IRAZ ALPER

DEFI PHYLOGENETIQUE CHEZ LA LEVURE D'INTÉRÊT LAITIER GEOTRICHUM CANDIDUM

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en Sciences et technologie des aliments pour l'obtention du grade de Philosophiae doctor (Ph. D.)

DEPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2013

Iraz Alper, 2013

Jusqu 'au milieu du XIX e siècle, on observait les êtres vivants, mais on ne cherchait guère à en déranger l'ordonnance pour l'analyser. On considérait les organismes dans leur entier pour préciser leurs propriétés et leurs structures. On les comparait entre eux pour déterminer les analogies et les différences. Pour Darwin comme pour Cuvier, c 'était la nature qui effectuait les expériences pour le naturaliste.

François Jacob La logique du vivant

11

Résumé Geotrichum candidum est une levure couramment utilisée comme ferment

d'affinage pour la fabrication des fromages à croûte fleurie et à croûte lavée. Cette espèce,

pour laquelle très peu d'études génétiques ont été réalisées, présente un intérêt

technologique pour les industries fromagères et productrices de ferments. Les membres de

l'espèce arborent une diversité de propriétés morphologiques et physiologiques qui sont

souche-dépendantes. Afin d'exploiter cette diversité de façon optimale et de fabriquer

industriellement des fromages affinés en surface à saveur et à texture plus traditionnelles, il

est donc impératif de pouvoir identifier les souches de G. candidum et de les caractériser.

Il existe actuellement un débat concernant l'utilisation de la région ITS de l'ADN

ribosomique, tel un code-barres, pour l'affiliation des mycètes. Il était donc important de

déterminer si les bases du DNA barcoding s'appliquaient à G. candidum. Le premier

objectif a été d'augmenter l'information phylogénétique pour cette espèce en séquençant

pour la première fois la région complète du 18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S de l'ADNr et ce pour

18 souches. Des hétérogénéités intra-espèce et intra-génomique inhabituelles au niveau de

l'ADNr ont été révélées amenant un questionnement sur la robustesse de cette région pour

l'affiliation des isolats de cette espèce. Les résultats obtenus suggèrent que les techniques

de profilage des communautés de mycètes basées sur l'ADNr doivent être utilisées avec

précaution.

La diversité des propriétés technologiques des souches de G. candium nécessite une

méthode de génotypage discriminante générant des profils génétiques fiables pour la

caractérisation des souches. Le premier schéma de Multilocus Sequence Typing (MLST) a

donc été développé avec 18 souches en identifiant, puis séquençant au complet, six

nouveaux gènes domestiques. Le schéma fut ensuite validé sur 22 souches supplémentaires.

Le MLST a permis de révéler au sein de l'espèce G. candidum l'existence probable d'une

sous-espèce.

Les résultats de l'ADNr et du MLST combinés aux résultats publiés sur la plasticité

du génome de G. candidum et la variabilité morphologique des souches révèlent la fragilité

des frontières entourant cette espèce. L'affiliation des isolats à cette espèce est un véritable

défi phylogénétique qui nous rappelle que finalement les frontières des espèces ne sont pas

hermétiques et que la nature ne fait pas de "sauts" dans son processus d'évolution.

Ill

Abstract Geotrichum candidum is a yeast which is commonly used as a ripening agent for the

manufacture of bloomy-rind and washed-rind cheeses. This species for which little genetic

investigations have been carried on, displays morphological and physiological strain-

dependent properties, which have considerable technological interest for starters suppliers

and cheeses industries. To optimize the use of strains belonging to this species and to

manufacture industrially surface-ripened cheeses with more traditional texture and flavor, it

is imperative to identify the G candidum isolates and to characterize them.

There is currently a debate regarding the use of the ITS region of rDNA as a

barcode for the affiliation of fungi. It was therefore important to determine if DNA

barcoding could be applied to G. candidum. The first objective was to increase the

phylogenetic information for this species by sequencing for the first time the entire 18S-

ITS1-5.8S-ITS2-26S rDNA region. Unusual intra-species and intra-genomic

heterogeneities of rDNA were revealed among the 18 strains studies leading to an

evaluation of the robustness of this region for the affiliation of the isolates belonging to this

species. The results obtained suggest also that the profiling community techniques of fungi

based on rDNA be used with caution.

The diversity of technological properties in G. candium strains requires a

discriminant method of genotyping generating reliable genetic profiles for strains

characterization. The first Multilocus Sequence Typing (MLST) scheme has been

developed with 18 strains after identification and sequencing of six new housekeeping

genes. The scheme was then validated on 22 additional strains. MLST revealed within the

G. candidum species the potential existence of a subspecies that has not been described

previously.

The results of rDNA and MLST, combined to previously published results on the

plasticity of the genome of G. candidum and the morphological variability of strains, reveal

the fragility of species boudaries limiting this species. The affiliation of the isolates to this

species is a phylogenetic challenge reminding us that the species boundaries are not

hermetical and that there is no gap in the evolutionnary process in nature.

IV

Remerciements

Dans un premier temps, je tiens à remercier mon directeur de thèse, le Dr Steve Labrie qui

a encadré ce travail avec la plus grande disponibilité et un soutien sans faille. Je lui exprime

toute ma reconnaissance pour la confiance qu'il m'a témoignée, l'autonomie qu'il m'a

laissée tout au long de ce projet et surtout pour m'avoir offert la possibilité à plusieurs

reprises de présenter mes résultats lors de congrès nationaux et internationaux. Les

remerciements exprimés ici ne seront jamais à la hauteur de l'immense respect et de la

profonde gratitude que j 'ai pour lui.

Je souhaite également remercier mon co-directeur de thèse, le Dr Michel Frenette pour sa

grande disponibilité, son appui scientifique, ses conseils avisés et les encouragements

continus qu'il m'a prodigués tout au long de mon cheminement. Je lui exprime toute ma

reconnaissance et ma gratitude pour son implication dans ma thèse de doctorat.

Mes remerciements s'adressent également au Dr Linda Saucier de l'Université Laval pour

avoir accepté d'être prélecteur de ma thèse, au Dr Julie Jean de l'Université Laval et au

Dr Nathalie Desmasures de l'Université de Caen pour avoir accepté d'examiner mon

manuscrit.

Un grand merci aux membres du laboratoire de Steve Labrie et plus particulièrement à

Céline Paquin, Catherine Viel, Francis Bergeron, Francis Boileau et Marie-Michelle

Gagnon pour leurs conseils, leur support technique et leurs encouragements. Un grand

merci également à Rébecca, Rima, Marie-Hélène, Geneviève, Karine et Catherine de

m'avoir accordé leur amitié. Sans les innombrables éclats de rire, les petites danses, les

«remontages » de moral, les pauses-café, tous ces moments importants de la vie partagés

ensemble et surtout sans votre appui, la réalisation de cette thèse de doctorat n'aurait pu

être possible et soyez assurées en retour de toute mon amitié, de ma reconnaissance et de

ma gratitude.

Et enfin, un merci qui vient du plus profond de mon coeur à mes parents pour leur soutien,

leurs encouragements et leur amour inconditionnel qui ont su m'atteindre et me guider par-

delà l'océan. Annem, babam, sans le courage et la force d'avancer que vous m'avez

transmis, je n'aurais jamais pu commencer cette aventure canadienne. Soyez assurés de

toute ma reconnaissance et de tout mon amour.

Je tiens également à remercier madame Micheline Guéguen de l'université de Caen,

monsieur Patrick Boyaval de chez Danisco ainsi que Julie Audy qui travaillait à l'époque

chez Lallemand pour le don des souches de Geotrichum candidum. Et enfin, la réalisation

de ce projet n'aurait pu être possible sans l'appui financier du Conseil de recherches en

sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), du Fonds de recherche sur la nature et

les technologies du Québec (FQRNT), de la Faculté des Sciences de l'agriculture et de

l'alimentation de l'Université Laval (Département des sciences des aliments et de nutrition)

et de l'Institut des nutraceutiques et des aliments fonctionnels (INAF).

VI

Avant-Propos

Cette thèse est présentée en sept chapitres. Le chapitre 1, chapitre d'introduction, présente

la problématique générale de la thèse. Au chapitre 2, une revue de la littérature résume les

connaissances actuelles sur les fromages affinés en surface comme les fromages à croûte

fleurie et les fromages à croûte moisie. Un intérêt particulier est porté aux levures de la

microflore d'affinage et plus spécifiquement à Geotrichum candidum, la levure à l'étude

dans la présente thèse. Une présentation générale de ce mycète ainsi que son implication

dans les différentes caractéristiques organoleptiques des fromages affinés en surface sont

abordées. Les différentes techniques d'identification, de differentiation et de caractérisation

couramment utilisées pour cette espèce seront décrites, selon l'état actuel de nos

connaissances, puisque la sélection des souches est un préalable à la formulation des

ferments ainsi qu'à la fabrication des fromages affinés en surface.

L'hypothèse, le but et les principaux objectifs de cette thèse sont ensuite énoncés au

chapitre 3. Puis, les principaux résultats de cette thèse sont présentés sous la forme

d'articles scientifiques, au nombre de deux, qui sont rédigés en anglais. Le premier volet

abordé dans cette thèse, présenté au chapitre 4, porte sur la mise en évidence de

polymorphismes nucléotidiques intra-espèce et intra-génomique de l'ADN ribosomique au

sein de l'espèce G. candidum. Les résultats de cette étude ont été publiés dans la revue

internationale Fungal Biology, sous la forme d'un article intitulé « Ribosomal DNA

polymorphisms in the yeast Geotrichum candidum ». L'auteure de cette thèse a effectué

l'ensemble des expérimentations, l'interprétation des résultats et la rédaction de cet article

dont elle est la première auteure. Le Dr Michel Frenette et le Dr Steve Labrie sont co­

auteurs ayant participé à la rédaction de l'article, supervisé le travail de recherche et obtenu

le financement.

Le second article présenté dans cette thèse porte sur le développement du premier schéma

de Multilocus Sequence Typing pour la differentiation et la caractérisation des souches de

G. candidum. Les résultats sont présentés au chapitre 5. Cet article, intitulé « Genetic

diversity of dairy Geotrichum candidum strains revealed by Multilocus Sequence Typing »,

Vil

a été publié dans la revue internationale Applied Microbiology and Biotechnology.

L'auteure de cette thèse a effectué l'ensemble des expérimentations, l'interprétation des

résultats et la rédaction de cet article dont elle est la première auteure. Le Dr Michel

Frenette et le Dr Steve Labrie sont co-auteurs ayant participé à la rédaction de l'article,

supervisé le travail de recherche et obtenu le financement.

La discussion générale de cette thèse est présentée au chapitre 6. Ce chapitre vise à mettre

en relief les principaux résultats obtenus et leur contribution à l'avancement des

connaissances. Enfin, dans le chapitre 7 de cette thèse, sont présentées des perspectives

pour des travaux futurs et les conclusions générales.

Le faible nombre d'études publiées portant sur G. candidum, et donc de données génétiques

exploitables, ainsi que le faible nombre de méthodes de caractérisation et de techniques

génétiques disponibles ont constitué un défi important lors de la réalisation de la présente

thèse. En effet, cette étude a été réalisée dans un tout nouveau laboratoire s'intéressant à la

problématique des levures laitières. Plusieurs techniques maintenant utilisées de routine

dans ce laboratoire ont été développées et optimisées lors de la réalisation de cette thèse. De

plus de nombreux gènes ont été identifiés et séquences pour la première fois pour cette

espèce, constituant ainsi les prémices du typage moléculaire basé sur des séquences

nucléotidiques chez G. candidum. Ceci a entraîné certains délais dans la réalisation des

travaux, mais s'est avéré très formateur au niveau scientifique.

Vll l

A mes parents, A la mémoire de mon grand-père,

le Dr Halil Ibrahim Dônmezer

IX

Table des matières

Résumé ii

Abstract iii

Remerciements iv

Avant-Propos vi

Table des matières ix

Liste des tableaux xiii

Liste des figures xv

Liste des abréviations xviii

Chapitre 1- Introduction 1

Chapitre 2- Revue de littérature 5

2.1 La technologie fromagère 5

2.1.1 De formage à fromage 5

2.1.2 Les fromages affinés en surface 6

2.1.2.1 Les fromages à croûte fleurie 7

2.1.2.2 Les fromages à croûte lavée 8

2.1.3 Les levures de la microflore d'affinage : un rôle central tout en surface 9

2.2 Geotrichum candidum 11

2.2.1 Histoire et taxinomie 12

2.2.2 Habitat et origine 16

2.2.3 Diversité morphologique et phénotypes associés 18

2.2.4 Structure génomique 20

2.3 Contributions de G. candidum à la maturation des fromages affinés en surface..21

2.3.1 Participation à l'apparence des fromages affinés en surface 21

2.3.2 Participation au profil aromatique des fromages affinés en surface 23

2.3.2.1 Activité lipolytique 23

2.3.2.2 Activité protéolytique 25

2.3.2.3 Catabolisme des acides aminés 26

2.3.2.4 Réduction de ramertume 28

2.3.3 G. candidum et ses interactions au sein du microbiote fromager 29

2.3.3.1 Interactions avec Pénicillium camemberti 29

2.3.3.2 Interactions entre G. candidum et les autres microorganismes 30

2.3.4 Propriétés probiotiques potentielles de G. candidum 34

2.4 Exploration de la diversité des souches de G. candidum à travers des méthodes

d'identification et de typage 34

2.4.1 Les méthodes d'identification 34

2.4.1.1 Les caractères phénotypiques et physiologiques 35

2.4.1.2 Le DNA barcoding 38

2.4.2 Les méthodes de typage 42

2.4.2.1 Méthodes basées sur l'amplification aléatoire d'ADN par PCR 42

2.4.2.2 Le Multilocus Sequence Typing : nouvelle approche proposée pour le

typage des souches de G. candidum 46

Chapitre 3- Problématique, hypothèses de recherche et les objectifs 51

3.1 Problématique 51

3.2 Hypothèses de recherche 52

3.3 Objectifs 52

Chapitre 4- Polymorphismes de l'ADN ribosomique chez la levure G. candidum 54

4.1 Résumé 54

4.2 Avant propos 54

4.2.1 La contribution des auteurs 54

4.2.2 Publication et communications associées à ce chapitre 55

4.3 Abstract 55

4.4 Introduction 56

4.5 Materials and methods 58

4.5.1 Biological materials, culture conditions, and genomic DNA extractions 58

4.5.2 PCR amplification and sequencing of ribosomal DNA 59

4.5.3 Bioinformatic analysis 62

4.5.4 Amplification, cloning, and sequencing of the ITS1-5.8S-ITS2 region 63

4.6 Results 64

4.6.1 Intragenomic variations in the complete sequence of the G. candidum rRNA

genes and their ITS1 and ITS2 spacer regions 64

XI

4.6.2 Analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region 67

4.6.3 Analysis of the 18S region 70

4.6.4 Analysis of the 26S region 72

4.7 Discussion 72

4.8 Acknowledgments 76

Chapitre 5- Diversité génétique des souches de G. candidum d'origine laitière mise en

évidence par Multilocus Sequence Typing 77

5.1 Résumé 77

5.2 Avant propos 77

5.2.1 La contribution des auteurs 77

5.2.2 Publication et communications associées à ce chapitre 78

5.3 Abstract 78

5.4 Introduction 79

5.5 Materials and methods 81

5.5.1 Biological material, culture conditions and genomic DNA extractions 81

5.5.2 Ribosomal DNA operon and ITS1-5.8S-ITS2 sequencing 81

5.5.3 Phenotypic tests 83

5.5.4 RAM-PCR profile 83

5.5.5 COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers (CODEHOP)

strategy for identification of new housekeeping genes in G. candidum 84

5.5.6 Genome walking strategy and complete gene sequence determination 86

5.5.7 Rapid amplification of cDNA ends (RACE) for coding sequence integrity

confirmation 86

5.5.8 MLST loci selection 87

5.5.9 MLST data treatment and bioinformatical analysis 87

5.6 Résultats 89

5.6.1 Identification of G. candidum isolates 89

5.6.2 RAM-PCR of 18 G. candidum strains 91

5.6.3 Characteristics of six housekeeping genes targeted for G. candidum species..92

5.6.4 Polymorphisms in MLST loci 93

5.6.5 Population structure based on MLST data for 40 strains of G. candidum 96

Xll

5.6.6 Differentiation of G. candidum isolates using MLST 96

5.6.7 Genotyping by RAM-PCR vs. MLST 99

5.6.8 Phylogeny based on MLST data for G. candidum species 99

5.7 Discussion 100

5.8 Acknowledgments 103

Chapitre 6- Discussion générale 104

6.1 Le DNA barcoding et ses limitations chez G. candidum 105

6.2 Une application industrielle de la technique du Multilocus Sequencing Typing

pour l'espèce G. candidum 109

6.3 Un groupe de souches phylogénétiquement distant 110

Chapitre 7- Conclusions générales et perspectives 112

Bibliographie 117

Annexe 1 : Diagramme technologique du fromage 141

Annexe 2 : Lipases caractérisées chez G. candidum (Boutrou et Guéguen 2005) 142

xin

Liste des tableaux

Tableau 1. Caractères culturaux et morphologie de Geotrichum candidum en fonction du

morphotype 19

Tableau 2. Liste des acides gras saturés produits par Geotrichum candidum sur milieux

laits et dans des modèles fromagers 24

Tableau 3. Liste des méthylcétones produites par Geotrichum candidum sur milieux laits et

dans des modèles fromagers 25

Tableau 4. Caractères utilisés pour la differentiation des espèces au sein du genre

Galactomyces 35

Tableau 5. Caractères physiologiques décrivant la morphologie parfaite de l'espèce

Geotrichum candidum 37

Tableau 6. Marqueurs moléculaires communs utilisés pour la discrimination au niveau de

l'espèce 39

Tableau 7. Caractéristiques des différentes méthodes de typage appliquées sur des isolats

de mycètes 49

Table 8. Geotrichum candidum strains and their origin 59

Table 9. Primers names, sequences, and references 60

Table 10. Distribution of the polymorphic sites on the 18S, 5.8S, 26S rRNA-encoding

genes and their ITS1 and ITS2 spacer regions of G candidum based on direct

sequencing results 65

Table 11. Distribution of polymorphic sites on the cloned sequences of ITS1-5.8S-ITS2. 68

Table 12. Origins of G candidum strains and isolates typed using MLST 82

XIV

Table 13. Characteristics of Geotrichum candidum (LMA-40) housekeeping genes and

their encoded proteins compared to those of phylogenetically related yeast species. ..85

Table 14. Characteristics of the six loci used for Geotrichum candidum MLST after

analysis of 40 strains 88

Table 15. Genotypes of the 40 Geotrichum candidum isolates tested 97

XV

Liste des figures

Figure 1. Différents gradients établis au sein d'un fromage Camembert lors de son

affinage. Illustration tirée intégralement de McSweeney et Fox (2004) 7

Figure 2. Dynamique des espèces de levures retrouvées dans le Livarot. Graphique tiré

intégralement de Larpin et coll. (2006) 12

Figure 3. Photographie en microscopie optique à contraste de phase de Geotrichum

candidum souche LMA-77 au troisième jour de croissance. La désarticulation et la

fragmentation des hyphes sont observables. Photo Emilie Hardy, 2009. Microscopie

optique. Microscope Olympus BX51, grossissement 40X 13

Figure 4. Endomyces geotrichum. Jeunes asques (en haut) et ascospores matures dans des

asques (en bas), x 1000. Image tirée intégralement de Butler et Petersen (1972) 15

Figure 5. Aspect des souches de Geotrichum candidum LMA-75 (A) et LMA-21 (B) sur

milieu gélose YEG après quatre jours de croissance à 25 °C dans l'obscurité. Photos

Francis Boileau 18

Figure 6. Interactions (—», positive, —•, négative) entre Debaryomyces hansenii (Dh),

Yarrowia. lipolytica (Yl), Geotrichum candidum (Gc), Leucobacter sp. (Ls) et le

groupe C incluant Arthrobacter arilaitensis, Hafnia alvei, Corynebacterium casei,

Brevibacterium aurantiacum et Staphylococcus xylosus au sein d'un fromage Livarot

expérimental. Figure tirée intégralement de Mounier et coll. (2008) 33

Figure 7. Mycellium formé par Geotrichum candidum en culture pure (A), en co-culture

avec Debaryomyces hansenii (B) et en co-culture avec Yarrowia lipolytica (C). Photos

tirés de Mounier et coll. (2008) 33

Figure 8. Nombre de séquences de mycètes déposées chaque année dans GenBank/INSD.

Gris clair : séquences amplifiées de mycètes; gris foncé : séquences ITS de l'ADNr.

Graphique tiré de Begerow et coll. (2010) 41

XVI

Figure 9. Vue d'ensemble des étapes expérimentales de la RAPD-PCR et du MLST. Figure

tirée intégralement de Vanhee et coll. (2010) 48

Figure 10. Distribution of universal primers (arrows) used in the PCR amplification of

rDNA and location of polymorphic 61

Figure 11. Neighbor-joining tree based on the complete rDNA sequence (Fig. 11 A) and the

complete ITS1-5.8S-ITS2 region (Fig. 11B) of 18 Geotrichum candidum strains.

Bootstrap values are shown next to the nodes. Geotrichum klebahnii FJ838778 was

used as outgroup in Figure 1 IB 66

Figure 12. Comparison of 18S rDNA generated with the de Hoog and Smiths classification

(2004). The 18S neighbor-joining tree is based on 36 near-complete sequences

available from GenBank and 18 complete sequences from the Geotrichum candidum

strains determined in the present study. Bootstrap values are shown next to the nodes.

The strains of group 2 were used as an outgroup 71

Figure 13. Comparison of ITS1-5.8S-ITS2 rDNA generated with the de Hoog and Smith

(de Hoog and Smith 2004) classification. The ITS1-5.8S-ITS2 neighbor-joining tree

(1000 bootstrap) is based on 32 complete sequences available from GenBank, 18

complete sequences from the G candidum strains determined previously in Alper et

al. (2011) and 22 complete sequences from the G candidum strains determined in this

study. Bootstrap values are shown next to the nodes. The evolutionary distances were

estimated using the Maximum Composite Likelihood (gaps were eliminated from

phylogenetic analysis). Phylogenetic analyses were conducted in MEGA4. The strains

of group 2 were used as an outgroup. Phylogenetic analysis revealed that isolates

clustered in the group 1, are distributed between two subgroups: Group A, containing

LMA-21, -70, -244 and -1035 and Group B containing the other 36 strains and

isolates 91

Figure 14. Dendrogram showing the UPGMA cluster analysis of RAM-PCR profiles

generated using (GATA)4 primer, of 18 G candidum strains (Pearson correlation).

XVII

Origin of each strain is indicated next to the strain labeling. RAM-PCR was realized

according to the standardized protocol proposed by Gente et al. (2006) 92

Figure 15. Phylogenetic tree (Neighbor-Joining) of 18 Geotrichum candidum strains based

on ALA\, CDCX9, ERG10, GLN4, PGI\ and PGM2 complete gene contigs. The

phylogenetic trees were constructed using the Neighbor-Joining method with 1000

bootstraps (bootstrap values are shown next to the nodes). The evolutionary distances

were estimated using the Maximum Composite Likelihood (gaps were eliminated

from phylogenetic analysis). Phylogenetic analyses were conducted in MEGA4 94

Figure 16. Positions of the polymorphic sites for alleles identified for each locus. Allele 1

is presented as reference for each locus. For other alleles, only sites that differ from

allele 1 are shown and position with identical nucleotide are represented by dots.

Columns in grey correspond to polymorphic sites observed when 18 strains were used

for MLST scheme development. Columns in white correspond to new polymorphic

sites indexed when 22 additional strains were used for MLST scheme validation. Non-

synonymous substitution sites are identified using (*) 96

Figure 17. MLST phylogenetic tree (Neighbor-Joining) of 40 G candidum strains based on

six loci contig alignments. The phylogenetic trees were constructed using the

Neighbor-Joining method with 1000 bootstraps (bootstrap values are shown next to

the nodes). The evolutionary distances were estimated using the Maximum Composite

Likelihood (gaps were eliminated from phylogenetic analysis). Phylogenetic analyses

were conducted in MEGA4. Strains in bold are those used to develop the MLST

scheme 99

XV111

Liste des abréviations

5.8S, 16S, 26S et 28S: le S correspond au coefficient de Svedberg

Accl : Acetyl -Co-A carboxylase

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNr : ADN ribosomique

Adpl : Permease ATP-dépendante

Alal : Alanyl-tRNA synthetase

ARN : Acide ribonucléique

ATCC : American Type Culture Collection

CBS : Centraalbureau voor Schimmelcultures

Cdcl9 : Pyruvate kinase

CGL: cystathionine-y-lyase

cgi: gène de la cystathionine-y-lyase

CNIEL : Centre National Interprofessionnel de l'Économie Laitière

CODEHOP : Consensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers

COI : cytochrome c oxydase I

CVS : Composés Volatils Soufrés

cytb : gène du cytochrome b

DMS : diméthylsulfide

DMDS : diméthyldisulfide

DMTS : diméthyltrisulfide

dN : nombre de substitutions non synonymes

dS : nombre de substitutions synonymes

Erg 10 : Acetyl-coA acétyltransférase

Gln4 : Glutaminyl-tRNA synthase

IA : Index d'Association

ITS1 et ITS2 : Internal Transcribed Spacer 1 et Internal Transcribed Spacer 2

kb : kilo bases

KMBA : acide 4-méthylthio-2-oxobutyrique

LMA : Laboratoire de Mycologie Alimentaire

XIX

MLEE : Multilocus Enzyme Electrophoresis

MLST : Multilocus Sequence typing

MT : méthanethiol

NSLAB : Non Starter Lactic Acid Bacteria (Bactéries lactiques non levain)

pb : paire de bases

PCR : Polymerase Chain Reaction (réaction en chaîne de la polymerase)

PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis (Électrophorèse en champs puisé)

Pgil : Phosphoglucoisomerase

Pgm2 : Phosphoglucomutase

Pnpl : Purine nucleoside phosphorylase

qPCR : quantitative PCR (PCR quantitative)

RAM-PCR : Random Amplified Microsatellite by PCR

RAPD-PCR : Random Amplified Polymorphism DNA by PCR

rbcL : gène codant pour la grande sous-unité de la ribulose 1,5-biphosphate

carboxylase/oxygenase

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

Rpn2 : 26S protéasome regulatory subunit

ST : séquence type

UFC : Unité Formant des Colonies

Vpsl3 : Vacuolar sorting

YEG : Yeast Extract and Glucose (extrait de levure et glucose)

Chapitre 1- Introduction

L'industrialisation des étapes de fabrication fromagère, dans le but de produire des

fromages de qualité constante, a conduit à la commercialisation de ferments d'affinage

standardisés. Cette pratique a mené progressivement à l'abandon de la sélection empirique

des ferments. Cette pratique présente cependant le risque de diminuer la biodiversité des

microorganismes d'intérêt fromager et, par conséquent, de perdre certains fromages de

spécialité (ou de terroir). Or, leurs qualités organoleptiques sont recherchées par de plus en

plus de consommateurs au Canada (http://www.infolait.gc.ca/pdf7dpconsumption.pdf) et au

Québec (http://www.stat.gouv.qc.ca/publications/ind_bioalimentaire/prof_bio.htm).

L'abandon de vieux ferments et la diminution du nombre de souches disponibles

correspondent plus ou moins à perdre un peu du patrimoine. Au même titre que la

communauté scientifique ressent le besoin urgent de dresser le portrait de la biodiversité du

monde vivant afin de le comprendre et de le préserver, le monde microbien fromager

nécessite une grande attention (http://infos.cniel.com/actualite/la-conservation-de-

microorganismes-interessants-pour-les-produits-laitiers.html).

Geotrichum candidum, dont le téléomorphe est Galactomyces candidus, est une levure

dimorphique qui se retrouve à la frontière des levures et des moisissures (Guéguen et

Jacquet 1982; Barnett et al. 1990; Wouters et al. 2002; de Hoog et Smith 2004). Elle est un

composant de la flore naturelle du lait et est fréquemment utilisé comme agent d'affinage

en raison de sa participation active dans l'apparence et la texture des fromages affinés en

surface (Wouters et al. 2002; Boutrou et Guéguen 2005). Dans le cas du Camembert,

fromage à croûte fleurie, G. candidum recouvre la surface dès la première semaine

d'affinage (Leclercq-Perlat et al. 2004a). Son activité alcalinisante favorise le

développement de microorganismes acido-sensibles tel que Brevibacterium linens sur le

Livarot, fromage à croûte lavée (Irlinger et Mounier 2009). Elle présente également un effet

antagoniste en inhibant la croissance de microorganismes indésirables comme les

Mucor sp. et Listeria monocytogenes (Guéguen et Lenoir 1976; Dieuleveux et al. 1998).

Outre ce rôle de protection et son apport à l'apparence du fromage, G. candidum contribue

au développement des arômes des fromages affinés en surface par l'action de ses enzymes

lipolytiques et protéolytiques sur les constituants du caillé (Boutrou et Guéguen 2005;

Boutrou et al. 2006). Elle participe activement au profil aromatique caractéristique des

fromages à croûte lavée comme le fromage Livarot et confère au fromage Camembert

fabriqué industriellement une saveur plus traditionnelle et moins amère (Vassal et Gripon

1984; Berger etal. 1999).

L'étude de ses caractères morphologiques et de ses propriétés protéolytiques et lipolytiques

a révélé, au sein de l'espèce, une grande diversité technologique présentant un intérêt

économique important pour les industries fromagères et celles produisant des ferments.

