Chromatine et Mécanismes Epigénétiques

Frédérique Peronnet

8 juin 2009

1) Epigénétique 2) La chromatine 3) Les mécanismes épigénétiques

- Les modifications des histones - La méthylation de l'ADN - Epigénétique et cancer - Epigénétique et cellules souches

4) Méthodes d'étude des modifications épigénétiques

1) Epigénétique : définition(s)

Waddington, 1942

"Étude des processus par lesquels le génotype, l'ensemble des gènes, engendre le phénotype, les caractéristiques de l'organisme"

Définition "fourre-tout"

"Est considéré comme épigénétique ce qui ne relève pas de la génétique"

Epigenetic mechanisms of gene regulation, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996

"Étude des changements dans l'expression des gènes qui sont héritables lors de la mitose et/ou de la méïose, et qui ne résultent

pas de modifications de la séquence de l'ADN "

Paysage épigénétique

Epigénétique : définition(s)

Etude des caractères, tels que l'état de transcription des gènes, qui sont héritables au cours des divisions cellulaires mais qui n’impliquent aucun changement de la séquence d’ADN.

Ces caractères sont en général réversibles ("reprogrammables") (selon le type cellulaire) et sont portés par des modifications dites épigénétiques.

Génotype Séquence ou ensemble de séquences d’ADN correspondant à un caractère héréditaire donné (phénotype).

Epigénotype Ensemble des modifications épigénétiques conduisant à l'état de transcription d’un gène (expression ou répression).

L'information épigénétique est donc une extension de l'information génétique

Silencing du locus du type sexuel chez la levure

Inactivation du chromosome X chez les mammifères

Empreinte génomique parentale

ARN interférence

Quelques exemples de Processus Épigénétiques

Deux phénotypes pour un même génotype

Deux "espèces" du genre Lunaria

Aucune différence génétique Hérédité épigénétique

Epimutation Altération directe et anormale des modifications épigénétiques, sans modification de séquence de l’ADN Maintien stable

Hérédité non mendélienne

Les souris Agouti (Avy)

Un seul génotype

Diversité de phénotypes liée à une variation de l'expression d'Avy

Variations épigénétiques établies in utero

Génétique versus Épigénétique Modifications génétiques

Mutation : Altération de la séquence nucléotidique

Irréversible ! Héritable !

Modifications post-traductionnelles des histones

(code histone)

Modifications épigénétiques

Aucune altération de la séquence nucléotidique

CHROMATINE ADN

Méthylation de l’ADN (îlots CpG)

Modification de l’activité transcriptionnelle des gènes

Réversible ! Héritable !

2) La chromatine

Dans les cellules eucaryotes, l'ADN est complexé à des protéines. Cette association ADN/protéines est appelée chromatine.

2 types de protéines sont associées à l'ADN les histones: H2A, H2B, H3, H4, H1 6.107 molécules/cellule, compaction de l'ADN, régulation de la transcription les protéines non-histones: 104 molécules/cellule, réplication, transcription

Compaction de l’ADN dans le noyau

20 Km de fil de fer fin 1 balle de tennis

Compaction

X 400.000

ADN Noyau

http://www.geneticengineering.org

ADN

Nucléosome

Fibre de 30nm

Boucles I

Boucles II

Chromosome mitotique

Les différents niveaux de compaction de la chromatine

Le nucléosome : Unité de base de la chromatine

Octamère d’histones : (H2A, H2B, H3, H4)2

Caractéristiques des histones : petites protéines, très conservées, basiques

Luger et al., 1997

Structure du nucléosome

Enroulement de l'ADN autour des histones (fibre de 10nm)

H2a, H2b,H3, H4

Double hélice d’ADN entourée 2 fois autour de l’octamère L'histone H1 pince l'ensemble

3) Les mécanismes épigénétiques

Modifications post-traductionnelles des histones: méthylation,

acétylation, phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, polyADP-

ribosylation

Méthylation de l'ADN: par l'ADN méthyl-tranférase, chez la plupart

des eucaryotes (sauf S.cerevisiae, C.elegans, peu chez

D.melanogaster), liée à la répression des gènes

Utilisation de variants d'histones: isoformes non allèliques des

histones conventionnelles, présentes en très faible quantité

(macroH2A…)

Résidus modifiés

Modifications Les extrémités NH2-terminales des histones

Zhang & Reinberg, 2001

Les différentes modifications

Acétylation (K) Méthylation (K/R) Phosphorylation (S/T) Ubiquitination (K) Sumoylation (K) ADP-ribosylation Glycosylation Biotinylation Carbonylation …?

