Diagnostic sérologique des salmonelloses aviaires: Mise au point d'un test ELISA utilisant des...

J. Vet. Med. B 40,305-325 (1993) 0 1993 Paul Parey Scientific Publishers, Berlin and Hamburg ISSN 0931 - 1793

Ministire de I’Agriculture et de la Fort3 Centre National d’Etudes Vkte‘rinaires et Alimentaires (C.N. E. V.A.)

Laboratoire Central de Recherches Avicole et Porcine (L.C.R.A.P.), Ploufragan -France

Diagnostic sirologique des salmonelloses aviaires: Mise au point d’un test ELISA utilisant des antigttnes

adsorbis l’aide de sirurns anticolibacillaires

V. KLES”, M. MORIN, F. HUMBERT, F. LALANDE, M. GUITTET, G . BENNEJEAN

Adresse des auteurs: Ministire de I’Agriculture et de la For&, Centre National d’Etudes Vtttrinaires et Alimentaires (C.N.E.V.A.) Laboratoire Central de Recherches Avicole et Porcine

(L.C.R.A.P.) B.P. 53,22440 Ploufragan - France

Avec 1 figure et 12 tableaux

(Regupourpublication 31. Mars 1993)

Summary A serological ELISA test for diagnosis of avian salmonellosis infections with Salmonella

typhimurium or enteritidis has been established. Plates were coated half with a negative antigen and half with a positive antigen. Both negative and positive antigens were adsorbed with a monovalent agglutinant anti Escherichia coli serum prior to being distributed into wells of the plates. Sera from SPF birds and from SPF birds vaccinated and/or inoculated with numerous viruses or bacteria, or sera from conventional birds bacteriologically free of any salmonellosis were tested and the percen- tage of false positive reactions was inferior than 1 %. In groups of birds naturally infected or expe- rimentally inoculated with Salmonella enteritidis or typhimurium the percentages of positive indi- viduals were ranged from 15 to more than 90 % according to the doses and routes of inoculation and the delay between contamination and sampling.

Introduction Les toxi-infections humaines d’origine alimentaire sont friquemment associies aux

salmonelles et notamment Salmonella enteritidis et Salmonella typhimurium, et des pro- duits avicoles sont mis en cause dans de tres nombreux cas (4, 15). Ditecter les animaux contaminis devient donc primordial pour la Santi Publique. Or, des poulets infectis avec S. typhimurium ou S. enteritidis peuvent montrer des titres en anticorps spicifiques ile- vis, mtme en l’absence d’excrition ditectable de bactiries (3, 15). I1 semble donc appro- prii de choisir un test sirologique pour le dipistage des salmonelloses aviaires.

Nous avons opti pour la technique ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), pour ses qualitis de spicificiti et sensibiliti et pour son automatisation facile.

Nous avons utilisi un melange d’antigines provenant de S. enteritidis et de S. typhimurium afin de ditecter avec un seul test les infections dOes i ces deux sirovars. Ces antigenes ont 6t i adsorbis avec un sirum anti Escherichia coli pour amiliorer la spicificiti;

U.S. Copyright Clearance Center Code Statement: 0931 - 1793/93/4005 - 0305$02.50/0

306 KLES, MORIN, HUMBERT, LALANDE, GUITTET et BENNEJEAN

chaque paramitre d e la riaction a i t i opt imisi lors d’une i t u d e priliminaire. L a technique ainsi mise au point a p u &re Cvaluie ?I l’aide de plus d e 2500 sirums, provenant d’oiseaux infectis ou non pa r des salmonelles.

Matiriel et Mithode Animaux

Les poulets et canards utilises pour produire les serums ttaient soit Exempts de micro-Orga- nismes Pathogenes Specifies (E.O.P.S.), soit des volailles conventionnelles hibergies ou non en animalerie protegee.

Souches bacteriennes et virales La souche S. typhimurium G459 a servi h I’extraction de l’antigtne flagellaire utilisi pour la

technique ELISA. La souche S. typhimurium F98 (Phage type 14), mutant resistant h I’acide nalidixique (Nalr) a

6t6 fournie par P. BARROW (A.F.R.C.-I.A.H., Houghton, Grande Bretagne), et la souche de S. enteritidis, responsable d’une toxiinfection alimentaire humaine, a ttt fournie par I’Institut Pasteur (Paris, France).

Les deux souches E. Coli 078:K80 ont kt6 isolees de sujets malades, et fournis par C. GADRAS- MONOT (Labovet, Les Herbiers, France).

La souche Mycoplusma gallisepticum R Strain RP 10 (C.N.E.V.A.-L.C.R.A.P.) ou la souche Paramyxovirus type 1 velogine ((2.N.E.V.A.-L.C.R.A.P.) ont it6 utilisees.

Vaccins Les vaccins utilists pour priparer des sirurns possedant des anticorps sptcifiques concernaient

les agents bactiriens et viraux suivants : Mycoplasma gallisepticum, Pasteurella hultocida, Haemo- phzlus paragallinarum, Coronavirus, Paramyxovirus type 1, Birnavirus, Riovirus.

Sirurns testis Les strums etaient conserves h -20 “C jusqu’h leur analyse. Lors des etudes de cinttique siro-

logique, tous les echantillons d’un m h e lot etaient testes en une seule manipulation.

Les serums d’animaux bactiriologiquement nigat f s provenaient - De 478 poules E.O.P.S., d’iiges diffirents (lot Nl) , ainsi que de 104 poussins iges de un jour,

issus de reproducteurs conventionnels indemnes de salmonellose (lot N2) et de 20 poussins iges de 19 jours, issus des mPmes reproducteurs et places en isolateurs a l’ige de un jour (lot N3), (tableau 1).

- De 187 poulets E.O.P.S., vaccines et eventuellement eprouves avec des agents infectieux autres que des entirobactiries (lot N4), (tableau 2).

- D’animaux conventionnels (173 serums) et des poules E.O.P.S. sentinelles (36 strums) elevies dans un mOme bitiment (lot N5) (tableau 3).

- De pondeuses conventionnelles tlevees dans un bitiment voisin d’un poulailler contamin6 par S. enteritidis (voir lot SE4) et entretenu par le mCrne Cleveur (lot N6), prdevees trois fois i un mois d’intervalle (tableau 4).

- De 29 canes conventionnelles igees de 46 semaines, ilevees en cages individuelles (lot N7). - De 18 canards E.O.P.S. inocules h I’ige de 4 semaines avec l’une des deux souches E. coli

078:K80 par la voie sous-cutanke ou intra-trachiale (tableau 5). Ces serums ont it6 preleves 15jours apres l’inoculation (lot N8).

- D’une poule E.O.P.S. rkagissant vis-i-vis de S. pullorum selon la technique d’Agglutination Rapide sur Lame (A.R.L.), prilevie trois fois durant la semaine prtcidant son abattage.

Sirums issus d’animaux inoculis avec S. enteritidis ou S. typhimurium - Le lot STl comportait 264 skrums provenant de 24 poulets E.O.P.S. repartis en 4 lots de 6 sujets

et inoculis h l’ige de huit semaines avec S. typhimurium G459 selon differentes voies et avec diverses doses. Ces serums ont et6 preleves six jours avant I’inoculation puis dix fois jusqu’au 69ieme jour aprhs I’inoculation, date h laquelle les oiseaux ont 6t6 sacrifies (tableau 6).

- Le lot ST2 cornprenait 161 serums de poussins - issus de reproducteurs conventionnels bac- teriologiquement indemnes de salmonellose - inocults i l’ige de un jour par la voie I.M. avec

Diagnostic serologique des salmonelloses 307

diffirentes doses de S. typhimurium F.98, et dont les strums ont it6 prileves de un h 21 jours apres l’inoculation (tableau 7).

- Le lot SEl concernait les serums de 36 poules conventionnelles bactiriologiquement indemnes de toute salmonellose, placies en animalerie protegee ?i 1’8ge de 26 semaines et reparties en 2 lots de 16 sujets et un lot de 4 individus. Elles ont 6te inoculies par gavage, ou dans l’eau de boisson ou par contact avec diffirentes doses de S. enteritidis (travaux de J. PROTAIS et al., 26). Un suivi sirologique a eti instaure pendant quatre semaines (tableau 8).

