant Htz1. Mol Cell 12, 1565-1576.

Kuo, H. C., Moore, J. D., and Krebs, J. E. (2005). Histone H2A and Spt10 cooperate to regulate induction and autoregulation of the CUP1 metallothionein. J Biol Chem 280, 104-111.

Kuo, M. H., and Allis, C. D. (1999). In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods 19, 425-433.

Kusch, T., Florens, L., Macdonald, W. H., Swanson, S. K., Glaser, R. L., Yates, J. R., 3rd, Abmayr, S. M., Washburn, M. P., and Workman, J. L. (2004). Acetylation by Tip60 is required for selective histone variant exchange at DNA lesions. Science 306, 2084-2087.

Lacoste, N., and Cote, J. (2003). [The epigenetic code of histones]. Med Sci (Paris) 19, 955-959.

Ladurner, A. G. (2003). Inactivating chromosomes: a macro domain that minimizes transcription. Mol Cell 12, 1-3.

66

Lee, S. E., Moore, J. K., Holmes, A., Umezu, K., Kolodner, R. D., and Haber, J. E. (1998). Saccharomyces Ku70, mre11/rad50 and RPA proteins regulate adaptation to G2/M arrest after DNA damage. Cell 94, 399-409.

Lehmann, A. R. (2003). DNA repair-deficient diseases, xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. Biochimie 85, 1101-1111.

Lindahl, T. (1993). Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature 362, 709-715.

Lo, W. S., Trievel, R. C., Rojas, J. R., Duggan, L., Hsu, J. Y., Allis, C. D., Marmorstein, R., and Berger, S. L. (2000). Phosphorylation of serine 10 in histone H3 is functionally linked in vitro and in vivo to Gcn5-mediated acetylation at lysine 14. Mol Cell 5, 917-926.

Longtine, M. S., McKenzie, A., 3rd, Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., and Pringle, J. R. (1998). Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14, 953-961.

Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., and Richmond, T. J. (1997). Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389, 251-260.

Madigan, J. P., Chotkowski, H. L., and Glaser, R. L. (2002). DNA double-strand break-induced phosphorylation of Drosophila histone variant H2Av helps prevent radiation-induced apoptosis. Nucleic Acids Res 30, 3698-3705.

Matangkasombut, O., and Buratowski, S. (2003). Different sensitivities of bromodomain factors 1 and 2 to histone H4 acetylation. Mol Cell 11, 353-363.

Megee, P. C., Morgan, B. A., and Smith, M. M. (1995). Histone H4 and the maintenance of genome integrity. Genes Dev 9, 1716-1727.

Meneghini, M. D., Wu, M., and Madhani, H. D. (2003). Conserved histone variant H2A.Z protects euchromatin from the ectopic spread of silent heterochromatin. Cell 112, 725-736.

Mizuguchi, G., Shen, X., Landry, J., Wu, W. H., Sen, S., and Wu, C. (2004). ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science 303, 343-348.

Moore, J. K., and Haber, J. E. (1996). Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 16, 2164-2173.

Morrison, A. J., Highland, J., Krogan, N. J., Arbel-Eden, A., Greenblatt, J. F., Haber, J. E., and Shen, X. (2004). INO80 and gamma-H2AX interaction links ATP-dependent chromatin remodeling to DNA damage repair. Cell 119, 767-775.

67

Nourani, A., Doyon, Y., Utley, R. T., Allard, S., Lane, W. S., and Cote, J. (2001). Role of an ING1 growth regulator in transcriptional activation and targeted histone acetylation by the NuA4 complex. Mol Cell Biol 21, 7629-7640.

Nowak, S. J., and Corces, V. G. (2004). Phosphorylation of histone H3: a balancing act between chromosome condensation and transcriptional activation. Trends Genet 20, 214-220.

Ohba, R., Steger, D. J., Brownell, J. E., Mizzen, C. A., Cook, R. G., Cote, J., Workman, J. L., and Allis, C. D. (1999). A novel H2A/H4 nucleosomal histone acetyltransferase in Tetrahymena thermophila. Mol Cell Biol 19, 2061-2068.

Owen, D. J., Ornaghi, P., Yang, J. C., Lowe, N., Evans, P. R., Ballario, P., Neuhaus, D., Filetici, P., and Travers, A. A. (2000). The structural basis for the recognition of acetylated histone H4 by the bromodomain of histone acetyltransferase gcn5p. Embo J 19, 6141-6149.

Paques, F., and Haber, J. E. (1999). Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 63, 349-404.

Paull, T. T., Rogakou, E. P., Yamazaki, V., Kirchgessner, C. U., Gellert, M., and Bonner, W. M. (2000). A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Curr Biol 10, 886-895.

Peterson, C. L., and Cote, J. (2004). Cellular machineries for chromosomal DNA repair. Genes Dev 18, 602-616.

Pitcher, R. S., Wilson, T. E., and Doherty, A. J. (2005). New insights into NHEJ repair processes in prokaryotes. Cell Cycle 4, 675-678.