= Marques épigénétiques

Ces modifications ont des conséquences sur la structure de la chromatine et par conséquent sur l'expression des gènes

La compaction de la chromatine empêche la

transcription

Différents états de la chromatine

Hétérochromatine transcriptionnellement inactive

Euchromatine compatible avec la transcription

Hypothèse de l'existence du code histone

(Strahl & Allis, 2000)

La combinaison des modifications post-

traductionnelles des queues des histones

constituerait un code spécifiquement reconnu par

des complexes protéiques :

Notion de "writer" et "reader"

Marque épigénétique apposée par les "writers" Ex:

Protéines à domaine SET méthylation des histones

(H3K4me3, H3K27me3 etc...)

Marque épigénétique lue par des "readers" Ex:

HP1 (protéine à chromodomaine) (H3K9me3)

Polycomb (protéine à chromodomaine) (H3K27me3)

BPTF (hNURF) (protéine à PHD finger) (H3K4me3)

Modifications de la structure de la chromatine (remodelage de la

chromatine), en conséquence de l'expression des gènes

Notions de "writers" et "readers"

Décoder le code histone : l'exemple de l'extrémité NH2-ter de l'histone H3

Transitions chromatiniennes

Allis et al., 2007

Effet en cis

Effet en trans

Remplacement des histones

Remodelage de la chromatine

Kingston & Tamkun, 2007

Remodelage de la chromatine Le complexe SWI/SNF

Rôle du complexe SWI/SNF transfert des nucléosomes en trans, transfert en cis (glissement), formation de structures cruciformes (superenroulement), relâchement de l'interaction ADN/nucléosomes

Les complexes SWI/SNF

Kingston & Tamkun, 2007

Modifications des histones

acétylation

méthylation

phosphorylation

ubiquitination

Acétylation des histones

Chromatine « fermée » Non permissive pour la transcription

Chromatine « ouverte » Permissive pour la transcription

Histone Acétyl

Transférase

Histone DéAcétylase

Recrutement de facteurs de transcription par des histones acétylées

Kouzarides & Berger, 2007

Réversibilité de l'acétylation des histones : Transition chromatine active/chromatine fermée

Méthylation des histones

Protéines à domaine SET = "WRITERS" Su(var)3.9 (H3K9me3) EZH2 (H3K27me3, H1K26me3) Trx/MLL (H3K4me3)

A - Marque épigénétique (mono-, di- ou tri-méthylation) apposée sur un résidu spécifique des histones par une Histone Méthyl Transférase (HMTase):

B - Marque épigénétique (mono-, di- ou tri-méthylation) lue par d'autres protéines chromatiniennes = "READERS"

HP1 (protéine à chromodomaine) (H3K9me3)

Polycomb (protéine à chromodomaine) (H3K27me3)

BPTF (hNURF) (protéine à PHD finger) (H3K4me3)

H3K9me3, H3K27me3 sont associées à la répression de la transcription

H3K4me3 est associée à l'activation de la transcription

Mono-, di- ou tri-méthylation

Zhang, Y. and D. Reinberg (2001) Genes Dev 15(18): 2343-60.

Kouzarides & Berger, 2007

Recrutement de facteurs de transcription par des histones méthylées

Immunomarquage des chromosomes polytènes de glandes salivaires de larves de 3ème stade de Drosophila melanogaster

Centrosome (hétérochromatine)

Bras des chromosomes

Méthylations différentielles de l'hétérochromatine et de l'euchromatine

H3K9me / hétérochromatine : gènes OFF H3K4me / interbandes de l'euchromatine : gènes ON

D.Allis Lab

La méthylation de l'arginine 3 de l'histone H4 est enrichie dans certains puffs développementaux

Immunomarquage des chromosomes polytènes de glandes salivaires de larves de 3ème stade de Drosophila melanogaster

H4R3me DAPI Merge

D.Allis Lab

H4 SGRGKGGKGLGL---------

me

Déméthylation des histones

Kouzarides & Berger, 2007

Phosphorylation de la sérine 10 de l'histone H3 par les kinases Snf1 et Aurora lors de l'activation de la transcription ou de la condensation des chromosomes mitotiques

Phosphorylation de la sérine 129 de l'histone H2A par Mec1 en réponse à certains dommages à l’ADN chez la levure

Phosphorylation de la sérine 139 du variant H2A.X par la kinase ATM/ATR en réponse à certains dommages à l’ADN chez les mammifères

Phosporylation de la sérine 14 de H2B dans les cellules en apoptose

Phosphorylation de la sérine 28 de H3, de la sérine 1 de H4 et H2A etc...