- Le lot SE2 itait constitui des sirurns de 30 poules E.O.P.S. de 62 semaines, reparties en 2 lots de 15 sujets et inoculees par gavage avec lo5 (lot SE2-a) ou lo8 (lot SE2-b) S. enteritidis par animal. Les sirums ainsi que les caeca, intestins, foies, oviductes et ovaires nicessaires aux recherches bacteriologiques ont it6 prkleves 14 semaines aprks l’inoculation.

Skrums d’animaux naturellement contaminks par S. ententidis ou S. typhimunum - Le lot ST3 etait compose des serums des animaux d’un poulailler dans lequel la contamination

par S. typhimurium a it6 dicelie sur quelques poussins de un jour, i la mise en place du lot. Pen- dant la piriode d’ilevage, quatre traitements antibacteriens ont kt6 effectuis. Les contrbles bac- tkriologiques sont ensuite rest& nigatifs jusqu’h I’abattage (tableau 9).

- Le lot ST4 Ctait constitui des serums de 18 canes conventionnelles, igkes de plus de 50 semaines, issues d’un lot contarnine par S. typhimurium et contrblies individuellement sur les plans bactkriologique et strologique (tableau 10).

Tableau 1: Lots A, N1, N2, N3, N 7

Nombre Age des ELISA ARL Lot de animaux DOC uouNbre(n) Nombre Nombre

serums \ I

(a) de DOC t 0,l (et pourcentage) (et pourcentage) de reactions de reactions positives positives

A: 44 > 18 0,0222 u = 0,0235 0 (0%) NT Pondeuses semaines EOPS

N1: 478 / 0,0197 (7 = 0,0267 3 (0,63%) 7 (1,46%) Animaux EOPS dont

-poulets 220 < 18 0,015 n = 2 0 (0%) 1 (0,45%)

- pondeuses 258 > 18sem. 0,0237 n = 10 3 (1,16%) 5 (2,3%) semaines

N2: 104 1 jour 0,0037 n = O 0 ( O Y O ) 0 (0%) Poussins conventionnels

N3: 20 19jours 0,0022 n=O 0 (0%) 0 (0%) Poussins conventionnels

N7Canes 29 46 0,014 o = 0,0128 1 (3,3%) 0 ( O Y O ) conven- semaines tionnelles

~

(a) DOC: Densite Optique Corngee Moyenne du lot (b) U: Ecan type (de la distribution des DOC) (c) NT: Non test6


- Le lot SE3 itait constitui de 106 sirurns de pondeuses conventionnelles provenant d’un poulailler de quatre parquets, dont deux itaient bactiriologiquement positifs (S. enteritidis) deux mois et demi avant la prise de sang testie (tableau 11) .

- Le lot SE4 comprenait les serums de 89 poules Pgies de 45 semaines, issues d’un troupeau i partir duquel S. enteritidis a it6 isolie trois mois avant l’abattage de soixante-trois oiseaux et le suivi sirologique de 26 autres placis en animalerie protegee (tableau 12).

Skums d’animaux naturellement contaminh par Salmonella vircbow Ce lot SV comprenait 163 sirurns prilevis sur des pondeuses conventionnelles ilevies en cages

dans un poulailler contamine par Salmonella vircbow (diagnostic bactiriologique plus typage).

Tableau 2: LOT N 4

Types de vaccins Epreuve: Pge Test sirologique: huileux Premiere Deuxieme dose et voie Pge et lot

Vaccination: Age dose, voie

injection injection

Pateurella 6 semaines 9 semaines Non fait 12 semaines multocida 1 dose sous cutanie 1 dose sous cutanie

Haemophilus 4 semaines 7 semaines Non fait 9 vaccinA Paragallinarum 1 dose Intramuscul. 1 dose sous cutanie sem. vaccinB

Mycoplasma 4 semaines 7 semaines 14 semaines 14 IotSC Gallisepticum 1 dose sous cut. ou 1 dose sous cutanie 0,l ml(10’ h lo5 sem. lot IM

1 dose Intramuscul. lot SC 0 dose: lot contact>> 0 dose: dot contact>> Intranasal sem. lotIM

lot contact

ou 1 dose Intramuscul. M. gallisepticum). 18

Coronavirus 8 semaines 10 semaines Non fait 14 semaines 1 dose Intramuscul. 1 dose Intramuscul.

Paramyxovirus 6 semaines 10 vaccinA type 1 1 dose sous cut. Non fait Non fait sem. vaccinB (PM V1) 0 dose: d o t contact>> vaccin C

vaccin D lot <contact,

Birnavirus 5 semaines Non fait Non fait 9 semaines 1 dose Intramuscul. 11 semaines

PMV 1 5 semaines 9 semaines: et Coronavirus 1 dose Intramuscul. Non fait 105 D L ~ O

PMV 1 souche 15 semaines viloghe Intramusculaire

PMV 1, 4 semaines Coronavirus Non fait Non fait 8 semaines et Birnavirus 1 dose Intramuscul.

PMV 1, Riovirus, 4 semaines Non fait Non fait 8 semaines Coronavirus 1 dose Intramuscul. et Birnavirus ~

DOC: densiti optique corrigie moyenne du lot


Priparation des antiginespour I’ELISA Les antigknes flagellaires de S. typhimurium G.459 ont it6 ditachis des bactiries par l’action

d’acide chlorhydrique 1M et purifies selon la technique dicrite par Ibrahim et a1 (18). 11s ont it6 con- servis h +4 “C et diluis avant utilisation h 1/10 dam de l’eau bidistillie (E.B.D.).

Les Lipopolysaccharides (L.P.S.) de S. typhimun’um et S. enteritidis (Sigma, France. Rtfiren- ces L2262 et L2012 respectivement) ont i t i diluis dans de 1’E.B.D. (lmg/lml). Toutes les quantitis donnies le sont pour une plaque de 96 cupules.

L’antigine positif ttait composi des flagellines de S. typhimuriurn et des L.P.S. de S. enteritidis et de S. typhimurium, diluis dans du tampon carbonate pH 9,s. L’antigine nigatif Ctait constitut du milieu utilisi pour la croissance de S. typhirnurium G.459, ayant subi les m h e s itapes de purification que les flagelles (1 8), et dilui dans 5,5 ml de tampon carbonate (20).

Tableau 2: cont.

ELISA A.R.L.

N b de positifs/ YO de - N b de N b de positifs/ YO de Nb. de sir. testis positifs DOC 0,l IDOC<0,15 N b de serums positifs (DOC des positifs) testis

0/19 0 0,007 0 3/20 15

Oh0 0 0,0375 3 1/10(0,204) 10 -0,0346 1

0/10 0 0/10 0

0/10 0/5 0/8 0/6 0/5

0 0,0059 0

0 0,0445 1

0 0,0337 1

0 -0,0214 0

0 -0,0153 0

0/10 0 0/5 0 8/8 100

4/5 80 6/6 ‘1 00

0/20 0 0,0364 1 0/20 0

0/10 o n 0 0/10 0/10 0/4

0 0,0046 0 0 0,0041 0 0 0,004 0 0 0,0154 1 0 0,0082 0

2/10 20 6/10 60 6/10 60 3/10 30 1 /4 25

0/10 0/10

0 0,0005 0 0 0,0047 0

0/10 0 0/10 0

0/10 0 0,0028 0 9/10 90

1/10(0,42 1) 10 0,0351 0 0/10 0

0/10 0 -0,0426 0 0/10 0

bJ

0

Tabl

eau

3: L

ot N

5 C

L

Age

des

EL

ISA

an

imau

x N

bre

de

lors

St

atut

V

acci

natio

ns po

ur

seru

ms

Nbr

e de

N

bre

de

de la

pris

e (1

) le

s ani

mau

x te

stes

N

bre

de

O,l<

DO

C<

posi

tifs

de s

ang

conv

entio

nnel

s (2)

po

sitif

s %

de

Posi

tifs

DO

C

DOC'

" 0,

15

en

des p

ositi

fs (3

) A

.R.L

. p "E

1 Jou

r C

onv.

