Ann. 1st. Super. Sanità Vol. 21, N. 3 (1985). pp. 363-376

COURS SUR LES LEPTOSPIROSES à l'Istituto Superiore di Sanità. Rome, le 6 février 1985

M. Mailloux

Centre National de Référence des Leptospires, Institut Pasteur, Paris Cedex 15

Résumé Bactériologie. - Classée dans l'ordre des Spirochétales, la famille des

Leptospiraceae groupe deux genres, Leptospira et Leptonema. Le leptospire mesure 6 à 15 microns de long sur 0.1 micron de diamètre. C'est la plus fine des bactéries. La mobilité propre est intermittente, assez rapide. Cette bactérie est costituée d'un cylindre cytoplasmique, un filament axial, et, engainant le tout, une enveloppe externe. Les leptospires, bactéries dont la culture est délicate, ne poussent pas sur les milieux usuels. Les leptospires sont aérobies. Le carbone est la principale source d'énergie. L'azote est utilisée sous forme d'ammoniac (NH ). Le primum movens serait la libération d'une endotoxine agissant sur llar&riole glomfrulaire et initiant le cercle vicieux conduisant à l'insuffisance rénale aigue.

Épidémiologie. - Ces germes sont nichés dans les tubules et canalicules rénauk et excrétés par les urines. Les réservoirs de leptospires sont nombreux. L'eau apparaTt come un facteur épidémiologique particulièrement constant. Le laboratoire de 1'Institut Gamaleja a étudié la survie des leptospires pathogè- nes dans le milieu (sols humides) pendant 280 jours. L'origine hydrique est souvent retrouvée. La contamination peut se faire par voie transcutanée, par voie muqueuse: digestive, nasale. conjonctivale.

La maladie humaine. - Quel que soit le leptospire en cause, la leptospiro- se associe à des degrés variables les manifestations suivantes: syndrome fébrile. syndrome algique, syndrome méningé, réaction conjonctivale, et aussi syndrome rénal, rougeur de la peau. A ces signes fondamentaux peuvent s'ajou- ter: une hépato-néphrite, un syndrome hémorragique, une atteinte respiratoire. L'évolution est fréquement caractéristique et diphasique. Le diagnostic différentiel se pose pour: les syndromes infectieux peu nets; les méningites a liquide clair; les rickettsioses; les hépatites; ictères fébriles; des parasi- toses; enfin, selon les régions: borréliose, fièvre bilieuse hémoglobinurique; paludisme; fièvre jaune.

Le diagnostic biologique est fonction de la chronologie de la physio-pa- thologie; 2 phases:

1) phase septicémique: le germe est dans le sang, le L.C.R., jusqu'au 12e jour environ, donc diagnostic direct: bactériologique;

2) phase immunitaire: les anticorps, formés dès le 4e jour, sont immunolo- giquement décelables à partir du 6e jour, donc diagnostic indirect: immunologi- que :

- réactions de dépistagr: agglutination macroscopique; hémagglutination; agglutination microscopique d'un antigène du genre Leptospira; méthode ELISA;

- réaction de confirmation: R.A.L.: réaction d'agglutination avec lecture microscopique.

La therapeutique des leptospiroses comprend des règles hygiénodiététiques, et un traitement physio-pathologique, un traitement étiologique: antibiothéra- pie. La prophylaxie est basée sur la protection. Plusieurs vaccinations ont

déjà été effectuées dans certains pays: au Japon, en Europe, en Israel .... Depuis 1974, la vaccination contre la leptospirose à Icterohaemorrhagiae a été entreprise en France. Les controles immunologiques donnent d'excellents résul- tats. Les leptospiroses représentent la zoonose la plus frfquente et la plus répandue, a écrit van der Hoeden dans con livre, "Zoonoses".

Summary Bacteriology. - The genus Leptospira is divided into two species, Lepto- and Leptonema. The lenght of leptospires is from 6 to 15 microns. The

diameter is 0.1 micron. They are the thinnest known bacteria. Their motility is intermittent and relatively swift. This organism is constituted of a cytopla- smic cylinder, an axial filament and an outer envelope. The culture of these bacteria is not easy. Leptospires do not grow on usual media. They are aerobic. Fatty acids and carbon are their major source o£ energy. Ammonium salts are source o£ nitrogen. A toxin acting on the glomerule arteriole and initiating the process leading to acute renal deficiency is probably liberated: this would be the primum movens of pathogenicity.

Epidemiology. - These germs do multiply in the kidneys and are excreted by urine. There are numerous anima1 reservoirs. Water is also a main epidemiologi- cal factor. Researchers o£ the Institute Gamaleya have studied the survival o£ pathogenic leptospires in the environment(wet ground) during 280 days. Aquatic environment is often involved. Contamination occurs through cutaneous or mucous route (digestive, nasal or conjunctival).