Phosphorylations des histones

H3S10p (mitoses)

Exemples de phosphorylations

H3S10p (activation des gènes de heat-shock), Corces lab

Dapi H2B-S14p

Cellules HL-60 en apoptose

Ubiquitination des histones

Kouzarides & Berger, 2007

Activation versus Répression: langage croisé entre marques épigénétiques

ARTK4QTARK9STGGK14APRKQLATKAAK27S28A H3 NH2-

CH3

Trx/MLL HMTase

Complexe TAC1

CH3 CH3

Complexe PRC2

Eed

E(Z) HMTase

CH3 CH3

CH3

Psc PH PC

Complexe PRC1

BPTF (hNURF)

BAP Osa

Moira BRM Complexe

BRM (remodelage de la chromatine ATP-dépedant) ?

Répression

NuRD HDAC

P

?

Exemple: PcG / TrxG

HAT

Ac

Activation

Ac Ac Ac

Exemple : les complexes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) et le maintien de l'expression des gènes Hox

Hox genes

Facteurs de Transcription du développement précoce

Initiation

Hox

Hox gene réprimé

Hox

H3K27 H3K27

deAc

H3K27me3 PC

Hox gene exprimé

Hox

H3K4 H3K4

Ac

H3K4me3 BPTF

Maintien

PcG TrxG

Comment ces modifications des histones sont-elles reproduites lors de la

réplication de la chromatine?

Nucléosome parental

Nucléosome néosynthétisé

mK

+

Hémi-nucléosome parental

Hémi-nucléosome néosynthétisé

mK

mK

mK

mK

Modèle conservatif Modèle semi-conservatif

La Méthylation de l’ADN

Effecteurs DNA methyl-transferase (DNMTs)

Localisation Îlots CpG

Héritage Semi-conservative lors de la réplication

Techniques d’études • Séquençage bi-sulfite • Enzymes de restriction sensibles à la

méthylation de l’ADN • Immunoprécipitation de l’ADN

méthylé (MeDIP)

Modification très stable Dynamique

Effet Associé à la répression de la transcription

Méthylation des cytosines

Li & Bird, 2007

Les effecteurs de la méthylation de l'ADN

DNA methyl transferase (DNMTs)

Donneur: S-adénosyl-méthionine (SAM)

Famille de protéines très hétérogène

Mammifères 2 méthyltransférases de novo:

DNMT3a DNMT3b

1 méthyltransférase de maintien DNMT1

Protéines à motif MBD (methyl-CpG binding domain)

ECRITURE

LECTURE

INTERPRÉTATION Répression de la transcription

Localisation des méthylations de l'ADN

Régions riches en CG qui chevauchent les régions promotrices et le premier exon de nombreux gènes

Îlots CpG

Ilot CpG

CDS intron promoter CDS 3’ UTR

Ilot CpG

PREdictor

EVX-1 A2 A1 A3 A5 A6 A7 A9 A4 A10 A13 A11

Bloyer, S and Robertson, G.A, Vancouver Genome Science Center, British Columbia, Canada

ADN non méthylé ADN méthylé

DNMT3a DNMT3b

Méthylation de l’ADN Les méthyltransférases de novo

Les méthyltransférases de maintien: mécanisme post-réplicatif

ADN hémi-méthylé ADN méthylé

DNMT1

Comment la méthylation de l'ADN est-elle héritée ?

Semi-conservatif

ADN non méthylé

ADN méthylé

ADN hémi-méthylé

réplication

ADN hémi-méthylé

ADN méthylé

ADN méthylé

Méthylation de novo

Méthylation de maintien

Déméthylation passive de l’ADN

ADN méthylé

ADN hémi-méthylé

ADN hémi-méthylé + ADN non-méthylé

Réplication 1

Réplication 2

Réplication 3

Réplication n

Dilution, puis perte de la méthylation au cours des divisions cellulaires successives

Pas d’activité méthyltransférase de maintien

Déméthylation active de l'ADN

ADN méthylé ADN hémi-méthylé

Par des déméthylases

DNdMTase ? DNdMTase ?

ADN non-méthylé

énergie énergie

Par des glycosylases

ADN méthylé ADN hémiméthylé

Glycosylase

Réparation du nucléotide endommagé

?

Clivage de la base azotée en laissant le squelette sucre-phosphate intact

Thermodynamiquement défavorable

?