Selon les rapports annuels 2009-2010 respectifs de chacune des entreprises, la division

"Cultures" représente 15 % du chiffre d'affaires de Danisco

(http://www.danisco.com/uploads/tx_tcdaniscofiles/Annual_report_uk.pdf) et la division

Cultures & Enzymes représente 62 % du chiffre d'affaires de Chr. Hansen (http://www.chr-

hansen.com/fileadmin/userupload/3.Do wnloaddocuments/ARlO/ChrHansenAarsrapport

_2010_UK.pdf), deux importantes industries de ferments dans le monde. Les ferments

comme G. candidum représentent donc une certaine valeur commerciale. Il est donc

important de les caractériser afin d'optimiser la sélection des souches et la formulation des

ferments. Malgré cette valeur commerciale, très peu d'investigations ont été réalisées afin

d'estimer la diversité génétique existante au sein de l'espèce G. candidum et d'élaborer des

méthodes de génotypage des souches en vue de l'optimisation de leur utilisation comme

ferment d'affinage. Afin d'affilier de manière rigoureuse des isolats à l'espèce G. candidum

et de mieux définir cette dernière, il est nécessaire de disposer d'outils moléculaires

permettant la différenciation et la caractérisation des souches.

Le « All Fungi Barcode Initiative » a proposé la région ITS de l'ADN ribosomique,

incluant les espaceurs internes ITS1 et ITS2 et le gène 5.8S, comme code-barres pour

l'identification des isolats de mycètes. Cependant, pour certaines espèces de mycètes, cette

région ne permet pas une identification fiable et robuste et son utilisation est donc

questionnable. En effet pour 1,96 % des Ascomycètes, dont fait partie G. candidum, cette

région présente des polymorphismes intra-espèces. D'autres résultats, incluant l'analyse des

régions 18S, 26S et ITS, indiquent la présence de polymorphismes intra-génomiques au

sein de certaines espèces, dont la levure Clavispora lusitaniae. Dans ce contexte, il apparaît

évident que la région complète 18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S de l'ADNr chez G. candidum se

devait d'être analysée afin d'apporter des éléments de réponses sur ce débat.

Il existe également quelques méthodes moléculaires qui permettent d'estimer la diversité au

sein de cette espèce et de génotyper les souches comme l'amplification aléatoire des

polymorphismes de l'ADN (RAPD-PCR) ou des microsatellites (RAM-PCR) par PCR. Ces

méthodes de génotypage présentent l'avantage de différencier les souches en se basant sur

des polymorphismes répartis au niveau du génome complet. Cependant, ces méthodes de

differentiation basées sur l'amplification aléatoire de l'ADN génomique ou des

microsatellites, présentent plusieurs limitations. Tout d'abord la reproductibilité inter­

laboratoires est faible ce qui rend difficile la comparaison des profils électrophorétiques

obtenus. L'analyse des résultats est basée sur une sélection plus ou moins subjective des

bandes électrophorétiques à intégrer à l'étude. Les expériences ne peuvent être conduites de

façon séquentielle, c'est-à-dire sur un seul isolât à la fois. Et enfin, ces méthodes ne

permettent pas de réaliser des études phylogénétiques puisqu'elles sont basées sur

l'observation des différences de structures génomiques générées par des polymorphismes

au niveau de l'ADN génomique ou des microsatellites et non sur la séquence de gènes.

Le Multilocus Sequence Typing (MLST) est une méthode de génotypage fréquemment

utilisée en étude clinique afin d'identifier des isolats et permettre de réaliser des études

épidémiologiques pour des pathogènes. De par son principe, cette méthode peut contourner

toutes les limitations énoncées un peu plus haut. En effet, le MLST repose sur le

séquençage et la comparaison des séquences nucléotidiques de régions ou loci d'environ

650 pb, provenant de six à sept gènes domestiques (housekeeping genes). En plus de

génotyper les souches, le MLST permet de réaliser des études phylogénétiques. Afin de

pouvoir appliquer cette technique aux souches de G candidum, l'identification préalable de

gènes domestiques est primordiale permettant ainsi de sélectionner les loci présentant un

pouvoir résolutif important. Tous ces objectifs conduisant au génotypage des souches par

MLST permettront de mieux comprendre la diversité des souches de G. candidum et

d'augmenter les informations génétiques pour cette espèce. Une meilleure caractérisation

des souches de G. candidum permettra de dresser un portrait de la diversité génétique présente au sein de cette espèce et une meilleure gestion des collections de souches. Enfin le génotypage par MLST permettra aussi de contribuer au développement de nouveaux ferments afin de fabriquer des fromages variés, de qualité constante, et pouvant présenter des caractéristiques proches des fromages traditionnels.

Chapitre 2- Revue de littérature

2.1 La technologie fromagère

2.1.1 De formage à fromage

Le fromage résulte d'un processus irréversible qui est la prise en gel du lait, ou coagulation,

dans la cuve de fabrication (Froc 2006). Dans le Massif central en France, une variété de

fromage bleu porte encore, dans son appellation, la trace de l'origine du mot fromage : la

Fourme d'Ambert que l'on disait autrefois produite par « formage », c'est-à-dire par action

de mouler; mettre en forme (Froc 2006).

La fabrication fromagère (Annexe 1) comporte quatre étapes communes à tous les

fromages. La coagulation est l'étape de formation du gel par acidification du lait par les

bactéries lactiques (telles que Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus,

Lactobacillus helveticus et Lactobacillus delbrueckii, ajoutées seules ou en combinaison)

et/ou l'action d'enzymes coagulantes comme la présure (Beresford et Williams 2004; Fox et

McSweeney 2004). L'égouttage du coagulum permet l'évacuation du lactosérum et

conduit à la formation d'un caillé (Fox et McSweeney 2004). Cette étape est complétée par

le salage qui contribue également à la formation de la croûte en régulant l'activité de l'eau

et, par effet ricochet, à la modulation de la nature et de l'activité du système microbien et

des activités enzymatiques endogènes du lait (Fox et McSweeney 2004). Et enfin,

l'affinage, ou étape de maturation, au cours de laquelle des cascades de réactions

biochimiques provoquées par les enzymes endogènes du lait, l'action de la présure et le

développement d'une microflore microbienne secondaire (bactéries lactiques, NSLAB pour

Non Starter Lactic Acid Bacteria, bactéries non lactiques) et fongique (levures et

moisissures) permettent de parvenir aux caractéristiques organoleptiques et texturales du

fromage (Molimard et al. 1995; Fox et McSweeney 2004). Ce sont toutes ces étapes de

prise en gel du lait et de déshydratation qui ont permis, il y a de cela 8 000 ans environ, de

conserver l'excédent de lait et ses propriétés nutritionnelles. Et c'est l'amélioration de ce

procédé de fabrication, sa maîtrise et le savoir-faire du fromager qui ont fait de certains

fromages des produits de haute gastronomie consommés partout dans le monde (Beresford

et al. 2001; Fox et McSweeney 2004). La production mondiale de fromages (excluant les

fromages fondus et à tartiner) a été estimée à 20 millions de tonnes en 2010 (Fédération

Internationale du Lait 2011).

L'impressionante diversité fromagère illustrée par la citation d'Oison (1990) « There is a

cheese for every taste preference and a taste preference for every cheese », s'explique par

des étapes de production différentes, des variations dans chacune de ces étapes et par la

nature des quatre ingrédients utilisés: le lait, les microorganismes, la présure et le sel

(Beresford et al. 2001). Les fromages peuvent donc être classés selon le type de lait

employé, leur richesse en matière grasse, le mode de coagulation du lait, leur texture, leur

mode d'affinage et leur aspect extérieur pour ne citer que ceux-là (McSweeney et al. 2004).

Le Camembert de Normandie (11 cm de diamètre) par exemple diffère principalement des

Bries de Meaux et de Melun par sa taille (35 cm et 27 cm de diamètre respectivement)

(Spinnler et Gripon 2004). Mais, il est important de bien comprendre pour la suite

qu'autant une modification du procédé de fabrication va conduire à la production d'un type

de fromage différent, autant une variation dans la microflore microbienne fromagère va

conduire à des propriétés organoleptiques et texturales propres à chaque fromage au sein

même d'une famille de fromages (Beresford et al. 2001).

2.1.2 Les fromages affinés en surface

Les fromages affinés en surface sont des fromages possédant une microflore complexe.

Cette communauté est composée de bactéries provenant du ferment, d'une microflore

d'affinage secondaire composée de bactéries lactiques (NSLAB) et des levures et/ou des

moisissures qui se développent en surface. Ces microorganismes interagissent ensemble et

s'adaptent à leur environnement, du début de la fabrication à la fin de l'affinage. Les

bactéries lactiques de la microflore secondaire se développent à l'intérieur du fromage, alors

que des levures et moisissures naturelles du lait peuvent également se développer en

surface (Lavoie et al. 2011). En fonction de la variété de fromage, les interactions seront

différentes et mèneront à des changements physico-chimiques dans la matrice fromagère et

l'établissement de différents gradients (Fig. 1 ; Beresford et al. 2001).

Growth of Pénicill ium camembert! at surface

~ ^

Lactate metabolised at surface ^_ C»»(PO.). precipitates L < j ï ^

Migration of soluble Ca, PO}­ and ™ ■ . lactate towards surface

Ammonia produced at surface by proteolysis diffuses into cheese

Migration of soluble Ca. PO}­ and lactate towards surface

Figure 1. Différents gradients établis au sein d'un fromage Camembert lors de son

affinage. Illustration tirée intégralement de McSweeney et Fox (2004).

Il existe deux types de fromages affinés en surface : les fromages à croûte fleurie et les

fromages à croûte lavée. Ces deux grandes classes de fromages sont décrites ci-après.

2.1.2.1 Les fromages à croûte fleurie

Les fromages à croûte fleurie, tel que le Brie et le Camembert, sont des fromages à pâte

molle caractérisés par la présence d'une croûte blanche et duveteuse générée par la

croissance de la moisissure Pénicillium camemberti et facultativement par la levure

Geotrichum candidum sous forme de tapis feutrant (Spinnler et Gripon 2004; Molimard et

al. 1994). Ces deux mycètes peuvent être inoculés directement dans le lait ou pulvérisés sur

la surface du fromage (McSweeney et al. 2004).

La fabrication de fromages à croûte fleurie débute par une coagulation du lait, cru ou

pasteurisé, par acidification des bactéries mésophiles et par l'ajout de présure. Dans le cas

de la fabrication du Camembert de Normandie par exemple, l'acidification du lait est

obtenue par des lactocoques et la présure est ajoutée lorsque le pH atteint 6,4. Le coagulum

est ensuite versé à la louche dans un moule où commence l'égouttage spontané qui va être

complété par le saumurage. Les fromages sont ensuite affinés à une température variant

entre 11-13 °C et à environ 90 % d'humidité. Un affinage minimal de 21 jours est requis

pour le Camembert de Normandie (Spinnler et Gripon 2004).

2.1.2.2 Les fromages à croûte lavée

Les fromages à croûte lavée, tel que le Livarot et le Mont d'Or, sont caractérisés par la

croissance à leur surface d'une microflore bactérienne majoritairement à Gram positif et de

levures (Bockelmann 2007). Des bactéries Gram négatif appartenant aux genres

Psychrobacter, Halomonas et Hafhia, ne présentant pas de risque pour la santé et

participant à la production de composés aromatiques lors de l'affinage ont également été

isolées de la surface de ces fromages (Coton et al. 2012; Irlinger et al. 2012).

Lors de l'affinage, la croûte développe un aspect luisant rouge-orangé qui survient après

plusieurs lavages de la surface. Les fromages à croûte lavée peuvent être à pâte molle,

semi-ferme ou ferme selon le procédé de fabrication (Bockelmann 2007).

La coagulation du lait, cru ou pasteurisé, est obtenue par l'acidification réalisée par une

culture de souches bactériennes mésophiles et l'ajout de la présure. Les fromages sont

ensuite cuits à basse température (inférieur à 35 °C), pressés légèrement, moulés puis

saumurés. Après le saumurage, la surface des fromages peut être inoculée par

Debaryomyces hansenii, Brevibacterium linens et/ou G. candidum pour ne citer que ceux-

là; le choix dépendant du type de fromage désiré ou du pays de fabrication. À titre

d'exemple, en Autriche, tout microorganisme autre que Brevibacterium linens retrouvé sur

la surface des fromages à croûte lavée est considéré comme un contaminant de

l'environnement fromager (Brennan et al. 2004). Mounier et coll. ont démontré, pour la

première fois, la participation active d'une microflore « maison » à l'affinage des fromages

à croûte lavée sur le lieu de fabrication (2006). Des souches de Staphylococcus

saprophytics et Debaryomyces hansenii isolées de la saumure et de Corynebacterium

casei et Corynebacterium variabile isolées des mains des employés ont été retrouvées sur

les croûtes des fromages (Mounier et al. 2006).

Les fromages sont affinés entre 10 et 15 °C pendant 14 à 63 jours, à des taux d'humidité

élevés pour éviter le dessèchement des croûtes. Lors de l'affinage, la surface des fromages

est lavée périodiquement avec de l'eau saumurée pour préserver la souplesse de la croûte,

brossée pour homogénéiser et activer la croissance microbienne et parfois inoculée de

nouveau une ou plusieurs fois. Traditionnellement, l'inoculation de la surface des fromages

à croûte lavée se fait avec de l'eau saumurée préalablement utilisée pour le lavage de

fromages plus vieux et contient ainsi tous les microorganismes nécessaires à l'affinage.

Mais, cette pratique peut être responsable de contaminations par des microflores

indésirables telles que Listeria monocytogenes, certains entérocoques, certaines

entérobactéries et des moisissures (Bockelmann 2007). Dans certaines régions de France,

l'eau saumurée peut être remplacée par du marc, du vin, du cidre ou de la bière afin de

conférer à la croûte une saveur particulière

(http://www.cniel.com/prodlait/fromage/clavee/Clavee2.html). Les fromages à croûte lavée

sont caractérisés par une concentration élevée de composés soufrés à la surface (arômes de

choux, d'ail et de pourriture) due à des niveaux élevés de protéolyse et de lipolyse (Brennan

et al. 2004; McSweeney et al. 2004; Bockelmann 2007).

2.1.3 Les levures de la microflore d'affinage : un rôle central tout en

surface

Les fromages à croûte fleurie et à croûte lavée diffèrent principalement par la communauté

microbienne et fongique implantée à leur surface (Brennan et al. 2004, Beresford et al.

2001) et par conséquent par l'aspect de leur croûte. La microflore de surface des fromages à

croûte fleurie est composée essentiellement de la moisissure P. camemberti et des levures

D. hansenii, Kluyveromyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, et G.

candidum (Schmidt et Lenoir 1980; Spinnler et Gripon 2004; Bockelmann 2007; Gente et

al. 2007b). La flore de surface des fromages à croûte lavée est composée essentiellement de

levures, de corynébactéries, de staphylocoques et de microcoques. En ce qui concerne les

levures, les principales sont D. hansenii, Kluyveromyces sp., Y. lipolytica, G. candidum,

Clavispora lusitaniae et Candida krusei (Prillinger et al. 1999; Corsetti et al. 2001;

Bockelmann et al. 2005; Larpin et al. 2006; Gente et al. 2007b).

10

Les levures de la microflore d'affinage peuvent être des ferments commerciaux qui vont

être ajoutés par le fromager et/ou émerger à partir de la microflore naturelle du lait cru par

l'action du procédé de fabrication. Dans tous les cas, ces levures, qui prédominent sur les

fromages affinés en surface et qui jouent un rôle majeur lors de la maturation, doivent

présenter certaines ou l'ensemble des propriétés suivantes : fermentation et assimilation du

lactose, production d'enzymes protéolytiques et lipolytiques extracellulaires, assimilation

du lactate et du citrate, croissance à de faibles températures et à de faibles teneurs en

humidité, tolérer de faibles pH et des concentrations salines élevées (Fleet 1990; Roostita et

Fleet 1996; Cosentino et al. 2001). Des expressions élevées des gènes codant pour des

enzymes impliquées dans la dégradation du lactose, du lactate (lactate-deshydrogénases) et

dans le catabolisme des acides aminés générant la production de composés aromatiques

(L-méthionine transaminase et la L-méthionine déméthiolase) ont été mises en évidence

chez des ferments d'affinage comme D. hansenii, G. candidum, Y. lipolytica et

Kluyveromyces lactis (Spinnler et al. 2001; Cholet et al. 2007).

La croûte d'un fromage représente son squelette externe puisqu'il participe à sa tenue, à sa

résistance et à sa protection contre les agressions extérieures (Froc 2006). Elle assure donc

également son innocuité. De par leurs propriétés technologiques intrinsèques, les levures

sont les premières à s'implanter et à se développer à la surface du fromage, formant ainsi

une croûte fromagère d'environ 200 um d'épaisseur (Spinnler et Gripon 2004).

À la surface des fromages Camembert, le nombre de levures peut varier de IO6 à

108cellules.g"1 au cours des deux premières semaines d'affinage (Schmidt et Lenoir 1978;

Fleet 1990; Roostita et Fleet 1996; Corsetti et al. 2001). Ce nombre diminue de l'extérieur

vers l'intérieur de la pâte et est généralement 100 à 1000 fois moins élevé au cœur du

fromage (Schmidt et Lenoir 1978; Fleet 1990; Chambra et Irlinger 2004). Cette

colonisation rapide de la surface va empêcher le développement de microorganismes

indésirables, tant d'un point de vue de la qualité, comme l'inhibition de la croissance des

Mucor sp., que d'un point de vue de l'innocuité, comme l'inhibition de la croissance de

L. monocytogenes (Guéguen et Lenoir 1976; Jakobsen et Narvhus 1996; Dieuleveux et al.

1998). Un phénomène entraînant un quelconque déséquilibre au niveau de cette

11

communauté et de son activité conduira donc à une mauvaise production fromagère et à un

risque pour la santé des consommateurs (Bockelmann 2007).

La capacité des levures de la microflore secondaire à métaboliser l'acide lactique produit

par les bactéries lactiques entraîne une alcalinisation de la surface (Fleet 1990; Rohm et al.

1992; McSweeney et Fox 2004; Bockelmann et al. 2005). Au delà d'un pH supérieur à 5,8,

des bactéries acidosensibles plus protéolytiques et tolérantes à des concentrations salines

élevées peuvent alors s'implanter et participer activement à la maturation du fromage (Fleet

1990; Corsetti et al. 2001; Spinnler et Gripon 2004; Bockelmann et al. 2005). En effet, le

pH optimum des enzymes protéolytiques et lipolytiques avoisine généralement la neutralité

(Spinnler et Gripon 2004). C'est ainsi que débute la succession des flores observées lors de

l'affinage, conduisant aux propriétés aromatiques et texturales du fromage (Rohm et al.

1992; Bockelmann et al. 2005). Pour les fromages à croûte fleurie, la neutralisation de la

croûte fromagère va entraîner la migration de minéraux du cœur vers l'extérieur avec

formation de phosphates de calcium insolubles en surface et un ramollissement de la pâte

de la croûte vers l'intérieur du fromage (Fig. 1; McSweeney et Sousa 2000; Spinnler et

Gripon 2004). En fin d'affinage, les fromages vont atteindre un pH de surface avoisinant la

neutralité et le cœur du fromage aura un pH d'environ 6 (Spinnler et Gripon 2004).

2.2 Geotrichum candidum

Selon Beresford et coll. (2001), G. candidum serait présent sur tous les fromages affinés en

surface aussi bien à croûte fleurie qu'à croûte lavée. Elle représente l'espèce de levure

dominante sur des fromages aussi variés que le Livarot, l'Époisses Bourgogne, le Petit

Pont-1'Evêque (croûtes lavées à pâte molle), le St. Nectaire (croûte lavée à pâte semi-

ferme), le Cabrales (fromage bleu) et l'une des deux espèces dominantes avec D. hansenii

sur le fromage Reblochon (croûte lavée à pâte molle), et ce quel que soit le degré

d'avancement de l'affinage (Fig. 2; Bàrtschi et al. 1994; Prillinger et al. 1999; Larpin et al.

2006; Belén Flôrez et al. 2007). Dans le fromage espagnol Armada fabriqué à partir de lait

cru de chèvre, G. candidum est l'espèce dominante durant les deux premières semaines

d'affinage (Tornadijo et al. 1998).

12

G. candidum apparaît donc comme étant un constituant majeur de la microflore secondaire

des fromages affinés en surface. Elle est particulièrement recherchée en technologie

fromagère, car elle possède de nombreuses propriétés intéressantes mentionnées

précédemment comme des propriétés alcalini santés, texturantes, aromatisantes,

antimicrobiennes et antifongiques. Cependant, les sections suivantes mettront en évidence

que ces propriétés technologiques sont souche-dépendantes et qu'il existe une grande

diversité morphologique et génétique au sein de cette espèce. La maîtrise du procédé

fromager ne peut contourner une bonne connaissance des souches de G. candidum et donc

leur differentiation et leur caractérisation.

Yarrowia lipolytica Kluyveromyces lactis

Geotrichum candidum Debaryomyces hansenii

Cryptococcus musci

Figure 2. Dynamique des espèces de levures retrouvées dans le Livarot. Graphique tiré

intégralement de Larpin et coll. (2006).

2.2.1 Histoire et taxinomie

G. candidum est la forme asexuée, imparfaite, ou « anamorphe » de Galactomyces

candidus, mycète appartenant à la division des Ascomycetes et à la classe des

Saccharomycetes anciennement appelée Hemiascomycetes (Guého 1979; Smith et al. 2000;

Kurtzman et Robnett 2003; Hibbet et al. 2007; Lumbsch and Huhndorf 2010; Mitchell

13

2010). G. candidumIGal. candidus fait partie de l'ordre des Saccharomycetales et de la

famille des Dipodascaceae (Hibbet et al. 2007; Mitchell 2010).

La forme sexuée parfaite ou « téléomorphe » se multiplie avec production d'asques. Ces

asques sont libres, c'est-à-dire non protégées dans un ascocarpe et contiennent chacune une

ascospore (Butler et Petersen 1972; Barnett et al. 1990; Jollivet et al. 1994; Kieffer et

Morelet 1997; Kurtzman 1982; Pitt et Hocking 2009). La reproduction végétative chez la

forme asexuée imparfaite se fait par production d'arthroconidies, aussi appelées

arthrospores, suite à la désarticulation et à la fragmentation d'hyphes végétatifs préexistants

(forme filamenteuse, Fig. 3; Jollivet et al. 1994; Kieffer et Morelet 1997; Pitt et Hocking

2009). Cette forme de scission est appelée sécession schizolytique (Kieffer et Morelet

1997).).

Figure 3. Photographie en microscopie optique à contraste de phase de Geotrichum

candidum souche LMA-77 au troisième jour de croissance. La désarticulation et la

fragmentation des hyphes sont observables. Photo Emilie Hardy, 2009. Microscopie optique.

Microscope Olympus BX51, grossissement 40X.

G. candidum est un mycète particulier puisqu'elle se place à la frontière des levures et des

moisissures. Même si, depuis 1983, elle est classée comme étant une levure (Barnett et al.

14

1990), le débat sur sa classification est toujours d'actualité et certains auteurs la considèrent

encore comme une moisissure (Bârtschi et al. 1994; Plihon et al. 1998; Wouters et al.

2002). C'est la formation d'un mycélium et la septation des hyphes en arthrospores qui lui

valent le terme de moisissure; le terme « moisissure » désignant un micromycète qui

possède un mycélium bien défini (Kirk et al. 2008). Son rattachement aux levures quant à

lui vient de sa forme parfaite qui se multiple sexuellement avec production d'asques non

protégés (Barnett et al. 1990). Plusieurs autres levures, dont Candida albicans, montrent ce

caractère dimorphique puiqu'elles se retrouvent soit à l'état levuriforme, mycélien ou

intermédiaire (Mitchell 1998; Pérez-Campo et Dominguez 2001). L'émergence des

techniques de biologie moléculaire, notamment l'utilisation de certaines régions de l'ADN

ribosomique (ADNr) comme la petite sous-unité (18S) ou les espaceurs internes ITS1 et

ITS2 intercalés du 5.8S, ont montré que G. candidum est phylogénétiquement proche des

levures telles que Y. lipolytica, C. albicans, Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata et

Sehizosaccharomyces pombe (Ueda-Nishimura et Mikata 2000; de Hoog et Smith 2004).

Le premier G. candidum d'intérêt laitier fut isolé d'un tapis mycélien formé à la surface

d'un lait cru coagulé à la température de la pièce. Mais, elle fut d'abord nommée Oidium

lactis en 1850 puis Oospora lactis en 1880 (Wouters et al. 2002). Certains fromagers ont

d'ailleurs conservé l'appellation Oidium pour désigner G. candidum. Le genre Geotrichum

fut introduit en 1809 par Link, avec comme seule espèce G. candidum isolée d'un terreau

de feuilles (Carmichael 1957; Guého 1979). L'affiliation à ce genre était basée sur

l'observation de spores tronquées (Carmichael 1957; Wouters et al. 2002). Le genre fut

ensuite complété par de nombreuses autres espèces se multipliant de façon asexuée par

arthroconidiogenèse (Guého 1979). La description originale du genre Geotrichum fut

corrigée de nombreuses fois à cause de la confusion régnant dans les caractères

phénotypiques permettant la délimitation des espèces et aussi à cause de la présence, pour

certaines espèces, de blastospores caractéristiques des levures se multipliant de façon

asexuée par bourgeonnement (Guého 1979).

En 1957, Carmichael éclaircit quelque peu la situation pour l'espèce G candidum en

analysant l'habitat et les caractéristiques culturales de 52 souches sur six milieux différents

15

et en compilant les 55 synonymes utilisés pour désigner cette espèce dont Oidium lactis le

synonyme le plus commun (de Hoog et Smith 2004; Boutrou et Guéguen 2005). Windish

en 1951, puis Carmichael en 1957 furent les premiers à noter que la difficulté à reconnaître

G. candidum reposait sur la diversité des morphotypes existants au sein de l'espèce.

En 1951, Windish fut le premier à observer des asques contenant des ascospores chez une

souche de G. candidum (Fig. 4) et proposa la désignation Endomyces lactis pour sa forme

parfaite sexuée. Mais, comme cette observation ne se produisit qu'une seule fois sans

pouvoir être répétée, cette appellation ne fut pas retenue et la reproduction sexuée chez

G. candidum fut remise en question (Butler et Petersen 1972; Carmichael 1957). C'est

finalement en 1972 que Butler et Petersen désignèrent Endomyces geotrichum comme le

téléomorphe de G. candidum qui deviendra par la suite Galactomyces geotrichum Redhead

and Malloch (Butler et Petersen 1972).

Figure 4. Endomyces geotrichum. Jeunes asques (en haut) et ascospores matures dans des

asques (en bas), x 1000. Image tirée intégralement de Butler et Petersen (1972).

L'émergence des méthodes de biologie moléculaire a permis de redessiner les frontières de

l'espèce Gai. geotrichum et révéla une hétérogénéité au sein de l'espèce, malgré des

similitudes phénotypiques. En effet, le taux de guanine et de cytosine dans le génome

nucléaire et le pourcentage d'hybridation ADN/ADN a permirent dans un premier temps de

16

différencier les souches de cette espèce en quatre groupes phylogénétiquement proches :

Gai. geotrichum sensu stricto, Gai. geotrichum groupe A, Gai. geotrichum groupe B et

Gai. geotrichum groupe C (Smith et al. 1995). Puis, l'utilisation des techniques de réactions

de polymérisation en chaîne (PCR) et d'amplifications aléatoires de microsatellites par

PCR (RAM-PCR) a permis de distinguer clairement ces quatre groupes en quatre espèces

proches, mais distinctes (Naumova et al. 2001). Ces derniers résultats furent corroborés par

l'analyse des espaceurs internes ITS1 et ITS2 et de la région 5.8S de l'ADNr et les

Gai. geotrichum A, B, et C furent renommés respectivement Galactomyces candidum,

Gai. candidus et Geotrichum europaeum (de Hoog et Smith 2004). Toutefois, aucun état

anamorphe pour l'espèce Gai. geotrichum ne fut décrit et l'anamorphe G. candidum fut

finalement attribué au téléomorphe Gai. candidus. Depuis, les frontières des espèces

G. candidum et G. candidus sont en perpétuelle évolution, d'une part grâce à de nouveaux

critères de classification et d'autre part, en raison de la signification taxinomique des

caractères phénotypiques utilisés pour délimiter ces espèces qui est encore sujette à

différentes interprétations.

Le débat sur la classification de G. candidum ainsi que la confusion dans la nomenclature

des espèces et des genres indiquent la nécessité de disposer de nouveaux outils

moléculaires permettant une définition plus rigoureuse des frontières au sein de l'espèce

G. candidum et de son téléomorphe Gai. candidus.

2.2.2 Habitat et origine

G. candidum est un organisme présent dans des habitats aussi variés que l'air, l'eau, les

fourrages, le sol, les plantes, les fruits, les insectes, les humains et autres mammifères

(Butler et Eckert 1962; Butler et Petersen 1972; Carmichael 1957; Gente et al. 2002; Gente

et al. 2006; Pitt et Hocking 2009; Pottier et al. 2008; Thornton et al. 2010). Contrairement

aux genres Pénicillium et Mucor qui sont couramment utilisés en fabrication fromagère,

G. candidum a été suggéré comme un mycète d'origine laitière, car elle est retrouvée sous

forme de tapis feutrant à la surface de lait cru tourné à température pièce (Wouters et al.

2002). Elle est donc un composant naturel de la microflore du lait cru (Desmasures et al.

17

1997; Kawai et al. 2007; Wouters et al. 2002) et ce quel que soit le type de lait et bien que

le lait soit stérile dans la glande mammaire (Verdier-Metz et al. 2012).

G. candidum a été isolée de 39 % des échantillons de lait de vache provenant de 27 fermes

de la région Camembert en Normandie, mais en faible quantité puisque seulement 6 % des

laits contenaient des taux supérieurs à IO2 cfu.mL"1 (Desmasures et al. 1997). Elle est

fréquemment retrouvée dans des fromages à base de lait de brebis (Cosentino et al. 2001).

Elle représente, par exemple, une des espèces de levure dominante dans le fromage italien

Fiore Sardo, fromage au lait cru de brebis et à pâte ferme, et ce jusqu'à trois mois

d'affinage. Ce fromage a la particularité d'être fabriqué sans aucun ajout de ferments.

L'affinage est donc réalisé uniquement par la microflore indigène du lait, ce qui suggère la

présence de G. candidum dans le lait cru de brebis (Pisano et al. 2006). Elle est également

présente dans du lait de chèvre et par conséquent dans des fromages à base de lait cru de

chèvre, comme le fromage espagnol Armada, où G. candidum est l'espèce dominante

(Tornadijo et al. 1998).