Leptospirosis in man. - Whatever the infecting serogroup, in the human disease the following symptoms are associated: fever, pain, meningitis, con- junctival suffusion, renal syndrome, cutaneous reaction. Sometimes, hepato- -nephritis, haemorrhages and respiratory signs are also observed. Evolution is often characteristic and diphasic. Differential diagnosis is evoked in various infectious diseases; meningitis; rickettsioses; hepatitis; febrile jaundice; parasitoses; and in some areas: borreliosis; bilious hemoglobinuric fever; malaria; yellow fever.

Biologica1 diagnosis depends on the chronology o£ physio-pathology. Two stages are differentiated:

1) septicemic stage: the organism is in the blood, the cerebrospinal fluid, u~itil the 12th day approximately: direct diagnosis (hacteriological diagnosis);

2) immune stage: antibodies are present as soon as the 4th day and are im- munologically detectable since the 6th day onwards: indirect diagnosis (immuno- logica1 diagnosis): - screening tests: macroscopic slide test; hemagglutination; MAT with a genus-specific antigen; ELISA; - confirmatory test: FiAT with reading by dark-field microscopy.

Therapy: in leptospiroses is based on hygienic and dietetic measures, and essentially on physio-pathological and etiological treatment: antibiotherapy.

Prophylaxis: protection is ensured by vaccination, which has been succes- sfully conducted in various countries: Japan, Europe, Israel ... Since 1974, vaccination against leptospirosis Ictcrohaemorrhagiae has been applied in France. lmmunological controls give satisfactory results. "Leptospirosis is probably the world's most wide spread contemporary zoonosis", stated van der Hoeden in his book, "Zoonoses".

Riassunto Batteriologia. - Il genere Leptospira comprende due specie, Leptospira e

Leptonema. La lunghezza delle leptospire è da 6 a 15 microns. Il diametro è 0,l micron. Sono i più sottili tra i batteri noti. La motilità è intermittente e molto rapida. I1 microrganismo è costituito da un citoplasma cilindrico, un filamento assiale e una membrana esterna. La coltura di questi batteri non è facile. LE leptospire non crescono su terreni usuali. Sono aerobie. Acidi grassi e carboni0 sono le principali fonti energetiche. I sali di ammonio costituiscono la sorgente di azoto. Il probabile meccanismo patogenetico è

rappresentato da una endotossina, che agisce sulle arteriole glomerulari e dà inizio al processo di insufficienza renale acuta.

Epidemiologia. - Le leptospire si localizzano nei tubuli e nei canalicoli cenali e vengono escrete con le urine. Numerosi sono gli animali serbatoio di leptospira. L'acqua è il fattore epidemiologico di trasmissione più costante. Nel laboratorio dell'Istituto Gamaleja è stata osservata la sopravvivenza di leptospire patogene nell'ambiente (terreni umidi) per 280 giorni circa. L'ori- gine idrica è la causa più frequente di infezione. I1 contagio avviene per via transcutanea o per via mucosa: digestiva, nasale, congiuntivale.

Leptospirosi umane. - La leptospirosi dell'uomo si manifesta con una sintomatologia variabile: sindrome febbrile, sindrome algica (artralgia, mialgia), sindrome meningea, reazione congiuntivale e, ancora, sindrome renale, congestione cutanea. I predetti quadri clinici sono comuni alle diverse siero- varianti di leptospire patogene. A questi sintomi fondamentaii possono aggiun- gersi una sindrome epatorenale, una sindrome emorragica, una sindrome polmonare (polmonite interstiziale). I1 decorso è caratteristicamente difasico. La dia- gnosi differenziale viene posta per sindromi infettive diverse: meningiti a li- quor limpido; rickettsiosi; epatiti e itteri febbrili; parassitosi; e infine, in regioni particolari: borreliosi; febbri emoglobinuriche; malaria; febbre gialla.

La diagnosi microbiologica è correlata alla cronologia fisiopatologica della infezione, in cui sono riconoscibili due fasi:

1. fase setticemica: il germe si ritrova nel sangue e/o nel liquido cefalorachidiano fino al dodicesimo giorno circa di malattia, e di conseguenza è possibile la diagnosi diretta batteriologica (esame batterjoscopico, esame colturale, prova biologica);

2. fase immune: gli anticorpi sono svelabili dal quarto giorno circa di infezione, ed è possibile la diagnosi indiretta immunologica: reazioni di screening (agglutinazione macroscopica su vetrino; emoagglutinazione indiretta; agglutinazione microscopica con antigeni genere-specifici; reazione immunoenzi- natica, ELISA).