/

80

0 0

/ 0,

0095

5 0

0 5

Ma i 1

jour

-5

sem

aine

s 11

sem

aine

s 40

0

0 /

0,01

82

0 0

F i5 "2 F E.

O.P

.S.

/ 19

0

0 /

0,02

55

1 0

28

ND

, BI,

EDS,

RT

I i

eE se

mai

nes

Con

v.

19 se

mai

nes (

exci

pien

t 38

1

26

0,

328

0,02

735

0 0

9 3 41

E.

O.P

.S.

/ 17

0

0 /

0,03

53

0 0

ti se

mai

nes

r: E C

onv.

/

15

0 0

/ 0,

0232

0

0

3 20

9 1

0,48

0,

328

0,01

897

1 0

c-

18

Con

v.

BI i 1 J

our,

4 et

ND

i 4

et 1

1 se

mai

nes

AE

4 14

sem

aine

s m

r

z

huile

ux)

z (1

) C

onv.

: Con

vent

ionn

el

(2)

Ma:

Mal

adie

de

Mar

ek

EDS:

Mal

adie

des

Oeu

fs H

ardi

s R

TI: R

hino

trach

eite

Infe

ctie

use

E.O

.P.S

.: Exe

mpt

de

mic

ro O

rgan

ism

es P

atho

gene

s Spe

cifie

s

BI:

Bro

nchi

te In

fect

ieus

e N

D: M

alad

ie d

e N

ewca

stle

A

E: E

ncip

halo

myi

lite

Infe

ctie

use A

viai

re

(3)

DO

C:

~ D

ensi

te O

ptiq

ue C

orrig

ee

(4)

DO

C: D

ensi

te O

ptiq

ue C

orri

gie

moy

enne

du

lot.

Tabl

eau 4: L

ot N

6

Dat

e de

EL

ISA

A

RL

prel

kvem

ent

Bact

erio

logi

c"

Nbr

. de

%

-

DO

C d

es

Nom

bre

de

Nb

de

Yo

posi

tifd

posi

tifs

DO

C

posi

tifs

O,l<

DO

C<O

, 15

posi

tifsl

Po

sitif

s N

b. te

stes

N

b te

stis

Moi

s 1

nega

tif

0/66

0

0 0/

68

0

Moi

s 2

nega

tif

0/36

0

0,01

37

/ 0

0/38

0

P. 09

Moi

s 3

niga

tif

1 /59

1,

7 0,

0263

0,

174

1 0/

59

0

2 D

OC

: Den

siti

optiq

ue c

orri

gie

VI 8 72.

Tabl

eau

5: lo

t N8

n

2

Bac

tirio

logi

e: su

r fec

es e

t pou

ssik

res.

DO

C: D

ensi

te o

ptiq

ue c

orri

gie

rnoy

enne

du

lot

". g 9 VI

Souc

he

Voi

e A

ge i la

N

ornb

re d

e N

ornb

re d

e po

sitif

s t",

-

2 k

ELIS

A

inoc

ulte

pr

ise

de

seru

ms

Nom

bre

de

en A

RL

sang

te

stis

po

sitif

s D

OC

6

E. C

oli 0

78:K

80

Intra

6

sem

aine

s 5

souc

he A

Tr

achi

ale

0 0,

0009

1

E. C

oli 0

78:K

80

Souc

he A

so

us cu

tane

e 6

sem

aine

s 3

0 0,

0013

2

E. C

oli 0

78:K

80

Intr

a So

uche

B

Trac

hial

e 6

sern

aine

s 4

0 0,

0002

3

E. C

oli 0

78:K

80

LJ

L

Souc

he B

so

us c

utan

ee

6 se

rnai

nes

6 0

0,00

06

4 -


DIm a h

22

a

a

a

a

a

a

a

a

*

0

0

3 W B G 8 B 2 ‘P 4 E

.s a

ln 0 0 a 0-

f 2

2

2

ln m N

ln ln 0

c( 0

0 v?

m * -?

0”

x 3

3 a m

ln N

0 pi.

“1 m 3 k 3

: 0

N

N

N

3

N

n

m

rr)

m

3

0

3 3 8

B 2 2 ‘P 4 2

a

a

a

a

a

a

a

a

a

m

0

3 W 4

g n

2 ‘P

3 B

a n 2 3 0- 0-

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

3 5

8 3

‘P i ;

n

m

m

m

N

N

N

N

0

0

0

3 W 8

g

2 ‘P

3 a B

$

.- 5% a ’ W m o o a

- 0

0

- 0

0

0

0

0

0

0

3 8 3 B B 2

\W

$

3

3

- 3

*

- N

0

0

0

0

3 w 8 3 8 m

‘P i ;

0 h

8 8 8

8

8

8

2

8 % 8 k 8 s1 8

8

- a - m

i?

- 0

m m DI

m

0

0

m 2

$ r2

*

n

n

*

*

In

m

a

m

N

0

3 8

8

2 ‘P

3 a B

;

W m * 0-

m m x x x

m n

m 0

m m W m 0”

$ 3

3 r. *

W

9 0.. 2

2

0-

m 8 5 0 0-

8 CI


Avant d’Ctre distribuis, les antigtnes nigatif et positif ont &ti adsorbis une heure B 37 “C avec 0,5 ml de sirum agglutinant monovalent anti E. coli Olll:B4 (Diagnostics Pasteur, Marnes la Coquette, France. Rifirence 57241).

Tests sirologiques Agglutination Rapide sur Lame (A. R. L.)

Les serums diluis au quart dans du Phosphate Buffered Saline (P.B.S., pH 7,2) ont it6 testis vis-i-vis d’un antigtne color6 de S. pullorum, souches standard et variant (Laboratoire de Divelop- pement et d’Analyses 22, Ploufragan, France), selon la technique dicrite par H. BOURHY et al. (5).

ELISA La technique ELISA utilis6e est celle dicrite par V. KLES et al. (20). Deux couples conjugui-

substrat diffirents ont ete employes pour chaque espkce: d’une part anti-IgG de poule marquies B la phosphatase alcaline et p-Nitrophinyl Phosphate disodique pour cette esptce, d’autre part anti-IgG de canard marquies i la piroxydase et ortho-phinyl-diamine.

Bacte‘riologie La nature des priltvements (chiffonnettes, organes, f6ces) a varii selon les expirimentations.

11s ont tous subi un pri-enrichissement en eau peptonee tamponnte (A.E.S., ref. 140.302), puis un enrichissement dans deux milieux (Rappaport Vassiliadis Merck, ref. 7700 et titrathionate de Mul- ler-Kaufman A.E.S., ref. 140.702). A partir de ces deux enrichissements, un isolernent sur gelose au vert brillant (A.E.S., ref. 151.492) a it6 effectui. Les colonies suspectes ont it6 ensuite identifiies biochimiquement et sirologiquement.

Tableau 7 lot ST2 ~~ ~~

Nombre de ELISA ARL: bactiries Nombre de Nombre de - Nombre de BactCriologie inoculies par jours PI skrums Nombre de D O C positifs sujet testis positifs

10’ 15 35 0 0,01696 0 + caeca

1 02 1 10 0 0,0034 0 + caeca 3 10 0 0,0158 0 + foies, caeca 7 10 0 0,0015 0 + foies, rates, caeca

21 2 0 0,028 0 N T

10’ 1 10 0 -0,0027 0 + caeca 3 10 0 0,0034 0 + foies, rates, caeca 7 9 0 0,0005 0 + foies, rates, caeca

1 O b 1 10 0 0,0048 0 + caeca 3 10 0 0,0023 0 + foies, rates, caeca 7 10 0 0,0009 0 + foies, rates, caeca

21 2 0 0,0135 0 NT

108 1 10 0 0,0039 0 + caeca 3 10 0 0,0033 0 + foies, rates, caeca 7 9 0 0,0004 0 + foies, rates, caeca

21 4 0 0,0217 0 NT ~

DOC: Densiti Optique Corrigie moyenne du lot PI: Post Inoculation NT: Non Test6


Rksultats Tous les risultats sont exprimis en Densiti Optique Corrigie (DOC) qui reprisen-

te la diffirence entre les valeurs lues pour un mCme strum avec les antigenes positif et nigatif.