Cependant, G. candidum étant thermosensible (Pitt et Hocking 2009; Vadillo et al. 1987),

elle n'est généralement pas identifiée dans les fromages fabriqués à base de lait pasteurisé,

à moins de s'y retrouver suite à une contamination par l'air, les équipements, le personnel

ou l'environnement de travail (Hayaloglu et Kirbag 2007; Kure et al. 2004; Welthagen et

Viljoen 1999). À titre d'exemple, elle est souvent isolée à partir de fromages à pâte molle

tels que le Limburg ou le Romadour, sans pour autant y être ajoutée comme ferment

d'affinage. Ceci indique que sa présence est permanente dans l'environnement de la

fromagerie (Bockelman et al. 2005).

De par sa présence ubiquitaire, elle peut également devenir un agent d'altération des fruits,

principalement de la tomate et du citron, lorsque ceux-ci présentent une lésion (Butler et

Petersen 1972; Pitt et Hocking 2009; Thornton et al. 2010). Cependant, le rôle de

G. candidum comme agent pathogène pour l'humain est considéré comme quasi nul. Elle

serait responsable de moins d'un cas d'infection par an et l'origine de l'infection

n'impliquerait pas l'utilisation alimentaire des souches de cette espèce (Pottier et al. 2008).

18

G. candidum est d'ailleurs commercialisée comme membre de plusieurs ferments

d'affinage par des industries internationales tels que Cargill. Chr. Hansen et Danisco

(Bockelmann 2010).

2.23 Diversité morphologique et phénotypes associés

Une autre des raisons qui rend difficile la classification de G. candidum en tant que levure

ou moisissure est le phénomène de dimorphisme présent au sein de l'espèce. En effet, deux

morphotypes distincts ont clairement été mis en évidence en 1982 par Guéguen et Jacquet,

puis confirmés par la suite par d'autres auteurs comme Gente et coll. (2002a et 2002b) et

Missous et coll. (2010). Le premier type est le morphotype levuriforme (Fig. 5 A) et le

second le morphotype filamenteux (Fig. 5 B). Ces deux morphotypes extrêmes se

distinguent par des différences phénotypiques présentées dans le tableau 1.

Figure 5. Aspect des souches de Geotrichum candidum LMA-75 (A) et LMA-21 (B) sur

milieu gélose YEG après quatre jours de croissance à 25 °C dans l'obscurité. Photos

Francis Boileau.

19

Tableau 1. Caractères culturaux et morphologie de Geotrichum candidum en fonction du

morphotype.

Aspect des colonies Levuriforme Filamenteuse

Couleur des colonies Crème Très blanche

Température optimale (°C) 2 2 - 2 5 2 5 - 3 0

Production d'arthrospores Importante Prédominance d'hyphes

végétatifs, très peu d'arthrospores

Mycélium Peu développé Très développé

Activité protéolytique Faible Importante

Activité alcalinisante Faible Importante

Activité acidifiante Importante Faible Tableau inspiré des résultats présentés dans l'article scientifique de Guéguen et Jacquet (1982).

Cependant, la majorité des souches de G. candidum appartiennent à un troisième groupe de

morphotype qui est intermédiaire entre les deux extrêmes. Les souches appartenant à ce

groupe forment un continuum, c'est-à-dire que chacune présente un morphotype similaire à

celle de ses voisines, mais est très différente des deux morphotypes extrêmes (Guéguen et

Jacquet 1982; Gente et al. 2002a et 2002b; Missous et al. 2010). Leurs activités

physiologiques vont être semblables soit à la forme levuriforme, soit à la forme

filamenteuse (Guéguen et Jacquet 1982).

Il ne semble pas y avoir de liens clairs entre l'aspect morphologique et l'origine des

souches de G. candidum. D'après Guéguen et Jacquet (1982), le morphotype levuriforme

serait plus fréquemment isolé des fromages à pâte pressée, alors qu'il y aurait autant de

morphotypes levuriformes que de morphotypes filamenteux/intermédiaires isolés de

fromages à pâte molle. Mais, seules des souches filamenteuses (18 au total) furent isolées

de fromages Saint-Nectaire (pâte pressée) par l'équipe de Marcellino et al. (2001). Par

ailleurs, une étude récente montre que la distribution des souches entre les formes levures et

filamenteuses, basée sur le ratio arthrospores/hyphes (Guéguen et Jacquet 1982), peut être

remise en question suite à l'observation d'une souche filamenteuse présentant une quantité

égale d'arthrospores et d'hyphes (Missous et al. 2010). Des cultures en milieux liquides

20

permirent une meilleure distinction des souches puisque les formes levures présentaient une

croissance en profondeur correspondant à des arthrospores, alors que les souches ayant un

morphotype filamenteux présentaient, en plus, une croissance en surface correspondant à

des hyphes (Missous et al. 2010). Malgré cela, certaines souches montrent un

comportement particulier, car l'une des souches filamenteuses de la même étude ne

correspond pas à ces observations. Également, des observations réalisées par Guéguen et

Jacquet (1975a et 1982) rapportent une croissance à deux phases pour les formes

levuriformes et une croissance en surface pour les formes filamenteuses. La compilation

des observations réalisées dans ces articles illustre bien que la distinction des morphotypes

au sein de l'espèce G. candidum demeure imprécise sur une base d'étude macroscopique et

microscopique.

2.2.4 Structure génomique

Treize souches de G. candidum d'aspect morphologique varié, caractérisées sur milieu

solide, furent soumises à une analyse par caryotypage électrophorétique et à une analyse

des fragments de restriction génomiques par électrophorèse en champ puisé (PFGE, Pulsed

Field Gel Electrophoresis; Gente et al. 2002a). Une analyse du génome de G. candidum a

mis en évidence que, en fonction des souches, de cinq à huit chromosomes variant en taille

de 0,6 à 4,5 Mb étaient présents (Gente et al. 2002a). Selon ces caryotypes, le génome de

G. candidum pourrait donc varier de 11 à 19 Mb (Gente et al. 2002a). Il semblerait que

l'aspect morphologique des souches de G. candidum soit corrélé à la structure génomique

puisque la taille moyenne des génomes est de 13,3 Mb pour les souches levuriformes,

16,7 Mb pour les souches filamenteuses et 15,5 Mb pour les souches intermédiaires. Il

existerait un polymorphisme de taille et de nombre des chromosomes au sein même des

morphotypes. Par contre, toutes les souches ont en commun un chromosome de 2,9 Mb,

quel que soit leur aspect morphologique. Cette observation suggère la présence, sur ce

dernier, de gènes essentiels à la survie des souches qui ne seraient pas soumis aux

phénomènes de translocation, duplication et de deletion responsables de la variabilité de la

structure génomique des souches au sein de cette espèce.

21

Cette diversité morphologique, phénotypique et génétique au sein de l'espèce G. candidum

représente une diversité de choix pour les industries productrices de ferments et de

transformation fromagère. Mais, pour une exploitation optimale de cette diversité, il

apparaît clairement qu'il est nécessaire de disposer d'outils moléculaires permettant une

différenciation et une caractérisation rigoureuses des souches de G. candidum.

2.3 Contributions de G. candidum à la maturation des

fromages affinés en surface

2.3.1 Participation à l'apparence des fromages affinés en surface

Le choix de la souche de G. candidum présente à la surface des fromages à croûte fleurie et

à croûte lavée contribue à déterminer la texture, la fermeté et l'épaisseur de la croûte

(Marcellino et al. 2001). En effet, il a été mentionné précédemment que l'espèce

G. candidum regroupe des souches de morphotypes variant de filamenteux à crémeux avec

des propriétés protéolytiques différentes influençant donc l'aspect de la croûte (Guéguen et

Jacquet 1982; Chambra et Irlinger 2004).

G. candidum colonise la presque totalité de la surface au cours des trois premiers jours

d'affinage (Molimard et al. 1995; Berger et al. 1999; Leclercq-Perlat et al. 2004a). Sur des

fromages Reblochon, certaines souches apparaissent même dès le premier jour à une

concentration de IO3 ufc.g"1, atteignent 107 ufc.g"1 au huitième jour d'affinage pour ensuite

rester constant jusqu'au 36eme jour (Bârtschi et al. 1994). Sur des fromages de type

Camembert expérimentaux, la phase stationnaire de croissance est atteinte après 12 jours à

une concentration de 6xl07 ufc.g"1 (Arfi et al. 2004; Leclercq-Perlat et al. 2004a). Une

récente étude de quantification par PCR en temps réel (qPCR) des levures et des

moisissures a été réalisée sur fromages-modèles de type Camembert (Lessard et al. 2012).

L'analyse moléculaire montre que G. candidum apparaît effectivement dès les premiers

jours d'affinage, et ce avant même la détection visuelle de la croûte fromagère (Lessard et

al. 2012). La méthode de qPCR s'est révélée être plus précise qu'un dénombrement sur

22

boîte de Pétri puisqu'elle a permis de tenir compte des cellules contenues dans les hyphes

qui, par méthode microbiologique traditionnelle, correspondent rarement chacune à une

colonie (Lessard et al. 2012). Il est estimé qu'il y aurait de 100 à 1000 fois plus de

G. candidum sur la croûte des fromages affinés en surface qu'en profondeur (Chambra et

Irlinger 2004).

Plusieurs conditions peuvent influencer la croissance de G. candidum dans les fromages.

Ainsi, de mauvaises conditions au niveau des gaz présents dans les chambres d'affinage

(pourcentages de CO2 et d'02) ou une concentration saline inadéquate peuvent entraîner

une modification de la densité de la population de G. candidum. Il a été démontré,

cependant, qu'une faible densité de la croûte facilite les échanges gazeux à travers la

surface du fromage lors de l'affinage (Marcellino et al. 2001). Mais, une densité trop faible

ou des souches de G. candidum moins désirables présentant une croissance irrégulière

peuvent entraîner la formation d'une croûte fragile qui peut se désintégrer au moment où

les jeunes fromages sont retournés pendant l'affinage (Marcellino et al. 2001). La

colonisation rapide et quasi-intégrale de la surface fromagère par G. candidum permet

également de protéger la croûte d'une contamination par des moisissures telles que les

Mucor sp. ou des bactéries pathogènes comme L. monocytogenes (voir partie 2.3.3.2).

Également, une croissance excessive de G. candidum causée par une quantité de sel

inférieure à 1 % ou par un pourcentage en CO2 supérieur à 4 % peut conduire à une

mauvaise implantation de P. camemberti et une surcroissance de G. candidum sur les

fromages Camembert entraînant un défaut de la croûte, appelé « Peau de crapaud »

(Marcellino et al. 2001; Spinnler et Gripon 2004; Leclercq-Perlat et al. 2006). C'est

d'ailleurs la raison pour laquelle G. candidum était autrefois considérée comme un agent

indésirable et écartée de la microflore d'affinage utilisée en production fromagère (Spinnler

et Gripon 2004). Aujourd'hui, une meilleure compréhension de la diversité des propriétés

technologiques des souches, et par conséquent un meilleur savoir-faire, a conduit à la

commercialisation de ce mycète comme agent d'affinage.

23

2.3.2 Participation au profil aromatique des fromages affinés en surface

Il existe quatre voies métaboliques principales permettant la production d'arômes au sein

d'une matrice fromagère : le catabolisme du citrate, du lactose, la protéolyse et la lipolyse

(Molimard et Spinnler 1996; Molimard et al. 1997a; McSweeney et Sousa 2000; Martin et

al. 2001; Yvon et Rijnen 2001; Irlinger et Mounier 2009). Le métabolisme du citrate est

principalement observé chez les lactocoques citrate-positives (McSweeney et Sousa 2000).

G. candidum n'assimile pas le lactose (Kreger-van Rij 1984; Barnett et al. 1990; Arfi et al.

2004). En revanche des activités protéolytiques et lipolytiques générant des composés

aromatiques au sein de matrices fromagères ont largement été démontrées chez des souches

de G. candidum.

2.3.2.1 Activité lipoly tique

La lipolyse est une étape cruciale dans la génération de flaveurs en technologie fromagère

puisque les acides gras libérés, en plus d'être eux-mêmes des composés aromatiques, sont

les précurseurs d'autres molécules aromatiques importantes comme les méthylcétones, les

lactones, les esters, les alcanes et les alcools secondaires (Jollivet et al. 1994; Molimard et

Spinnler 1996; Molimard et al. 1997a; McSweeney et Sousa 2000; Collins et al. 2004).

Le système lipolytique de G. candidum a largement été étudié et de nombreuses lipases,

ayant des substrats variés et générant ainsi des profils aromatiques dépendants des souches,

ont été identifiées et caractérisées (Annexe 2; Welch Baillargeon et al. 1989; Sidebottom et

al. 1991; Jacobsen et Poulsen 1995; Boutrou et Guéguen 2005). La présence d'acide

oléique et d'autres acides gras insaturés dans les fromages à croûte fleurie, comme le

Camembert, ou dans l'Armada, un fromage espagnol à base de lait cru de chèvre, serait en

grande partie attribuée à l'activité lipolytique de G. candidum (Molimard et al. 1997a;

Tornadijo et al. 1998; Collins et al. 2003; Spinnler et Gripon 2004; Sacristan et al. 2011).

24

Sur des milieux laits et des modèles fromagers, G. candidum libère également des acides

gras saturés (Tableau 2). Parmi ces acides gras, l'acide butanoïque, l'acide 3-

méthylbutanoïque et l'acide octanoïque sont les composés ayant un potentiel odorant parmi

les plus importants du fromage Camembert (Kubiôkovâ et Grosch 1997).

Tableau 2. Liste des acides gras saturés produits par Geotrichum candidum sur milieux

laits et dans des modèles fromagers.

Acide gras saturés Notes aromatiques

Acide butanoïque odeurs de rance, de fromage

Acide 2-méthylpropanoïque notes odorantes douces, de beurre rance, rappelant la pomme

Acide 2-méthylbutanoïque notes fruitées, amères, rappelant la sueur

Acide 3-méthylbutanoïque notes de fruits pourris, douces, rappelant la sueur

Acide pentanoïque notes odorantes rappelant le fromage, la sueur, le rance et la

cire

Acide hexanoïque notes odorantes acres et de fromages bleus

Acide octanoïque notes odorantes de cire, de savon, de chèvre, de moisi, de

rance et de fruits Tableau inspiré des résultats présentés dans les articles scientifiques de Jollivet et al. (1994), Molimard et

Spinnler (1996), Molimard et al. (1997) et Sablé et Cottenceau (1999).

G. candidum produit également des méthylcétones (Tableau 3) et les alcools secondaires

correspondants comme le 2-heptanol (notes odorantes terreuses, huileuses, douceâtres) et le

2-nonanol (notes odorantes douces, rappelant le gras et le melon; Jollivet et al. 1994;

Molimard et Spinnler 1996; Sablé et Cottenceau 1999). Les méthylcétones et les alcools

secondaires correspondants représentent généralement les composés aromatiques les plus

abondants retrouvés dans les fromages à pâte molle et à croûte fleurie (Molimard et

Spinnler 1996; Sablé et Cottenceau 1999).

25

Tableau 3. Liste des méthylcétones produites par Geotrichum candidum sur milieux laits et

dans des modèles fromagers.

Méthylcétones Notes aromatiques

pentan-2-one notes fruitées, d'acétone et d'éther

pentan-3-one notes fruitées, de champignons et d'épices

heptan-2-one notes de moisi, d'épices, de fromages bleus et de Roquefort

nonan-2-one notes fruitées, florales et de moisi

undecan-2-one notes florales, de roses, d'iris et d'herbe Tableau inspiré des résultats présentés dans les articles scientifiques de Jollivet et al. (1994), Molimard et Spinnler (1996); Molimard et al. (1997) et Sablé et Cottenceau (1999).

Un fromage Camembert, par exemple, contient de 25 à 60 umol de méthylcétones pour

100 g de matière grasse (Molimard et Spinnler 1996). L'activité lipolytique de G. candidum

contribue de façon importante aux propriétés aromatiques de ces fromages puisque le

pentan-2-one, l'heptan-2-one et le nonan-2-one sont des méthylcétones caractéristiques des

fromages à croûte fleurie (Sablé et Cottenceau 1999; Leclercq-Perlat et al. 2004b). De plus

l'heptan-2-one, le nonan-2-one et leurs alcools secondaires correspondants représentent de

10 à 20 % et de 5 à 10 %, respectivement, des composés aromatiques retrouvés au sein du

Camembert (Molimard et Spinnler 1996).

Durant les premiers jours d'affinage, G. candidum produit aussi une partie importante des

esters retrouvés dans le Camembert avec pour certains d'entre eux une note fruitée et de

melon prononcée (Molimard et Spinnler 1996; Collins et al. 2003; Leclercq-Perlat et al.

2004b).

2.3.2.2 Activité protéolytique

L'activité protéolytique de G. candidum a été étudiée et caractérisée sur 30 souches par

Guéguen et Lenoir en 1975(a). Les souches ont été réunies en deux groupes : 25 % des

souches se développent activement sous forme mycélienne et présentent une forte activité

protéolytique extracellulaire contre 75 % des souches qui présentent une croissance

mycélienne limitée et qui produisent une faible quantité d'enzymes protéolytiques

26

(Tableau 1). En 1976, suite à de nouveaux travaux, les mêmes auteurs ont démontré que

quelle que soit l'intensité de l'activité protéolytique extracellulaire, elle était toujours plus

faible que celle de l'activité intracellulaire (Guéguen et Lenoir 1976).

L'activité protéolytique chez G candidum a également été étudiée in situ sur des fromages

Camembert expérimentaux (Boutrou et al. 2006b). La souche utilisée présentait une activité

protéolytique primaire en surface avec dégradation importante des caséines entre le 8eme et

le 15eme jour d'affinage, générant l'apparition de fragments de caséines de taille moyenne et

élevée (Boutrou et Guéguen 2006b). Ensuite, elle présentait une activité protéolytique

secondaire à partir de deux semaines d'affinage conduisant à la libération de peptides et

d'acides aminés libres qui sont des précurseurs de composés aromatiques (Boutrou et

Guéguen 2006b).

2.3.2.3 Catabolisme des acides aminés

De nombreux composés volatils soufrés (CVS) issus du catabolisme des acides aminés

soufrés ont été mis en évidence dans les fromages affinés en surface comme le

méthanethiol (MT), le diméthylsulfide (DMS), le diméthyldisulfide (DMDS) et le

diméthyltrisulfide (DMTS) (Molimard et al. 1996; Kubickovâ et Grosch 1997; Spinnler et

al. 2001). Le MT, le DMDS et le DMTS contribuent à une note d'ail particulièrement

recherchée dans la fabrication des fromages traditionnels normands (Jollivet et al. 1994;

Yvon et Rijnen, 2001). En plus de produire le MT et ces sulfides, G. candidum produit un

large éventail de thioesters comme le S-méthyle thioacetate, le S-méthyle thiobutyrate, le

S-méthyle thiopropionate, le S-méthyle thioisobutanoate, le S-méthyle thioisovalerate et le

S-méthyle thiohexanoate (Jollivet et al. 1994; Berger et al. 1999; Demarigny et al. 2000;

Helinck et al. 2000; Bonnarme et al. 2001). Ces CVS, qui présentent des seuils de détection

très faibles, contribuent à l'arôme des fromages à croûte fleurie et particulièrement à celle

des fromages à croûte lavée (Kubickovâ et Grosch 1997; Berger et al. 1999).

La methionine est d'abord convertie en MT, précurseur aromatique commun à la majorité

des CVS, selon deux voies métaboliques possibles (Yvon et Rijnen 2001). La première est

27

une réaction dite de transamination, surtout connue pour être utilisée par les bactéries

lactiques, qui est la voie principale pour la dégradation de tous les acides aminés (Yvon et

Rijnen 2001). Bonnarme et coll. (2001) ont montré que cette voie métabolique pouvait être

empruntée par des souches de G. candidum. Cette voie est initiée par une réaction de

transamination catalysée par une L-méthionine aminotransferase et qui conduit à la

formation de l'acide 4-méthylthio-2-oxobutyrique (KMBA) à partir de la L-méthionine.

Puis, le KMBA subit une réaction de déméthiolation par une KMBA déméthiolase pour

générer le MT.

La seconde voie permet directement la bioconversion de la methionine en MT (Bonnarme

et al. 2001; Yvon et Rijnen 2001). L'activité d'une cystathionine-y-lyase a clairement été

mise en évidence dans cette réaction par un suivi de l'expression du gène cgi chez treize

souches de G. candidum (Gente et al. 2007a). Une méthionine-y-lyase ou aussi appelée

L-méthionine-y-déméthiolase, préalablement identifiée chez B. linens et d'autres bactéries

d'affinage, pourrait aussi être responsable de la transformation intracellulaire de la

methionine en MT par G. candidum (Berger et al. 1999; Demarigny et al. 2000; Helinck et

al. 2000). Cette réaction dite d'élimination est observée pour les acides aminés aromatiques

et les acides aminés branchés. Il s'agit de la voie de dégradation principale de la methionine

et elle conduit à la majorité des CVS comme les sulfides et les S-méthylthioesters

(Bonnarme et al. 2001; Yvon et Rijnen 2001). Ensuite de nombreux auteurs ont démontré

que G. candidum était capable de produire les sulfides et les S-méthylthioesters à partir de

la methionine via une oxydation du MT (Jollivet et al. 1994; Berger et al. 1999; Demarigny

et al. 2000).

Même si dans le Camembert le méthanethiol, le DMDS, le DMTS et les méthylthioesters

sont produits en grande quantité par G. candidum, la quantité de méthanethiol ainsi que le

type de thioester produits sont dépendants de la nature des souches (Jollivet et coll., 1994;

Berger et coll., 1999; Demarigny et coll., 2000; Guichard et Bonnarme, 2005). En effet, un

milieu de culture permettant de différencier les souches sur la base de la quantité de CVS

produit a été développé, révélant ainsi le potentiel technologique de chaque souche

(Guichard et Bonnarme, 2005). Ces différents panels aromatiques soufrés générés au sein

28

de l'espèce G. candidum pourraient être en partie expliqués par des niveaux d'activité

différents de la L-méthionine-y-déméthiolase et/ou d'autres enzymes (Berger et al. 1999).

D'un point de vue moléculaire, Gente et coll. (2007a) ont été les premiers à évaluer le

potentiel de G. candidum à produire des CVS in situ par la transcriptomique en évaluant

l'expression du gène cgi. L'enzyme CGL est principalement impliquée dans la

transformation de la cystathionine en cysteine et homocysteine, mais peut également

produire du méthanethiol à partir de la L-méthionine (Yvon et Rijnen 2001; Gente et al.

2007a). De nombreuses enzymes sont impliquées hypothétiquement dans ces réactions,

mais à part la CGL aucune de ces enzymes n'a été identifiée chez G. candidum. Leur

présence n'est qu'hypothétique puisque leur implication n'a été suggérée que par les voies

métaboliques susceptibles de générer les composés aromatiques retrouvés dans les milieux

de culture (Berger et al. 1999; Yvon et Rijnen 2001).

Sur des modèles fromagers, il a été démontré que les huit souches de G. candidum à l'étude

produisent également des alcools primaires comme le propanol, le 2-méthylpropanol, le

3-méthylbutanol, du 2-méthyl-3-pentanol qui est un alcool secondaire et de l'acide

butanoïque et sept souches sur huit produisent également du 2-pentanone, du 3-pentanone,

des acides hexanoique et octanoique et du phényléthanol (Jollivet et al. 1994). Ces

composés proviendraient du catabolisme des acides aminés, comme la phenylalanine pour

le phényléthanol, la leucine pour le 3-méthylbutanol et la valine pour le 2-méthylpropanol

et l'acide butanoïque (Jollivet et al. 1994; Yvon et Rijnen 2001).

2.3.2.4 Réduction de l'amertume

L'amertume est un défaut organoleptique qui peut être détecté dans les fromages à pâte

molle et à croûte fleurie (Vassal et Gripon 1984). Elle est provoquée par la présence de

peptides hydrophobes de faible poids moléculaire produits par la protease de P. camemberti

à partir des molécules de p-caséine (Vassal et Gripon 1984; Molimard et al. 1995;

Molimard et al. 1997). G. candidum, qui autrefois était un agent indésirable en production

fromagère fut finalement réintroduit pour sa capacité à réduire cette amertume (Molimard

29

et al. 1994; Molimard et al. 1995; Molimard et al. 1997; Marcellino et al. 2001). Selon la

souche, elle génère beaucoup moins de peptides que P. camemberti de par une activité

protéasique globale plus faible et surtout, elle est capable d'hydrolyser les peptides formés

par ce dernier par une activité aminopeptidasique plus forte (Vassal et Gripon 1984;

Molimard et al. 1994; Molimard et al. 1997). Ces différences d'activité enzymatiques

justifient encore une fois l'importance de la sélection des souches de G. candidum par les

industries produisant des ferments et les industries fromagères.

2.3.3 G. candidum et ses in terac t ions au sein du microbiote f romager

2.3.3.1 Interactions avec Pénicillium camemberti

G. candidum et P. camemberti sont les deux principaux mycètes responsables des

propriétés organoleptiques des fromages de type Camembert (Fleet 1990; Molimard et al.

1994; Molimard et al. 1996; Molimard et al. 1997; Spinnler et Gripon 2004). Il est donc

important de comprendre les interactions qui s'établissent entre ces deux microorganismes

au cours de l'affinage afin d'optimiser la production fromagère. G. candidum se développe

dès les premiers jours d'affinage suivi par la croissance de P. camemberti au jour sept

(Molimard et al. 1995; Leclercq-Perlat et al. 2004a). Il semble difficile d'établir si les

interactions sont synergiques ou inhibitrices, car des effets souches-dépendants inhérents

aux deux espèces et/ou des effets résultants des conditions de culture sélectionnées ont été

mis en évidence. Ceci a conduit à la publication de certains résultats pour le moins

contradictoires.

Des fromages expérimentaux à pâte molle de type Camembert ont été fabriqués avec des

combinaisons différentes de souches de G. candidum et de P. camemberti (Molimard et al.

1995). Les trois souches de G. candidum ne semblent pas influencer de façon significative

la croissance des quatre souches de P. camemberti. Ce même résultat a été observé par

Molimard et coll. (1994). Pourtant, c'est sur des Camemberts expérimentaux que Vassal et

Gripon (1984) avaient montré l'effet limitant de G. candidum sur la croissance de

P. camemberti permettant la réduction de l'amertume et recommandant ainsi l'utilisation de

30

cette levure pour la fabrication de Camemberts. Par contre, le développement de

G. candidum semble être influencé de façon positive ou négative selon la sélection des

souches de G. candidum et de P. camemberti (Molimard et al. 1995).

Des travaux ont également été menés sur du jus de Camembert récupéré à l'étape du

démoulage. Ce jus permet de simuler les conditions nutritives retrouvées au niveau du

caillé lactique. Un effet synergique sur la protéolyse a clairement été démontré lors de la

combinaison des deux espèces (Aziza et al. 2005; Boutrou et al. 2006a). Sur des

Camemberts expérimentaux, certaines combinaisons de souches de G. candidum et de

P. camemberti conduiraient soit à une intensification des arômes de chou, d'étable, de notes

fermentées et une intensification de la flaveur globale des fromages, soit à une

intensification des flaveurs de lait, de crème et de beurre (Molimard et al. 1997).

D'un point de vue technologique, l'association de G. candidum et de P. camemberti est

particulièrement intéressante pour la fabrication de fromages à pâte molle et à croûte

fleurie. En effet, une colonisation plus rapide de la surface fromagère par P. camemberti en

présence de G. candidum permettrait, d'une part, de prévenir le développement d'une

microflore contaminante et, d'autre part, de réduire le temps d'affinage (Molimard et al.

1995). La réduction du taux de croissance de P. camemberti par G. candidum, quant à elle,

permettrait d'obtenir une croûte moins blanche considérée plus traditionnelle (Boutrou et

al. 2005; Vassal et Gripon 1984) et de réduire l'amertume qui serait principalement générée

par l'activité protéasique de P. camemberti sur les caséines (Vassal et Gripon 1984).

Cependant, les bénéfices dépendent clairement des combinaisons de souches utilisées et les

mécanismes impliqués derrière ces différentes interactions restent encore mal expliqués.

2.3.3.2 Interactions entre G. candidum et les autres microorganismes

Les arômes, le goût, l'aspect, la texture des fromages ainsi que leur innocuité dépendent

principalement de l'implantation et de la succession de groupes microbiologiques et plus

précisément des interactions qui s'établissent entre les levures, moisissures et/ou bactéries

de cette microflore d'affinage (Bockelman et al. 2005; Irlinger et Mounier 2009). Au

31

moment de sa consommation, un fromage affiné contient généralement entre 8 et 10 log

UFC.g*1 de levures et de bactéries cohabitant ensemble (Corsetti et al. 2001; Irlinger et

Mounier 2009). C'est l'alcalinisation de la croûte fromagère qui permet la succession des

flores et la mise en place de ces interactions. L'oxydation du lactate et la production

d'ammoniac sont donc des étapes clés dans l'affinage des fromages.

Sur 62 souches de G. candidum étudiées, 86 % ont montré une capacité, à différents degrés

d'activité, de cataboliser le lactate (Marcellino et al. 2001). Ces souches possèdent une

enzyme lactate oxydase qui leur permet de métaboliser le L-lactate via une voie oxydative

en produisant du pyruvate et du peroxyde d'hydrogène, puis du CO2 et du H2O, permettant

ainsi une neutralisation de la croûte fromagère (Sztajer et al. 1996; McSweeney et Sousa

2000; Adour et al. 2002; McSweeney et Fox 2004). G. candidum est aussi capable de

cataboliser des peptides et des acides aminés entraînant une production élevée d'ions

ammonium conduisant également à une remontée du pH en surface (Adour et al. 2002).