La terapia delle leptospirosi è sintomatica, per quanto riguarda le manifestazioni cliniche, ed eziologica, mediante trattamento antibiotico. La profilassi è passiva, mediante norme di protezione cutanea negli ambienti infetti, ed attiva mediante vaccinazione con sospensioni di leptospire uccise. I vaccini antileptospirosi si sono dimostrati efficaci in campagne vaccinali svolte in Giappone, Italia, Spagna, Israele ... Dal 1974, in Francia viene applicata la vaccinazione contro Leptospira Icterohaemorrhagie, con una rispo- sta immunitaria anticorpale soddisfacente. Le leptospirosi sono la zoomsi più frequente e a maggiore diffusione ambientale, come affermato da van der Hoeden nel suo trattato, "Zoonoses".

BACTERIOLOGIE

Historique

Les leptospires ont été vus à la Nouvelle-Orléans par Stimson en 1907 dans des coupes histologiques de rein d'un malade supposé mort de fièvre jaune.

La découverte dc la première souche de leptospires remonte à novembre 1914 quand, à 1'Université Impériale de Kyushu, Inada, Ido, Hoki, Kaneko et Ito en firent l'isolement microbiologique.

Et, toujours pendant la guerre 1914 - 18, en Allemagne, Ruebener et Reiter ont, les premiers, réussi la transmission de la "maladie de Weil" au cobaye. Uhlenhuth et Fromme ont reconnu et décrit les spirochètes.

Du coté francais et anglais, en juin 1916, Adrian, Stokes et Ryle tran- smettent la maladie à l'animai. En septembre 1916, des "jaunisses" sont réunies dans le Service du Docteur Marce1 Garnier, à Bar-le-Duc. Auguste Pettit inocule

à des cobayes le sang et les urines de malades. Et, le 10 october 1916, Pettit signale à llAcadémie de Médecine les premiers cas de leptospirose ictérohé- morragique observés en Francé.

Ensuite, les découvertes se succèdent.

Classification et Nomenclature

Classés dans l'ordre des Spirochétales, la famille des Leptospiraceae grouperait désormais deux genres. Leptospira et Leptonema.

Le genre Leptospira est divisé en deux espèces phénotypiquement définies: - l'une patogène, parasite, Leptospira interrogans, - l'autre saprophyte, aquicole, Leptospira biflexa. Cette division en deux espèces existe depuis le début de la bactériologie

des leptospires. Les leptospires sont, par ailleurs. classés en sérogroupes et sérovars (ex

sérotypes). Le sérovar reste le taxon de base. La classification est basée sur le

différences sérologiques. Le sérogroupe est constitué par le groupement des sérovars ayant des

relations antigéniques. Actuellement, il existe 138 sérovars classés en 20 sérogroupes (cf. "Liste

des 20 sérogroupes").

Liste des 20 sérogroupes

1915 Icterohaemorrhagiae 1938 Sejroe

1918 Hebdomadis 1939 Djasiman

1923 Autumnalis 1939 Cynopteri

1925 Bataviae 1941 Tarassovi

1927 Pyrogenes 1942 Mini

1928 Grippotyphosa 1944 Ballum

1931 Canicola 1954 Celledoni

1937 Pomona 1964 Louisiana

1937 Australis 1966 Panama

1938 Javanica 1966 Shermani

Morphologie et Structure

Les leptospires sont pratiquement invisibles au microscope ordinaire à cause de la finesse de leur diamètre: 0,10 m. Leur examen nécessite l'emploi d'appareils à fond noir.

Au début de la culture, la morphologie est la suivante: - filament hélicoidal gracile, s'enroulant dans les divers plans de

l'espace, apparaissant en blanc brillant sur un fond noir; - il mesure 6 à 15 m de long sur 0.1 pm de diamètre;

- ce germe est formé de spires serrées régulières: vingt à trente environ, leur amplitude est de 0,3 à 0,5 pm.

La mobilité propre est intermittente, assez rapide; elle peut Ztre disso- ciée en trois types de mouvements:

- une rotation rapide autour de l'axe; - un mouvement de translation ou de va-et-vient; - des mouvements serpentins ou de "forage". I1 existe aussi des détentes dans le sens de la longueur, identiques à

celles d'un ressort.

La structure interne est démontrée par la microscopie électronique et les techniques enzimologiques.

1. Cylindre cytoplasmique enroulé en hélice, correspondant au corps cellulaire: - avec cytoplasme sans mitochondries. mais avec ribosomes; - avec structure nucléaire centrale, plus claire, filamenteuse; - avec membrane cytoplasmique - condensation périphérique à 3 feuillets,

contenant le glycosaminopeptide caractéristique de la paroi bactérienne. donnant des mésosomes et attaquable par la pénicilline.

