DIFFICULTES DU SYSTEME Rh

DIFFICULTES DU SYSTEME Rh

38e Colloque Nationaldes Biologistes des Hôpitaux

MONTPELLIER28 septembre – 2 octobre 2009

A. Mailloux, CNRHP, 1 octobre 2009

Agnès Mailloux

Responsable de l’Unité Fonctionnelle de BiologieCNRHP – Pôle de Biologie –ImagerieHôpital Saint-Antoine – AP-HP – Paris 12

LE COMPLEXE Rh


Protéine RH1 :protéine transmembranaire du Globule Rouge

produite par le gène RHD .

15 à 30 000 sites/GR

mosaïque d’épitopes antigéniques (plusieursdizaines), identifiables par des anticorpsmonoclonaux spécifiques.

RhBox

SMP1RHD RHCERhBox

Gène RHD : 57295 nt Gène RHCE : 57831 nt1249 nt codant

1p34.3-36.1

LE LOCUS RH


nt

polymorphes : 3 4 7 7 2 11 1

I II III IV V VIVII VIII IX X IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXX

SMP1

délétion650 nt

intron IV

(35 nt polymorphes)

Le phénotype RH1 est négatif

HaplotypeIX

Gène Ddélété

cdeCdecdE

Rh box hybride5’+3’

HAPLOTYPES VARIANTS


Gène Dy cDye

duplication37 nt

I X IXIVIII VI

T/G807 codon STOP

GèneHybrideD-CE-D

(C)ces/ce

I X IXIII IX

Le phénotype RH1 reste positif (Du)

Gène Du

Type I

I X IXVI

T/G

HAPLOTYPES VARIANTS


T/G809

Gène Du

Type II

G/C1154

I X IXIX

I X IX

Gène Du

Type III

C/G8

HAPLOTYPES VARIANTS

Le phénotype RH1 reste positif (RH1 partiel)

I III IV V X IX

Gène DPartiel IIIa


A/C455

C/G602

T/G667

cDpe

Gène DPartielVI

cDpE

I IV V X IXVI

Partiel III

I- DIFFICULTES POUR CONCLURE SURLE STATUT RH1

38e Colloque National des Biologistesdes Hôpitaux


II- IMMUNOPROPHYLAXIE

III- GENOTYPAGE RHD FOETAL

Réactifs anti-RH1 de groupageGénéralement mélange d’anticorps monoclonaux reconnaissant tousles variants sauf parfois le sérotype DVI considéré dans certains payscomme équivalent de RH1 négatif (statut receveur).

OUTILS DE MISE EN EVIDENCE DEL’ANTIGENE RH1


Techniques (par ordre croissant de sensibilité)

PlaqueTubemicroplaqueGel avec réactif inclusTIA (tube ou gel)

Reconnaissance des RH1 faibles

-+

++

++++

OUTILS DE MISE EN EVIDENCE DEL’ANTIGENE RH1

Techniques directes

+++


Réactifs anti-RH1 pour sérotypage des RH1 partiels : panel d’anticorpsmonoclonaux séparés permettant de typer l’appartenance à une catégorieRH1 partiel.Ne jamais utiliser en première intention pour groupage

TIA (tube ou gel) ++++

I- AFFAIBLISSEMENT REACTIONS

TECHNIQUES GEL : + ou ++

TDA NEGATIF (MEME SI AUTO-TEMOIN NEGATIF)

POSITIVITE AVEC AU MOINS DEUXREACTIFS ANTI-RH1OU POSITIVITE RENFORCEE EN TIA

TECHNIQUES GEL: -TECHNIQUES TIA : + ou ++

HEMATIES DU PATIENT + REACTIF ANTI-RH1

POSITIVITE AVEC AU MOINS DEUXREACTIFS ANTI-RH1


OU POSITIVITE RENFORCEE EN TIA

CONFIRMATION SUR UN SECOND ECHANTILLON SANGUIN

SI REACTIONS TRES FAIBLEMENT POSITIVES(UNIQUEMENT EN TIA)FAIRE CONFIRMER PAR UN LABORATOIRE DEREFERENCE(IMMUNOPHENOTYPAGE + GENOTYPAGE)