Cette alcalinisation progressive de la surface des fromages permet l'implantation et le

développement de bactéries acido-sensibles, mais plus protéolytiques, comme B. linens,

Micrococcus, Arthrobacter et Corynebacterium spp. sur les fromages à croûte lavée

(Corsetti et al. 2001). Il semblerait, comme pour le cas de P. camemberti, que cette

stimulation soit dépendante de la souche puisqu'un effet limitant sur la croissance de

B. linens a été observé sur caillé modèle à cause d'une mauvaise neutralisation de la croûte

par G. candidum (Arfi et al. 2005). Par ailleurs, une analyse des interactions s'établissant

entre cinq groupes de microorganismes de la microflore d'affinage du Livarot a été réalisée

sur des fromages expérimentaux (Fig. 6; Mounier et al. 2008). G. candidum stimule la

croissance des bactéries et est même une condition sine qua non pour l'implantation et le

développement de Leucobacter sp. Outre l'alcalinisation de la croûte fromagère qui permet

la multiplication à la surface des bactéries sensibles aux pH acides G. candidum produirait

des metabolites qui seraient essentiels à la croissance de Leucobacter sp. et qui

favoriseraient la croissance de Brevibacterium aurantiacum (Mounier et al. 2008).

Des résultats sur fromages Camembert ont clairement montré que G. candidum a un fort

potentiel d'inhibition sur la croissance de moisissures indésirables comme Pénicillium

32

commune, Pénicillium caseifulvum, Pénicillium verrucosum, Pénicillium discolor,

Pénicillium solitum, Pénicillium coprophilum et Aspergillus versicolor (inhibition complète

sur des Camemberts entreposés sept jours à 25 °C; Nielsen et al. 1998; van den Tempel et

Nielsen 2000). P. camemberti ne contribue pas à cette inhibition renforçant le rôle

protecteur de G. candidum dans la fabrication des fromages à croûte fleurie (Guéguen et

Lenoir 1976; Nielsen et al. 1998). Mais, dans le cas de fromages bleus, G. candidum est

considéré comme une levure contaminante qui peut inhiber la croissance de Pénicillium

roqueforti, espèce utilisée dans la fabrication de ce type de fromages (van den Tempel et

Nielsen 2000). G. candidum produit des composés volatils, dont le triméthylamine, qui

permettent d'inhiber la germination de ses propres arthrospores ainsi que la croissance de

ses hyphes (Robinson et al. 1989). Ces metabolites ont aussi un effet inhibiteur sur la

germination et la croissance d'autres moisissures indésirables comme Aspergillus flavus,

Botrytis allii, Pénicillium italicum, Microsporum canis et Mucor sp. (Tariq et Campbell

1991; Marcellino et al. 2001). En plus de la production de composés volatils inhibiteurs, ce

rôle protecteur pourrait être expliqué par sa rapidité de croissance et donc une compétition

pour l'occupation de la surface et l'utilisation des nutriments (Nielsen et al. 1998). Sa

capacité à inhiber la croissance des Mucor sp., qui sont responsables de l'accident du « poil

de chat » lors de la fabrication de fromages type Camembert, est un critère de sélection des

souches de G. candidum pour la formulation des ferments (Guéguen et Lenoir 1976;

Tornadijo et al. 1998). Certaines souches de G. candidum produisent également deux

metabolites, l'acide D-3-phényllactique et l'acide D-3-indollactique, qui inhibent la

croissance de L. monocytogenes (Dieuleveux et al. 1998).

33

Figure 6. Interactions (—», positive, —•, négative) entre Debaryomyces hansenii (Dh),

Yarrowia. lipolytica (Yl), Geotrichum candidum (Gc), Leucobacter sp. (Ls) et le groupe C

incluant Arthrobacter arilaitensis, Hafhia alvei, Corynebacterium casei, Brevibacterium

aurantiacum et Staphylococcus xylosus au sein d'un fromage Livarot expérimental. Figure

tirée intégralement de Mounier et coll. (2008).

Les interactions entre les différents microorganismes de la microflore d'affinage et

G. candidum peuvent avoir un impact sur l'apparence du fromage. En effet sur des

fromages Livarot expérimentaux, il s'est avéré que Y. lipolytica inhibait la formation

d'hyphes de G candidum conduisant à une croûte d'aspect de « spaghetti » (Fig. 7C). Ce

changement de morphotype était accompagné d'une diminution de l'efficacité de

G. candidum à utiliser le lactate. Les mécanismes impliqués derrière ce phénomène sont

encore en cours d'étude.

Figure 7. Mycellium formé par Geotrichum candidum en culture pure (A), en co-culture

avec Debaryomyces hansenii (B) et en co-culture avec Yarrowia lipolytica (C). Photos tirés

de Mounier et coll. (2008).

34

En ce qui concerne les propriétés organoleptiques, l'association de certaines souches de G. candidum à des cultures de bactéries (comme B. linens ou Corynebacterium glutamicum) ou de levures (tel K. lactis) permet de modifier la nature et l'intensité des composés aromatiques produits (Martin et al. 1999; Martin et al. 2001).

2.3.4 Propriétés probiotiques potentielles de G. candidum

La présence de G candidum dans des fèces de rats soumis à une diète de six semaines contenant uniquement du Camembert suggère un éventuel effet probiotique de cette espèce de par sa survie durant le transit gastro-intestinal (Lay et al. 2004). Une étude similaire sur l'humain a permis de tirer les mêmes conclusions (Firmesse et al. 2008). L'impact de G. candidum sur la santé humaine, sur l'équilibre du microbiote gastro-intestinal et sur les activités métaboliques restent à démontrer.

2.4 Exploration de la diversité des souches de G. candidum à travers des méthodes d'identification et de typage

2.4.1 Les méthodes d'identification

Il apparaît clairement que le morphotype et les propriétés technologiques des souches de G. candidum sont souche-dépendantes. Il est important de garder en mémoire cette variabilité intra-espèce lors de l'amélioration ou de la formulation des ferments. Ces diversités morphologiques et technologiques sont bien évidemment corrélées à une diversité génétique. Il existe plusieurs outils moléculaires permettant d'explorer cette diversité et la sélection d'une méthode de typage sera fonction du niveau d'information nécessaire. Ces différentes méthodes d'identification, de differentiation et de typage actuellement utilisées pour G. candidum sont présentées ci-après.

35

2.4.1.1 Les caractères phénotypiques et physiologiques

Pendant longtemps, les méthodes d'identification et de description (taxinomie) des levures

étaient basées sur des propriétés physiologiques et biochimiques, sur des critères

morphologiques ou sur la combinaison des deux. La formation des ascospores et leur

description, l'utilisation des sucres fermentescibles, l'assimilation de composés carbonés et

azotés, les besoins en vitamines, leur tolérance aux températures étaient quelques-uns des

critères utilisés afin de différencier les espèces (Kreger-van Rij 1984; Barnett et al. 1990;

de Hoog et al. 1998; de Hoog et Smith 2011). En se basant sur des caractères

morphologiques et physiologiques, la frontière entre deux espèces peut être mince et

discutable selon la souche et selon les propriétés physiologiques testées. Dans le tableau 4,

par exemple, il apparaît que les espèces Gai. candidus et G. geotrichum peuvent se

distinguer sur la base d'un seul critère, leur capacité de croître à 35°C.

Tableau 4. Caractères utilisés pour la differentiation des espèces au sein du genre

Galactomyces.

Croissance

Species Ribitole D-Mannitole

D-Glucono-1,5-lactone 35°C Sans

vitamine Gai. candidus v + + + +

Gai. citri-aurantii + + V — — Gai. geotrichum - + + — +

Gai. pseudocandidus — - — v + Gai. reessii - - - V -

Tableau extrait intégralement du livre The yeasts, a taxonomic study (de Hoog et Smith 2011).

Les tests physiologiques peuvent également être utilisés pour explorer la diversité des

souches de G. candidum. En 2001, soixante-quatre isolats de G. candidum furent prélevés

par Marcellino et coll. de laits, de caillés, de fromage fabriqués traditionnellement dans six

régions d'importance fromagère en France. Ces isolats furent préalablement affiliés à

l'espèce G. candidum sur la base de l'assimilation du D-xylose (+), du cellobiose (-) et du

maltose (-) comme seule source de carbone. Ils furent ensuite différenciés sur la base de

l'assimilation du D-mannitol, du DL-lactate et du citrate. Les isolats présentaient une

36

variabilité au niveau de l'assimilation du D-mannitol et l'assimilation du lactate était

dépendante de la région géographique où a été effectué l'isolement. Aucune souche

n'assimilait le citrate comme unique source de carbone. Or, une récente révision réalisée

par de Hoog et Smith (2011) suggère l'affiliation à l'espèce G. candidum pour les souches

D-mannitol (+) et DL-lactate (+) (Tableau 5). Il a également été proposé que l'assimilation

du citrate et la fermentation du glucose et du galactose soient les seuls tests physiologiques

discriminant pour l'espèce G. candidum (Tableau 5).

De nombreux tests biochimiques à utilisation rapide sont disponibles, tels que les galeries

API commercialisées par la compagnie Biomérieux, et sont utilisés pour l'identification des

souches de G. candidum isolées de fromages affinés en surface et au lait cru (Kawai et al.

2007; Chen et al. 2010). Mais, comme mentionné précédemment les souches de

G. candidum présentent une grande variabilité morphologique, leurs propriétés

technologiques sont dépendantes de la souche et l'interprétation des résultats de ces tests

avec l'émergence des méthodes moléculaires sont sujets à changement. Il est donc clair que

les tests biochimiques présentes des limitations et ne sont pas suffisants pour réaliser une

distinction rigoureuse des espèces du genre Geotrichum sp. et donc pour une identification

et une description fiables des souches d'importance laitière.

37

Tableau 5. Caractères physiologiques décrivant la morphologie parfaite de l'espèce Geotrichum candidum.

Description de 2011 Description de 1998

Fermentation Glucose V v Galactose - , vw v Sucrose - -Maltose - -Lactose - -Raffinose - -Trehalose - Non considéré Croissance en milieu liquide Glucose Inuline Sucrose Raffinose Mélibiose Galactose Lactose Trehalose Maltose Mélézitose Méthyl-a-D-glucoside Amidon soluble Cellobiose Salicine L-Sorbose L-Rhamnose D-Xylose L-Arabinose D-Arabinose D-Ribose D-Méthanol n Éthanol + + Glycerol + + Erythritol - -Ribitol v v Galactitol - -

D-Glucitol + + myo-Inositol - -Dl.-Lactate + v Succinate + v Citrate v v D-Gluconate - -D-Glucosamine - -jV-Acétyl-D-Glucosamine n n Hexadécane n n Nitrate Sans vitamine + + Tableau extrait intégralement du livre The Yeasts, a taxonomic study (de Hoog et al. 1998, de Hoog et Smith 2011 ).

38

2.4.1.2 Le DNA barcoding

Le DNA barcoding est une stratégie développée afin de permettre une identification des

espèces qui soit rapide, exacte et automatisée, basé sur l'utilisation unique d'un court

fragment de gène commun à toutes les espèces (Hébert et Gregory 2005). La principale

exigence du DNA barcoding est de disposer d'un fragment nucléotidique qui soit

suffisamment variable entre les espèces, mais suffisamment conservé au sein d'une espèce

pour ne pas entraver les frontières établies par les notions de diversités intra-espèce et inter­

espèce (Ebach et Holdrege 2005; Meier et al. 2006; Stockinger et al. 2010; Lewis et al.

2011 ; von Cràutlein et al. 2011).

Il est communément admis qu'il n'existe pas de barrières nettes entre les espèces et que le

monde du vivant évolue selon un continuum. « La nature ne fait pas de saut » a écrit

François Jacob (1970). Cependant, le but du DNA barcoding est de trouver des coupures

marquées et d'y poser des frontières afin d'être en mesure d'identifier des espèces connues

et d'en découvrir, ou décrire, de nouvelles (Hébert et Gregory 2005). Ces coupures

« existent » justement si le nombre minimal de variations inter-espèce est supérieur au

nombre maximal de variations intra-espèce (Stockinger et al. 2010). Le DNA barcoding

n'est donc pas une alternative à la taxinomie ni à la phylogénie, mais une méthode

complémentaire. D'ailleurs selon l'International Code of Botanical Nomenclature, la

description morphologique d'une espèce est toujours obligatoire (Begerow et al. 2010).

Dans un but ultime d'identification, le DNA barcoding permet de façon simple, en

collectant des données moléculaires, de dresser un portrait de la biodiversité du monde

vivant. Ceci est particulièrement important dans un contexte de recensement des espèces

avant leur disparition de la planète, ce qui représente un sentiment d'urgence pour plusieurs

écosystèmes qui sont altérés pour une raison ou une autre. En 250 ans, seulement 15 % des

espèces vivantes auraient été répertoriées (Ebach et Holdrege 2005).

La sélection du fragment de gène est une étape cruciale afin d'obtenir une identification

fiable des espèces. Plusieurs fragments de gènes ont été proposés pour le DNA barcoding

(Tableau 6; Hajibabaei et al. 2007).

39

Tableau 6. Marqueurs moléculaires communs utilisés pour la discrimination au niveau de

l'espèce.

Gène* Localisation génomique

Nombre de . séquences Gène* Localisation

génomique Animaux Plantes Protistes Mycètes

Code-barres COIb mitochondrie 195 777 520 1931 410 16S-ADNr mitochondrie 41 381 221 2059 285

cytb mitochondrie 88 324 165 1920 1084

ITSl-ADNr noyau 12 175 57 693 68 839 56 675 ITS2-ADNr noyau 13 923 58 065 67 332 56 349 18S-ADNr noyau 21 063 17 121 32 290 33 327

rbcL plaste Pas applicable 30 663 37 328 Pas applicable Tableau extrait intégralement de Hajibabaei et coll. (2007). a Abréviations des gènes : COI, cytochrome c oxidase I; cytb, cytochrome b; ITS, espaceur interne transcrit (internal transcribed spacer); rbcL, large sous-unité du ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase (large subunit of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase). b Les statistiques du code-barres COI ont été obtenus à partir du site Internet du Barcode of Life Data systems Oittp://www.barcodinglife.org). Données des autres loci ont été obtenues à partir du site internet de GenBank.

Un fragment d'environ 650 pb de la sous-unité 1 du gène mitochondrial du cytochrome c

oxydase (COI, coxl; Tableau 6) est largement utilisé dans le règne animal pour identifier

les espèces (Meier et al. 2006; Hajibabaei et al. 2007; Lewis et al. 2011). De façon

simplifiée, le barcoding est réalisé comme suit : le fragment COI de l'organisme à l'étude

est comparé à une banque de données de fragments COI. Soit le code-barres correspond à

une espèce préalablement répertoriée, soit il ne correspond pas. Dans ce dernier cas, soit un

nouveau code-barres est proposé pour une espèce préalablement existante (dans le cas d'un

variant géographique par exemple), soit il s'agit d'une nouvelle espèce (Meier et al. 2006;

Hajibabei et al. 2007). Cependant, même si deux séquences de COI sont identiques, il

existerait 6 % de chance que les isolats ou organismes appartiennent à deux espèces

différentes (Meier et al. 2006).

On estime entre 1,5 à 5 millions le nombre d'espèces de mycètes sur Terre. Or, 98 %

d'entre elles ne seraient pas encore identifiées, ce qui rend le projet du DNA barcoding plus

qu'intéressant pour l'étude de la biodiversité au sein de ce règne (Blackwell 2011). Le

40

locus du gène mitochondrial de la cytochrome c oxydase ne s'est pas révélé être le code-

barres idéal chez les levures et moisissures à cause d'un manque de séquences conservées

pour la construction d'amorces universelles, d'un polymorphisme de longueur du gène dû à

un nombre élevé de séquences introniques mobiles et de longueurs variables, et de la

présence multi-copies du gène au sein d'espèces comme Aspergillus niger (Meier et al.

2006; Hajibabaei et al. 2007; Rossman 2007; Seifert 2009; Stockinger et al. 2010). Même

si la présence multi-copies du gène et la présence d'introns sont des contraintes pouvant

être contournées par l'utilisation d'une PCR transcriptase inverse, l'utilisation de COI chez

les mycètes impliquerait néanmoins l'utilisation de paires d'amorces de séquences

nucléotidiques différentes en fonction des genres (Rossman 2007). En effet, la difficulté de

sélectionner le locus idéal repose essentiellement sur la difficulté de générer des couples

d'amorces universelles pour son amplification et son analyse (Robert et al. 2011).

À ce jour, aucune région n'a été approuvée pour l'identification des espèces de mycètes

(Rossman 2007; Stockinger et al. 2010; Lewis et al. 2011). Néanmoins depuis 1990, il

existe des séquences d'amorces universelles qui permettent l'amplification et le séquençage

de l'ADN ribosomique (l'ADNr) des mycètes (White et al. 1990). L'ADNr, est un

fragment d'ADN, présent chez tous les organismes vivants (Hillis et Dixon 1991). Chez les

mycètes, il est composé de trois gènes ribosomiques qui sont la sous-unité 18S, la sous-

unité 5.8S et la sous-unité 26/28S (26S chez les levures et 28S chez les moisissures). Ces

gènes sont regroupés dans une unité de transcription répétée en tandem une centaine de fois

(Williams et al. 1988; Hillis et Dixon 1991; Eickbush et Eickbush 2007; Poczai et Hyvônen

2010). Chaque unité de transcription est séparée de la suivante par un espaceur intergénique

(IGS pour InterGenic Spacer en anglais), de longueur variable selon les espèces. Les trois

zones codantes sont séparées par deux espaceurs internes (ITS pour Internal Transcribed

Spacers en anglais, ITS1 et ITS2), transcrits puis épissés lors de la maturation de l'ARNr.

Les gènes 26/28S codent pour les ARNr participant à la constitution de la grande sous-unité

du ribosome, alors que le gène 18S code pour l'ARNr participant à la formation de la petite

sous-unité. Les zones codantes sont relativement conservées entre les espèces, ce qui a

permis de les utiliser pour définir des amorces universelles. Les espaceurs internes ITS1 et

ITS2 et la région D1/D2 de la grande sous-unité sont généralement moins conservés au

41

cours de l'évolution et peuvent être utilisés pour identifier et différencier des espèces

phylogénétiquement proches (Williams et al. 1988; Hillis et Dixon 1991; Eickbush et

Eickbush 2007; Poczai et Hyvônen 2010). Depuis plus de 20 ans, des séquences de 1TTS et

de la région D1/D2 sont couramment utilisées pour l'identification des levures et des

moisissures, ce qui a conduit à l'ajout de nombreuses séquences dans les bases de données

comme GenBank ou l'International Nucleotide Sequence Database (INSD) (Fig. 8;

Rossman 2007; Seifert 2009; Begerow et al. 2010). À titre indicatif, au 28 février 2012,

543 850 séquences ITS de mycètes, provenant de mêmes espèces ou non, étaient

répertoriées sur Genbank; 543 850 séquences pour un nombre d'espèces de levures et de

moisissures estimées entre 1.5 à 5 millions (Blackwell 2011).

1000000

750000

500000

250000

1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007 2009

Figure 8. Nombre de séquences de mycètes déposées chaque année dans GenBank/TNSD.

Gris clair : séquences amplifiées de mycètes; gris foncé : séquences ITS de l'ADNr.

Graphique tiré de Begerow et coll. (2010).

De par sa variabilité inter-espèce et sa longueur facilement amplifiable et séquençable, la

région ITS de l'ADNr a été proposée par le All Fungi Barcode Initiative comme code-

barres pour l'identification des espèces de levures et de moisissures (Scorzetti et al. 2002;

Rossman 2007; Eberhardt 2010; Stockinger et al. 2010). Pour les levures ascomycètes dont

fait partie G. candidum et les levures basidiomycètes, le séquençage de la région D1/D2 du

42

26S a été proposé comme code-barres complémentaire à la région ITS (Rossman 2007;

Eberhardt 2010).

Bien que l'identification des souches de G. candidum ainsi que les études phylogénétiques

pour cette espèce soient basées essentiellement sur les différentes régions de l'ADNr, le

séquençage complet du 18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S et son analyse dans un but taxinomique et

phylogénétique n'ont jamais été réalisés (Smith et al. 1995; Kurtzman et Robnett 1998;

Smith et al. 2000; Ueda-Nishimura et Mikata 2000; Naumova et al. 2001; Vasdinyei et

Deâk 2003; de Hoog et Smith 2004; Lopandic et al. 2006; Senses-Ergul et al. 2006).

D'ailleurs très peu de gènes ont été séquences pour cette espèce d'intérêt laitier

représentant une valeur commerciale importante pour les industries productrices de

ferments et fromagères. Dans un contexte de désaccord concernant le choix du gène et du

locus pour le DNA barcoding des levures, il nous apparaît fondamental de participer au

débat entourant la robustesse des régions ITS et D1/D2 en séquençant la région 18S-ITS1-

5.8S-ITS2-26S chez plusieurs souches de G. candidum.

2.4.2 Les méthodes de typage

Selon van Belkum et coll. (2007) faire du typage correspond à faire des analyses

phénotypiques (phénotypage) et/ou génotypiques (génotypage) des isolats appartenant à

une espèce dans le but de générer des empreintes ou un ensemble de données spécifique à

chacune des souches.

2.4.2.1 Méthodes basées sur l'amplification aléatoire d'ADN par PCR

Les techniques d'amplification aléatoire d'ADN polymorphe (Random Amplified

Polymorphic DNA-PCR en anglais; RAPD-PCR) et d'amplification aléatoire des

microsatellites (Random Amplified Microsatellites-PCR en anglais; RAM-PCR) sont deux

méthodes de génotypage couramment utilisées pour typer les souches de G. candidum

(Prillinger et al. 1999; Marcellino et al. 2001; Gente et al. 2002b; Vasdinyei et Deâk 2003;

Larpin et al. 2006; Gente et al. 2006; Lopandic et al. 2006; Belén Flôrez et al. 2007). La

43

RAPD-PCR et la RAM-PCR sont des méthodes basées sur l'amplification aléatoire de

l'ADN génomique par PCR. La RAPD-PCR est réalisée avec une amorce de séquences

nucléotidiques aléatoires de 10 pb environ. La température d'hybridation utilisée pour la

PCR est donc permissive et se situe entre 36 °C et 40 °C (Williams et al. 1990). La RAM-

PCR est une variante de la RAPD-PCR qui se différencient par l'amorce sélectionnée et qui

est complémentaire à une séquence de microsatellites. Les microsatellites sont des

répétitions en tandem de courts motifs d'un à quatre nucleotides, hautement représentés et

sont répartis de manière homogène dans le génome des eucaryotes. Ils présentent un

polymorphisme élevé d'une souche à l'autre (Bruford et Wayne 1993; Lieckfeldt et al.

1993). Une amorce RAM-PCR ciblant les microsatellites a généralement une longueur

d'environ 20 pb et s'hybride à des températures plus élevées que celles de la RAPD-PCR

(environ 50 °C).

Une variation dans la séquence génomique complémentaire à l'amorce utilisée pour la

RAPD-PCR ou la RAM-PCR entraîne une variation dans le nombre et de la longueur des

fragments d'ADN amplifiés. Les différences de profils de migration électrophorétiques

peuvent donc servir à différencier les souches (Williams et al. 1990; Bruford et Wayne

1993; Lieckfeldt et al. 1993). Il existe deux grands avantages à ce type de méthodes de

differentiation. Premièrement, elles ne nécessitent aucun séquençage de gène préalable pour

la construction des amorces et, en second lieu, elles permettent de révéler les

polymorphismes au niveau du génome complet de la souche (Fernândez-Espinar et al.

2006; Labrie 2010).

La grande diversité génétique présente au sein de l'espèce G. candidum a été mise en

évidence pour la première fois par la technique de la RAPD-PCR qui a été appliquée sur

64 isolats prélevés de laits, de caillés et de fromages fabriqués de manière traditionnelle

dans sept régions de France (Marcellino et al. 2001). Sur 55 amorces RAPD-PCR testées,

l'analyse bioinformatique de la combinaison des profils électrophorétiques obtenus par

l'utilisation de trois amorces, OPA-19, OPT-12 et OPT-15, permirent de distribuer les

64 souches en 48 groupes distincts. Cependant, aucune relation entre les profils générés et

l'origine géographique des souches n'a pu être dégagée des résultats. Les auteurs ont

44

néanmoins constaté que l'âge de la culture, avant l'extraction de l'ADN, ainsi que la

méthode d'extraction en tant que telle influençaient l'amplification par PCR, un

phénomène qui a fréquemment été rapporté dans la littérature (Gente et al. 2002b; Gil-

Lamaignere et al. 2003; Beh et al. 2006). De plus, la température d'hybridation permissive

(34°C) nécessaire à la réalisation de la RAPD-PCR a conduit à des amplifications non

spécifiques pour le témoin négatif de la réaction (sans ADN) suggérant que la réalisation de

cette méthode peut amener certains biais dans l'interprétation des profils électrophorétiques.

Gente et coll. (2002b) ont comparé le pouvoir discriminant de la RAM-PCR avec celui de

la RAPD-PCR sur 57 isolats d'origines laitières et non-laitières. Sur 14 amorces RAM-PCR

testées, les amorces (GATA)4 et (CGA)s ont été les seules amorces permettant la

différenciation des souches. La combinaison des profils électrophorétiques de (GATA)4

avec ceux obtenus par OPA-19, OPT-15 et DB-18 a permis de regrouper les souches en

fonction de leur niche écologique, mais aussi en fonction de l'espèce (Gente et al. 2002b).

Mais, dans le cas de la RAM-PCR, Gente et coll. (2002b) constatèrent néanmoins que des

conditions de conservation différentes (4 °C vs. -80 °C) pour une même souche pouvaient

entraîner un problème de reproductibilité intra et inter-laboratoires. Donc pour résumer

l'ensemble de ces travaux, pour un total de 70 amorces testées sur 121 souches de

G. candidum, seulement deux amorces microsatellites, (GATA)4 et (CGA)s, et quatre

amorces aléatoires, OPA-19, OPT-12, OPT-15 et DB-18, permirent de différencier les

souches et, pour certaines d'entre elles, de les caractériser en fonction de leur niche

écologique et de l'espèce.

Ces résultats suggèrent que la diversité existant au sein de l'espèce G. candidum, mise en

évidence par des souches présentant différents nombres de chromosomes, morphotypes,

profils aromatiques et capacités texturales pour ne citer que ces caractéristiques, est

difficilement discernable par des méthodes d'amplification aléatoire par PCR. De plus, la

RAM-PCR et la RAPD-PCR peuvent se montrer inefficace en terme de differentiation des

souches de G. candidum, même avec les amorces (GATA)4, OPA-19, OPT-15 et DB-18

(Larpin et al. 2006). En plus de générer des amplifications secondaires non spécifiques,

chaque étape de réalisation de ces méthodes peut être soumise à des variations dues à

l'expérimentation (Gil-Lamaignere et al. 2003; Beh et al. 2006; Labrie 2010). Ce point a

45

également été mentionné par Gente et coll. (2006) qui recommandent l'utilisation de leur

protocole standardisé de RAM-PCR validé sur un total de 75 souches testées avec cinq

amorces microsatellites supplémentaires. Cependant, l'uniformisation inter-laboratoire d'un

protocole d'archivage des souches, du modèle de thermocycleur et des réactifs chimiques et

biochimiques est une contrainte difficilement réalisable. Et enfin, l'analyse des profils

électrophorétiques est subjective puisque Gente et coll. (2002), par exemple, sélectionnent

les bandes à analyser en fonction de leur intensité ou de leur taille (Gil-Lamaignere et al.

2003; Ayoub et al. 2006; Beh et al. 2006). Ainsi deux laboratoires peuvent obtenir des

profils électrophorétiques différents, mais arriver à la même conclusion finale quant à

l'assignation à une espèce particulière ou bien générer des conclusions différentes à partir

de profils électrophorétiques identiques.

Dans certains cas, la RAPD-PCR a été utilisée sur des isolats prélevés de fromages et de

produits laitiers comme méthode d'affiliation à l'espèce (Prillinger et al. 1999; Vasdinyei et

Deâk 2003; Lopandic et al. 2006). La méthode n'est cependant pas toujours efficace et

validée pour l'espèce G. candidum (Vasdinyei et Deâk 2003). Il apparaît clairement que les

plus grandes limitations de ces méthodes de génotypage sont le manque de reproductibilité

inter-laboratoires et la faible résolution. Or, typer des souches est d'une importance capitale

dans l'industrie des ferments. Les industriels doivent s'assurer que la souche isolée est

unique dans leur collection et qu'elle n'appartient pas à la concurrence. Par ailleurs, la

diversité phénotypique existant au sein de l'espèce G. candidum est un vivier dans lequel

peuvent puiser les industries fromagères afin de produire de nouveaux fromages de qualité

constante. Cette diversité phénotypique est le reflet d'une diversité génotypique qui doit

être révélée de façon fiable. Or, dans cette optique très peu d'études génétiques ont été

réalisées sur G. candidum. Une technique utilisant des données fiables et objectives basée

sur les polymorphismes observées directement au niveau des séquences nucléotidiques

pourrait améliorer la discrimination des souches.

46

2.4.2.2 Le Multilocus Sequence Typing : nouvelle approche proposée pour le typage des

souches de G. candidum

Idéalement, un génotypage fiable et complet des souches serait basé sur la comparaison de

la séquence des génomes complets. Les coûts élevés de séquençage, le temps nécessaire à

l'analyse et la comparaison de génomes complets sont encore des facteurs limitants pour

atteindre cet idéal (Hajibabaei et al. 2007).

Actuellement, il existe une autre méthode de génotypage, le Multilocus Sequence Typing

(MLST) qui repose sur le séquençage de fragments de six à huit gènes domestiques

(Housekeeping genes, en anglais) au sein d'une espèce (Maiden et al. 1998; Cooper et Feil

2004; Maiden 2006). Les gènes domestiques sont des gènes constitutifs codants pour des

protéines participants au métabolisme central de l'organisme et qui sont indispensables à sa

survie. Ces gènes vont donc présenter un degré d'évolution modéré, car des mutations

affectant l'activité des protéines pour lesquels ils codent compromettrait la survie même de

l'organisme (Cooper et Feil 2004; Maiden 2006). Le MLST permet de détecter la variation

allélique de ces gènes directement au niveau des séquences nucléotidiques qui les

composent. Les souches présentant les mêmes alleles sont ensuite regroupées au sein du

même groupe appelé séquence type (ST) (Maiden et al. 1998; Maiden 2006).