Le seuil de positiviti individuel retenu pour l'espkce poule est fonction de la distribution a priori normale des valeurs obtenues avec un Cchantillon de 44 sirurns provenant de pondeuses E.O.P.S. (lot A), testis lors d'une Ctude priliminaire. Statistiquement plus ~ de 99 % des s i r u m d a t i f s doivent donner des valeurs contenues dans l'intervalle DOC(A) k 3 u (A) (DOC (A) = densiti optique corrigie moyenne du lot A, u (A) = kar t type du lot A), soit, en pratique, des valeurs infirieures i DOC(A)+ 3 u (A).

Afin de compenser l'absence de toute stimulation immunitaire des animaux E.O.P.S. et sur la base des risultats observis avec les &rums provenant d'animaux inoculis et testis lors de l'itude priliminaire, nous avons ajouti i cette limite une valeur de 0,05 ce qui a donne pour seuil de positiviti toute D O C 2 O , k

Pour les 478 sirurns E.O.P.S. testis (lot N l ) , la somme D O C + 3 u donne une valeur (0,0997) tris proche de celle observie avec les 44 strums du lot A (0,0927) (tableau 1). Avec le seuil de positiviti fixC i 0,15, seulement trois sirums apparaissent positifs. Sept riactions positives sont enregistries avec la technique A.R.L. (tableau 1).

En ce qui concerne les poussins conventionnels de un et 19 jours (lots N 2 et N3), les DOC sont tris basses (respectivement 0,00377 et 0,0022), aucune riaction positive avec le test A.R.L. ni I'ELISA n'itant enregistrie (tableau 1). - Pour les canes conventionnelles (lot N7), le seuil de positiviti a C t C fix6 i 0,052

(DOC + 3 u de ce lot). Un animal est positif en ELISA, aucun en A.R.L. (tableau 1).

Tableau 8: lot SE1 ~~~ ~~ ~~ ~

ELISA A.R.L. Nombre de ~

Lot jourPI(1) Nombrede D O C D O C Nombre Bacteriologie positifs extremes de positifs

Nombre Nornbre testes (2) (3) testes

des positifs

0 0/4 0,04 0/4 - Feces = 1 prilk-

19 014 0,0317 014 - Tous les organes 26 012 0,0185 0/4 negatifs

Lotcontact 12 013 0,0263 014 vernent positif i J19

Lotinocule 0 0/16 0,013 0116 -Feces = positives des avec lo8 bacte- 12 11/15 0,212 0,1634,490 14/16 la prernisre sernahe ries par sujet, 19 13/16"':. 0,38 0,172-0,951 12/16 - Au moins un organe pargavage 26 0,409 0,2364,631 13/16 positif pour 15 animaux 7/8:;.":k

Lot inocule 0 0/16 0,0163 0116 -Feces = toujours avec 10' bacte- 12 0/15 0,0145 0/16 negatives ries par sujet 19 0/16 0,0071 0116 - Organe = 1 ovaire dans l'eau de 26 0/8 0,0052 0116 positif boisson pendant 10 jours

(1) : m o s t inoculation (2) : DOC: Densite Optique CorrigCe Moyenne du lot (3) : DOC: Densite Optique Corrigee " *':. : Deux des trois serums negatifs en ELISA sont aussi nigatifs en ARL *% Le serum negatif en ELISA est aussi negatif en ARL

: Les deux serums negatifs en ARL sont aussi negatifs en ELISA

Tab

leau

9: l

ot S

T3

Con

trel

es s

erol

ogiq

ues

EL

ISA

A

RL

C

ondi

tions

A

ge

Vac

cina

tions

T

raite

men

ts

Con

trde

s d’

elev

age

anti-

infe

ctie

ux

bact

krio

logi

ques

N

b de

Pos

itifs

l D

OC

des

Nb

de

posi

tifsl

N

b de

seru

ms

% p

ositi

f po

sitif

s N

b d

e se

rum

s %

pos

itif

test

es

test

es

0110

7 0

/ 01

160

0

BPt

imen

t 1

jour

M

a B

I O

rgan

es +

d’

ileva

ge

4 se

mai

nes

ND

BI

5 se

mai

nes

pend

ant

5 jo

urs

8 se

mai

nes

Fece

s +

rn

tt 11

scm

aine

s N

D B

I P

Ani

mau

x 13

sem

aine

s pe

ndan

t 6 jo

urs

c.

19 se

mai

nes

pend

ant 3

jour

s Fe

ces -

5.

en c

ages

15

sem

aine

s Fe

ces +

v)

16 se

mai

nes

Fece

s -

(D

17 se

mai

nes

pend

ant

6 jo

urs

%

Tra

nsfe

rt

batim

ent

pond

euse

s (c

onv.

) In

trod

uctio

n po

ulet

tes

E.O

.P.S

. us

entin

elle

s..

Ani

mau

x en

cag

es

20 s

emai

nes

23 s

emai

nes

26,2

8,30

sem

31

sem

aine

s 32

sem

aine

s 37

sem

aine

s 39

sem

aine

s

43 se

mai

nes

46 s

emai

nes

55 se

mai

nes

57 se

mai

nes

60 s

emai

nes

68 s

emai

nes

RT

I, E

DS,

Pr

obio

tique

Fe

ces,

pou

ssie

res -

conv

. 0/

20

0 N

D, B

I co

nv.

0/15

0

E.O

.P.S

. 3/

19

15,8

FC

ces.

Dou

ssiir

es -

conv

. Fe

ces.

Dou

ssik

res -

EO

PS

,I

FCce

s, po

ussi

ires

-

conv

. E

OP

S

conv

. E

OPS

conv

. E

OP

S

conv

. E

OP

S

Fece

s, p

ouss

iere

s -

Fece

s, p

ouss

iere

s -

Fece

s, p

ouss

iere

s -

conv

. EO

PS

1/18

5

3

3/19

15

,8

NT

N

T

0115

0

1/19

5,

2

0123

0

3/26

11

,5

1/11

9,

l 1/

16

6,2

1/16

6,

2 0/

19

0

0120

2/20

0,

1764

,258

4,39

9 0/

20

0,16

1 0/

20

0,15

8-0,

163-

O,1

70

0/20

0/16

1/

19

0/20

0,

151

0/20

0120

0,

191-

0,21

7-0,

376

011 8

0,

276

012 1

0,

167

0110

0,17

4 01

16

0/19

0 10 0 0 0

52

0

0 0 0 0

0 0 0

316 KLES, MORIN, HUMBERT, LALANDE. GUITTET et BENNEJEAN

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

+

I

+

I

I

+

I

W Dt ." - ." '2 z a

W

,W 3

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

+

I

I

+

I

2 1 0

N

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

d d

I

I

I

+

-I-

+

I

I

I

I

I

+

I

+

+

I

I

I

3 3J 4 '% F4

B .W rc1

I

+

I

+

+

+

I

1

I

I

I

I

I

+

+

I

h

v N

I

3 .B '% .2 a

B ,W d

I

I

I

I

+

+

I

I

I

I

I

I

I

+

+

I

h

c?

I

.B - 4 3 d

I

I

+

E +

I

+

I

I

I

I

+

+

+

I

I

h

c?