SUJET RH1 POSITIF AVEC ANTIGENE RH1 AFFAIBLI

POSITIVITE

TECHNIQUES GELDirecte : ++

POSITIVITE AVEC AU MOINS DEUX REACTIFS ANTI-RH1

TDA NEGATIF

Gel newborn Diamed Gel Patient Diamed Gel Biorad


POSITIVITERENFORCEE

EN TIA

Bioclone Ortho IgG DIAGAST TOTEM DIAGASTIgG+IgM

D screening Diagast + Pannel Diamed : positif avec les IgG, négatif avec les IgM

SUJET RH1 POSITIF AVEC ANTIGENE RH1 AFFAIBLI

Génotypage : exon 7, exon 10, intron 4, exon 4 positif

Faut-il rechercher systématiquement l’antigène RH1 en TIA ?

Non recommandé par les EFS en première intention si résultat négatif entechnique gel avec anti-RH1 inclus, même si présence de RH2 ou RH3(recommandation interne à l’EFS, 28 mars 2008)

- Chez le receveur de CGRs : intérêt nul

UTILITE DE LA RECHERCHE EN TIA ?


- Chez la femme enceinte : utile car si RH1 positif faible, pasd’indication de prophylaxie par IgRh et RAI itératives inutiles durantla grossesse mais situation rare, moins de 1 % des sujets RH1négatif en gel

- Chez le nouveau-né : intérêt nul car hématies fœtales RH1faibles ne peuvent immuniser contre l’antigène RH1 les accouchéesRH:-1

Anti-RH1 connu pour ne pas réagir avec les RH1 partiel type DVI

II- REACTIONS DISCORDANTES

Discordance de groupage RH1 avec desréactifs anti-RH1 différents

RH1 PARTIELS SUSPECTES


RECHERCHE D’UN RH1 PARTIEL DANS UN LABORATOIRE DE REFERENCEMaintien du statut RH 1 partiel jusqu'à la conclusion finale avec conseiltransfusionnel de CGR RH-1

LA MAJORITE DES RH1 PARTIELS SONT NONIDENTIFIABLES AVEC REACTIFS USUELS UTILISES EN

ROUTINE

SEROTYPAGEGel Newborn

Gel Patient


GENOTYPAGEExon 10 : +Exon 7 : +Exon 4 : -Intron 4 : -

RH1 PARTIEL TYPE VI PROBABLE

III- ANTICORPS ANTI-RH1CHEZ UN SUJET RH :1

RAI + avec présence d’un anti-RH1 chez un sujet RH1 positif avectémoin autologue négatif

RH1 PARTIELS FORTEMENT SUSPECTES

mais attention à la possibilité d’un anti-RH1 passif (injection d’IgRhchez une patiente RH1 faible ) car dans ce cas le témoin autologuepeut être également négatif


ENVOYER A UN LABORATOIRE DE REFERENCE

peut être également négatif

ou à un auto-anti-RH1 (dans ce cas témoin autologue positif avecinconstamment TDA + et élution positive anti-RH1) .

AUCUNE OBLIGATION DE LES RECONNAÎTRE EN L’ABSENCED’ANOMALIE DE GROUPAGE (DISCORDANCE DE REACTIF OU ANTI-RH1 CHEZ SUJET RH1 POSITIF)

RH1 PARTIELS DIAGNOSTIC ENLABORATOIRE DE REFERENCE

Sérotypage: - panel d’anticorps monoclonaux anti-RH1 séparés permettantde typer l’appartenance à une catégorie RH1 partiel

- anticorps dirigés contre des antigènes de basse fréquenceassociés aux différents sérotypes de RH1 partiel (anti-Goa….)