Le MLST est une adaptation du Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE). Le MLEE

considère les polymorphismes de séquences protéiques codées par des gènes domestiques

en fonction de leur profil de migration sur gel. Le MLST indexe directement ces

polymorphismes au niveau des séquences nucléotidiques. Le code génétique étant

redondant le MLST offre la possibilité de générer plus d'alleles par locus. Par ailleurs, le

MLEE a le désavantage d'être une méthode de migration électrophorétique qui génère des

profils de migrations plus difficilement comparables entre laboratoires que les séquences

nucléotidiques (Maiden et al. 1998; Maiden 2006).

Le MLST a été développé initialement pour typer des souches de la bactérie pathogène

Neisseria meningitidis dans le cadre d'une étude épidémiologique (Maiden et al. 1998;

47

Maiden 2006). Depuis son introduction en 1998, il est couramment utilisé en epidemiologic

pour typer également des souches de levures pathogènes comme C. albicans, C. glabrata,

Candida tropicalis (Bougnoux et al. 2002; Bougnoux et al. 2003; Dodgson et al. 2003;

Tavanti et al. 2003; Taylor et Fisher 2003; Bougnoux et al. 2004; Odds et Jacobsen 2008).

Cette méthode a également été appliquée sur des microorganismes d'intérêt alimentaire

comme les bactéries lactiques Oenococcus oeni, Lactobacillus casei, Lactobacillus

plantarum, L. delbrueckii, Pediococcus parvulus et Pediococcus damnosus, les

bifidobactéries et la levure de boulangerie S. cerevisiae (Taylor et Fisher 2003; de las Rivas

et al. 2004; Ayoub et al. 2006; de las Rivas et al. 2006; Diancourt et al. 2007; Calmin et al.

2008; Bilhère et al. 2009; Munoz et al. 2009; Delétoile et al. 2010; Taïbi et al. 2010;

Tanigawa et Watanabe 2011).

Un des avantages les plus importants du MLST par rapport à la RAPD-PCR et à la

RAM-PCR, qui sont couramment utilisées sur des souches de G. candidum, est l'obtention

de résultats qui ne dépendent pas de la méthodologie (Maiden et al. 1998; Bougnoux et al.

2004; Maiden 2006; Vanhee et al. 2010). Tel que mentionné précédemment, les méthodes

de typage basées sur l'amplification aléatoire de l'ADN produisent des résultats qui vont

dépendre du matériel et des réactifs utilisés (Gil-Lamaignere et al. 2003; Ayoub et al. 2006;

Beh et al. 2006; Gente et al. 2006). Or, comme il est difficile d'imaginer que tous les

laboratoires s'équipent du même matériel et des mêmes réactifs, on s'attend donc à un

minimum de variabilité entre les résultats provenant de laboratoires différents (Fisher

2006). De plus, le procédé de traitement des données, qui repose sur la sélection des bandes

de profils électrophorétiques à analyser (Fig. 9), peut être subjectif d'une personne à l'autre

(Gil-Lamaignere et al. 2003; Ayoub et al. 2006). Cette analyse subjective des résultats

concerne également les méthodes basées sur les caractères phénotypiques et physiologiques

(Tavanti et al. 2003). Dans le cas du MLST, les données sont brutes et non-subjectives

puisqu'elles consistent en des séquences nucléotidiques qui peuvent être déterminées sans

ambiguïté par séquençage (Fig. 9; Maiden 2006; Odds et Jacobsen 2008; Tavanti et al.

2003). Cet avantage permet ainsi de comparer les résultats entre laboratoires et de partager

facilement les résultats au moyen du réseau Internet (Tableau 7; Maiden 2006; Fisher

2006). Le 12 mars 2012, le site Internet Pubmlst (http://pubmlst.org/) de Keith Jolley

48

recensait 38 schémas MLST de bactéries et quatre de levures. Finalement, le dernier avantage qui découle du principe même de la méthode est que le MLST peut être réalisé de façon séquentielle, c'est-à-dire appliqué sur des isolats découverts au fur et à mesure, sans nécessité d'analyser simultanément une souche contrôle (Gil-Lamaignere et al. 2003; Vannée etal. 2010).

MLST Amplification of

housekeeping genes

2 Z*E

I Sequencing of the PCR

products 1 ATGCTAGGCAT

2 ATGCTCGGCAT

RAPD Amplification with a

single, arbitrary primer

I

Electrophoresis 1 2

Figure 9. Vue d'ensemble des étapes expérimentales de la RAPD-PCR et du MLST. Figure tirée intégralement de Vanhee et coll. (2010).

La stabilité du MLST ainsi que la reproductibilité de la méthode furent testées par Bougnoux et coll. (2002) pour la levure C. albicans. Ces caractéristiques sont assurées par l'utilisation de gènes domestiques et de leur faible taux d'évolution au cours du temps (Maiden et al. 1998; Bougnoux et al. 2002; Cooper et Feil 2004).

Les avantages techniques du MLST par rapport aux autres méthodes de génotypage sont présentés au tableau 7. Il est néanmoins important de préciser qu'un des désavantages du MLST au moment de son introduction était le coût de l'expérience, mais ce coût diminue progressivement avec le développement de nouvelles technologies de séquençage plus performantes (Cooper et Feil 2004).

49

D'un point de vue génotypique, le MLST présente l'avantage de permettre des études

phylogénétiques. En effet, contrairement à la RAM-PCR et la RAPD-PCR qui ne révèlent

qu'une architecture génomique des polymorphismes, le MLST, en se basant sur les

séquences nucléotidiques de gènes domestiques, permet d'établir les liens de parenté entre

les souches, de délimiter les espèces du même genre et de mettre en évidence des sous-

espèces (Mitchell 2005; Ayoub et al. 2006; Bilhère et al. 2009; Delétoile et al. 2010;

Tanigawa et Watanabe 2011). Il permet aussi de réaliser des études de structure de

population qui sont importantes d'un point de vue épidémiologique et en écologie

microbienne (Maiden et al. 1998; Dodgson et al. 2003; Taylor et Fisher 2003; Mitchell

2005; de las Rivas 2006; Diancourt et al. 2007; Bilhère et al. 2009).

Tableau 7. Caractéristiques des différentes méthodes de typage appliquées sur des isolats

de mycètes.

Méthode Reproductibilité Portabilité ,. Réalisation ... _., ,. .. . , . Résultats discriminant d interpretation isolât AFLP Elevé Faible Elevé Modéré Difficile Modéré 2 jours MLST Très élevé Excellente Modéré Modéré Modéré Elevé 2jours PFGE Elevé Faible Elevé Modéré Modéré Modéré 3 jours RAPD Modéré Faible Limité Facile Modéré Faible 1 jour RFLP Elevé Faible Modéré Facile Modéré Faible 1 jour

Tableau extrait de Vanhee et coll. (2010).

Malgré tous les avantages présentés ci-dessus, il existe des espèces pour lesquelles les

schémas proposés ne sont pas encore optimaux. Ceci fait en sorte que le MLST peut être

une méthode moins discriminante qu'une autre méthode de génotypage. C'est le cas par

exemple pour les espèces S. cerevisiae ou C. glabrata (Dodgson et al. 2003; Ayoub et al.

2006; Munoz et al. 2009). Le pouvoir discriminant du MLST fut comparé avec celui du

génotypage par microsatellites de 83 souches de S. cerevisiae (Ayoub et al. 2006). Le

MLST n'était pas capable de différencier des souches présentant le même profil

électrophorétique alors que le génotypage par microsatellites était capable de différencier

des souches présentant la même ST (Ayoub et al. 2006). Les microsatellites sont moins

conservés que les gènes domestiques ce qui expliquerait une meilleure mise en évidence de

la diversité génétique présente au sein de l'espèce 5. cerevisiae (Tautz 1989; Bruford et

50

Wayne 1993). Les auteurs rappellent que le schéma initialement établi peut constamment

être amélioré avec l'ajout et le remplacement de gènes domestiques (Maiden et al. 1998;

Maiden 2006). Le MLST de l'espèce C. albicans en est l'exemple type. En effet, suite au

premier schéma proposé en 2002 par Bougnoux et coll., quatre autres schémas ont été

développés se différenciant par le nombre et la nature des loci utilisés (Bougnoux et al.

2002; Bougnoux et al. 2003; Tavanti et al. 2003; Robles et al. 2004; Tavanti et al. 2005).

Le pouvoir discriminant du MLST peut se révéler limité face à des espèces ou populations

qui présentent un faible degré de variation génétique. C'est le cas de l'espèce

Mycobacterium tuberculosis chez qui la fréquence de polymorphisme est de 1 nucleotide

sur 10 000 (Taylor et Fisher 2003). Des gènes évoluant plus rapidement pourraient être

utilisés, mais dans le cas d'études épidémiologiques le MLST ne servirait qu'à faire de

l'épidémiologie à court terme et non de 1'epidemiologic globale (Maiden et al. 1998;

Cooper et Feil 2004). Néanmoins certains auteurs suggèrent l'utilisation de schémas MLST

développés avec la combinaison de gènes domestiques et de gènes fonctionnels lorsque

cela paraît nécessaire comme pour M. tuberculosis ou Bacillus anthracis (Cooper et Feil

2004).

Le MLST n'a jamais été appliqué à l'espèce G. candidum. Mais, il a été appliqué avec

succès sur C. albicans par rapport à d'autres méthodes de génotypage, et cette levure est

phylogénétiquement proche de G. candidum (Bougnoux et al. 2002, Bougnoux et al. 2003;

Tavanti et al. 2003; Bougnoux et al. 2004; Robles et al. 2004; Odds et Jacobsen 2008).

Pour C. albicans, le MLST permet une discrimination des souches à 99,9% (Odds et

Jacobsen 2008). Ces résultats rendent la méthode prometteuse pour distinguer les souches

de l'espèce G. candidum, même si le MLST est une technique espèce-dépendante.

51

Chapitre 3- Problématique, hypothèses de recherche et

les objectifs

3.1 Problématique

Le débat sur le DNA barcoding suscite le besoin de générer davantage d'informations

génétiques et ce chez un plus grand nombre d'espèces, incluant Geotrichum candidum. En

effet, aucune séquence complète de l'ADNr n'a été publiée pour cette espèce. La

disponibilité de ces données génétiques pour G. candidum permettrait de mieux orienter le

choix quant à la région de l'ADNr à considérer comme code-barres chez les mycètes. Le

séquençage complet de la région du 18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S chez plusieurs souches

permettrait en plus de démontrer si les bases du DNA barcoding peuvent s'appliquer à cette

espèce. Les pages précédentes ont également illustré la diversité des propriétés

technologiques qui existe au sein de l'espèce G. candidum qui est une levure d'importance

laitière. Ces palettes de fonctionnalités représentent une diversité de choix pour les

industries productrices de ferments et fromagères. Il est donc important d'être en mesure de

distinguer et de caractériser les souches pour l'optimisation ou la formulation de systèmes

microbiens alimentaires performants, la gestion des collections de souches industrielles ou

de laboratoire et la veille concurrentielle. Il existe donc une réelle nécessité de développer

une méthode de génotypage discriminante qui ne soit pas soumise aux variations

expérimentales inter-laboratoires. Le MLST, qui est une méthode de génotypage

moléculaire, offre un langage unique sans équivoque et donc partageable entre laboratoires

pour la differentiation des souches et leur caractérisation. Le but des travaux de doctorat

présentés dans cette thèse est d'explorer et de mettre en évidence la diversité génétique des

souches de G. candidum afin de la préserver et de l'exploiter au meilleur. Ceci passe

également par le développement d'une nouvelle méthode de génotypage.

52

3.2 Hypothèses de recherche

D'après l'état actuel des connaissances sur la génétique de G. candidum ce projet de

recherche est construit de façon à vérifier les deux hypothèses suivantes :

• Le séquençage complet des gènes de l'ADNr et des espaceurs internes ITS1 et IT2

ainsi que leur analyse permettent d'augmenter les connaissances sur la phylogénie de

l'espèce G candidum et d'affilier toutes les souches de l'étude à cette espèce.

• Les gènes domestiques préalablement identifiés chez des levures

phylogénétiquement proches de G. candidum, sont présents chez cette dernière et

permettent de développer un schéma MLST pour la différenciation des souches.

3.3 Objectifs

Ce projet de recherche a pour objectif général d'obtenir une meilleure connaissance du

bagage génétique de G. candidum par MLST. Ainsi, les résultats obtenus permettront

d'identifier et de caractériser les souches de G. candidum industrielles et celles présentes

dans différentes régions du terroir québécois. Quatre objectifs spécifiques ont été atteints

lors de cette thèse :

• Le premier objectif spécifique consistait à déterminer la séquence complète des

gènes 18S, 5.8S et 26S de l'ADNr ainsi que des espaceurs internes ITS1 et ITS2

chez 18 souches de G. candidum.

s Le second objectif visait à valider l'affiliation des souches à l'étude à l'espèce

G. candidum et la contribution des séquences d'ADNr à la stratégie de code-barres

actuellement proposée. Les deux premiers objectifs sont traités dans la publication

scientifique présentée au chapitre 4.

• Le troisième objectif consistait à identifier, chez G. candidum, des gènes

domestiques homologues à ceux séquences chez Candida albicans, Candida

glabrata, Saccharomyces cerevisiae, Sehizosaccharomyces pombe et

Yarrowia lipolytica;

53

• Le quatrième objectif avait pour but de développer le premier schéma MLST pour l'espèce G. candidum et de le valider sur 22 souches provenant de différentes sources d'isolement Les deux derniers objectifs sont présentés au chapitre 5 et ont été soumis pour publication dans un journal scientifique.

54

Chapitre 4- Polymorphismes de l'ADN ribosomique chez la levure G candidum

4.1 Résumé

Geotrichum candidum est une levure dimorphique couramment utilisée comme ferment

d'affinage pour la fabrication des fromages affinés en surface. Pourtant très peu

d'informations concernant sa lignée phylogénétique sont disponibles pour cette espèce. La

région 18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S de l'ADN ribosomique a été entièrement séquencée pour

la première fois chez G. candidum et ce chez 18 souches d'origine laitière principalement.

Au total, 60 sites polymorphiques ont été détectés, ce qui est élevé pour l'ADNr au sein

d'une espèce. En effet, il existe un mécanisme génétique nommé mécanisme d'évolution

concertée qui permet, au sein d'une espèce, une homogénéisation génétique des copies de

l'ADNr. Les électrophorégrammes obtenus lors du séquençage présentaient des doubles

pics suggérant, de surcroit, une variabilité intra-génomique. En effet, les régions ITS1-

5.8S-ITS2 de quatre souches ont été clonées et l'analyse de 68 clones a révélé 32 versions

différentes au total, chaque souche comportant de quatre à douze versions. Ces résultats

amène une meilleure compréhension du manque de robustesse et de fiabilité de la région

ITS comme code-barres chez les mycètes et suggèrent que les techniques permettant de

déterminer le profil des communautés microbiennes, basées sur l'ADNr, doivent être

utilisées avec prudence.

4.2 Avant propos

4.2.1 La contribution des auteurs

J'ai réalisé l'ensemble du travail expérimental décrit dans l'article scientifique présenté dans

ce chapitre. Dr Michel Frenette a cosupervisé le travail et a contribué à la rédaction du

55

manuscrit. Le Dr Steve Labrie a supervisé le travail et a participé activement à l'écriture de

l'article.

4.2.2 Publication et communications associées à ce chapitre

Alper, I, M. Frenette et S. Labrie. 2011. Ribosomal DNA polymorphisms in the yeast

Geotrichum candidum. Fungal Biology 115:1259-1269.

Les principaux résultats énoncés dans cet article ont été présentés sous forme de poster

intitulé « The genetic diversity of Geotrichum candidum » lors du congrès annuel de

VAmerican Dairy Science Association qui s'est tenu à Montréal (Canada) en 2009 et lors

du sommet mondial laitier de la Fédération Internationale du Lait (FIL-IDF) qui s'est tenu à

Berlin (Allemagne) en 2009.

4.3 Abstract

The dimorphic yeast Geotrichum candidum (teleomorph: Galactomyces candidus) is

commonly used to inoculate washed-rind and bloomy-rind cheeses. However, little is

known about the phylogenetic lineage of this microorganism. We have sequenced the

complete 18S, 5.8S, 26S ribosomal RNA genes and their ITS1 and ITS2 spacer regions

(5126 nucleotides) from 18 G. candidum strains from various environmental niches, with a

focus on dairy strains. Multiple sequence alignments revealed the presence of 60

polymorphic sites, which is generally unusual for rDNA within a given species because of

the concerted evolution mechanism. This mechanism drives genetic homogenization to

prevent the divergent evolution of rDNA copies within individuals. While the

polymorphisms observed were mainly substitutions, one insertion/deletion (indel)

polymorphism was detected in ITS1. No polymorphic sites were detected downstream from

this indel site, that is, in 5.8S and ITS2. More surprisingly, many sequence

electrophoregrams generated during the sequencing of the rDNA had dual peaks,

suggesting that many individuals exhibited intragenomic rDNA variability. The ITS1-5.8S-

ITS2 regions of four strains were cloned. The sequence analysis of 68 clones revealed

56

32 different ITS1-5.8S-ITS2 variants within these four strains. Depending on the strain,

from four to twelve variants were detected, indicating that multiple rDNA copies were

present in the genomes of these G candidum strains. These results contribute to the debate

concerning the use of the ITS region for barcoding fungi and suggest that community

profiling techniques based on rDNA should be used with caution.

4.4 Introduction

Geotrichum candidum (teleomorph: Galactomyces candidus) belongs to the Ascomycota

phylum, Saccharomycetes class and Saccharomycetales order (Hibbet et al. 2007).

G. candidum is a dimorphic yeast, meaning that strains belonging to this species can

display two distinct colonial morphotypes, that is, cream-colored yeast-like or mold-like

colonies. However, most display an intermediate morphotype (Guéguen and Jacquet 1982).

G. candidum is a ubiquitous species that is present in various habitats, including the human

respiratory and gastro-intestinal tracts, soil, plants, fruits, water, and insects (Carmichael

1957; Spencer and Spencer 1997). It is also a natural member of the microflora of raw milk

and raw milk cheeses and is also used as a ripening culture for washed-rind and bloomy-

rind cheeses (Boutrou et al. 2006; Desmasures et al. 1997; Marcellino et al. 2001). Some

30 years ago, G candidum was considered as undesirable in traditional cheesemaking

because it caused unstable slim or "toad skin" rinds (Marcellino et al. 2001; Molimard el

al. 1995). The benefits of some strains were finally recognized in the early 80s in France,

when they began to be used to reduce the bitterness of Camembert cheese (Molimard et al.

1994). According to Pottier et al. (2008), G. candidum is used to inoculate 600,000 tons of

French cheese produced every year. It helps to determine the appearance of cheese rind by

covering the surface during the first week of ripening while its alkalinizing activity, which

mainly occurs by the metabolism of lactate and the release of ammonia, promotes the

development of acid-sensitive microorganisms such as Pénicillium camemberti and

Brevibacterium linens (Arfi et al. 2006; Molimard et al. 1995). Some strains also have an

antagonistic effect on undesirable microorganisms such as Mucor spp. and Listeria

monocytogenes and can inhibit their growth (Dieuleveux et al. 1998; Guéguen and Lenoir

1976). G candidum also contributes to the ripening process via the action of its proteases

57

and lipases on the constituents of cheese curd (Arfi et al. 2006; Boutrou et al. 2006;

Guéguen and Lenoir 1976; Molimard and Spinnler 1996). However, these beneficial

technological traits are reported being morphotype- and strain-dependent. Strains must thus

be screened before they can be used in cheesemaking (Boutrou and Guéguen 2005;

Guéguen and Jacquet 1982; Marcellino et al. 2001). The accurate identification of the

phylotypes of G. candidum strains is thus vital in the development of new cheese starters.

Detailed knowledge of the genetic diversity of G. candidum strains would be an important

tool in helping the cheese industry select new technologically relevant strains. However,

unlike lactic acid bacteria, little effort has been devoted to investigating the genomes of

dairy fungi, especially those of G candidum strains. Ribosomal DNA (rDNA) is widely

used as phylogenetic marker for taxonomic studies and phylogenetic inferences. rDNA is

composed of three subunits (18S, 5.8S, and 26S) and three spacers (an external transcribed

spacer [ETS] and two internal transcribed spacers [ITS1 and ITS2]), each with a different

evolution rate (Eickbush and Eickbush 2007; Hillis and Nixon 1991; Poczai and Hyvonen

2010; Williams et al. 1988). For phylogenetic purposes, each region can be considered

separately, and the choice of a given region depends on the taxonomic level targeted by the

study. As such, regions that evolve quickly are used for phylogenetic inferences of closely

related species or genera.

In 2000, Ueda-Nishimura and Mikata suggested that the 18S region of rDNA be used to

differentiate Geotrichum and its teleomorphs (de Hoog and Smith 2004; Ueda-Nishimura

and Mikata 2000). However, the ITS1-5.8S-ITS2 region may be a better genetic marker for

fungal barcoding (Nilsson et al. 2008; Rossman 2007). This region has the advantage of

being shorter and thus easier to clone and has generally a higher rate of evolution than 18S

and 26S, which makes it possible to compare closely related species (Nilsson et al. 2008;

Rossman 2007). However, little else is known about G candidum rDNA since only partial

rDNA sequences have been available to date. In addition to its importance for phylogenetic

studies, accurate information on rDNA structures and sequences is vital for culture-

independent community profiling techniques such as PCR-SSCP, RFLP, T-RFLP, ARISA,

DGGE, and TTGE to avoid conflicting results that can lead to a misinterpretation of

community profiles (Arteau et al. 2010; Jansa et al. 2002; Korabecna et al. 2003; Muyzer

58

1999; Pannecouque and Hotte 2009). The aim of the present study was to provide more

information on the genome of G. candidum and to study the diversity of rDNA among

G candidum strains. We sequenced and analyzed the complete 18S, 5.8S, 26S ribosomal

RNA genes and their ITS1 and ITS2 spacer regions of 18 G candidum strains from various

environmental niches, with a focus on dairy strains. Most were isolated from bloomy-rind

and smear cheeses or were industrial starter strains. Multiple rDNA sequence alignment

analyses and the cloning of the ITS1-5.8S-ITS2 region revealed the presence of

intragenomic polymorphisms in each strain. A bioinformatic analysis also revealed that the

rDNA subunits and spacers provided different resolutions for determining phylogenetic

affiliations. While the sequences of the entire 18S-5.8S-26S rDNA region would provide

the most accurate picture of phylogenetic relationships, the sequence of the ITS1-5.8S-ITS2

region alone could be used to rapidly differentiate the phylotypes of G candidum strains.

4.5 Materials and methods

4.5.1 Biological materials, culture conditions, and genomic DNA extractions

The eighteen G candidum strains of diverse origin selected for our study are listed in

Table 8. They were grown on YEG agar plates (10 g/L of yeast extract, (EMD Chemicals),

10 g/L of D-glucose, (EMD Chemicals), and 15 g/L of Difco agar, (BD Diagnostics)). The

strains were inoculated directly from glycerol stock cultures stored at -80 °C. The plates

were incubated for 72 h at 25°C in the dark. Before extracting the genomic DNA, the

mycelia were ground in liquid nitrogen using a mortar and pestle. Genomic DNA was

extracted from 100 mg of ground mycelium as described by Al-Samarrai and Schmid

(2000). The purified DNA was stored at -20 °C until used.

59

Table 8. Geotrichum candidum strains and their origin.

Strain LMA*

Origin* Reference*

15 Bloomy-rind cheese from Quebec 20 Bloomy-rind cheese from Quebec 28 Bloomy-rind cheese from Quebec 34 Bloomy-rind cheese from Spain 37 Smear cheese from France 38 Bloomy-rind cheese from France 39 Smear cheese from France 40 Smear cheese from France 48 Bioreactor contaminant 73 Smear cheese from France (UCMA-91 = ATCC-204307) 74 Grass (UCMA-291) 75 Corn silage (UCMA-293) 76 Cow's milk (UCMA-302) 77 Milk (UCMA 760 = CBS 110.12) 436 Industrial starter strain 1024 Industrial starter strain 1025 Industrial starter strain 1026 Industrial starter strain

This study This study This study This study This study This study This study ATCC-204307 This study (Gente et al. 2002,2006) (Gente et al. 2006) (Gente et al. 2006) (Gente et al. 2006) (Gente et al. 2006) This study This study This study This study

: LMA, Laboratoire de Microbiologie Alimentaire, Université Laval; ATCC, American Type Culture Collection; CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures; UCMA, Université de Caen, Laboratoire de Microbiologie Alimentaire (Caen, France).

4.5.2 PCR amplification and sequencing of ribosomal DNA

Three universal primer pairs were used for the rDNA PCR amplifications (Fig. 10,

Table 9).

60

Table 9. Primers names, sequences, and references.

Primer name

Sequence (5' -> 3') References

NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC NS2 GGCTGCTGGCACCAGACTTGC NS3 GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC NS4 CTTCCGTCAATTCCTTTAAG NS5 AACTTAAAGGAATTGACGGAAG NS6 GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC NS7 GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC NS8 TCCGCAGGTTCACCTACGGA ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC LR2 TTTTCAAAGTTCTTTTC LR5 TCCTGAGGGAAACTTCG LR7 TACTACCACCAAGATCT LR8 CACCTTGGAGACCTGCT LR9 AGAGCACTGGGCAGAAA LR 12 GACTTAG AGGCGTTCAG LR14 AGCCAAACTCCCCACCTG LR16 TTCCACCCAAACACTCG LROR ACCCGCTGAACTTAAGC LR3R GTCTTGAAACACGGACC LR7R GCAGATCTTGGTGGTAG LR8R AGCAGGTCTCCAAGGTG LR 1 OR G ACCCTGTTG AGCTTG A LR 17R TAACCTATTCTC AAACTT

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62

PCR fragment NS1/ITS4 (2104 bp) covered the small rDNA subunit (SSU), internal

transcribed spacer 1 (ITS1), 5.8S, ITS2, and LSU start, PCR fragment LR0R/LR12

(3053 bp) covered the large rDNA subunit (LSU), and PCR fragment NS5/LR8 (2785 bp)

covered ITS1-5.8S-ITS2, part of SSU, and part of LSU. The PCR amplification were

performed in 50 uL reactions containing Taq polymerase buffer (IX), 1 ng of genomic

DNA, 1.25 U of Taq DNA polymerase (New England Biolabs), 10 nmol dNTPs (New

England Biolabs), and 50 pmol of each primer (Invitrogen) according to the manufacturer's

protocol. The PCR reactions were carried out using a MasterCycler ep apparatus

(Eppendorf) as follows: an initial 1-min denaturing step at 94°C, followed by 30-s

denaturing steps at 94°C, 30-s annealing steps at 55°C, and 3-min extension steps at 72°C

(35 cycles), with a final 5-min extension step at 72°C. The PCR products were separated on

0.8% agarose gels, stained with ethidium bromide, and visualized under UV light. A single

band was obtained for each strain. The PCR fragments were purified on 1.2% agarose gels

using the Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega). The PCR fragments were

sequenced using universal primers (Table 9) on an Applied Biosystems Genetic Analyzer

3130XL (Biomolecular Analysis Platform, Université Laval, Quebec City, QC, Canada).

4.5.3 Bioinformatic analysis

Contig assemblies were performed using the Staden Package and multiple sequence

alignments were performed using MEGA 4 (Tamura et al. 2007). The phylogenetic trees

were constructed using the Neighbor-Joining method with 1000 bootstraps. The

evolutionary distances were estimated using the Maximum Composite Likelihood (gaps

were eliminated from phylogenetic analysis). Phylogenetic analyses were conducted using

MEGA 4 (Tamura et al. 2007). The G. candidum sequences were deposited in GenBank

under accession numbers JF262180 through JF262197. The rDNA regions were identified

as follows. The D1/D2 domain was delimited on MEGA 4 multiple alignments using NL-1

and NL-4 primer sequences (Kurtzman and Robnett 1998). Multiple alignments were also

used to locate the ITS1, ITS2, and 5.8S regions using GenBank BLAST searches

(GQ458022 and GQ458034, (Arteau and Labrie 2010)). The 5.8S region was located

63

between positions 1828 and 1984, which included the group 1 consensus sequence

AACTTTTAAC beginning at position 1831 (de Hoog and Smith 2004).

4.5.4 Amplification, cloning, and sequencing of the ITS1-5.8S-ITS2

region

When PCR amplicons were used as templates for rDNA sequencing, the bioinformatic

analyses repeatedly identified dual peaks at the same positions in the electrophoregram

profiles. This phenomenon was observed for nearly all strains analyzed. This suggests that

either the strains had multiple copies of rDNA with sequence polymorphisms, the genomic

DNA was contaminated with rDNA, or the genomic DNA was contaminated with

mitochondrial DNA. An in-depth analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region was performed to

verify the presence of multiple copies of polymorphic rDNA in the G. candidum strain.

This region was selected because it was more variable than the SSU and LSU regions. The

ITS1-5.8S-ITS2 region in strains LMA-15, LMA-48, LMA-74, and LMA-1025 was

amplified using universal ITS1 and ITS4 primers and the PCR conditions described above

(Table 9). The amplicons were cloned into the pCR®IITOPO® vector using TOPO TA

cloning kits (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Fifteen to 19 clones

of each strain were randomly selected. The plasmids were extracted and purified using

Plasmid Miniprep96 kits (Millipore). The universal M13R and M13F primers were used for

the insert sequencing as described above. The purified PCR fragments were sequenced

using an Applied Biosystems ABI 3730XL (Sequencing and Genotyping Platform, CHUL

Research Center, Quebec City, QC,Canada).