I

4 2


Tableau 11: lot SE 3

ARL (2) ELISA (2)

Nb de positifd N b de positif/ -

testes testes extremes Parquet Batiriologie Nbre de sirums % Positif N b de serums % positif D O C DOC

(3)

(1) Positive sur environnement

1 (2) Positive sur 12/19 63 3/21 14,3 0,0558 0,236 animaux 0,469

2 (1) Positive sur environnement 11/23 47,s 22/26 84,6 0,7198 0,161 (2) Positive sur 1,423 animaux

3 (1) Nigative (2) Positive sur 25/30 83,3 27/30 90 0,6226 0,167 animaux et environnement 1,238

4 (1) Negative (2) Positive sur 22/29 75,s 19/29 65,5 0,3896 0,192 animaux et 1,197 environnement

(1) - Pr6ll.vements effectuts au mois de Mars (2) - Prilkements effectuks au mois de Mai (3) - Valeurs pour les serums positifs DOC: Densitt Optique Corrigee d’un serum DOC: Densitt Optique Corrigte moyenne d’un lot

En ce qui concerne les animaux du lot N4 (tableau 2), quelques D O C sont infkrieures i ziro. Des fixations non spicifiques importantes sur l’antigkne negatif (DO > 1) ont i t i noties avec certains serums d’animaux vaccinis contre H. paragallinarum, M. gallisepticum et avec les vaccins viraux tri et tetravalents. Les DOC de ces 187 serums restent neanmoins infkrieures au seuil de 0,15, sauf pour deux animaux, l’un vaccine contre H. paragallinarum et l’autre avec le vaccin viral trivalent. Aucune fixation aspkcifique n’a i t6 notie avec les autres vaccins, ni pour les animaux non vaccints mais CprouvCs par M. gallisepticum. Par contre 15 % des serums d’animaux vaccines contre l? multocida ont provoqui des agglutinations avec l’antigkne S. pullorum, ainsi que 80 h 100 % des sirums d’animaux eprouves avec M. gallisepticum. Vingt h quatre-vingt-dix pour cent de riactions positives sont egalement enregistries selon cette technique avec les serums d’animaux vaccinis avec les vaccins viraux mono ou bivalents (tableau 2).

Sur les 209 serums du lot N5, un seul est positif selon la technique ELISA et aucun selon la techniaue A.R.L.(tableau 3)

En ce qui concerne les animaux du lot N6, toutes les sirologies selon la mCthode A.R.L. sont negatives, un seul serum se rivilant positif selon la mCthode ELISA (tableau 4).

Aucun canard E.O.P.S. inoculC avec E. coli 078:K80 (lot N8) n’est positif en ELISA alors que trois sur huit ou sept sur dix, selon la souche utilisie, sont positifs en A.R.L.(tableau 5).

318 KLES, MORIN, HUMBERT, LALANDE, GUIITET et BENNEJEAN

Tableau 12: lot SE4

ELISA A.R.L. Date des prikvements Nb de positifsl Nb de positifsl (1) Nb de sirurns - DOC extrCmes Nb de sirurns

testes YO positifs DOC des positifs testis Yo positifs

J6 11/63 17,5 0,2105 0,187 9/63 14,3 1,93 1

JO 5/22 22,7 0,2080 0,160 1/26" 3 3 1,117

J3 9/26 34,6 0,277 0,159 1/26" 398 1,423

510 8/25 32 0,237 0,166 1/26" 3,8 1,248

524 5/23 21,7 0,147 0,159 1/23" 4,8 0,959

538 9/26 34,6 0,290 0,187 5/26"X- 19,l 1,399

DOC: Densite Optique Corrigie DOC: Densite Optique Corrigee Moyenne du lot (1): JO: Jour 03 les poules sont placees en animalerie protegte

53, J6, JlO, 524,538: Respectivement les 3 4 62,102,248 et 388 jours d'htbergement en animalerie protigee. Une gelification de certains serums a empCchi leur analyse systimatique selon les deux techniques. I1 s'agit toujours du mCme serum, qui est igalement positif en ELISA ":

Z.". . Ces cinq serums sont tgalement positifs en ELISA

L'exarnen bactiriologique des organes de la poule E.O.P.S. riagissant en A.R.L. a perrnis d'isoler une souche d'E. colz dont les caractkres antiginiques itaient proches de ceux des salrnonelles du groupe OMA. Les trois sirurns de cette poule sont tous nCgatifs en ELISA (DOC: 0,0495) et positifs en A.R.L.

Selon la technique ELISA les sirurns des anirnaux du lot STI se positivent de six i treize jours apris l'inoculation pour les sujets ayant r e p lo9 S. typhimurium G459 PO, et de 13 i 20 jours pour ceux ayant it6 inoculis par la voie IM (tableau 6). Ces 12 anirnaux restent positifs jusqu'i la fin de l'expirirnentation. Deux sujets du lot inoculi avec 10' bactiries adrninistries trois fois dans l'eau de boisson deviennent positifs 20 jours post inoculation (PI), un troisikrne 50 jours PI. Un animal contact est positif i partir de 27 jours PI et jusqu'i la fin de I'itude ; un autre est transitoirernent positif h 27 jours PI seulernent (tableau 6). Les DOC individuelles des animaux positifs augmentent jusqu'i la fin de I'observation, les valeurs les plus ilevies itant atteintes par les anirnaux inoculis avec lo9 organisrnes PO (figure 1). Les tests A.R.L. rivklent de zero 1 trois sirurns positifs sur six selon les dates des prilkvernents et les lots considiris (tableau 6). Seulernent trois anirnaux du lot lo9 bactiries PO et un du lot lo7 bactiries IM restent positifs rigu- likrement selon cette technique, toutes les autres reactions positives enregistries avec cette rnithode itant des reactions fugaces (un i deux prilkvernents positifs sur onze par animal).

En revanche aucune reaction positive n'a it6 enregistrie pour les poussins inoculis i l'iige de un jour quelle que soit la technique sirologique utilisie et rnalgri les ri-isole- rnents systirnatiques de S. typhimurium F98 i partir des organes des poussins (tableau 7).

Diagnostic serologique des salmonelloses

1.6 - 1.4 -

1.2 - 1 -

0.8 -

319

,"/ - -

0.1 5

J-6 J+6 J+13 J+20 J+27 J+36 J+43 J+50 J+58 J+64 J+69JOurS

Figure 1.a: Animaux inocults avec lo' IM Variations individuelles des D O C

Pour le lot SE1, seules les poules inoculies avec lo8 bactiries par sujet montrent des sirologies positives avec les mithodes ELISA (75 i 87,5 % des sCrums testb) et A.R.L. (73J i 87,5 %). S. enteritidis a igalement pu Gtre isolCe i partir des feces et des organes de ces animaux. Les DOC individuelles des animaux positifs montrent des variations importantes h la fois au cours du temps pour un individu et entre individus. Globalement, les DOC augmentent avec le temps et les serums se positivent entre J12 et J19 (tableau 8). Pour les lots contact et inoculis avec 10' bactiries par sujet, seuls deux prilirvements (un ovaire et des feces) sont bactiriologiquement positifs. Aucune sirologie n'est positive

* N' 276

0 N' 277

N' 278

+ N' 279

rn N' 280

@- N' 281

- - (tableau 8).

D .O 1.6 - 1.4 -

1.2 - 1 -

0.8 - 0.6 -

0.4

0.2 0.15-

0 J-6 J+6 J+13 J+20 J+27 J+36 J+43 J+50 J+58 J+64 J+69 Jourt

Figure 1.b: Animaux inoculis avec 10' PO Variations individuelles des DOC

-

*N' 283

0 N' 284

N 285

+N' 286

mN' 287

8" 288

320

1.6 -

1.4-

1.2 -

1 -

0.8 - 0.6 -

KLES, MORIN, HUMBERT, LALANDE, GUITTET et BENNEJEAN

0.1 5 -

4- c

0.4

0.15%

0

* N' 289

0 N' 290

0 N' 291

+ N' 292

N' 293

E N' 294

J-6 J+6 J+13 J+20 Jf27 J+36 J+43 J+50 J+58 J+64 J+69Jours

Figure 1.c: Animaux inoculis avec 10' PO. 3 fois Variations individuelles des DOC

Au contraire, pour le lot SE2 et bien que la souche inoculie soit la m&me que pour le lot SE1,29 serums sur 30 ( 9 6 , 7 x d o n t 15 du lot SE2-a et 14 du lot SE2-b, montrent des D O C supirieures h 0,15. La D O C de ce lot est de 0,7143 et les DOC extrcmes sont 0,204 et 1,824. Pour les sous-lots SE2a et SEZb, les valeurs moyennes sont respectivement de 0,628 et 0,800 et les extrcmes sont respectivement 0,204-1,824 et 0,206-1,285. Selon la technique ARL, 23 sirums sur 30 (76,7 %) dont 11 du lot SE2-a et 12 du lot SE2-b ria- gissent. Le riisolement de S. enteritidis n'a i t i possible que pour 12 sujets sur les 30 inoculis.