Génotypage par PCR possible en routine pour certains RH1 partiels (DVI, DIV,DFR…)


DFR…)

Conséquences cliniques :- Edition d’une carte de groupe avec mention « RH1 partiel » et conseiltransfusionnel comme pour receveur RH1 négatif

- En cas de grossesse chez une femme RH1 partiel :- si anti-RH1 partiel associé, suivre comme femme RH1 négativemais risque hémolytique fœtale très atténué- si absence d’anti-RH1 partiel, envisager immunoprophylaxie Rh

Séquençage

1- Immunisation anti-RH1 des femmes RH1 partiel : pas de formes cliniquessévères de maladie foetale ou néonatales

2- Action immunosuppressive des IgRh non documentée chez les femmes RH1partiel

3- Efficacité ? lorsque hématies maternelles avec fort pouvoir d'absorption (et

IMMUNOPROPHYLAXIECHEZ LA FEMME RH1 PARTIEL ?


3- Efficacité ? lorsque hématies maternelles avec fort pouvoir d'absorption (etdonc de neutralisation ) des anti-D contenus dans les Ig Rh ?

- A l'accouchement (si nouveau-né RH : 1 standard)

- Circonstances anténatales avec hémorragie foeto-maternelle documentéechez les femmes RH1 partiel avec expression affaiblie de l'antigène RH1 (typeVI, DFR, DHAR,etc...)

- Patientes RH1 partiel avec antigène RH1 fortement exprimé : abstention outest éprouvant la capacité de neutralisation des IgRh

QUAND TRAITER ?

I- DIFFICULTES POUR CONCLURE SUR LESTATUT RH1



II- IMMUNOPROPHYLAXIE- Intérêt du Microtitrage des anti-RH1


TEST DE KLEIHAUER OUI APRES NON OUI

ANTENATALECIBLEE

ANTENATALESYSTEMATIQUE

POSTNATALE

RAPPEL SUR LES OUTILS BIOLOGIQUESNECESSAIRES POUR LA PREVENTION

Injection d’IgG anti-RH1 chez la femme enceinte RH1 négatif


RAI AVANT INJECTION

GROUPAGE ENFANT

OUI APRES15 SA

OUI OUI OUI

OUIPAS POSSIBLE PAS POSSIBLE

GENOTYPAGEDans le futur

GENOTYPAGEDans le futur

250

300

350

45 ng/ml

APRES INJECTION DE 300 µg D’IgRH A 28 SA

POSITIVITE DE LA RAI

½ VIE 3 SEMAINES DIMINUTION DE MOITIE TOUTES LES 3 SEMAINES

DETECTION ANTI-RH1 DEPENDDOSE

A. Mailloux, CNRHP, 1 octobre 2009 Terme SA

0

50

100

150

200

250

28 30 32 34 36 38 40 42

22 ng/ml

11 ng/ml

6 ng/ml

3 ng/ml

DOSEDELAISENSIBILITE TECHNIQUE

2 QUESTIONS

1- ANTICORPS TROUVE DANS LE SERUM UNIQUEMENTEXPLICABLE PAR ANTI-RH1 PASSIF (ALLO-IMMUNISATION EN PLUS) ?


2- EST-CE QUE LA QUANTITE D’ANTICORPS ESTSUFFISANTE POUR PROTEGER ?

INTERET DU MICROTITRAGE

• Technique de microtitrage en gels au CNRHP mise en placeen 1999FEUILLETS DE BIOLOGIE , 2002 –Vol.XXXXIIII-N°245, 11-17

TECHNIQUE DE MICROTITRAGE (1)

TECHNIQUE SIMPLE FACILEMENT REALISABLE


• Intérêt : Déterminer si l’Anti-D dosé est uniquement unAnti-D passif (résiduel) consécutif à une injection d’Ig anti-D connaissant la posologie et la date d’injection.