64

4.6 Results

4.6.1 Intragenomic variations in the complete sequence of the G. candidum rRNA genes and their ITS1 and ITS2 spacer regions

We determined the complete sequences of the G. candidum 18S, 5.8S, 26S rRNA genes

and their ITS1 and ITS2 spacer regions (5126 nucleotides). Surprisingly, multiple sequence

alignments for the 18 strains studied revealed the presence of 60 polymorphic sites in these

regions (Fig. 10, Table 9), which is unusual for rDNA within a given species. Based on

comparisons of multiple strain sequence alignments, the polymorphisms corresponded to

substitutions. An insertion in the ITS1 region at position 1825 was also observed for some

strains. Dual peaks were also observed in electrophoregrams at several positions. No

polymorphisms were detected downstream from position 1825 in ITS1 by direct

sequencing (Fig. 10, Table 9), suggesting that one allele was dominant. To eliminate the

possibility that the polymorphisms and the dual peaks were caused by contamination, we

performed numerous re-isolation procedures, repeated the PCR reactions, and sequenced

the same region using different primers, all with the same results. This indicated that

intragenomic variations were present in all the strains. Furthermore, searches of the

GenBank database using the BLAST algorithm revealed high levels of homology with

partial G candidum rDNA sequences. Interestingly, five partial rDNA sequences in

GenBank also had ambiguous nucleotide sequences or substitutions at the same position

(Accessions GQ458018, GQ458033, and GQ458034 (Arteau et al. 2010), X69842

(Wilmotte et al. 1993), GQ862350). Because of the dual peaks in the electrophoregrams, it

was impossible to determine the precise nucleotide identity of the strains by direct

sequencing of PCR products. Nevertheless, a phylogenetic analysis could be performed

using the 18 complete rDNA sequences, including the ambiguities. Based on this analysis,

the strains could be divided into four groups (Fig. 11 A.). When each rDNA region was

studied separately, the phylogenetic analysis revealed that the ITS1-5.8S-ITS2 region more

closely resembled the whole sequences of rRNA genes with their ITS 1 and ITS2 spacer

region than the 18S and 26S regions (Fig. 1 IB.).

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66

Figure 11 A.

85

LMA-40

LMA-73

LMA-39

LMA-15

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LMA-1026

LMA-76

LMA-77

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LMA-48

LMA-75

Figure 11B. 0.0001

65

78

LMA-15 ITS 1-5.8S-rrS2

LMA-1026 ITS1-5.8S-IT32

LMA-39 ITS1-5.8S-ITS2

LMA-40 ITS1-5.8S-ITS2

LMA-28 ITS1-5.8S-rrS2

LMA-76 ITS1-5.8S-ITS2

LMA-73 ITS1-5.8S-rrS2

LMA-77 ITS1-5.8S-.TS2

LMA-1025 ITS1-5.8S-ITS2

LMA-1024 ITS1-5.8S-ITS2

LMA-48 ITS' 85

67

82

LMA-74 ITS1-5.8S-ITS2

LMA-75 ITS1-5.8S-ITS2

LMA-20 ITS1-5.8S-ITS2

LMA-34 ITS1-5.8S-ITS2

LMA-37 ITS1-5.8S-ITS2

LMA-38 ITS1-5.8S-rTS2

LMA-436 ITS1-5.8S-ITS2

Geotrichum klebahnii FJ838778

0.005

Figure 11. Neighbor-joining tree based on the complete rDNA sequence (Fig. 11 A) and

the complete ITS1-5.8S-ITS2 region (Fig. 11B) of 18 Geotrichum candidum strains.

Bootstrap values are shown next to the nodes. Geotrichum klebahnii FJ838778 was used as

outgroup in Figure 1 IB.

67

4.6.2 Analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region

The ITS1-5.8S-ITS2 regions in strains LMA-15, LMA-48, LMA-74, and LMA-1025 were

amplified and cloned to study the dual peaks. No dual peak was observed with LMA-15

when the rDNA PCR fragment was sequenced without cloning. LMA-48, LMA-74, and

LMA-1025 were selected to confirm the presence of multiple rDNA copy variants within

individual strains. Fifteen to 19 clones were randomly selected and analyzed for each strain.

The sequences of the clones confirmed the presence of multiple rDNA copy variants in

each genome as well as the polymorphisms at the positions previously identified as dual

peaks. In addition, some clones harbor one of the nucleotides corresponding to the peak

while others harbor the other (Table 11).

Cloning ITS1-5.8S-ITS2 also revealed the presence of several previously unknown

polymorphic sites, even in LMA-15, which was not known to possess polymorphisms. The

new discovered polymorphic sites increased the number of known sites detected up from 26

to 48 (Table 11). Of the 68 sequenced clones, 32 variants of the ITS1-5.8S-ITS2 region

were identified. At least four partial rDNA sequences are known for LMA-15, but type V2

sequences predominate, and have been cloned 12 times. V2 corresponds to the sequence

initially obtained from the sequencing of the PCR amplicons without cloning. Its

predominance might explain why no dual peaks were observed after direct sequencing.

LMA-48 and LMA-74 shared two variant sequences, V5 and VI5, which are identical, and

V6 and VI9, which are also identical. Forty-eight sites with polymorphisms were detected

in ITS1-5.8S-ITS2, mainly in the ITS1 region (Fig. 10, Table 11).

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70

A single indel polymorphism was also detected at position 1825 of ITS 1 (Tables 10 and

11). A nucleotide was missing in 27 of the 68 clones. The indel was not detected in strains

LMA-48, LMA-74, and LMA-1025 prior to cloning. These results suggest that the genome

of each strain contains multiples copies of rDNA operon that vary in sequence and length.

4.6.3 Analysis of the 18S region

The complete rDNA 18S region, which is delimited by the NS1 and ITS1 universal

primers, is 1751 bp in length. Multiple alignments of the 18 complete sequences obtained

in the present study and 36 partial sequences from public databases suggest that all the

strains belong to group 1 of Ueda-Nishimura and Mikata (2000) revised by de Hoog and

Smith (2004), which includes dairy G. candidum (Fig. 12). Despite the fact that the 18S

rDNA sequence is highly conserved in G. candidum strains, 13 polymorphic sites were

identified in 18S (Fig. 10, Table 10). As with the ITS1-5.8S-ITS2 region, dual peaks were

also detected with 18S, suggesting the presence of intragenomic polymorphisms. To make

sure that our genomic rDNA samples were not contaminated with mitochondrial rDNA, we

performed a mitochondrial rDNA sequence comparison by BLAST similarity searches of

the GenBank database (EU429454 and EU429453 (Sulo et al. 2009)) (data not shown).

Since no significant homology was found, the possibility that the genomic rDNA was

contaminated with mitochondrial rDNA was ruled out.

71

Group 1

99 58

LMA-48 Galactomyces geotrichum - X69842 LMA-40 LMA-15 LMA-76 LMA-38 LMA-28 LMA-77 LMA-1026 LMA-73 LMA-20 LMA-1024 LMA-1025 LMA-75 LMA-436 LMA-34 LMA-37 LMA-39 LMA-74 Galactomyces geotrichum - AB000647

as1 Galactomyces geotrichum - U00974 - Galactomyces reessil - AB000646

Jjj)_l Galactomyces citri-aurantii - AB000665 lav Galactomyces citri-aurantii - AB000664

Dipodascus aggregatus - AB000645 Dipodascus armillariae - AB000639 Dipodascus macrosporus - AB000640

731- Geotrichum klebahnii - AB000641 1001—Candida intermedia -JCM 1607-AB013571

' Clavispora Kisitaniae - M55526 Pichia membranifaciens - X58055

100

99, Candida albicans - AB013586 «H Candida albicans - X53497 Ï Candida albicans-AF114470

— Candida dubliniensis - X99399 Candida parapsilosis - AB013588

«el- Candida parapsilosis - AY055855 Hanseniaspora uvarum - X69844

100 r Geotrichum fragrans - AB000656

100, Candida glabrata - AY046237 ~~L- Candida glabrata - AB094140

- Saccharomyces yakushimaensis - AB016514 Saccharomyces naganishii - AB016512 Saccharomyces cerevisiae - AF548094 Saccharomyces bayanus - AB094139

>-| Saccharomyces paradoxus - X97806 00 Saccharomyces cerevisiae - AY218888

Saccharomyces pastorianus - X97805

Saccharomycetales

Dipodascus magnusii - AB000653 — Dipodascus ingens - JCM 9471 -AB018130

93 ; Dipodascus spiclf er - AB000649 1 Geotrichum clavatum - AB000655

TOIj Dipodascus capitatus - AB083080 s Dipodascus capitatus - AB083079

Group 2

Figure 12. Comparison of 18S rDNA generated with the de Hoog and Smith's

classification (2004). The 18S neighbor-joining tree is based on 36 near-complete

sequences available from GenBank and 18 complete sequences from the

Geotrichum candidum strains determined in the present study. Bootstrap values are shown

next to the nodes. The strains of group 2 were used as an outgroup.

72

4.6.4 Analysis of the 26S region

The 26S region of G. candidum rDNA, which begins with the group 1 conserved nucleotide

sequence AACCTC (de Hoog and Smith 2004), was 3078 bp in length and had

21 polymorphic sites (Fig. 10, Table 10). Dual peaks were observed in the 26S region,

including the D1/D2 domain that is often used for phylogenetic analyses, indicating the

presence of polymorphisms (Table 10). According to the phylogenetic tree based on the

26S region, LMA-1024 and LMA-1025 were the most divergent strains (data not shown),

which is in agreement with the results of the analysis of the rDNA repeats (18S-5.8S-26S)

(Fig. 11 A).

4.7 Discussion

The complete rDNA sequence analysis of 18 G. candidum strains and the cloning of the

ITS1-5.8S-ITS2 region of four strains revealed the presence of multiple intragenomic

rDNA copies that vary in sequence and length with a frequency that is unusual for fungi. In

the present study, we identified 32 different nuclear ITS1-5.8S-ITS2 variants among the

68 clones studied. Each strain harbored four to twelve rDNA variants. This number was

probably an underestimation given the number of clones analyzed and variants identified.

The frequency of these polymorphisms and their specific location indicated that they were

not generated randomly by the Taq polymerase during the PCR sequence analysis, as

suggested by some investigators (Clapp et al. 1999; Hijri et al. 1999; Krâlovâ-Hromadovâ

et al. 2010; Lafranco et al. 1999). Similar intraspecies and intragenomic heterogeneities

involving the ITS region have been documented in other fungal species (Hijri et al. 1999;

mlansa et al. 2002; Kageyama et al. 2007; Korabecna et al. 2003; Naumova et al. 2010;

Nilsson et al. 2008; Pannecouque and Hôfte 2009), plants (Poczai and Hyvônen 2010) and

in other organisms as diverse as insects, animals, tapeworms, mollusks, and crustaceans

(Gandolfi et al. 2001; Kageyama et al. 2007; Krâlovâ-Hromadovâ et al. 2010;

Pannecouque and Hôfte 2009; Vierna et al. 2009). Nilsson et al. (2008) reported that the

frequency of ITS intraspecies variability in the Ascomycota phylum, which includes

G. candidum, was 1.96%.

73

No polymorphic sites were detected downstream from the indel position (nucleotide 1825,

Table 11) in the ITS1 region by direct sequencing, suggesting that 5.8S and ITS2 are more

conserved than ITS1 (Poczai and Hyvônen 2010). It has been suggested that ITS2 is more

strictly conserved because it is important for ribosome formation (Poczai and Hyvônen

2010). However, according to Nilsson et al. (2008), the hypothesis that ITS1 is more

variable than ITS2 in fungi cannot be generalized. A comparison of the ITS1-5.8S-ITS2

regions from 4185 species in the International Nucleotide Sequence Database revealed that

34% of the fungi had a more variable ITS2 region. Even if ITS2 is highly conserved and is

occasionally used to identify yeasts (Garner et al. 2010), the use of this region is not

recommended as a phylogenetic marker since it can group distantly related species together

(Mullineux and Hausner 2009).

rDNA has several properties that make it a commonly used phylogenetic marker. It has the

same function in all organisms, is moderately repeated, and is composed of tandemly

repeated transcription unit structures with variable levels of conservation depending on the

region (Eickbush and Eickbush 2007; Hillis and Dixon 1991). The use of rDNA for

phylogenetic inferences is based on the fact that while rDNA sequences vary between

species, the mechanism of concerted evolution homogenizes all the copies within a given

species (Eickbush and Eickbush 2007; Hillis and Dixon 1991; Poczai and Hyvônen 2010).

Our results showed that this mechanism does not operate efficiently in G. candidum since

we detected intraspecies and intragenomic rDNA polymorphisms. Poczai and Hyvônen

(2010) suggested that some rDNA copies might be nonfunctional pseudogenes. Nilsson et

al. (2008) showed that ITS heterogeneity is not evenly distributed in the fungi kingdom.

Williams et al. warned that intraspecies variations in rRNA-encoding genes may overlap

interspecies variations (1988). ITS, which was proposed to generally evolve faster than 18S

or 26S, can be used to study the relatedness of close species and is the most common

molecular marker used for species identifications and phylogenetic inferences in

mycological research (Hillis and Dixon 1991; Nilsson et al. 2008; Poczai and Hyvônen

2010). An exception was found in some Basidiomycetes fungi such in the Filobasidiales

and Trichosporonales lineages (Scorzetti et al. 2002). While the intragenomic variability in

74

ITS as well as in SSU and LSU in some species has been reported on a number of

occasions, these results have been overlooked (Lachance et al. 2003; Nilsson et al. 2008).

The use of ITS1-5.8S-ITS2 could induce bias into species affiliation if only a few ITS

variants caused by intragenomic polymorphisms are analyzed (Gandolfi et al. 2001). This

is important in the context of the barcoding projects that are attempting to standardize

phylogenetic inferences of fungi using ITS as a molecular marker. Nilsson et al. (2008)

attempted to determine the strength of ITS as a phylogenetic marker, but they excluded

sequences with ambiguous sites exceeding 1% (likely the result of dual peaks similar to

those observed in the present study), indicating that they did not take intragenomic

variability into consideration. Using our data, a phylogenetic tree based on the 32 ITS

variants showed that isolates with clustered sequences do not necessarily belong to the

same strain, which is in agreement with the results reported by Lafranco et al. (1999).

A Mycological Society of America workshop recommended that the ITS region be used for

fungal barcoding (Rossman 2007). However, our results raise doubts about the suitability

of fungal barcoding based mainly on the ITS region (Nilsson et al. 2008; Rossman 2007;

Will et al. 2005). Given that the ITS region might be problematic in some species, it has

also been suggested that the ITS region be used as a first step and that a second region be

used, as warranted (Mullineux and Hausner 2009; Rossman 2007). Other authors, who also

reported that ITS is not sufficient in some cases to determine species affiliation, proposed a

multigene approach (Cai et al. 2006). However, the ITS region seems to be the most

appropriate molecular marker for preliminary fungal identifications (Nilsson et al. 2008).

Our results showed that an analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region is a good approach for

exploring genetic diversity within the G. candidum species as well as within a given strain.

The idea that heterogeneity in the ITS region might hide widespread heterogeneity in the

entire rDNA sequence has been expressed by several investigators (Clapp et al. 1999,2001;

Lafranco et al. 1999). To our knowledge, we are the first to report intraspecies and

intragenomic polymorphisms in the rDNA operon of G. candidum species, which confirms

this possibility. While a rigorous approach is required when using ITS region as

phylogenetic marker, the high rate of intraspecies and intragenomic polymorphisms could

75

be helpful in differentiating G. candidum strains. An analysis of ITS1-5.8S-ITS2 was just

as effective at differentiating 18 strains as an analysis of the entire 18S-5.8S-26S region.

The ITS region could thus be used as a molecular marker to rapidly determine the genetic

diversity of G. candidum strains by PCR amplification using the ITS 1 and ITS4 universal

primers. This region provides as much information as the entire 18S-5.8S-26S region and is

more convenient to generate and analyze.

The G. candidum strains studied in our study had at least eight polymorphic sites in the

D1/D2 region (588 pb) of LSU. The LSU or D1/D2 region is often used for yeast

identifications and phylogenetic inferences. According to Kurtzman and Robnett (1998),

ascomycetous yeasts that differ by more than 1% in their D1/D2 regions should be

considered as different species. However, given the intragenomic variability that results in

multiple copies of the rRNA 26S-encoding gene with different sequences in G. candidum,

it is not easy to determine the percentage of identity between two strains of G. candidum,

making it difficult to use this threshold for species differentiation. Conspecificity

establishment of two strains based on D1/D2 26S identity might thus not be applicable to

G. candidum and its relatives.

Intragenomic variability in the SSU, ITS, and LSU regions may also result in

misinterpretations when using community profiling techniques based on rRNA-encoding

genes are used such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), temporal

temperature gradient gel electrophoresis (TTGE), automated ribosomal intergenic spacer

analysis (ARISA), PCR-single-strand conformational polymorphisms (PCR-SSCP), or

terminal restriction fragment length polymorphisms (T-RFLP) (Arteau et al. 2010; Hijri et

al. 1999; Pannecouque and Hôfte 2009). All these techniques rely on a stable DNA

sequence that is homogeneous among all members of a given species. With community

profiling techniques, polymorphisms and intragenomic variability could generate artifacts

in that could be misinterpreted. A striking example is provided by the analysis of rDNA

polymorphisms in strains LMA-40 and LMA-73. These two strains were obtained from

different source, but correspond to strain UCMA-91 (Table 8). Sequence analyses of the

76

26S region (positions 2492 and 3996) revealed polymorphisms in LMA-40 that were not

detected in LMA-73, suggesting that strain history can affect the results of rDNA analyses.

rDNA analyses (mainly of the ITS1 region and the D1/D2 domain) may give rise to

alternative interpretations of phylogenetic inference results given the intragenomic rDNA

polymorphisms in G. candidum and several other species. A more exhaustive investigation

of the mechanisms underlying concerted evolution is still required. For some species,

including G candidum, rDNA regions should be used with caution, and their nuclear

genetic structures should be explored before using them as phylogenetic markers. However,

the heterogeneity of the rDNA could be used to investigate the mechanisms of concerted

evolution (Poczai and Hyvônen 2010).

4.8 Acknowledgments

This work was supported by a Discovery grant from the Natural Sciences and Engineering

Research Council of Canada (NSERC) and a grant from the Fonds de recherche sur la

nature et les technologies du Québec (FQRNT).

77

Chapitre 5- Diversité génétique des souches de G candidum d'origine laitière mise en évidence par Multilocus Sequence Typing

5.1 Résumé

Le premier schéma de Multilocus Sequence Typing (MLST) basé sur les polymorphismes nucléotidiques de six fragments de gènes domestiques a été développé pour le génotypage de Geotrichum candidum. Pour la première fois, les séquences complètes des gènes domestiques ALA\, CDC19, GLN4, ERGIO, PGI\ et PGM2 ont été déterminés pour 18 isolats. Les six régions présentant le plus la même discrimination que les séquences complètes des gènes domestiques ont été déterminées chez 22 souches/isolats supplémentaires. Sur 3009 nucleotides analysés, 58 sites polymorphiques ont été indexés. Les souches/isolats se sont répartis entre 17 séquences types, dix d'entre elles représentées par une souche unique. Les analyses des loci concaténés et de la région ITS1-5.8S-ITS2 de l'ADNr ont révélé un groupe de quatre souches/isolats phylogénétiquement isolé. La reproductibilité et la portabilité du MLST ont été comparées à l'amplification aléatoire des microsatellites par PCR (RAM-PCR), une méthode de profilage sur gel proposée pour le typage des souches de G. candidum. Nos résultats ont montré que le génotypage par MLST est plus discriminant et a l'avantage d'offrir un langage unique, sans équivoque.

5.2 Avant propos

5.2.1 La contribution des auteurs

J'ai réalisé l'ensemble du travail expérimental décrit dans l'article scientifique présenté dans ce chapitre. Dr Michel Frenette a cosupervisé le travail et a contribué à la rédaction du manuscrit. Le Dr Steve Labrie a supervisé le travail et a participé activement à l'écriture de l'article.

78

5.2.2 Publication et communications associées à ce chapitre

Alper, I, M. Frenette et S. Labrie. 2012. Genetic diversity of dairy Geotrichum candidum

strains revealed by Multilocus Sequence Typing. Applied Microbiology and Biotechnology.

Les principaux résultats décrits dans cet article ont été présentés sous forme de posters

intitulés « Development of a novel multilocus sequence typing (MLST) scheme for

diversity analysis of Geotrichum candidum strains » et « Phylogenetic challenges in

Geotrichum candidum. » respectivement lors des sommets mondiaux laitiers de la

Fédération Internationale du Lait (FIL-IDF) qui se sont tenus à Auckland (Nouvelle-

Zélande) en 2010 et à Parme (Italie) en 2011.

5.3 Abstract

The introduction of multilocus sequence typing (MLST) for strain characterization

provided the first sequence-based approach for genotyping many fungi, leading to

reproducible, reliable, and exchangeable data. A MLST scheme based on the analysis of six

housekeeping genes was developed for genotyping Geotrichum candidum. The scheme was

first developed using 18 isolates for which the complete sequences of the alanyl-tRNA

synthetase (ALA1), pyruvate kinase (CDC19), acetyl-coA acétyltransférase (ERG10),

glutaminyl-tRNA synthase (GLN4), phosphoglucoisomerase (PGI1), and

phosphoglucomutase (PGM2) housekeeping genes were determined. Multiple sequence

alignments of these genes were used to define a set of loci showing, as closely as possible,

the same phylogenetic resolution level as complete gene sequences. This scheme was

subsequently validated with 22 additional isolates from dairy and non-dairy sources.

Overall, 58 polymorphic sites were indexed among 3,009 nucleotides analyzed. Depending

on the loci, four to eight alleles were detected, generating 17 different sequence types, of

which ten were represented by a single strain. MLST analysis suggested a predominantly

clonal population for the 40 G. candidum isolates. Phylogenetic analysis of the

concatenated sequences revealed a distantly related group of four isolates. Interestingly,

this group diverged with respect to internal transcribed spacers 1 (ITS1), 5.8S, and ITS2

79

analysis. The reproducibility of the MLST approach was compared to random amplification

of microsatellites by PCR (RAM-PCR), a gel profiling method previously proposed for

G. candidum strain typing. Our results found MLST differentiation to be more efficient

than RAM-PCR, and MLST also offered a non-ambiguous, unique language, permitting

data exchange and evolutionary inference.

5.4 Introduction

Geotrichum candidum is a ubiquitous yeast commonly inoculated on surface-ripened

cheeses for its contribution to the ripening process and flavor formation. In the cheese rind,

the proteolytic, aminopeptidasic, and lipolytic activities of G. candidum generate several

flavor compounds and reduce bitterness (Boutrou and Guéguen 2005; Boutrou et al. 2006;

Jollivet et al. 1994; Sacristan et al. 2011). Moreover, G. candidum helps to alkalinize the

cheese surface through lactate catabolism and the release of ammonia (Boutrou and

Guéguen 2005; Marcellino et al. 2001). This promotes the development of an acid-sensitive

microflora on the cheese surface, an essential step in the global ripening process (Boutrou

and Guéguen 2005). In addition to the strains intentionally inoculated during the

cheesemaking process, adventitious G. candidum strains can develop in the cheese (Lavoie

etal. 2011).

G. candidum strains show several strain-dependent characteristics including dimorphic

colonial morphotypes (from the creamy-colored yeast-like form), different metabolic

pathways, the cheese covering ability, and salt tolerance (Boutrou and Guéguen 2005;

Boutrou et al. 2006; Guéguen and Jacquet 1982; Sacristan et al. 2011). Moreover, recent

studies identified genomic heterogeneity within the G. candidum species. Karyotype

analysis demonstrated a range of five to eight chromosomes per strain (Gente et al. 2002a).

A recent analysis of the complete ribosomal DNA of 18 strains also revealed intra-species

and intra-strain polymorphisms (Alper et al. 2011). The level of this genomic plasticity has

not been clearly elucidated but, added to the morphotypic diversity, emphasizes the need

for the development of robust tools for strain differentiation using phylogenetic analysis.

80

Differentiating G. candidum strains is of utmost importance for the tracking of commercial

strains protected under license, the selection and monitoring of commercial cultures

selected for cheese ripening, the identification of new promising candidates from natural

microflora, and the formulation of new cheese ripening cultures. Conventional

identification methods based on morphotypes and phenotypes might be of interest to

estimate the usefulness of the strain in cheesemaking, but they must be coupled with

complementary approaches, allowing the analysis of genetic relationships between strains,

in order to deliver the robustness expected by the modern cheesemaking-related scientific

community (Belén Flôrez et al. 2007; Lopandic et al. 2006; Prillinger et al. 1999).

Multilocus sequence typing (MLST) schemes were shown to be useful in the discrimination

of several bacterial and yeast species at the strain level. Originally, this typing method was

developed for clinical and epidemiological applications (Bougnoux et al. 2002; Bougnoux

et al. 2003; Bougnoux et al. 2004; Dodgson et al. 2003; Jacobsen et al. 2007; Maiden et al.

1998; Tavanti et al. 2003), but now MLST is applied to differentiate probiotics, bacteria,

and yeasts of dairy and enological interest (Bilhère et al. 2009; de las Rivas et al. 2004; de

las Rivas et al. 2006; Delétoile et al. 2010; Diancourt et al. 2007; Lavoie et al. 2011;

Muhoz et al. 2009; Taïbi et al. 2010; Tanigawa and Watanabe 2011). MLST generates

unique, unambiguous, and reproducible raw nucleotide data using methods that are portable

and reliable, facilitating the comparison of genotypes (Bougnoux et al. 2002; Bougnoux et

al. 2004; Maiden et al. 1998). Applying MLST to G. candidum strains should lead to better

management of culture collections with considerable genetic diversity, better strain tracking

capability, and reliable identification of new G. candidum strains.

The first objective of this study was to develop the first MLST scheme using 18

G. candidum isolates of dairy and non-dairy origin by targeting six new housekeeping

genes and to apply the MLST scheme to 22 additional isolates. The second objective was to

assess the discriminatory resolution and the reproducibility of MLST with a RAM PCR

method that was recently proposed to distinguish strains of G. candidum by analyzing

length polymorphisms between microsatellites (Gente et al. 2002a; Gente et al. 2006).

81

5.5 Materials and methods

5.5.1 Biological material, culture conditions and genomic DNA

extractions

A total of 40 G. candidum isolates from diverse origins, but predominantly from dairy

sources, were used in this study (Table 12). Isolates from cheeses were all originating from

different cheese types, except LMA 40 and LMA 73 which were expected to be identical

but were obtained from two different sources. Isolates from milk sampled by Lavoie et al.

(2011) were originating from three different milk processing plants. Industrial strains were

kindly provided by three different companies. They were expected to be different from each

other, but their technological properties were not specified. G. candidum growth and

storage were performed as described previously (Alper et al. 2011). Total DNA extractions

were performed as described in Al-Samarrai and Schmid (2000).

5.5.2 Ribosomal DNA operon and ITS1-5.8S-ITS2 sequencing

The complete ribosomal DNA (rDNA) sequences were previously determined for isolates

listed in bold in Table 12 (accession numbers JF262180 to JF262197 (Alper et al. 2011).

Using the same approach, complete rDNA was sequenced for G. candidum LMA 21 and

LMA 70, and the sequences are available under accession numbers JQ668739 and

JQ668740. For the 20 other isolates listed in Table 12, universal primer pair ITS1/ITS4 was

used for Internal Transcribed Spacer 1 (ITS1), 5.8S, and ITS2 amplification and sequencing

as previously described (Alper et al. 2011). These sequences are available under accession

numbers from JQ668719 to JQ668738.

82

Table 12. Origins of G. candidum strains and isolates typed using MLST.

Strains and isolates* Origin* Reference

LMA-15 Mold-ripened cheese from Quebec

LMA-20 Mold-ripened cheese from Quebec

LMA-21 Clotted carrot, ATCC-34614

LMA-28 Mold-ripened cheese from Quebec

LMA-34 Mold-ripened cheese from Spain

LMA-37 Smear cheese from France

LMA-38 Mold-ripened cheese from France

LMA-39 Smear cheese from France

LMA-40 Smear cheese from France, ATCC-204307

LMA-48 Bioreactor contaminant

LMA-70 Smear cheese from Quebec

LMA-73 Smear cheese from France (UCMA-91, ATCC-204307)

LMA-74 Grass (UCMA-291)

LMA-75 Corn silage (UCMA293)

LMA-76 Milk (UCMA-302)

LMA-77 Milk (UCMA 760 = CBS 110.12)

LMA-244 Milk - MPP 1, Province of Quebec, Canada

LMA-317 Biological Milk - MPP 2, Province of Quebec, Canada

LMA-436 Industrial strains - Company A

LMA-562 Milk - MPP 1, Province of Quebec, Canada

LMA-563 Milk - MPP 1, Province of Quebec, Canada

LMA-645 Smear cheese from Quebec

LMA-655 Mold-ripened cheese from Quebec

LMA-664 Milk - MPP 1, Province of Quebec, Canada

LMA-690 Milk - MPP 3, Province of Quebec, Canada

LMA-1024 Industrial strains - Company B

LMA-1025 Industrial strains - Company B

LMA-1026 Industrial strains - Company B

LMA-1028 Industrial strains - Company C

LMA-1031 Industrial strains - Company A

LMA-1032 Industrial strains - Company A

LMA-1033 Industrial strains - Company A

Alper etal. (2011)

Alper etal. (2011)

Guéguen and Jacquet (1982)

Alper etal. (2011)

Alper etal. (2011)

Alper etal. (2011)

Alper etal. (2011)

Alper etal. (2011)

Dieuleveux et al. (1997)

Alper etal. (2011)

Alper etal. (2011)

Gente et al. (2002a; 2002b; 2006)

Gente et al. (2002a; 2002b; 2006)

Gente et al. (2002a; 2002b; 2006)

Gente et al. (2002b; 2006)

Gente et al. (2002a; 2002b; 2006)

Lavoie etal. (2011)

Lavoie etal. (2011)

Alper etal. (2011)

Lavoie etal. (2011)

Lavoie etal. (2011)

Lavoie etal. (2011)

Lavoie etal. (2011)

Lavoie etal. (2011)

Lavoie etal. (2011)

Alper etal. (2011)

Alper etal. (2011)

Alper etal. (2011)

This study

This study

This study

This study

83

LMA-1034 Industrial strains - Company A This study

LMA-1035 Industrial strains - Company A This study

LMA-1036 Industrial strains - Company A This study

LMA-1037 Industrial strains - Company A This study

LMA-1038 Industrial strains - Company A This study

LMA-1039 Industrial strains - Company A This study

LMA-1040 Industrial strains - Company A This study

LMA-1041 Industrial strains - Company A This study

The 18 strains and isolates in bold were selected for RAM-PCR profiling and MLST scheme development. The 22 other strains were used for validating the MLST scheme. LMA Laboratoire de Mycologie Alimentaire, ATCC American Type Culture Collection, CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures, UCMA Université de Caen laboratoire de Microbiologie Alimentaire (Caen, France), MPP milk processing plant.