D.0 1.6

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

sc N' 295

0 N' 296

0 N' 297

i N' 298

H N' 299

E N' 300

Figure l.d: Animaux contacts Variations individuelles des DOC

Diagnostic serologique des salmonelloses 32 1

Pour le lot ST3, de rares sirologies positives, plus friquentes avec la technique ELISA qu’avec la technique A.R.L., ont it6 constattes h partir de la 232me semaine d’ilevage et jusqu’h I’abattage du lot (tableau 9).

Pour le lot ST4 dans lequel huit canes excritaient des salmonelles, sept sirums provenant d’animaux excriteurs sont positifs en ELISA. Avec la technique A.R.L., trois sirums de canes bactiriologiquement positives et trois sirums de canes bactiriologiquement nigatives sont positifs.

Pour le lot SE3, les techniques A.R.L. et ELISA ditectent des anticorps respectivement chez 47,8 h 63 % et 14,3 h 84,6 % des animaux des parquets 1 et 2, et chez 75,8 h 83,3 % et 65,5 h 90 % des sujets des parquets 3 et 4 (tableau 11).

Quant aux animaux du lot SE4, 3,s i 19,l % d’entre eux prisentaient des anticorps dicelables par la mithode A.R.L. et 17,5 h 34,6 % par la mithode ELISA (tableau 12). L’observation des risultats obtenus en cinitique sirologique suivant la mithode ELISA montre que, h part un animal pour lequel la D O C a considirablement augment6 au cours du temps, les D O C individuelles restent relativement stables et sont soit supirieures i 0,8, soit proches du seuil de positiviti.

Enfin 3,07 % (5/163) seulement des sirurns issus du lot SV montrent des riactions positives avec I‘a mithode ELISA (les D O C des positifs sont compris entre 0.154 et 0.555, et la D O C d e ce lot est de 0.0268) contre 36,8 % (60/163) avec la technique A.R.L.

Discussion L’intir2t d’une itape d’adsorbtion dans une technique ELISA a it6 dimontrie par

P. FAWCETI- et al. (12) qui ont rialisi une itude similaire i la n8tre en adsorbant les sirums h tester vis i vis de la maladie de Lyme avec des antigenes extraits d’E.Colz. 11s constatent une nette amilioration de la spicificiti de leur mithode, sans en modifier la sensibiliti. De mCme, HEUMAN et BAUMGARTNER (16) en couplant divers antigenes lipo- polysaccharidiques avec des Hight Density Lipoprotiines (HDL) augmentent la spicificiti de leur technique ELISA. 11s attribuent cette amklioration i des effets allostiriques exposant des diterminants hydrophiles qui favoriseraient la fixation d’anticorps spicifiques, tout en masquant les structures hydrophobes (favorisant, elles, les riactions non spicifiques). De plus le contenu protiique du complexe faciliterait sa fixation au plastique des plaques et la prisentation aux anticorps serait plus Ccphysiologique..

La mithode utilisie pour fixer le seuil de positiviti de la technique est classique et respecte les recommandations de la Sociiti Franpise de Biologie Clinique (10, 23, 25, 29). La valeur retenue est identique h celle de R. NICHOLAS - et G. CULLEN (23) qui ont utilisi un mode de calcul analogue au n8tre. Le calcul de la D O C + 30 (= 0,141) chez les poules conventionnelles utilisies pour une experimentation zootechnique et ;gees de plus de 18 semaines justifie a posteriori la correction de 0,05 apportie dans le calcul du seuil de positiviti ivalui avec les sirurns E.O.P.S. Cette correction n’a pas i t i apportie pour les canards, dans la mesure oh les sirums utilisis pour determiner le seuil de positiviti provenaient, pour cette espice, d’animaux conventionnels.

Pour l’ensemble des 855 poules indemnes de salmonelles des lots A, N1, N2, N 3 et N5, le pourcentage de faux positifs est respectivement de 0,46 % et de 0,82 % selon les techniques ELISA et A.R.L. Ces risultats, concernant des oiseaux Clevis dans des condi- tions expirimentales protigies, ne reflktent probablement pas la spicificiti de ces deux tests lorsqu’ils sont appliquis sur des sirums issus d’animaux conventionnels. L’absence de detection d’anticorps par la mithode ELISA dans les sirums des canards inoculis avec E. cofi ou de la poule porteuse d’une souche d’E. coli montre que 1’ELISA est plus spici- fique que l’A.R.L. Cependant les prilevements, pour les canards, ont i t 6 effectuis 15 jours seulement apres l’inoculation. M2me si ce dilai a i t i suffisant pour que la plupart des oiseaux inoculis avec des salrnonelles sicrktent des anticorps (voir infra), il est difficile dans ce cas de conclure formellernent.

La meilleure spicificiti de la technique ELISA mise au point, par rapport h l’A.R.L., est encore dimontrie avec les oiseaux du lot N4. En particulier il faut noter les nom-


breuses riactions faussement positives (1 8/19) enregistries avec la technique A.R.L. pour les animaux iprouvis avec M. gullisepticum alors qu’aucun de ces sirums ne riagissait avec la technique ELISA. Des riactions croisies entre antigenes agglutinants mycoplas- miques et sirums positifs vis-h-vis de S. pullorum ont it6 dicrites par I. Kempf (19).

L’apparition, uniquement dans certains groupes de ce lot, de fixations aspicifiques sur les deux antigenes positif et nigatif pose le probleme de l’interpritation de ces rtsul- tats. En effet, mtme si la D O C des sirums concernis reste infirieure h 0,15, il n’est pas certain que cette valeur ait une signification rielle. D’apris HEUMANN et BAUMGARTNER (16) des impuretis (protiines et A.R.N. bactiriens) peuvent subsister dans des L.P.S. extraits au phenol, et provoquer des riactions significatives en ELISA. I1 est possible que les fixations aspicifiques observies soient diies i un phinomine analogue, la technique de prhparation des anticorps anti E. coli utilisie nous Ctant inconnue. Les mtmes sirums testis sur des antigenes priparis sans ces anticorps ne riagissaient plus (risultats non publits). Une mithode d’extraction et/ou de purification de ces anticorps, adaptie h cette utilisation particulihe permettrait peut-ttre d’iliminer ces fixations aspicifiques. Elles n’ont cependant concern6 que peu d’animaux sur l’ensemble des sirums testis et uniquement des oiseaux Khyperimmunisisn. Elles itaient tris facilement dicelables g rke h l’utilisation systimatique, pour chaque sirum, de l’antigkne nigatif parallelement h l’antigkne positif. Seule l’utilisation de la technique sur le terrain permettra de difinir la friquence de ces fixations, ainsi que leur liaison iventuelle avec l’utilisation de certains vaccins ou adjuvants.

Pour les animaux expirimentalement inoculis ou naturellement contaminis avec des salmonelles, et si l’on excepte d’une part les animaux pour lesquels on ne connait pas pricisiment la dose de salmonelles absorbie (oiseaux contacts, ou inoculis par l’eau de boisson), d’autre part les oiseaux dont le statut immunologique ne leur permet pas de ripondre correctement h une stimulation (poussins de un jour ou oiseaux massivement traitis par des anti-infectieux), le pourcentage de riactions positives varie de 15 % h plus de 90 %. Cette observation permet d’imettre l’hypothise qu’un lot pourrait ttre consi- d i r i comme sirologiquement positif dis lors que 15 % des individus au moins montrent des D O C supirieures h la valeur seuil de 0,15.