• Domaine d’application : Prélèvements de femmes en âge deprocréer avec titre d’anti-D en technique tube < 1/4


FEUILLETS DE BIOLOGIE , 2002 –Vol.XXXXIIII-N°245, 11-17.

Dilution du standard Anti RH1

Standard ANTI-RH1 6 U CHP/ml ( 24 ng/ml) fait et congelé auCNRHP dilué en NaCl à 0,9 % au ¼ (6 ng/ml) ,1/8 (3 ng/ml),1/16 (1.5 ng/ml) et au 1/32 (0.75 ng/ml).


Dilution du patient

Echantillon testé du pur au 1/32ème

Distribution

Distribution des hématies test (Hématies R0r papainées à 0.8%en diluant 2 (Diamed) dans les gels (Gels DIAMED Liss/Coombs), 50 l par puits.

Distribution des dilutions de standard et des patients, 25 l parpuits .

1- Méthode princeps : distribution par alternance

Incubation gel à 37°C pendant 15 minutes

Centrifugation 10 minutes

Réaction interprétable uniquement quand puits échantillon négatif


Standard1/4

Patientpur

Standard1/8

Patient1/2

Standard1/16

Patient1/4

Standard1/32

Patient1/8


Réaction interprétable uniquement quand puits échantillon négatif

2- Méthode simplifiée : Série de 10 patients encadrée par une gamme

Standard1/4

Standard1/8

Standard1/16

Standard1/32

Patientpur

Patient1/2

Patient1/4

Patient1/8

Patient1/16

Patient1/32

INTERPRETATION RESULTATS (Fonction de l’intensité des réactions)


Inverse de la dernièredilution réactive de

l’échantillon

Concentration de ladilution du

standard avec lamême intensité de

réaction

XConcentration en anti-D =


6 ng/ml 3 1.5 0.75

STANDARD PATIENT

Pur 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

Concentration approchée = 8 x 1.5= 12 ng/ml

réaction

Concentration attendue en anti-RH1passif après injection

n = nombre de doses injectées de 100 mg

15 = concentration extrapolée au temps 0

après injection intraveineuse de 100 mg d’IgGANTI D (après équilibre intra et extra-C ng/ml = n x 15/e 0.03t


ANTI D (après équilibre intra et extra-vasculaire)

0.03 = fraction quotidienne IgG catabolisée

t = délai en jours depuis l’injection

Concentration maximale :tenant compte

- d’un poids- d’un catabolisme à 3 %- sans consommation par hématies foetales

C ng/ml = n x 15/e 0.03t

ANTI-RH1 APRES INJECTION D’IgRH :RESULTATS DU MICROTITRAGE

STANDARD +++ ++ +6 3 1,5 ng/ml

+++ ++ +Patient 1 6 ng/mlpur 1/2 1/4

- - -1/8 1/16 1/32

date prélèvement 13/09/2009date injection : 03/07/2009 Délai 10 semaines


Patient 2 ++ + - - - - 3 ng/ml

date prélèvement 12/09/2009date injection : 30/06/2009 Délai 11 semaines

+

date prélèvement 12/09/2009date injection : 15/07/2009

Patient 4 ++++ +++ - -++ 12 ng/ml

Délai 8 semaines 1/2

ANTI-RH1 APRES INJECTION D’IgRH :RESULTATS DU MICROTITRAGE

Patiente allo-immunisée

75

100

125

co

nc

en

tra

tio

nm

es

uré

e

Patiente présentant une allo-immunisation



0 5 10 15 20 25 30 350

25

50

Concentration attendue (ng/ml)