5.5.3 Phenotypic tests

The API 20C AUX (Biomerieux, Marcy l'Etoile, France) was used as recommended by the

manufacturer as a phenotypic method to confirm the species affiliation obtained from ITS1

5.8S ITS2 analysis.

5.5.4 RAM-PCR profile

RAM-PCR was performed as described previously by Gente et al. (2006) using primers

(CGA)5, (GGAT)4, (GACA)4, and (GATA)4 for the reference strains and isolates listed in

bold in Table 12. MasterCycler EP apparatus (Eppendorf, Hamburg, Germany).

Gel loading was optimized to 15 ul of fresh PCR products on a 2%(w/v) agarose gel rather

than the 35-ul volume recommended by Gente et al. (2006). This volume produced the best

thin and distinguishable band pattern for visualization. Migration was performed for 2 h at

100 V; the gel was stained with ethidium bromide and visualized under UV light. Gel

images were processed with GelCompare II v.6.5 software (AppliedMaths, Austin, TX,

USA). RAMPCR analysis was repeated three times. All bands were considered, regardless

of their intensity, because electrophoretic profiles and band intensities were reproducible

(data not shown). Similarities between band patterns were determined using the Pearson

84

correlation coefficient. Profiles were clustered using an unweighted pair group method with

arithmetic mean (UPGMA).

5.5.5 COnsensus—DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers

(CODEHOP) strategy for identification of new housekeeping genes

in G. candidum

Six housekeeping genes were selected for developing the first G. candidum MLST scheme

for this species. They encode the following proteins: alanyl-tRNA synthetase (Alal),

pyruvate kinase (Cdcl9), acetyl-coA acétyltransférase (ErglO), glutaminyl-tRNA

synthetase (Gln4), phosphoglucoisomerase (Pgi 1 ), and phosphoglucomutase (Pgm2). Since

no sequences were available for these genes in G. candidum, the COnsensus-DEgenerate

Hybrid Oligonucleotide Primers (CODEHOP) approach was selected to detect and

sequence the housekeeping genes. This strategy is useful for designing PCR primers from

known sequences of orthologous genes coded by phylogenetically related organisms (Rose

et al. 2003). Protein sequences of Alal, Cdcl9, ErglO, Gln4, Pgil, and Pgm2 were

obtained from GenBank for Candida albicans, Candida glabrata, Yarrowia lipolytica,

Saccharomyces cerevisiae, and Sehizosaccharomyces pombe, which are phylogenetically

closely related to G. candidum species. Accession numbers are listed in Table 13. Each

protein sequence set was aligned using the BlockMaker program to generate CODEHOP

primers, consisting of a 5' clamp region identical to the consensus region and a short 3'

degenerated region (Rose et al. 2003). Primers with a degeneracy level between 16- and

eightfold were selected even if 16-fold was preferred (Rose et al. 2003). PCR reactions

using CODEHOP primers were performed with strain LMA-40 in 50 uL containing 30 ng

of genomic DNA, 1.25 U of Taq DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA,

USA), 10 nmol of each dNTP (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), 50 pmol of

each primer (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) and Taq Polymerase buffer, as

recommended by the supplier (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). A PTC-200MJ

Research thermal cycler (Watertown, MA, USA) was programmed for touchdown PCR to

increase amplification specificity and sensitivity (Korbie and Mattick 2008). PCR reactions

were performed as follows: initial dénaturation step of 2 min at 94 °C, followed by 10

85

cycles (dénaturation 25 s at 94 °C, annealing 30 s at 5 8 ^ 8 °C and extension 3 min at 72

°C; the initial annealing temperature of 58 °C was reduced by 1 °C after each cycle to reach

48 °C for the final cycle), followed by 25 cycles (dénaturation 25 s at 94 °C, annealing 30 s

at 48 °C and extension 3 min at 72 °C) and a final extension step of 5 min at 72 °C. PCR

products were visualized by electrophoresis on 0.8 % agarose gel, stained with ethidium

bromide, and illuminated under UV light. For all primer sets, a single band was obtained.

PCR fragments were sequenced using an Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130XL

from the Plateforme d'analyse génomique, Université Laval, Québec, (Canada).

Table 13. Characteristics of Geotrichum candidum (LMA-40) housekeeping genes and

their encoded proteins compared to those of phylogenetically related yeast species.

G. candidum C. albicans C. glabrata K lipolytica SL cerevisiae S. pombe ALA 1 2940 bp 2910 bp 2871 bp 2883 bp 2877 bp 2880 bp

XP 718082.1 XP 445923.1 XP 500483.1 EDN63655.1 NP 593640.1 (82%) (78%) (84%) (79%) (76%)

CDC19 1545 bp 1515 bp 1527bp 1548 bp 1500 bp 1530bp XP 714997.1 XP 445932.1 XP 505195.2 CAA24631.1 NP 594346.1 (87%) (84%) (89%) (84%) (79%)

ERG\0 1209 bp 1209bp 1197bp 1179 bp 1197 bp 1188 bp XP 710124.1 XP 449306.1 XP 500646.1 NP 015297.1 NP 596686.1 (79%) (77%) (84%) (78%) (75%)

GLN4 2421 bp 2400 bp 2388 bp 2382 bp 2430 bp 2436 bp XP 720356.1 XP 448972.1 XP 501409.1 EDN64028.1 NP 596745.1 (72%) (73%) (78%) (74%) (69%)

PGIl 1659 bp 1653 bp 1668 bp 1668 bp 1665 bp 1653 bp XP 713554.1 XP 447033.1 XP 505131.1 NP 009755.1 NP 596635.1 (87%) (90%) (86%) (89%) (80%)

PGM1 1671 bp 1683 bp 1704 bp 1650 bp 1710 bp 1665 bp XP 715772.1 XP 448546.1 XP 503444.1 EDN64491.1 NP 596153.1 (82%) (79%) (86%) (79%) (78%)

Numbers in parenthesis correspond to the similarity percentage obtained with Blastx sequence analysis of NCBI. For ERG\Q, gene length is 1382 bp but the coding sequence is 1209 bp when intron are not considered.

86

5.5.6 Genome walking strategy and complete gene sequence

determination

Sequences obtained after the CODEHOP strategy were extended using a genome walking

strategy (Clontech genomewalker universal kit, Mountain View, CA, USA) as

recommended by the manufacturer. Complete housekeeping gene sequences were first

obtained for LMA-40 using this method. Based on the LMA-40 sequences, PCR reactions

were performed and the products sequenced to determine the complete gene sequences for

the 18 isolates listed in bold in Table 12. PCR reactions were performed as described for

the CODEHOP PCR reactions including the touchdown PCR program described

previously. For all isolates, a single band was obtained.

5.5.7 Rapid amplification of cDNA ends (RACE) for coding sequence

integrity confirmation

The primers for rapid amplification of cDNA ends (RACE) analysis were designed based

on the putative coding sequences of the housekeeping genes. The first-strand cDNA was

prepared from LMA-40 total RNA isolated using a RNAqueous kit (Ambion, Austin, TX,

USA). RACE was performed using the SMARTer RACE cDNA Amplification Kit

(Clontech, Mountain View, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. PCR

products were purified using a Wizard SV Gel and the PCR Clean Up kit (Promega,

Madison, WI, USA) and sequenced as described before. For genes ALA1, CDC19, ERG10,

GLN4, PGI1, and PGM2, the presence of exons and introns was determined based on the

mRNA alignment and the corresponding genomic sequences. All sequences were deposited

in GenBank under accession numbers from JQ668759 to JQ668776 for ALA1, JQ668665 to

JQ668682 for CDC19, JQ668683 to JQ668700 for GLN4, JQ682880 to JQ682897 for

ERG10, JQ682898 to JQ682915 for ERG10 coding sequences, JQ668741 to JQ668758 for

PGI1, and JQ668701 to JQ668718 for PGM2.

87

5.5.8 MLST loci selection

Based on exonic regions, a set of six loci was chosen for their capacity to differentiate the

isolates with the same resolution and efficiency achieved using the complete sequences of

the housekeeping genes. Six specific primer pairs (Table 14) were designed for the MLST

scheme, leading to the amplification and sequencing of fragments ranging from 350- to

650-bp regions, depending on the locus. PCR reactions and sequencing procedures were

performed using the same conditions described previously, including the touchdown PCR

program. The nucleotide sequences were deposited in GenBank under accession numbers

from JQ668937 to JQ668976 for alal, JQ668977 to JQ669016 for cdcl9, JQ668777 to

JQ668816 for erglO, JQ668817 to JQ668856 for gln4, JQ668857 to JQ668896 for pgil,

and JQ668897 to JQ668936 forpgm2.

5.5.9 MLST data treatment and bioinformatical analysis

Contig assemblies and multiple sequence alignments were performed using MEGA4

(Tamura et al. 2007). Evolutionary histories were inferred using the neighbor-joining

method with bootstrap test of 1,000 replicates. The evolutionary distances were computed

using the maximum composite likelihood method (Tamura et al. 2007). The number of

polymorphic sites, the dN/dS ratio (dN is the number of non-synonymous substitutions per

non-synonymous site and dS is the number of synonymous substitutions per synonymous

site), and the average number of nucleotide difference between populations were

determined using DNAsp software version 5.10 (Librado and Rozas 2009). Allelic profiles

of each locus were determined based on the analysis of nucleotide polymorphisms. A

unique number was attributed to each distinct allele sequence for each locus. Each unique

combination of six loci numbers was used to determine the sequence type (ST) of each

strain. The same ST was used for isolates sharing the same allelic profiles. The index of

association was calculated to determine the disequilibrium linkage degree between alleles

using START 2 (Jolley et al. 2001). Splitgraphs were generated using the Splits Tree

software version 4 in order to assess the degree of tree-like structure present in the

genotypes found for each locus (Huson and Bryant 2006).

X X

v.

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CJ

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m SJ>

C3 C

£ Z

89

5.6 Résultats

5.6.1 Identification of G. candidum isolates

The nucleotide sequence of the ITS1-5.8S-ITS2 region of isolates listed in bold Table 12

was determined and analyzed in combination with those previously published (Alper et al.

2011), including the data of de Hoog and Smith (2004) (Fig. 13). Phylogenetic analysis

revealed the existence of two groups: group A, containing LMA-21 (ATCC collection

strain), LMA-70, LMA-244, and LMA-103 5 (industrial commercialized strain), which is

related to the isolates of group B, supported by a bootstrap value of 86 %. In order to

confirm their species affiliation, LMA-21, LMA-70, LMA-244, and LMA-1035 were

submitted to miniaturized assimilation tests of API 20C AUX. The results were identical to

those obtained for LMA-40 and LMA-76, namely assimilation of D-glucose, glycerol,

D-xylose, D-galactose, and D-sorbitol and non-assimilation of calcium 2-keto-gluconate,

L-arabinose, adonitol, xylitol, methyl-aD-glucopyranoside, N-acetyl-glucosamine,

D-cellobiose, D-lactose, D-maltose, D-saccharose, D-trehalose, D-melezitose, and

D-raffinose, suggesting that these four isolates were correctly affiliated with G. candidum.

90

86

29

9 7 «

33

21

7±T'

48

LMA-21 LMA-70 LMA-244 LMA-1035

LMA-15 LMA-20 LMA-28 LMA-34 LMA-37 LMA-38 LMA-39 LMA-40 LMA-48 LMA-73 LMA-74 LMA-75 LMA-76 LMA-77 LMA-317 LMA-436 LMA-562 LMA-563 LMA-645 LMA-655 LMA-664 LMA-690 LMA-1024 LMA-1025 LMA-1026 LMA-1028 LMA-1031 LMA-1032 LMA-1033 LMA-1034 LMA-1036 LMA-1037 LMA-1038 LMA-1039 LMA-1040 LMA-1041

A Y788344.1 Galactomyces geotrichum A Y788343.1 Galactomyces geotrichum

"A A Y788345.1 Galactomyces geotrichum 4}j AY788288.1 Galactomyces geotrichum

A Y788334.1 Galactomyces geotrichum ^ AY788351.1 Galactomyces geotrichum

AY788331.1 Galactomyces citri-aurantii ^\AY788295.1 Galactomyces citri-aurantii

AY788296.1 Galactomyces citri-aurantii A Y788300.1 Galactomyces geotrichum AY788297.1 Galactomyces geotrichum AY788327.1 Galactomyces geotrichum

AY788299.1 Galactomyces reessii AY788314.1 Dipodascus australiensis AY788301.1 Dipodascus geniculatus

AY788342.1 Dipodascus albidus

- A

B

43

99

16

AY788319.1 Geotrichum fermentans AY788315.1 Geotrichum fermentans AY788318.1 Geotrichum fermentans

J 87, AY788294.1 Dipodascus aggregatus H

35

84

59

AY788292.1 Dipodascus aggregatus 64j/AV788298.f Geotrichum klebahnii

P AY788335.1 Geotrichum klebahnii AY7883481 Dipodascus armillariae AY788350.1 Dipodascus armillariae AY788320.1 Geotrichum klebahnii AY788310.1 Dipodascus macrosporus AY788311.1 Dipodascus macrosporus

79, A Y788346.1 Dipodascus starmeri f" A Y788347.1 Dipodascus starmeri

,AY788303.1 Dipodascus ovetensis 94^ AY788337.1 Dipodascus ovetensis

Group 1

99 Group 2

91 Figure 13. Comparison of ITS1-5.8S-ITS2 rDNA generated with the de Hoog and Smith

(de Hoog and Smith 2004) classification. The ITS1-5.8S-ITS2 neighbor-joining tree (1000

bootstrap) is based on 32 complete sequences available from GenBank, 18 complete

sequences from the G. candidum strains determined previously in Alper et al. (2011) and

22 complete sequences from the G. candidum strains determined in this study. Bootstrap

values are shown next to the nodes. The evolutionary distances were estimated using the

Maximum Composite Likelihood (gaps were eliminated from phylogenetic analysis).

Phylogenetic analyses were conducted in MEGA4. The strains of group 2 were used as an

outgroup. Phylogenetic analysis revealed that isolates clustered in the group 1, are

distributed between two subgroups: Group A, containing LMA-21, -70, -244 and -1035

and Group B containing the other 36 strains and isolates.

5.6.2 RAM-PCR of 18 G. candidum strains

To compare the RAM-PCR profiling method designed for typing G. candidum strains with

the MLST scheme, primers (CGA)5, (GGAT)4, (GACA)4, and (GATA)4 were applied to 18

isolates from diverse origins (in bold in Table 12), including five isolates previously

discriminated with this method, LMA-73, LMA-74, LMA-75, LMA-76, and LMA-77

(Gente et al. 2002b; Gente et al. 2006). Using the conditions described in the current study,

only the (GATA)4 primer generated a discriminatory pattern (Fig. 14). A cutoff threshold of

80 % permitted to delimit eight clusters, three of them represented by a single strain

(LMA-15, LMA-76, and LMA-77). Isolates showing more than 85 % similarity were

considered identical and, consequently, it was not possible to distinguish strains LMA-74

and LMA-75.

(GATA)4 92

LMA-28 Moid-ripened cheese from Quebec LMA-39 Smear cheese from France LMA-77 Milk LMA-1026 Industrial strain LMA-34 Moid-ripened cheese from Spain LMA-37 Smear cheese from France LMA-20 Moid-ripened cheese from Quebec LMA-38 Mold-ripened cheese from France LMA-436 Industrial strain LMA-48 Bioreactor contaminant LMA-40 Smear cheese from France LMA-73 Smear cheese from France LMA-74 Grass LMA-75 Corn silage LMA-15 Mold-ripened cheese from Quebec LMA-76 Milk LMA-1024 Industrial strain LMA-1025 Industrial strain

Figure 14. Dendrogram showing the UPGMA cluster analysis of RAM-PCR profiles generated using

(GATA)4 primer, of 18 G. candidum strains (Pearson correlation). Origin of each strain is indicated

next to the strain labeling. RAM-PCR was realized according to the standardized protocol proposed by

Gente et al. (2006).

5.6.3 Characteristics of six housekeeping genes targeted for G. candidum species

For the first time, the housekeeping genes ALAl, CDC19, ERG10, GLN4, PGI\ and PGM2

were selected and completely sequenced for 18 G. candidum isolates (in bold in Table 12).

Each of the LMA-40 genes sequenced was compared to those of the closely related species

C. albicans, C. glabrata, Y. lipolytica, S. cerevisiae and S. pombe that served for the

CODEHOP (Table 13). Except for PGI1, the G. candidum proteins encoded by these

housekeeping genes showed the highest similarity with Y. lipolytica, with homologies

ranging from 78 to 89 %, followed by S. cerevisiae and C. albicans. All genes used in this

study were intron-free, except ERG 10: three exons (111, 222, and 876 bp) and two introns

93

(103 and 70 bp) were detected for each strain after comparing the genomic and mRNA

sequences. Multiple sequence alignments were carried out separately for each gene set, and

overall 63 polymorphic sites were indexed on a total of 11,445 nucleotides analyzed. No

insertion/deletion (indel) polymorphisms or heterozygosities were detected in any of the

coding sequences, but for ERG 10, two substitution polymorphisms and one indel position

were located within each intronic sequence. In addition to thegenes selected in this work,

ACC1, VPS13, ADP1, and RPN2, currently used for C. albicans MLST (Bougnoux et al.

2002), and PNP1 were also considered as possible housekeeping genes. CODEHOP

strategy did not permit targeting ADP1, PNP1, and RPN2, and CODEHOP primers for

ACC1 and VPS13 generated amplicons with multiple signals, suggesting the presence of

several copies in the genome. The presence of multiple gene copies was confirmed by

cloning and sequencing experiments (data not shown).

5.6.4 Polymorphisms in MLST loci

For each gene, several regions were evaluated for their capacity to discriminate between

G. candidum strains and to retain the same discriminative ability as the complete gene

sequence. Therefore, a phylogenetic tree based on the concatenated sequence of all

complete housekeeping gene sequences of the 18 isolates from Table 12 (in bold) was

created (Fig. 15) and compared to the trees based on the concatenated sequences of loci

(data not shown), in order to confirm the selection. The selected MLST loci ranged from

355- to 652-bp for a total of 3,009 nucleotides comprising 27 polymorphic sites, and six

primer pairs were designed (Table 14). The sequences of the loci generate a phylogenetic

tree identical to the one obtained from the concatenated sequences of complete genes.

94

LMA-75

LMA-40 LMA-73

LMA-28 ^fA

LMA-39

100 92 ^<T.L

LMA-1024' LMA-1025

LMA-20 LMA-34 LMA-37 LMA-38 LMA-426

LMA-48 LMA-74 LMA-1 C

00002 LMA-76

Figure 15. Phylogenetic tree (Neighbor-Joining) of 18 Geotrichum candidum strains based

on ALA\, CDCX9, ERGXQ, GLN4, PGI\ and PGM2 complete gene contigs. The

phylogenetic trees were constructed using the Neighbor-Joining method with 1000

bootstraps (bootstrap values are shown next to the nodes). The evolutionary distances were

estimated using the Maximum Composite Likelihood (gaps were eliminated from

phylogenetic analysis). Phylogenetic analyses were conducted in MEGA4.

95

When 22 additional isolates (Table 12) were characterized using this MLST scheme,

multiple sequence alignment revealed that the number of polymorphic sites identified in the

selected loci increased from 27 to 58, which represented 1.93 % of variable sites

(Table 14). Each unique locus sequence was presented as an allelic variant and designated

with a unique number (Fig. 16). The proportion of variable sites ranged from 0.85 % to

3.22 % (as shown in Table 14), but for each locus, except cdcl9, the number of alleles was

lower than the number of polymorphic sites indexed, leading to 0.22 to 1.2 alleles per

variable site (Table 14). The ratio of dN/dS is always lower than 1 and generally lower than

0.09.

alal 1 2 2 2 2 2 2 2 9 1 1 1 1 1 1 2 7 0 2 3 3 7 7 7 1 0 4 6 9 2 5 7

allele 1 C C C T T G C G allele 2 T T T C C A T A allele 3 T T . C C A T A allele 4 . T . C C . . . allele 5 . T

cdcl9 3 5 5 5 5 7 0 4 7 8 4 7 6 0 5 *

allele 1 allele 2 allele 3 allele4 allele 5 allele 6

AC GCC H • -H . . A . T ■. .Si . . . T T . T . . T

erglO 1 1 1 1 5 5 6 6 6 6 0 1 1 1 7 9 4 6 6 7 7 4 7 8 1 1 5 6 9 0 7 3 9 5

allele 1 A A C A A A C T T T allele 2 . C . allele3 . G T . . . A CC C allele 4 . G . G G G . CC C allele 5 C G . G G G . C C C

g/r.4 1 1 1 1 1 1 1 1 7 7 7 7 7 8 9 9 9 9 0 0 0 0 1 1 1 2 0 1 2 3 4 3 3 6 8 9 3 5 7 8 0 3 7 0 8 7 9 8 7 1 3 6 7 9 2 0 1 3 2 4 7 6

* * allele 1 A T C C C C C C T T G T T T A G T A allele 2 G C T T T . T A C C A C C C C . C G allele3 A . . allele4 G C T T T T T A C C A C C C C . CG

pg/1 6 6 7 9 9 0 1 2 7 4 9 7 2 8 8 1 1 1

* * » * allele 1 C A G T G C allele 2 . . . C A T allele 3 T T . C A T allele 4 . . T . A T

pgml 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 9 0 1 1 2 2 2 2 3 4 8 9 6 3 7 5 5 6 8 5 0 7 0 5 1 6 1 7 6 1 5 1

* allele 1 G T C C C C C C T C T allele 2 . C T . C T C allele 3 . C T T . . . . C . C allele 4 ■ c c . c allele 5 . C . . . . T . C . C allele 6 . CT C . C allele 7 A . . . T . . T C . C allele 8 . C . . . T . . C . C

Figure 16. Positions of the polymorphic sites for alleles identified for each locus. Allele 1

is presented as reference for each locus. For other alleles, only sites that differ from allele 1

are shown and position with identical nucleotide are represented by dots. Columns in grey

correspond to polymorphic sites observed when 18 strains were used for MLST scheme

development. Columns in white correspond to new polymorphic sites indexed when 22

additional strains were used for MLST scheme validation. Non-synonymous substitution

sites are identified using (*).

5.6.5 Population structure based on MLST data for 40 strains of G. candidum

Rare mutational events inherited from one generation to another accumulate in non-random

combinations in a population. They are in linkage disequilibrium owing to a predominantly

clonal population (Maiden 2006), but when sexual reproduction occurs, genetic information

is transmitted horizontally, resulting in a randomization of association of genetic variation

or linkage equilibrium (Maiden 2006). In order to test for linkage disequilibrium, the index

of association (IÀ) was performed on six loci for 40 isolates (IA=1.5244). The observed

variance was greater than the maximum variance obtained in 1,000 trials (PO.001).

Significant linkage disequilibrium was detected, which means deviation from a non-clonal

population structure (panmictic structure). Split graph analysis showed that all loci

analyzed individually formed a star-like structure (branches irradiate from a single-centered

origin; with a fit of 100 %), suggesting that recombination is not likely to play a role in the

evolution of the analyzed genes and that the descent is clonal (data not shown; de las Rivas

et al. 2004; de las Rivas et al. 2006).

5.6.6 Differentiation of G. candidum isolates using MLST

Contig nucleotide sequences were represented by the succession of allele numbers defining

the ST of each strain (Fig. 17; Table 15). The 40 isolates of G. candidum were distributed

among 17 STs, and ten STs were represented by a single strain (Fig. 17; Table 15). From

the eight isolates originating from milk, five (LMA-76, LMA-244, LMA-317, LMA-664,

96

97

LMA-690) were only representative of one ST. Moreover, LMA-244, LMA-317,

LMA-664, and LMA-690 were isolated from milk collected in Quebec dairy farms.

The G. candidum MLST scheme also distinguished some industrial G. candidum

originating from three companies and distributed them into eight different STs, two of them

represented by one strain. Interestingly, the four non-dairy strains were also the unique

representative of one ST except LMA-21 isolated from clotted carrot which grouped in the

same ST as that of LMA-70, a smear cheese isolate.

Table 15. Genotypes of the 40 Geotrichum candidum isolates tested.

Strains ST Housekeeping genes Allele Number

1 alal cdcl9 erglO gln4 PgU pgm2

LMA-15,-77,-1041 1 1 1 1 1 1 LMA-20, -34, -37, -38, -436, -1028, -1034, -1036 2 2 2 1 2 2 LMA-21,-70 3 3 3 2 2 3 LMA-28,-39, -40, -73,-1039 4 1 1 1 1 4 LMA-48 5 1 4 3 2 4 LMA-74 6 4 3 1 3 5 LMA-75 7 5 2 1 4 4 LMA-76 8 1 4 1 2 4 LMA-244 9 3 3 4 2 6 LMA-317 10 4 4 4 3 2 7 LMA-562, -563, -645, -655, -1038, -1040 11 1 1 5 1 1 4 LMA-664 12 4 4 4 1 2 4 LMA-690 13 5 6 4 1 4 7 LMA-1024,-1025,-1037 14 5 1 1 1 1 1 LMA-1026 15 1 1 5 1 2 8 LMA-1031,-1032,-1033 16 5 1 5 1 1 1 LMA-103 5 17 3 4 3 2 2 3

98

LMA-20 LMA-34 LMA-37 LMA-38 LMA-436 LMA-1028 LMA-1034' LMA-1036 70

LMA-317 LMA-690

LMA-75

Group B

LMA-76 , 52 J

LMA-28 LMA-39 V ^ 4 Î LMA-40 LMA-73 -LMA-40 LMA-73 --pi LMA-1039

6 4 / * 62

LMA-1024 LMA-1025 LMA-1037

LMA-15 LMA-77 LMA-1041

57

LMA-1031 LMA-1032 LMA-1033

Group A

LMA-562 LMA-563 LMA-645 LMA-655 LMA-1038 LMA-1040

LMA-74

LMA-1035

LMA-244

H LMA-21 LMA-70

0.0005

99

Figure 17. MLST phylogenetic tree (Neighbor-Joining) of 40 G. candidum strains based on six loci

contig alignments. The phylogenetic trees were constructed using the Neighbor-Joining method

with 1000 bootstraps (bootstrap values are shown next to the nodes). The evolutionary distances

were estimated using the Maximum Composite Likelihood (gaps were eliminated from

phylogenetic analysis). Phylogenetic analyses were conducted in MEGA4. Strains in bold are those

used to develop the MLST scheme.

5.6.7 Genotyping by RAM-PCR vs. MLST

Results showed that while RAM-PCR profiling generated five groups containing two to

five strains and isolates, MLST allowed a finer subdivision of three of these groups. The

RAM-PCR groups [LMA-40, LMA-48, LMA-73, LMA-436], [LMA-20, LMA-34,

LMA-47, LMA-38, LMA-1026], and [LMA-74, LMA-75] (Fig. 14) were subdivided,

respectively, into three, two, and two STs (Fig. 17), suggesting that the MLST scheme had

more discriminating ability than RAM-PCR.

5.6.8 Phylogeny based on MLST data for G. candidum species

The phylogenetic relatedness of isolates was analyzed with a neighbor-joining tree based

on the concatenated sequences of six loci (Fig. 17). The tree revealed that a group B,

containing ST3, ST9, and ST17, previously identified by ITS region analysis, was

genetically distant from other STs in group A. This was strongly supported by a bootstrap

value of 100 %. The average number of nucleotide difference between these two groups

calculated by DNAsp was 35.833. Table 4 revealed that ST3, ST9, and ST 17 share unique

alleles for alal, cdc!9, gln4, and pgm2.

100

5.7 Discussion

We designed the first MLST method for G. candidum that has proven to be a useful tool for

discriminating between isolates of diverse origin and focuses on dairy interests.

The G. candidum MLST consists of sequencing six carefully selected loci within the

housekeeping genes ALA1, CDC19, ERG10, GLN4, PGI1, and PGM2. The ALA1 and

GLN4 genes have already been used in MLST applications for C albicans and S. cerevisae,

but CDC19, ERG10, PGI1, and PGM2 were new gene candidates (Bougnoux et al. 2004;

Munoz et al. 2009). All loci displayed a dN/dS ratio generally lower than 0.09. This

indicates a strong purifying selection preventing amino acid changes, which is a typical

phenomenon for housekeeping genes and desired in MLST schemes (Nei and Gojobori

1986).

The complete ribosomal DNA of the 18 isolates used in our MLST method was previously

sequenced and showed 60 polymorphic sites over a length of 5,126 bp, which is unusual for

ribosomal sequences because of the concerted evolution mechanism (Alper et al. 2011).

Interestingly, compared to rDNA, the sequences of the six housekeeping genes used in this

study are more conserved. One of the most important criteria for developing a MLST

scheme is to use loci that accumulate polymorphisms neutrally. The use of internal

fragments of housekeeping genes guarantees stable discrimination of strains over recent

time and provides a highly reproducible (nearly 100 %) and portable method between

laboratories (Bougnoux et al. 2002; Cooper and Feil 2004; Maiden et al. 1998).

Interestingly, two isolates belonging to ST11 (LMA-562 and LMA-563) were isolated from

the same milk processing plant, separated by 9 months, suggesting the persistence of the

genotype over time in a given plant. When concatenated, the loci selected for MLST

represented 1.93 % of polymorphic sites when applied to 40 isolates. In comparison,

previous MLST schemes have been successfully developed with 0.5 % (S. cerevisiae),

2.5 % (C. glabrata), and 2.9 % (C. albicans) of polymorphic sites (Bougnoux et al. 2002;

Dodgson et al. 2003;Muhoz et al. 2009). The proportion of variable sites per locus for

G. candidum species varied from 0.85 to 3.22 %, which is slightly lower than the variability

observed for C. albicans (1.5 to 4 %) and C. glabrata (1.5 to 3.5 %) (Bougnoux et al. 2002;

101

Dodgson et al. 2003). Nevertheless, G. candidum isolates were distributed non-

ambiguously in 17 distinct STs.