2. Filament axial (F.A.). Ces filaments axiaux ne vont pas d'une extrEmité de la cellule à l'autre. La partie médiane de la cellule en est dépourvue. Les filaments axiaux et le cylindre cytoplasmique sont entrelacés.

3. Engainant le tout, une enveloppe externe à 5 couches, séparée du cylindre cytoplasmique par un espace contenant les filaments axiaux. Elle est souple, élastique, et peu résistante.

Culture - Croissance Les leptospires. bactéries dont la culture est délicate, ne poussent pas

sur les milieux usuels. Tous les milieux de culture contiennent du sérum de lapin: ex. milieu de Stuart, de Reiter Ramme, de Korthof. de Fletcher. Récem- ment, des milieux sans sérum de lapin ont été mis au point par Ellinghausen, McCullough, Johnson et Harris (EMJH).

Le milieux courants de laboratoire sont liquides, parfois semigélosés. Les conditions générales de culture sont impératives: - pH légèrement alcalin, 7,2 à 7,h; - température entre 10" et 30°, avec optimum à 28°C; - obscurité nécessarie; - inoculum abondant: 1/10e du volume du milieu de culture environ. La vitalité des leptospires dépend donc des conditions de culture. A 28'C le développement conmence au 2e jour, il est abondant entre le 3e

et le 6e jour, et augmente jusqu'au 10e jour, puis des formes longues apparais- sent.

Les besoins nutritifs ont pu $tre étudiés après la mise au point de milieux synthétiques ou semi-synthétiques.

Le carbone est la principale source d'énergie. L'azote est utilisée sous forme d'ammoniac (NH ) ou de sels ammoniacaux 3

(NH4 CI). La vitamine B est un facteur de croissance.

12 ~'ion ferreux est indispensable à la croiss,a$ce destfeptospires parasites. De plus, la thiamine (vitamine B,), les ions Ca et Mg favorisent la crois- sance des leptospires.

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Caracteres Biochimiques

Les leptospires sont aérobies. 11s possèdent un sistème cytocrom C et une catalase.

Une toxine cytopathogène a été mise en évidence dans les cultures. Une fraction glucido-lipido-polypeptidique à caractère d'endotoxine a été

isolée a partir d'une souche saprophyte Patoc 1. Certains sérovars produisent une hémolysine pour les hématies de mouton,

de lapin, les globules rouges humains également.

Antigènes. - Les travaux de Faine ont prouvé l'existence de trois antigè- nes: 1. antigène H, protéique, "flagellaire", du filament axial, qui a un role dans la réaction d'agglutination-lyse (R.A.L.); 2. antigène 0, polyosidique, de la paroi, "somatique" qui a un role dans l'immunité (effet leptospiricide, effet protecteur); 3. antigène de surface, de nature encore inconnue, situé dans l'enveloppe, et qui a un role dans R.A.L.: sa destruction ne permet plus d'obtenir une R.A.L.

Pouvoir pathogène expérimental

En dehors de l'homme et des animaux domestiques, divers animaux de labora- toire sont réceptifs à la maladie. Certains sont réfractaires à l'expérlmenta- tion: chat.

Le cobaye est l'anima1 de choix. La maladie expérimentale commence en général le 3e - 4e jour par une poussée thermique à 40' - 41'; puis, le 5e jour, apparaissent injection des conjonctives, fatigue marquée, ictère, amai- grissement, hypothermie, prostration . . .; la mort survient entre le 6e et le 12e jour. A l'autopsie, on observe: ictère intense généralisé, infarctus pulmo- naire, suffusions sanguines.

La souris inoculée reste très longtemps porteuse de leptospires. Le harnster jeune (1 mois 112) peut faire des lésions comparables à celles

du cobaye. Le jeune chien et le jeune lapin sont également sensibles. L'existence d'effets cytopathogènes sur divers types de cellules et tissus

en culture a été démontrée: dégénérescence des cellules de type fibroblastique.

Pathogi'nie

Les manifestations de la leptospirose grave rappellent celles observées au cours d'affections à la fois endotoxiniques et septicfmiques.

Le primum movens serait la libération in situ, ou dans la circulation générale, d'une endotoxine secrétée ou libérée par la lyse des leptospires. Cette "néphrotoxine" agirait sur l'artériole glomérulaire afférente et initie- rait le cercle vicieux conduisant à l'insuffisance rénale aigiie. Ce cycle, une fois enclenché. expliquerait la lenteur du retour à la normale des fonctions rénales. L'hypothèse d'une endotoxine secrétée ou libérée par la lyse, agissant in situ, semble conforme aux observations cliniques, histologiques et experi- mentales.

Au niveau du rein, à coté des lésions histologiques classiques (néphrite tubulo-interstitielle), il existe des lésions glomérulaires individualisées en microscopie électronique.