co

nc

en

tra

tio

nm

es

uré

e

Résultats de 50 patientes

100

120

140

SUIVI ANTI-RH1 APRES INJECTION D’IgRH


GROSSESSE MME X

RAI AVANT L’INJECTIONDE 28 SA> 96 ng/ml

Pondéral 130 ng/ml


0

20

40

60

80

17-nov 7-déc 27-déc 16-janv 5-févr 25-févr 17-

mars

6-avr 26-avr

INJECTION DE RHOPHYLAC A 6 SAPAS DE RESULTAT DE RAI AVANT INJECTION

J+340 ng/ml

J + 306 ng/ml

J + 603 ng/ml

J+90< 1,5 ng/ml

250

300

350

45 ng/ml

CAPACITE IMMUNOSUPRESSIVE


EFFICACITE IMMUNO-SUPPRESSIVE 100% si à 20 µg/ml GR

15 ml d’Hématies foetales RHD+


0

50

100

150

200

250

28 30 32 34 36 38 40 42

Terme SA

22 ng/ml

11 ng/ml

6 ng/ml

3 ng/ml

7,5 ml d’Hématies foetales RHD+

3,8 ml d’HF RHD+

2 ml d’HF RHD+

1 ml d’HF RHD+

I- DIFFICULTES POUR CONCLURE SUR LESTATUT RH1



II- IMMUNOPROPHYLAXIE


LE GENOTYPAGE RHD FŒTALADN fœtal dans le plasma maternel

Suite à la découverte de la présence d’ADN fœtal dans le plasma desfemmes enceintes (1 à 6 % d’ADN d’origine fœtale sous forme acellulaire)

LO Y.M. et al. Am J Hum Genet, 1998, 62 : 768-775.

Génotype RHD fœtal à partir du sang des femmes enceintes RhD –

- Diagnostic non invasif


ADN fœtaldans le plasma

Quantité deGénomes

(copies par ml de plasmamaternel)

25 (3 à 70) à 15 S.A.290 (77 à 769) à terme

Isolement

Rapide,simple

Persistancein vivo

Demi-vie< 1 heure

- Diagnostic non invasif

LE GENOTYPAGE RHD FŒTALEN PRATIQUE

Sang maternel collecté sur EDTA ( 5 à 7 ml)

72h max entre prélèvement et réception aulaboratoire

1Extraction de l’ADN plasmatique


Amplification par PCRdes séquencesspécifiques du gèneRHD

3

Centrifugation puis décantation plasma

2

LE GENOTYPAGE RHD FŒTALQUELLE STRATEGIE ?

1er NIVEAU : GENOTYPAGE EXON 7 / EXON 10Cadre de la prévention par IgRHD : dépistage

Quelle cible ? Combien d’Exons?

E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10Allèle RHD

A. Mailloux, CNRHP, 1 octobre 2009SFTS 24 juin 2009

- Applicable dans la population caucasienne : gène RHD délété dans 99 % des cas- Sensibilité maximum (tolérance 0 pour les faux négatif)- Limiter la lourdeur technique (diminution du coût)- Moins bonne spécificité tolérable (traitement par défaut)

Kit Jacques Boy 1ère génération

MAIS

- exclusion population non caucasienne- Pas de possibilité d’identification de variants

LE GENOTYPAGE RHD FŒTALKit de 1ère génération

Coopération RECHERCHE –INDUSTRIE

(INSERM – INTS- CNRHP - J.BOY)

Trousse développée en 2006-2007

Kit de 1ère génération pour PCR en Temps Réel avec reporterfluorescent. Marquage CE obtenu en JUIN 2007


fluorescent. Marquage CE obtenu en JUIN 2007

Cibles: exons X et VII (amorces CNRHP)Sonde Taqman

ADN marqueur : maïs

Free DNA Fetal Kit® RhDKit de génotypage foetal RHD à partir d’ADN foetal libre du sang maternel

(Technique PCR Temps réel)

Réf. : 502080133

gène Dpsi : gène RHD non exprimé

Fréquence : 1 % dans la population caucasienne

60 % dans la population Africaine RH1 négatif

C654(Ile6218)G667(Val223)T674(Phe225)

37pbA609(Asp216) G807(Stop269)