De nombreuses etudes concernant la mise au point de techniques ELISA pour le dipistage des salmonelloses aviaires sont disponibles. Les anticorps peuvent ttre dicelis dans les oeufs pondus par des poules infecties (11, 14,22) ou dans les sirums provenant d’animaux de statuts tris variis (age lors de la contamination, dilai entre la contamination et le test sirologique, dose et voie d’inoculation ... ). Or, le lot ST1 de notre itude montre que la m2me souche inoculie h des animaux de mtmes origines et de mtme Ige mais selon des doses et voies diffirentes provoque des riactions immunitaires tris diffirentes (dilai d’apparition et taux d’anticorps, pourcentages d’animaux positifs). De plus la nature de I’antigene utilisi pour sensibiliser les plaques varie d’une itude h l’autre : L.P.S. (3,6,7,9, 15, 16,17,22), flagelhe (6,15,28), cellule entiere (15), protiines (22,24). Seules seront donc comparies les etudes utilisant un antigene lipopolysaccharidique pour sensibiliser les plaques. H. CHART et al. (6) enregistrent des anticorps chez 22 poules sur 29 (75,s %), issues d’un troupeau contamini par S. enteritidis. Lors d’une autre itude portant sur six troupeaux dont cinq desquels a it6 isolie S. enteritidis, ces auteurs (7) montrent 2 h 58 % d’oiseaux positifs selon la technique A.R.L., mais sans obtenir de corrilation individuelle avec les valeurs de densiti optique de la riaction ELISA. G. L. COOPER et al. (9) ditectent des anticorps chez 43 animaux sur 62 (environ 70 %), issus d’un troupeau contamini par S. enteritidis. Lors de l’examen de trois troupeaux contaminis par S. typhimurium ou S. enteritidis, R. NICHOLAS et S. ANDREW (22) montrent 21 h 75 % de riactions positives (pour 29 h 145 sirums testis) et R. NICHOLAS et G. CULLEN (23), avec la m2me technique, trouvent des anticorps chez 62,5 % (40 sirums testis) des poules provenant d’un troupeau contamini par S. enteritidis. Les risultats de la prisente itude sont donc tout h fait comparables aux donnies de la littirature.

Dans tous les cas on constate la coexistence, dans un lot contamini voire inoculi,


d’animaux sirologiquement positifs et d’animaux sirologiquement nigatifs ce qui est h l’origine d’une grande hitiroginiiti dans les valeurs de densiti optique obtenues comme le soulignent H. CHART et al. (7). Ainsi, parmi les sirums positifs que nous avons testis, les D O C sont comprises entre 0,151 et 1,931.

La taille restreinte des deux lots wontact, (parmi les animaux des lots ST1 et SE1) ne permet de tirer aucune conclusion formelle, si ce n’est que ces animaux ont eu la pos- sibiliti de se contaminer (un h deux sujets siropositifs pour les oiseaux ST1 et un bactiriologiquement positif pour les oiseaux SEl). Pour ce qui concerne les poules inoculies par l’intermidiaire de l’eau de boisson, la survie et/ou la multiplication des salmonelles dans l’eau du riseau que nous avons utilisie reste tris difficile h cerner.

Les risultats du lot ST3 sont tris difficiles h interpriter h cause des traitements anti- infectieux instauris tris t6t apris l’infection. 11s ont tris certainement dicapiti la riaction immunitaire iventuelle chez la plupart des oiseaux (quelques individus positifs seulement dans ce lot).

Diffirents travaux ont montri l’influence de l’ige, lors de la contamination par des salmonelles, sur la pathoginie et la riponse humorale des volailles (5, 15, 17, 27, 30). Ainsi, J. HASSAN et al. (15) obtiennent des taux d’anticorps Clevis sur des poussins inoculis h l’ige de quatre jours, de m2me que I. SARI et J. THAIN (27) avec des canetons inoculis h un jour. Au contraire J. WILLIAMS et A. WHITTEMORE (30) ne ditectent qu’une tris faible riponse sirologique sur des poussins inoculis h un jour. La notion d’acquisiti- on de compitence immunitaire ivoquie par ces auteurs pourrait expliquer l’absence de toute riaction sirologique positive, tant avec 1’ELISA qu’avec l’A.R.L., pour les poussins que nous avons inoculis h un jour. En outre, les sirums prilevis l’ont i t 6 tris pricoci- ment: un jour h 3 semaines post-inoculation (seulement 8 sirums pour ce dilai maxi- mum).

Des Ctudes de cinitiques sirologiques sur des poulets de diffirents iges ou des poules adultes inoculis avec S. typhimurium ou S. enteritidis permettent de ditecter des anticorps quelques jours h une semaine apris l’inoculation, selon la technique utilisie (ELISA, A.R.L., agglutination lente en tube, mithode h l’antiglobuline). Deux h trois semaines apris l’ipreuve, tous les animaux sont positifs (3, 13, 15, 17, 21, 30). En regle ginirale, 3. la fin de ces etudes d’une durie de dix h vingt-sept semaines (3, 13, 15, 17), la plupart des animaux sont toujours siropositifs mime s’ils n’excretent plus de salmonelles sauf pour deux cas particuliers (27,30). Les Ctudes cinitiques que nous avons rialisies ont fourni des risultats similaires : dilai de ditection d’une riponse sirologique de quelques jours 2i trois semaines pour l’ensemble des animaux et maintien d’un taux d’anticorps dicelable jusqu’h quatorze semaines post-inoculation ou 20 semaines post-contamination.

En ce qui concerne les animaux contaminis par S. virchow (lot SV), le pourcentage ilevi de riactions positives selon la technique A.R.L. laisse penser que ce troupeau est en debut d’infection par S. pullorum, S. enteritidis ou S. typhimurium, ou que 1’A.R.L. ditec- te des anticorps anti S. virchow voire des anticorps dirigis contre d’autres bactiries (E. coli, mycoplasmes ...). Mais, pour la premiere hypothese et selon les risultats de notre itude, I’ELISA devrait ditecter plus de 3 % d’animaux positifs si 1’A.R.L. en montre dijh pres de 40 % (tableaux 6, 8, 11). Par contre, il est impossible de savoir si les anticorps ditectis par I’ARL sont dirigis contre S. virchow ou d’autres bactiries.

Les risultats obtenus sur le canard montrent que la technique mise au point est apparemment adaptable h cette espece sans modification majeure, mime si les essais n’ont concern6 que peu d’ichantillons.

Conclusion La mithode ELISA prisente de nombreux avantages par rapport h la technique

A.R.L., en termes de spicificiti et de sensibiliti (1,2) mais aussi en termes d’automatisation. Elle est cependant plus lourde, nicessite le calibrage des rtactifs et un Cquipement plus coiiteux (7, 8). Le test que nous avons mis au point donne des bons risultats en uti-


lisant des riactifs cornmercialisis, h l’exception de l’antigkne flagellaire de S. typhimurium. U n seul test perrnet de rialiser u n screening afin de contr6ler l’infection pa r deux sirovars, la distinction entre eux devant iventuellernent pouvoir se faire avec des antigknes spicifiques p r ipa r i s selon le rnCrne principe (risultats n o n publiis). La technique est apparue facilement adaptable au canard, laissant prisager qu’elle pourrait s’avirer igalernent transposable aux autres espirces aviaires en adaptant le conjugui.

Enfin, rnalgri la diversit6 des sirurns testis, il est indispensable de valider cette technique h grande Cchelle avec des sirums d’anirnaux conventionnels afin d’ivaluer pricisi- rnent ses quali t is et d’amiliorer iventuellernent certains de ses paramktres. Alors son utilisation cornrne rnithode d e dipistage systirnatique prialable i la bactiriologie, pourrait &re envisagie.

Rernerciements Nous tenons i remercier vivement I’ensemble du personnel du CNEVA-LCRAP pour leur aide

lors de la ricolte et/ou de la priparation des sirums testis, particulierement MESDAMES F. GESBERT, V. JESTIN, I. KEMPF, A. LE BACHELIER, J. PROTAIS et MESSIEURS P. DROUIN, H. LE COQ, J. P. PICAULT,J. Y. Tom, ainsi que Madame S. FRANCART (Direction des Services Vitirinaires, CGtes d’Armor) et Mademoiselle N. LE FLOCH.