Ten STs were represented by a single strain with five of them having a dairy origin. The

discrimination of these strains with isolates from cheeses or industrial locations revealed

the great genetic diversity of G. candidum in the dairy environment that could be exploited

by starter industries and industrial cheesemakers. Interestingly, four of the isolates

representing a unique ST were founded in milk collected in Quebec dairy farms, suggesting

genetic diversity among isolates of Quebec terroir which can also be used for more

traditional cheesemaking. Technological properties of interest now need to be characterized

for these strains to validate this assumption. Moreover, three of the isolates from non-dairy

origin were the only representative of one ST, whereas one of them clustered with an

isolate from cheese. This observation also suggests that a non-dairy nvironment could be

exploited in order to sample new strains for cheesemaking. On the other hand, most of the

16 industrial strains clustered together, especially in ST2, ST14, and ST16. These results

highlighted that some industrial ripening cultures are close relatives and could be variants

from a common domesticated strain, but displaying different technological properties. It

could be useful for ripening culture producers to complement MLST data with information

on traditional technological properties, such as proteolytic and lipolytic activities, for better

characterization, strain selection, or developing new specialty cheeses with

different/additional sensory values. These STs may also be eventually subdivided by the

analysis of gene sequences that evolve more rapidly and which are therefore not typical

housekeeping genes (Cooper and Feil 2004; Maiden et al. 1998; Taylor and Fisher 2003).

The nucleotide sequences of lipases from G. candidum have been previously determined,

and polymorphisms were detected between strains, suggesting that these genes might be

used for distinguishing closely related strains clustered in the same ST (Bertolini et al.

\994;Ytmetal. 2007).

Phylogenetic trees, one based on the MLST scheme and another one based on the ITS1-

5.8S-ITS2 region of rDNA, revealed that G. candidum isolates could be differentiated into

two groups, A and B, supported by bootstrap values of 100 and 86 %, respectively. The

102

average number of nucleotide difference between groups A and B corresponded to the two

thirds of the polymorphic sites indexed along the MLST loci. According to the rDNA

analysis, all strains listed in bold in Table 1 belong to Ueda-Nishimura and Mikata group 1

and share two common signature sequences that are characteristic of this group:

AACTTTTAAC at the 5' termini of 5.8S and AACCTC at the 5' termini of the large 26S

sub-unit (Alper et al. 2011; de Hoog and Smith 2004; Ueda-Nishimura and Mikata 2000).

Similarly, LMA-21 and LMA-70 contain these motifs in their rDNA sequence. These

results suggest that LMA-21 and LMA-70 also belong to Ueda-Nishimura and Mikata

group 1 (Ueda-Nishimura and Mikata 2000). When the 18S sequences of LMA-21 and

LMA-70 are added to the phylogenetic tree generated with de Hoog and Smith's (2004)

classification, these two strains still belong to group 1 (data not shown). Moreover, the

API 20C AUX gallery applied to LMA-21, LMA-70, LMA-244, and LMA-1035 gave the

same results as LMA-40 and LMA-76 (Kawai et al. 2007). Altogether these results support

the hypothesis that a subspecies may be present in G. candidum species and could warrant

additional investigation especially at the genomic level. Previous strain characterization by

MLST suggested that this method can be used to unravel subspeciation, as observed in

Oenococcus oeni and Lactobacillus delbrueckii species (Bilhère et al. 2009; Tanigawa and

Watanabe 2011), or even species delineation, as in Coccidiodes and Bifidobacterium genera

(Delétoile et al. 2010; Taylor and Fisher 2003).

A standardized RAM-PCR protocol for G. candidum was developed to increase intra- and

inter-laboratory reproducibility, allowing comparison of RAM-PCR data (Gente et al.

2006). One of the main limitations of gel profiling methods is a protocol with steps that are

subject to experimental variations, such as DNA extraction and PCR amplification. Also,

visual observations and analysis of the RAM-PCR profiles are subjective because some

bands could be excluded from the profile analysis due to the inconstancy of their presence

even when internal standards are used (Beh et al. 2006; Gil-Lamaignere et al. 2003). Our

RAM-PCR results using the five quality control strains of Gente et al. (2002b, 2006)

(LMA-73, LMA-74, LMA-75, LMA-76, and LMA-77) confirmed the difficulty of

developing a reproducible RAM-PCR profile database. In this study, despite the use of a

well-standardized protocol, we needed to perform the PCR temperature cycling on a

103

different thermocycler than the one proposed by the original protocol. This might have

contributed partially to the differences observed in the profiles generated in this study.

Finally, RAM PCR, which is used to study genetic diversity, is not based on gene

sequencing and thus does not permit phylogenetic studies as MLST does.

In conclusion, we propose the use of alal, cdcl9, erglO, gln4, pgil, and pgm2 as loci for

the first MLST scheme for G. candidum. This scheme showed that industrial strains had a

tendency for clustering together, whereas isolates from the environment tended to scatter,

suggesting the presence of a higher order of genetic diversity among the different strains

studied. This observation suggests a common descent of the industrial strains after

domestication of one or a few initial strains. This method allowed us to identify two

phylogenetically distant groups among G. candidum species, suggesting the possibility of a

subspecies. This demonstrates that the molecular tools available today generate more

accurate affiliations than traditional physiological tests, and these tools might be useful for

the commercialization of new G. candidum strains and potentially for the development of

new cheeses (Sacristan et al. 2011).

5.8 Acknowledgments

The authors thank Dr. Micheline Guéguen for providing LMA-73, LMA-74, LMA-75,

LMA-76 and LMA-77, which are UCMA strains from Université de Caen, Laboratoire de

Microbiologie Alimentaire (Caen, France). This work was supported by a Discovery grant

from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) and a

grant "Nouveau chercheur" from the Fonds de recherche sur la nature et les technologies du

Quebec. The authors also thank Dr. Barb Conway for her assistance in editing the

manuscript.

104

Chapitre 6- Discussion générale

Actuellement, la fabrication industrielle des fromages à croûte fleurie et à croûte lavée,

ainsi que le développement de nouvelles recettes reposent sur l'utilisation de ferments

standardisés. La composition microbienne de ces ferments est plus pauvre en termes de

diversité d'espèces et de souches de la même espèce que ceux utilisés en fabrication

traditionnelle. Les levures qui sont sélectionnées de façon non empirique comme ferments

d'affinage sont en mesure de fermenter et d'assimiler le lactose, de produire des enzymes

protéolytiques et lipolytiques extracellulaires, d'assimiler le lactate et le citrate, de croître à

de faibles températures et à de faibles teneurs en humidité et enfin tolérer de faibles pH et

de hautes concentrations salines (Fleet 1990; Roostita et Fleet 1996; Cosentino et al. 2001).

Mais les caractéristiques organoleptiques propres à chaque fromage traditionnel, aux

fromages du terroir, reposent sur des fonctionnalités technologiques variées qui sont

intrinsèques aux espèces et surtout aux souches utilisées.

G. candidum est une levure qui est couramment utilisée comme ferment d'affinage pour la

fabrication des fromages à croûte fleurie et à croûte lavée. Cette espèce pour laquelle très

peu d'informations au niveau génétique sont disponibles, arbore une diversité de propriétés

technologiques dépendantes de la souche utilisée qui présente un intérêt économique

considérable pour les industries des ferments et fromagères. Afin de protéger cette

diversité, de l'exploiter de façon optimale et de fabriquer industriellement de nouveaux

fromages affinés en surface ou à saveur et à texture plus traditionnelles, il est donc

impératif de pouvoir identifier un G. candidum et le caractériser.

105

6.1 Le DNA barcoding et ses limitations chez G candidum

Le but de ce doctorat était d'explorer la diversité génétique des souches de G. candidum de

diverses origines, laitières ou non laitière, en réalisant le génotypage par RAM-PCR et

MLST. Le premier objectif consistait donc à confirmer l'affiliation des souches à l'étude à

l'espèce G. candidum, en séquençant la région complète du 18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S de

l'ADNr. De par la disponibilité d'amorces universelles depuis les années 90, les gènes 18S,

26S et la région ITS1-5.8S-ITS2 ont été largement séquences chez les mycètes. De plus,

compte tenu de sa taille et de son pouvoir discriminant, la région ITS1-5.8S-ITS2 a été

proposée par le All Fungi Barcode Initiative comme code-barres pour l'affiliation d'un

isolât à une espèce, avec le séquençage de la région D1/D2 comme locus complémentaire

(White et al. 1990; Scorzetti et al. 2002; Rossman 2007; Eberhardt 2010; Stockinger et al.

2010).

Le DNA barcoding est basé sur le principe que les variations génétiques inter-espèces sont

plus importantes que les variations intra-espèces. Ainsi, ces variations doivent être

clairement définies (Ebach et Holdrege 2005; Meier et al. 2006; Stockinger et al. 2010;

Lewis et al. 2011 ; von Cràutlein et al. 2011 ). Or, la diversité du monde vivant est construite

sur la base de la continuité et les frontières entre les espèces se chevauchent (Meier et al.

2006). Selon le naturaliste Buffon, c'est l'esprit humain qui a besoin de définir des espèces,

des genres, des ordres et des classes (François Jacob, 1970). Mais, même si « la nature, elle

ne connaît pas de classes », le DNA barcoding est un outil moléculaire à notre disposition

pour classer les organismes vivants afin de prédire leurs comportements et de les

comprendre (François Jacob, 1970). Selon Mitchell (2005), il serait aussi intéressant

d'analyser l'évolution de nos principes de classification, car selon lui « The way we order

represents the way we think ».

Pour établir ces frontières, il est donc primordial de posséder une vaste connaissance au

niveau moléculaire sur les loci sélectionnés comme code-barres, c'est-à-dire de les avoir

séquences chez plusieurs espèces différentes et pour de nombreux individus. Le principal

défi lors de ces études phylogénétiques est l'étude d'espèces proches ou qui ont divergé

106

récemment, mais également l'obtention d'un grand nombre de séquences chez un grand

nombre de membres de chaque espèce (Begerow et al. 2010; Casaregola et al. 2011). Dans

la présente thèse, c'est dans ce contexte que la région 18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S de l'ADNr

a été séquencée au complet pour la première fois chez G. candidum et ce pour 20 souches.

Également, la région ITS a été analysée pour 20 souches supplémentaires. Ceci permet

donc d'établir le potentiel réel de l'utilisation de la région ITS1-5.8S-ITS2 et

secondairement de la région D1/D2 pour le DNA barcoding des mycètes (Chapitre 4).

Les résultats obtenus au cours de ce doctorat ont mis en évidence une variabilité

nucléotidique plus importante qu'anticipée au sein de l'espèce G. candidum, avec 60 sites

polymorphiques dispersés sur les 5126 pb séquences de l'opéron de l'ADNr. Ceci a permis

de diviser 18 souches en quatre groupes phylogénétiques (Chapitre 4). Le séquençage de la

région ITS1-5.8S-ITS2 chez 22 souches supplémentaires a mis en évidence un groupe de

quatre souches, LMA-21, LMA-70, LMA-244 et LMA-103 5, plus distant

phylogénétiquement et regroupant ainsi, au sein du même clade, les 36 autres souches de

G. candidum (Chapitre 5). Ces résultats montrent que, pour G. candidum, la région ITS1-

5.8S-ITS2 de l'ADNr peut difficilement être utilisée comme code-barres pour justifier une

identification à l'espèce, ce qui est aussi valable pour la région 18S. Le nombre important

de polymorphismes intra-espèces démontre que ces régions de l'ADNr, qui sont pourtant

très utiles à la classification d'un grand nombre de fungi, présentent des limitations dans le

cas de G. candidum.

C'est ainsi que le premier objectif de la thèse qui consistait à utiliser le séquençage complet

des gènes de l'ADNr et des espaceurs internes ITS1 et IT2 pour affilier les souches à

l'espèce G. candidum a généré des questions supplémentaires. Il apparaît clairement que le

locus sélectionné pour réaliser le DNA barcoding proposé par le "All Fungi Barcode

Initiative" est limitant pour G. candidum. Au sein de cette espèce, les variations intra-

espèces chevauchent les variations inter-espèces ce qui est contraire au postulat qui est le

fondement même du DNA barcoding.

107

Certains auteurs ont proposé des seuils permettant de délimiter les frontières des espèces

basées sur les variations nucléotidiques observées au niveau de l'ADNr. Ces paliers ont

pour but de délimiter clairement les variations intra-espèces des variations inter-espèces.

Au sein du complexe Galactomyces geotrichumIG. candidum, une analyse de la région ITS

des espèces G. geotrichum sensu stricto, Galactomyces candidum, Galactomyces

pseudocandidus et Geotrichum europaeum a permis d'estimer une variation inter-espèce

située entre 4 et 4,4 % et une variation intra-espèce ne dépassant pas 1 % (de Hoog and

Smith 2004). Selon d'autres auteurs, le pourcentage séparant deux espèces de mycètes

serait de 3 % (Begerow et al. 2010). Or, la présente étude a montré que le nombre de sites

polymorphiques est très élevé chez G. candidum et que des polymorphismes

intragénomiques rendent difficile le calcul ou l'application d'un seuil de décision pour cette

espèce (Chapitre 4). Ce phénomène n'est pas unique à cette espèce puisqu'il existe d'autres

mycètes, comme les mycorhizes arbusculaires, pour lesquels ces seuils ne sont même pas

calculables à cause des taux élevés de variations intra-génomiques (Stockinger et al. 2010).

Pourtant de nombreuses nouvelles espèces appartenant au genre Geotrichum sont

identifiées sur la base de ce type de pourcentage. Fréquemment, les auteurs mentionnent

avoir écarté de leurs analyses les régions présentant des polymorphismes

d'insertion/délétion ou des sites ambiguës (Suh et Blackwell 2006; Nagahama et al. 2008;

Sulo et al. 2009; Kaewwichian et al. 2010). Ces derniers pourraient en fait correspondre

aux polymorphismes intra-génomiques révélés pour l'espèce G. candidum dans la présente

thèse. Dans certains cas, l'identification de nouvelles espèces appartenant au genre

Geotrichum peut donc être discutée.

Sulo et al. (2009) ont identifié et décrit une nouvelle espèce, Geotrichum bryndzae, dont les

dix isolats ont été obtenus de fromages traditionnels slovaques fabriqués à base de lait de

chèvre. G. bryndzae aurait également été isolé du rumen de vaches en Chine (Sulo et al.

2009). La distinction des isolats de l'espèce G. candidum reposait sur la non-utilisation du

ribitol et le D-mannitol et l'analyse de la région D1/D2 (Sulo et al. 2009). Cependant

l'utilisation du ribitol est dépendante de la souche chez G. candidum et elle l'était

également pour le D-mannitol jusqu'à la dernière révision du livre The Yeasts en 2011 (de

108

Hoog et al. 1998; de Hoog et Smith 2011). À la lumière des résultats présentés sur la

variabilité de l'ADNr, il serait pertinent d'approfondir l'étude des souches afin de

déterminer, par d'autres méthodes, à quel point ces souches sont phylogénétiquement

proches des G. candidum.

Malgré son utilité pour discriminer un très grand nombre de fungi, le manque de robustesse

du DNA barcoding a été démontré pour plusieurs autres loci et pour un nombre élevé

d'autres espèces de levures et de moisissures (Rossman 2007; Seiffert 2009; Begerow et al.

2010; Eberhardt 2010). Afin de réduire la subjectivité de l'établissement des critères

délimitants les espèces, inhérente à l'utilisation d'un locus unique, plusieurs auteurs ont

suggéré l'utilisation d'une approche multilocus basée sur plusieurs loci de gènes

domestiques (housekeeping genes en anglais; Meier et al. 2006; Casaregola et al. 2011;

Gazis et al. 2011; Lewis et al. 2011; Voigt et Kirk 2011; Vrâlstad 2011). La région ITS a

été utilisée dans une approche multigénique de trois loci (Gazis et al. 2011). Cette approche

a montré que l'utilisation de la région ITS uniquement sous-estime la diversité des espèces

contrairement à l'approche multigénique.

Mais, comme pour l'utilisation d'un locus unique, la limite expérimentale se situe au

niveau de la sélection des loci et de la conception des amorces universelles pouvant être

utilisées chez des espèces phylogénétiquement distantes (Lewis et al. 2011; Robert et al.

2011). Tout comme le nécessite l'utilisation d'une région de l'ADNr comme code-barres,

une approche multilocus nécessite le séquençage de nombreux gènes domestiques afin

d'estimer les variations intra- et inter-espèces et les polymorphismes intra-génomiques.

L'amplification de tous les loci candidats chez plusieurs souches de plusieurs espèces

générera immanquablement des coûts considérables pour l'étude de la biodiversité. Une

alternative récemment proposée consiste en l'utilisation d'amorces dégénérées (Lewis et al.

2011). Cette approche a cependant des limites puisque la présence de séquences introniques

chez les microorganismes eucaryotes peut être un obstacle à l'hybridation des amorces et

peut donc empêcher l'amplification du locus (Lewis et al. 2011). Néanmoins, 186 paires

d'amorces non-dégénérées sont en cours d'analyse et seraient utilisables sur 56 espèces

109

appartenant aux Ascomycètes. Il s'agit cependant d'un nombre plutôt faible comparé aux

5,1 millions d'espèces estimées (Blackwell 2010; Robert et al. 2011).

6.2 Une application industrielle de la technique du Multilocus Sequencing Typing pour l'espèce G. candidum

D'un point de vue industriel, une approche multilocus peut avoir une application

intéressante pour différencier et génotyper les souches de G. candidum et ainsi contribuer à

l'amélioration de l'étape de sélection des souches comme ferments. Donc, afin d'estimer et

d'exploiter la diversité génétique des souches d'intérêt laitier et non-laitier de G. candidum,

le second volet de ce doctorat avait pour but de développer le premier schéma de

Multilocus Sequence Typing applicable à cette espèce. Dans cette démarche six nouveaux

gènes domestiques pour G. candidum furent complètement séquences chez 18 souches:

ALA\, CDC19, ERG10, GLN4, PGIl et PGM2. Étonnement, un alignement multiple des

séquences a montré que ces gènes domestiques étaient plus conservés que la région

18S-ITS1-5.8S-ITS2-26S de l'ADNr. Au total, 63 sites polymorphiques furent indexés sur

le concatémère formé des séquences complètes de ces six gènes domestiques, représentant

11 445 pb. En l'absence de polymorphismes, intra-génomiques l'ADNr aurait pu être

intégré dans un schéma MLST.

Selon les résultats obtenus dans le deuxième volet de cette thèse, l'hypothèse indiquant que

les gènes domestiques préalablement identifiés chez des levures phylogénétiquement

proches de G. candidum, sont présents chez cette dernière et permettent de développer un

schéma MLST pour la différenciation des souches a pu être vérifiée. L'une des grande

conclusions du chapitre 5 est la tendance qu'on les souches provenant des ferments

industriels à se regrouper ensemble d'un point de vue phylogénétique en utilisant le MLST.

Ce phénomène peut s'expliquer par la standardisation des ferments et l'industrialisation de

la fabrication fromagère qui a probablement conduit à une perte de diversité au niveau des

souches utilisées. Il est intéressant de constater que les souches isolées dans la nature, telles

que celles isolées de laits obtenus de fermes au Québec, montrent une importante diversité.

Ce réservoir naturel pourrait bien être une source de nouvelles souches permettant aux

110

industriels fabriquants des ferments et les industries fromagères de développer de nouveaux

fromages sans nécessairement changer le procédé de fabrication (Lavoie et al. 2011).

6.3 Un groupe de souches phylogénétiquement distant

En considérant l'ensemble des résultats constitués de l'analyse de l'ADNr et de la séquence

des six loci de gènes domestiques, le groupe de souches constitué de LMA-21, -70, -244 et

-1035 semble éloigné d'un point de vue phylogénétique des autres souches étudiées dans

cette thèse. Il est donc possible que ce groupe de souches puisse appartenir à une sous-

espèce de G. candidum ou être une espèce distincte du genre Geotrichum. Cependant, peu

de données génétiques et phénotypiques sont actuellement disponibles afin de réellement

confirmer cette hypothèse. Parmi les éléments à déterminer, il serait intéressant d'établir les

différences de propriétés physiologiques et technologiques intrinsèques à ces quatre

souches, comparativement aux 36 autres souches de l'étude. Les méthodes physiologiques

et phénotypiques ont encore une place importante puisqu'elles sont complémentaires aux

données génétiques. Il est donc important d'éviter de considérer les outils moléculaires

comme des méthodes alternatives aux méthodes traditionnelles. La combinaison de la

caractérisation génétique et traditionnelle montre son utilité lors de la documentation ou la

commercialisation de nouvelles souches, lors du dépôt de brevets, de la veille

technologique, de la gestion de banques de souches, du développement de nouveaux

ferments et de la fabrication de nouveaux fromages. Il est également important de disposer

du maximum de données sur les souches qui justifient l'affiliation d'un isolât à une espèce

et qui permettent en plus de le typer.

L'une des observations importantes qui ressort de ce projet de doctorat est que l'émergence

des outils moléculaires, que ce soit pour l'identification ou le génotypage, poussent les

taxonomistes à redéfinir les frontières des espèces et rappellent que certaines délimitations

sont hypothétiques (Casaregola et al. 2011). Une espèce est basée sur la capacité de se

reproduire selon le Biological Species Concept, sur des ressemblances morphologiques

selon le Morphological Species Concept, sur l'adaptation à une niche écologique selon

l'Ecological Species Concept ou sur la divergence nucléotidique selon le Phylogenetic

I l l

Species Concept (Taylor et al. 2000; Giraud et al. 2008). Il n'existe donc pas de standard

unique pour délimiter précisément l'espèce. En ce qui concerne G. candidum, les souches

peuvent se distinguer par un morphotype différent allant de levuriforme à mycellaire

(Guéguen et Jacquet 1982, Gente et al. 2002a et 2002b; Missous et al. 2010). Une

observation microscopique révèle qu'elle peut former un mycélium comme une moisissure

et se reproduire sexuellement comme une levure (Barnett et al. 1990a; Kirk et al. 2008).

Avant même l'exploration nucléotidique de son ADNr, G. candidum présente, selon la

souche, un matériel chromosomique variant tant en nombre de chromosomes qu'en taille

(Gente et al. 2002a). Pour cette levure, plusieurs concepts d'espèce énoncés précédemment

portent à discussion. G. candidum illustre la faiblesse des méthodes d'identifications

classiques comme les analyses phénotypiques et de la méthode du DNA barcoding. Il

ressort de façon claire que la délimitation de l'espèce G. candidum nécessitera une

meilleure connaissance fondamentale de plusieurs souches. Elle doit aussi se baser sur

l'analyse rigoureuse des souches appartenant aux autres espèces du genre Geotrichum afin

de considérer également les informations concernant l'évolution et d'avoir une image plus

réelle de ce que les frontières pourraient être.

112

Chapitre 7- Conclusions générales et perspectives

L'affiliation des isolats à l'espèce G. candidum est un véritable défi phylogénétique qui

nécessitera l'acquisistion de nouvelles connaissances et le développement de nouvelles

méthodes. L'utilisation d'un locus unique comme code-barres pour l'identification

d'espèces a suscité de vives réactions de la part de certains taxonomistes avec la publication

d'articles portant des titres comme « More taxonomy, not DNA barcoding » ou « The perils

of DNA barcoding and the need for integrative taxonomy ». Cependant, le DNA barcoding

n'a pas été développé pour remplacer la taxinomie, car d'après les articles publiés sur le

sujet, le locus idéal ne semble pas exister. Même si cette méthode d'affiliation et

d'identification présente des avantages pour certaines espèces en terme de coût, de rapidité

et d'objectivité, G. candidum est une espèce qui met clairement en évidence certaines

limites de cette méthode. Même si seulement deux codes-barres ont été analysés sur

G. candidum, Le. les régions ITS et D1/D2, il est fort probable qu'il y aura toujours des

espèces qui infirmeront la validité de certains loci plus prometteurs, sans tenir compte de la

difficulté de construire des amorces universelles qui permettrait l'amplification de ce locus.

Des approches multigéniques ont vu le jour, plus prometteuses de par leur principe que le

DNA barcoding, mais l'application n'en est que plus coûteuse et plus difficile puisqu'une

des étapes critiques à l'amplification d'un locus est la construction d'amorces universelles.

Si des loci présentant un faible degré d'évolution sont sélectionnés, l'approche

multigénique peut alors servir de méthode de génotypage. C'est le cas du MLST dont le

principe est basé sur l'utilisation de six à sept gènes domestiques pour différencier les

souches d'une espèce. Mais, les résultats du chapitre 6 ont mis en évidence chez les

40 souches de G. candidum un groupe de quatre souches plus distant phylogénétiquement.

Ces derniers résultats, combinés à ceux de l'analyse de l'ADNr, remettent en question

encore une fois les contours dessinés pour l'espèce G. candidum.

113

Où placer les frontières des espèces lorsque comme l'a dit François Jacob « La nature ne

fait pas de saut » ? Dans l'idéal, il serait préférable de considérer un nombre suffisant de

souches susceptibles de constituer une espèce, d'étudier sa diversité par différentes

méthodes de typage, de choisir ensuite les souches représentatives de chacun des groupes

obtenus pour enfin étudier les relations phylogénétiques avec les espèces voisines. C'est ce

qui a été entrepris dans le cadre de ce doctorat avec l'espèce G. candidum. Cependant, un

nombre plus important d'investigations sera nécessaire pour les groupes qui sont

phylogénétiquement très proches et il faudra toujours garder en tête que ces délimitations

sont hypothétiques. Il est à prévoir que plus la base de données pour chaque espèce sera

importante, plus les frontières tracées vont être robustes et imperméables. La démarche peut

paraître lourde et coûteuse, mais c'est probablement le prix à payer pour avoir le plus

complet et le plus réaliste des portraits de la biodiversité du monde vivant.

Pour la caractérisation des souches industrielles de G. candidum, il est clair que toutes les

méthodes de typage ne peuvent être employées et doivent être sélectionnées

judicieusement. La RAM-PCR par exemple est une technique difficile à utiliser en

industrie. En effet, la possibilité de variations dans les profils est importante puisque cette

méthode implique des étapes qui sont sujettes à des variations expérimentales. Il est donc

nécessaire de toujours utiliser des souches contrôles qui permettront d'atténuer ces effets.

Avec la RAM-PCR, l'arbre phylogénétique construit peut ne pas tenir compte de tous les

fragments amplifiés, alors qu'avec le MLST, les amplifications sont obtenues directement

par séquençage.

Dans un futur proche, le séquençage complet de plusieurs génomes pourrait être une

solution à l'identification des souches et à leur caractérisation; un futur où les méthodes de

séquençage ne nécessiteraient plus d'amorces spécifiques, généreraient des coûts

négligeables et les ordinateurs seraient suffisamment puissants pour l'analyse de toutes ces

données. De nombreuses souches pourraient alors être intégrées dans un arbre

phylogénétique représentant toutes les espèces vivantes. Il existe actuellement un projet en

cours concernant le séquençage complet des génomes de souches types de mycètes appelé

le projet Dikaryome. Ce serait, comme le mentionne le Dr Casaregola, une méthode

114

taxinomique robuste est envisageable pour le futur, même si le séquençage complet des

génomes soulève souvent plus de questions qu'il n'apporte de réponses.

Les résultats obtenus au cours de la réalisation de ce doctorat ont ouvert de nouvelles voies

de recherche. Parmi les perspectives on peut noter les suivantes:

• Afin de caractériser le groupe de souches composé de LMA-21, -70, -244 et -1035

et décider de leur affiliation à l'espèce G. candidum, il serait intéressant de réaliser

l'étude des caractéristiques phénotypiques permettant de définir cette espèce. Par

ailleurs, il serait intéressant de sequencer l'ADNr des souches LMA-244 et

LMA-103 5 afin de voir si elles se regroupent avec les souches LMA-21 et LMA-70.

• Afin de mieux comprendre le mécanisme d'évolution concertée, il serait pertinent

d'analyser un plus grand nombre de clones de l'ADNr chez quelques membres de

cette espèce. Il serait possible également d'envisager la conception d'une puce à

ADN comme cela a déjà été réalisé pour mettre en évidence la diversité des copies

de 1TTS1 chez Pseudomonas syringae (2010). Des extractions d'ADN à différents

moment de la croissance de la levure pourraient également donner des informations

sur l'évolution du nombre et de la séquence des copies en fonction du temps.

• Afin de compléter la caractérisation des souches par MLST, l'arbre phylogénétique

généré par cette méthode pourrait être complété par les données technologiques

propres à chaque souche.

v Le schéma MLST pourrait être appliqué à des souches appartenant à d'autres

espèces du genre Geotrichum afin de mieux définir les frontières de l'espèce

G. candidum délimitées par cette méthode. Certaines espèces de Geotrichum sont

impliquées dans des geotrichoses. Il serait donc intéressant de déterminer, d'un

point de vue phylogénétique, où elles se situent par rapport aux ferments de

G. candidum. Les résultats permettront ainsi de documenter le dossier permettant à

115

G. candidum d'obtenir le statut Qualified Presumption of Safety (Pottier et al. 2008;

Bourdichon et al. 2012).

• Et enfin, le MLST est une méthode qui peut constamment être optimisée. Six gènes

domestiques ont été proposés pour le premier schéma développé pour G. candidum,

mais il est possible de proposer et de sequencer de nouveaux biomarqueurs et

d'ajouter plus de souches à l'étude provenant de différentes niches écologiques.

116

« After climbing a great hill, one only finds that there

are many more hills to climb »

(Nelson Mendela).

117

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Annexe 1 : Diagramme technologique du fromage

Préparation du lait : Standardisation Epuration bactérienne Chauffage

Coagulation

Egouttage : Acidification Découpage Brassage Cuisson Pressage

Salage : Sel Saumure

Affinage Agents d'affinage

Lait cru

Lait de fromagerie Ferments lactiques

Enzymes coagulantes

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Caillé

Fromage

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Fromage affiné

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