Redon, C., Pilch, D., Rogakou, E., Sedelnikova, O., Newrock, K., and Bonner, W. (2002). Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Curr Opin Genet Dev 12, 162-169.

Redon, C., Pilch, D. R., Rogakou, E. P., Orr, A. H., Lowndes, N. F., and Bonner, W. M. (2003). Yeast histone 2A serine 129 is essential for the efficient repair of checkpoint-blind DNA damage. EMBO Rep 4, 678-684.

Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., and Bonner, W. M. (1999). Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol 146, 905-916.

Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., and Bonner, W. M. (1998). DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem 273, 5858-5868.

Rouse, J., and Jackson, S. P. (2002). Lcd1p recruits Mec1p to DNA lesions in vitro and in vivo. Mol Cell 9, 857-869.

68

Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., and Wu, C. (2000). A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature 406, 541-544.

Shiio, Y., and Eisenman, R. N. (2003). Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13225-13230.

Shim, E. Y., Ma, J. L., Oum, J. H., Yanez, Y., and Lee, S. E. (2005). The Yeast Chromatin Remodeler RSC Complex Facilitates End Joining Repair of DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol 25, 3934-3944.

Shroff, R., Arbel-Eden, A., Pilch, D., Ira, G., Bonner, W. M., Petrini, J. H., Haber, J. E., and Lichten, M. (2004). Distribution and dynamics of chromatin modification induced by a defined DNA double-strand break. Curr Biol 14, 1703-1711.

Suka, N., Suka, Y., Carmen, A. A., Wu, J., and Grunstein, M. (2001). Highly specific antibodies determine histone acetylation site usage in yeast heterochromatin and euchromatin. Mol Cell 8, 473-479.

Sun, Z. W., and Allis, C. D. (2002). Ubiquitination of histone H2B regulates H3 methylation and gene silencing in yeast. Nature 418, 104-108.

Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., and Luger, K. (2000). Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nat Struct Biol 7, 1121-1124.

Thompson, L. H., and Limoli, C. L. (2003). Origin, recognition, signaling, and repair of DNA double-strand breaks in mammalian cells. In Eukaryotic DNA Damage Surveillance and Repair, K. Caldecott, ed. (Landes Press), pp. 107-145.

Thompson, L. H., and Schild, D. (2002). Recombinational DNA repair and human disease. Mutat Res 509, 49-78.

Thorne, A. W., Sautiere, P., Briand, G., and Crane-Robinson, C. (1987). The structure of ubiquitinated histone H2B. Embo J 6, 1005-1010.

Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., Page, N., Robinson, M., Raghibizadeh, S., Hogue, C. W., Bussey, H., et al. (2001). Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science 294, 2364-2368.

Tsukiyama, T. (2002). The in vivo functions of ATP-dependent chromatin-remodelling factors. Nat Rev Mol Cell Biol 3, 422-429.

Tsukiyama, T., Palmer, J., Landel, C. C., Shiloach, J., and Wu, C. (1999). Characterization of the imitation switch subfamily of ATP-dependent chromatin-remodeling factors in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev 13, 686-697.

69

Utley, R. T., Lacoste, N., Jobin-Robitaille, O., Allard, S., and Cote, J. (2005). Regulation of NuA4 histone acetyltransferase activity in transcription and DNA repair by phosphorylation of histone H4. Mol Cell Biol 25, 8179-8190.

van Attikum, H., Fritsch, O., Hohn, B., and Gasser, S. M. (2004). Recruitment of the INO80 complex by H2A phosphorylation links ATP-dependent chromatin remodeling with DNA double-strand break repair. Cell 119, 777-788.

Ward, I. M., and Chen, J. (2001). Histone H2AX is phosphorylated in an ATR-dependent manner in response to replicational stress. J Biol Chem 276, 47759-47762.

Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., and Chen, J. (2003). Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J Biol Chem 278, 19579-19582.

West, S. C. (1997). Processing of recombination intermediates by the RuvABC proteins. Annu Rev Genet 31, 213-244.

Zhao, K., Wang, W., Rando, O. J., Xue, Y., Swiderek, K., Kuo, A., and Crabtree, G. R. (1998). Rapid and phosphoinositol-dependent binding of the SWI/SNF-like BAF complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling. Cell 95, 625-636.

VII. ANNEXES

A) ARTICLE « BINDING OF CHROMATIN MODIFYING ACTIVITIES TO PHOSPHORYLATED HISTONE H2A AT DNA DAMAGE SITES »

B) ARTICLE « REGULATION OF NUA4 HAT ACTIVITY IN TRANSCRIPTION AND DNA REPAIR BY PHOSPHORYLATION OF HISTONE H4 »

71

ANNEXE A

84

ANNEXE B

DYNAMIQUE CHROMATINIENNE DANS LA RÉPARATION DE … · 2019-06-28 · La structure des chromosomes...

Documents

Transcript of DYNAMIQUE CHROMATINIENNE DANS LA RÉPARATION DE … · 2019-06-28 · La structure des chromosomes...