RCsumC Un test sirologique pour le dipistage des salmonelloses aviaires i Salmonella typhimurium ou enteritidis a it6 mis au point. Les plaques itaient sensibilisies pour moitii avec un antigkne nkgatif et pour moitii avec un antigene positif. Les deux antigenes positif et nigatif itaient adsorbis avec un sirum agglutinant monovalent anti Escherichia coli avant d’0tre distribuis dans les cupules. Des sirums d’oiseaux E.O.P.S., vaccines et/ou inoculis avec diffirents virus ou bacteries ou non, ou des serums d’oiseaux conventionnels bactiriologiquement indemnes de salmonelles ont i t i testis. Moins de 1% de riactions positives ont it6 enregistries. Parmi des lots d’oiseaux infectis naturellement ou expirimentalement inoculis avec Salmonella typhimurium ou enteritidis, 1es pourcentages d’individus positifs itaient compris entre 15 et plus de 90% selon les voies et doses d’inoculation et le dilai entre la contamination et le prklkvement.

Bibliographie 1. BARROW, P. A., 1991: Serological analysis for antibodies to Salmonella enteritidis. Vet. Rec.,

2. BARROW, P. A,; J. 0. HASSAN; A. P. A. MOCKETT, and S. McLEOD, 1989: “Detection of Sal-

3. BARROW, P. A.; M. A. LOVELL, 1991: “Experimental infection of egg laying hens with Salmo-

4. BARROW, P. A.; M. A. LOVELL, and A. BER CHIERI, 1990: “Immunisation of laying hens against

5. BOURRY, H., M. GUITTET, R. L’HOSPITALIER, G. BENNEJEAN, M. MORIN, H. LE COQ, and Y. MORIN, 1988: “Diagnostic sirologique de l’infection i Salmonella Gallinarum Pullorum”. Rec. Mid. Vet. 164(3): 213 220.

6. CHART, H., B. ROWE, A. BASKERVILLE, and T. J. HUMPHREY, 1990: “Serological response of chickens to Salmonella enteritides infection”. Epidemiol. Infect., 104: 63.71.

7. CHART, H., B. ROWE, A. BASKERVILE, and T. J. HUMPHREY, 1990: “Serological analysis of chicken flocks for antibodies to Salmonella enteritidis”. Vet. Rec. 127: 501.502.

8. CHART, H., B. ROWE, A. BASKERVILLE, and T. J. HUMPHREY, 1991: “Serological analysis for antibodies to Salmonella enteritidis”. Vet. Rec., March: 215.

9. COOPER, G. L.; R. A. J. NICHOLAS, and C. D. BRACEWELL, 1989: “Serological and bacteriologi- cal investigations of chickens from flocks naturally infected with Salmonella enteritidis”. Vet. Rec., 125: 567.572.

10. COOPER, G. L., R. A. J. NICHOLAS, G. A. CULLEN, and C. E. HORMAECHE, 1990: “Vaccination of chickens with a Salmonella enteritidis aro A live oral Salmonella vaccine”. Microbial patho- genesis 9: 255-265.

1 1 . DADRAST, H., R. HESKETH, and D. J. TAYLOR, 1990: “Egg yolk antibody detection in identifica- tion of Salmonella infected poultry”. Vet. Rec., 126: 219.

January 12: 43 - 44.

monella infection by ELISA”. Vet Rec., December 2: 586.

nella enteritidis phage type 4”. Avian Pathology, 20: 335 - 348.

Salmonella enteritidis with live attenuated vaccines”. Vet. Rec., 126: 241-242.


12. FAWCETT, P. T., K. M. GIBNEY, C. D. ROSE, J. D. KLEIN, and R. A. DOUGHTY, 1991: “Adsorp- tion with a soluble E. coli antigen fraction improves the specificity of ELISA tests for Lyme Disease”. The journal of Rheurnatology, 18(5): 705-708.

13. GAST, R. K., and C. W. BEARD, 1990. “Serological detection of experimental Salmonella enteritidis infections in laying hens”. Avian Diseases, 34: 721-728.

14. GAST, R. K., and C. W. BEARD, 1991: “Research note : detection of Salmonella serogroup D. spe- cific antibodies in the yolks of eggs laid by hens infected with Salmonella enteritidis”. Poultry Science 70: 1273-1276.

15. HASSAN, J. O., P. A. BARROW, A. P. A. MOCKET, and S. MCLEOD, 1990: “Antibody response to experimental Salmonella typhimurium infection in chickens measured by ELISA”. Vet. Rec., 126: 519.522.

16. HEUMANN, D., J. D. BAUMGARTNER, JACOT, H. GUII-LARMOD, and M. P. GILAUSER, 1991: “Antibodies to core Lipopolysaccharide determinants: absence of cross reactivity with hetero- logous lipopolysaccharides”. The journal of Infections Diseases, 163: 762-768.

17. HUMPHREY, T. J., H. CHART, A. BASKERVILLE, and B. ROWE, 1991: “The influence of age on the response of SPF hens to infection with Salmonella enteritidis PT4”. Epidemiol. Infect., 106: 33.43.

18. IBRAHIM, G. F, G. H. FLEET, M. J. LYONS, and R. A. WALKER, 1985: “Method for the isolation of highly purified Salmonella flagellins”. Journal of clinical Microbiology, 22(6): 1040 - 1044.

19. KEMPF, I., 1988: “Le dipistage des mycoplasmoses aviaires”. L’aviculteur, 486. 20. KLES, V., M. MORIN, F. HUMBERT, F. LALANDE, M. GUITTET, and G. BENNEJEAN, 1992: “Sero-

logical diagnosis of avian salmonellosis: an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) development using antigens adsorbed with E. coli antisera. Proceedings of symposium “Salmo- nella and salmonellosis”, 15-17 Sept i Ploufragan, 93-94.

21. LEE, G. M.; G. D. F. JACKSON, and G. N. COOPER, 1983: “Infection and immune responses in chickens exposed to Salmonella typhimurium”. Avian Diseases, 27(3): 577-583.

22. NICHOLAS, R. A. J., and S. T. ANDREWS, 1991: “Detection of antibody to Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium in the yolk of hens’ eggs. Vet. Rec., 128: 98-100.

23. NICHOLAS, R. A. J., and G. A. CULLEN, 1991: “Development and application of an ELISA for detecting antibodies to Salmonella enteritidis in chickens flocks”. Vet. Rec., 128: 74-76.

24. NICHOLAS, R. A. J., G. A. CULLEN, and P. DUFF, 1990: “Detection of Salmonella”. Vet. Rec., February 10: 147.

25. PENG, G. W.; W. L. CHIOU, 1990: “Review: analysis of drugs and other toxic substances in bio- logical samples for pharmacokinetic studies”. Journal of chromatography Biomedical applica- tions, 531: 3- 50.

26. PROTAIS, J., C. LAHELLEC, G. BENNEJEAN, Y. MORIN, and E. QUINTIN, 1989: “Transmission verticale des salmonelles chez la poule: exemple de Salmonella enteritidis”. Bul. d’Inf., Exp. d’aviculture de Ploufragan, 2 9 37-43.

27. SARI, I., and J. A. THAIN, 1983: “The serological response of ducklings to infection with Salmo- nella typhimurium as measured by the microantiglobulin and microagglutination tests”. Avian Pathology, 12/ 371-378.

28. TIMONEY, J. F., N. SIKORA, H. L. SHIVAPRASAD, and M. OPITZ, 1990: “Detection of antibody to Salmonella enteritidis by a gm flagellin based ELISA”. Vet. Rec., 127: 168-169.

29. VASSAULT, A., D. GRAFMEYER, C. NAUDIN, G. DUMONT, M. BAILLY, J. HENNY, M. F. GER- HARDT, and P. GEORGES, 1986: “Protocole de validation de technique”. Sociiti FranCaise de Biologie Clinique, commission validation de techniques. Ann. Biol. Clin., 44: 686-745.

30. WILLIAMS, I. E., and A. D. WITTEMORE, 1975: “Influence of age on the serological response of chickens to Salmonella typhimurium infection”. Avian Diseases, 19(44): 745-760.

Diagnostic sérologique des salmonelloses aviaires: Mise au point d'un test ELISA utilisant des...

Documents

Transcript of Diagnostic sérologique des salmonelloses aviaires: Mise au point d'un test ELISA utilisant des...