2ème NIVEAU : AJOUT D’UN TROISIEME EXONEXON 7 / EXON 10 / EXON 5

Cadre de la prévention par IgRHD : dépistage avancé

- Permet d’amorcer un diagnostic chez des femmes porteuses d’ungène Dpsi (exon 5 non Dpsi)- Identification de variants du gène D phénotypiquement exprimés

60 % dans la population Africaine RH1 négatif

Kit Jacques Boy 2ème génération

3ème niveau : AFFIRMATION DU RHESUS D FOETAL


37pbA609(Asp216)

C654(Ile6218)G667(Val223)T674(Phe225)

G807(Stop269)

Allèle RHD




Cadre des femmes immuniséesLaboratoires de Référence

1- Identification du gène des cellules maternelles dès qu’amplification deséquences maternelles suspectéeImportance +++ chez femmes Dpsi allo-immunisées

2- Application de PCR RHD ne reconnaissant pas le gène maternel Dpsi- EXON 5 non Dpsi en systématique (en même temps que le 7 et le 10)- EXON 6 non Dpsi uniquement si patiente confirmée Dpsi

I- Présence de variants silencieux du gène RHD chez le fœtusEXON 5 DpsiEXON 6 Dpsi

II- Présence de variants silencieux du gène RHD chez la mère de faiblefréquence : aucun outil disponible

Identification des fœtus DpsiEn cours de validation

LE GENOTYPAGE RHD FŒTALFAUX POSITIFS


fréquence : aucun outil disponible

III- Interférence des contaminations par augmentation de lasensibilité de la technique : contamination par aérosol lors du prélèvement,lors de la décantation du plasma, de l’éluat …

Au CNRHP D silencieux maternels (4% en 2007, 2.3% en 2008)

a) Autres D silencieux (24%)b) D silencieux D (76%)

1) Problème d’extraction ou d’inhibition de la PCR :

Inclusion d’un ADN traceur déposé dans le plasma (témoind’extraction de l’ADN et de non-inhibition de la PCR).

2) Absence d’ADN fœtal :Recherches d’ADN fœtal « témoin ».

2 PROBLEMES

LE GENOTYPAGE RHD FŒTALFAUX NEGATIFS


DONC POUR ECARTER LE RISQUE DE FAUX NEGATIF

REPETER LE TEST SUR UN SECOND PRELEVEMENT (>> à 12SA)

1) Concentration plus élevée d’ADN fœtal

2) Rattraper une erreur d’étiquetage

3) Rattraper un croisement pré ou per-analytique des échantillons

LE GENOTYPAGE RHD FŒTALREGLEMENTATION

Depuis le décret 1661 du 22 décembre 2006 le génotypagefœtal RHD peut être effectué uniquement :

1- Dans un laboratoire autorisé par l’Agence Régionaled’Hospitalisation, après avis de l’Agence de Biomédecine.


d’Hospitalisation, après avis de l’Agence de Biomédecine.

2- Par des praticiens agrées par l’Agence de Biomédecine.

OBLIGATION D’UN CONSENTEMENT DE LA PATIENTE(préalable à une analyse de biologie moléculaire en vue d’établirun diagnostic prénatal in utero)

LE GENOTYPAGE RHD FŒTALCONCLUSION

FEMME IMMUNISEE

FEMME ENCEINTE RHESUS D NEGATIF

FEMME NON IMMUNISEE


FEMME IMMUNISEE FEMME NON IMMUNISEE

AMNIOCENTESE SANS AMNIOCENTESE

PERMET DE LEGITIMER OUNON UNE SURVEILLANCE

ANTENATALE

DEVRAIT PERMETTRE D’EVITERINJECTION D’IgRHD SI LEGENOTYPE RHD FOETAL ESTNEGATIF (40%)

PERMET D’EVITER INJECTIOND’IgRHD SI LE GENOTYPE RHDFOETAL EST NEGATIF

DIFFICULTES DU SYSTEME Rh

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