Déméthylation active de l'ADN

Par des nucléases

ADN méthylé ADN hémiméthylé

Nucléase

Réparation du nucléotide endommagé

Clivage du squelette sucre-phosphate

La méthylation de l’ADN est associée à la répression de la transcription

Le groupement méthyl prend place dans le grand sillon de l’ADN

Les liaisons Watson-Crick ne sont pas perturbées

Les propriétés des liaisons protéines/ADN sont modifiées:

o Perte de l’affinité de fixation de certains facteurs de

transcription

o Fixation de protéines à domaine MBD qui répriment la

transcription via le recrutement de complexes

enzymatiques contenant des HMT et des HDAC qui

modifient les histones

Relation méthylation des histones /méthylation de l'ADN

Relation méthylation de l'ADN / désacétylation des histones

Recrutement du complexe répresseur Sin3A par une "Me-CpG-binding" protein

Li & Bird, 2007

Différents rôles du code histone

Code histone Méthylation

de l’ADN

Remodelage de la chromatine (SWI/SNF)

ARN interférence

Compartimentation nucléaire

Dépôt et échange de variants d’histones

Contrôle de l'expression des gènes

La mémoire épigénétique

FT1

FT2

FT3

FT1

Mémoire épigénétique FT1

FT3

Mémoire épigénétique FT3

Mémoire épigénétique FT2

Cellules différenciées de type 2

Cellules différenciées de type 3

Cellules différenciées de type 1

Cellules souches

Cellule souche pluripotente

Implication des mécanismes épigénétiques

Maintien du patron d’expression des gènes (PcG et trxG) Inactivation du chromosome X (mammifères - PcG) Contrôle du cycle cellulaire (H3Ps10) Maladies chroniques liées au vieillissement Clonage animal 3R (Réplication, Réparation, Recombinaison) Silencing du locus du "mating-type" chez la levure Empreinte génomique parentale Organisation des territoires nucléaires Structure de la chromatine (euchromatine / hétérochromatine) Voies de signalisation Nombreuses maladies génétiques Cancers etc...

Epigénétique & cancers

Méthylation de l'ADN et Cancer: Hyperméthylation des gènes suppresseurs de tumeurs

Ringrose & Paro, Development 134, 223-232 (2007)

Cellules souches et cancer

EPIGENOME

Comparison profile of H3K4me3 and H3K27me3 ES cells

Differentiated cells

Neuroblasts Fibroblasts

Domaines bivalents = H3K27me3 + H3K4me3

Domaines monovalents = H3K27me3 (répression)

Domaines monovalents = H3K4me3 (activation)

Non méthylé

ACTIVATION

RÉPRESSION

H3K4

H3K27

Type cellulaire A (ex. fibroblastes)

Les domaines bivalents des cellules souches ACTIVATION RÉPRESSION

H3K4 H3K27 =

ACTIVATION

RÉPRESSION

H3K27

H3K4

Type cellulaire B (ex. neuroblastes)

Cellules souches embryonnaires

Différenciation

Auto- renouvellement

4) Les méthodes d'analyse des modifications épigénétiques

Globales: imagerie cellulaire, western-blot

Dirigées: analyse d'une région définie par XChIP ou

MeDIP

Exhaustives: analyse de l'épigénome (ChIP-on-chip,

MeDIP, ChIP-Seq)

XChIP, une méthode d’analyse des marques épigénétiques

Cross linked Chromatine Immuno- Precipitation

ANALYSE

Southern blot quantitatif

PCR semi-quantitative

PCR quantitative

Analyse épigénomique globale ChIP on chip

= EPIGENOME

Séquençage global = ChIP-Seq

(454, Solexa etc..)

ChIP-on-chip, analyse de l'Epigénome

De très nombreux anticorps sont disponibles...

contre les histones: H1, H2A.X, H2A.Z, H2B, H3, H4,

Htz1, CENP-A, H3.3, H2A1 etc...

contre les enzymes de modifications des histones:

DNMT, HAT, HDAC, HDM, HMT etc...

contre les histones modifiées: H3K27me2, H3K27me3

etc etc etc ...

contre l'ADN méthylé

Techniques d’étude de la méthylation de l’ADN

Séquençage après traitement au Na bisulfite

Enzymes de restriction sensibles à la méthylation de l’ADN

(AgeI, ClaI, HpaII, MluI, NotI, PmlI, PvuI, SacII, SalI, SmaI etc …)

Immunoprécipitation de l’ADN méthylé: MeDIP

(ChIP-on-chip, CGH arrays)

Séquençage après traitement au Na bisulfite

C T

MeDIP = Methylated DNA IP

Mécanismes épigénétiques et Evolution

Merci de votre attention !!!!