UE1 Biochimie - Biologie moléculaire Pr. Cavé Le 03/10/18 de 15h30 à 17h30 Ronéotypeur : Coralie Salvador Ronéoficheur : Laura Azar

Cours n°4 : Du gène à la protéine mutante (1)

La prof a illustré son cours à travers des exemples qui sont pour certains non présents dans les diapos. Nous les avons quand même insérés dans la ronéo. Ils ne sont bien sûr pas à apprendre mais à comprendre car ce genre d’exercices peut être donné aux partiels. La prof a refusé toute implication à cette ronéo.

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Plan du cours

I. MUTATIONS A. Généralités B. Mutations constitutionnelles C. Mutations somatiques ou acquise

II. PROPRIÉTÉS GÉNÉRALES DES CANCERS

III. LES DIFFÉRENTS TYPES DE MUTATION EN ONCOGENÈSE A. Aneuploïdies B. Translocations C. Amplifications D. Gain de gènes extérieurs E. Mutations ponctuelles F. Insertions et délétions de quelques nucléotides

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I. MUTATIONS

A. Généralités

L’ADN des cellules est exposé en permanence à différents types d’agressions pouvant conduire à des mutations : - Agressions exogènes : provenant de l’environnement (radiations, agents génotoxiques) - Agressions endogènes : radicaux libres Ainsi que des processus inhérents au mode de fonctionnement de la cellule pouvant conduire à des mutations : - Erreurs de réplication - Accidents de recombinaison

La plupart de ces accidents n'ont pas de conséquences car ils ne sont pas traduits en protéine. En effet la cellule possède des systèmes des réparations qui vont corriger cela mais ces systèmes de réparation ne sont pas infaillibles. Ils vont laisser de temps en temps passer quelques erreurs et c'est ce qu’on va donc appeler des mutations.

Une mutation c'est une modification de l'information génétique dans le génome d'une cellule et donc une modification de la séquence d’ADN. Ces mutations se font suite à ces agressions diverses. Mutation est un terme générique qui parle d’une modification du génome, théoriquement cela ne signifie pas forcément que la modification a des effets délétères. Certaines mutations vont être pathogènes (la mutation va altérer la fonction d’une protéine de façon pathogène) et d’autres non pathogènes, c’est-à-dire neutres ou qui peuvent aussi améliorer une fonction (on a l’habitude de les appeler des polymorphismes). L’avancement des techniques de séquençage permet de découvrir un nombre important de mutations dont on ne peut statuer sur le caractère pathogène, d’où le fait que l’on préfère de plus en plus souvent utiliser le terme de variants génétiques pour désigner ces modifications de séquence. Le variant indique une différence par rapport à une séquence de référence sachant que les séquences de référence sont une basées sur une sorte de synthèse qui se fait sur le séquençage de milliers d'individus. Chacun d'entre nous possède des différences par rapport à cette séquence : ce sont donc des variances (pathogènes ou non pathogènes).

Les mutations sont le moteur de l’évolution : si le système de réparation corrigeait 100% des erreurs il y aurait très peu de diversité génétique et sans diversité il n’y aurait pas d’adaptation à l’environnement. Cependant, il y a aussi un risque de développer des maladies génétiques telle que la drépanocytose.

B. Mutations constitutionnelles

- Présentes avant la fécondation : soit nouvellement apparues dans la cellule germinale d’un parent (mutation de novo) ou soit transmises de génération en génération

- Peuvent aussi survenir lors des premières divisions du zygote - Présentes dans toutes les cellules de l’individu (somatiques et germinales) - Transmissibles à la descendance

Les mutations constitutionnelles pathogènes sont à l’origine des maladies génétiques monogéniques et des maladies génétiques chromosomiques.

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C. Mutations somatiques ou acquises

- Apparue dans une cellule somatique - Restreinte à un tissu somatique - Non transmissible à la descendance

Lorsque une mutation somatique confère un avantage sélectif à la cellule elle peut conduire à l’expansion d’un clone cellulaire et donc à l’origine d’une tumeur.

II. PROPRIÉTÉS GÉNÉRALES DES CANCERS

Les cellules tumorales sont très variables mais partagent certaines propriétés fondamentales : - Activation constitutive (attention ne pas confondre entre mutation constitutionnelle et le terme constitutive qui

signifie : n'est plus sensible aux régulations) des circuits de prolifération - Prolifération qui n'est plus régulée par les inhibiteurs de prolifération - Résistance à la mort cellulaire : notion importante car une cellule a énormément de moyens de se protéger

mais le meilleur moyen de se protéger reste de mourir. Donc en cas de problèmes, la cellule induit un processus d'apoptose qui sert de sécurité pour ne pas avoir des clones qui prolifèrent de façon incontrôlés. Mais si elle perd ses capacités de mourir, c'est donc une sacrée sécurité qui saute et c'est ce qu'on retrouve dans le cancer.

- Immortalité - Perte de la sénescence Ces phénomènes vont être dérégulés et incontrôlés. Les cellules tumorales vont accueillir des fonctions nouvelles comme la capacité d’angiogénèse (induction de nouveaux vaisseaux alimentant la prolifération tumorale) et la capacité d'invasion pour former des métastases.

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Les propriétés des tumeurs leur sont conférées par des altérations de l'ADN qui peuvent être des : - altérations génétiques : elles touchent la séquence de l’ADN (par exemple les mutations, les délétions) et vont

modifier la fonction et/ ou l’expression de gènes. - altérations épigénétiques qui sont des altérations qui ne vont pas modifier directement la séquence d’ADN

mais qui vont la marquer différemment c'est-à-dire envoyer des signaux particuliers pour induire l'expression des gènes. Ces signaux physiologiques vont être perturbés par la tumeur de sorte que l'expression des gènes va perdurer.

Les cancers sont considérés comme des maladies génétiques qui dans 90% résultent de mutations somatiques, on parle à ce moment de formes sporadiques : c’est une maladie génétique somatique où les altérations seront restreintes aux cellules tumorales (exemple de mosaïques avec présence au sein d’un organisme de tissus génétiquement différents mais provenant du même zygote). C’est pourquoi il faut prélever des cellules du tissu tumoral (par biopsie par exemple) pour retrouver la mutation à l’origine de cette tumeur.

En général ce n’est pas une seule mutation mais c'est tout un ensemble de mutations qui vont être acquises progressivement pour arriver un phénotype tumoral.

Il y a également des formes héréditaires de cancers (tumeurs avec prédisposition ou sporadiques) qui résultent de mutations constitutionnelles (germinales) et somatiques.

Depuis les années 1900-1910, on sait qu'il y a un aspect génétique dans les tumeurs c'est-à-dire que le génome de la cellule tumorale est différent de celui de la cellule saine. La capacité à faire des caryotypes a permis en 1960 d’observer la première translocation chromosomique récurrente (= qui était retrouvée dans plusieurs tumeurs). Il a fallu attendre les années 80 pour qu'on identifie les gènes qui étaient en cause dans cette translocation. A partir des années 2000, l'apparition de nouvelles techniques de séquençage ont décuplé les connaissances. Maintenant on sait séquencer l'ensemble des séquences codantes des cellules tumorales : l’exome. Donc le séquençage est devenu courant dans le diagnostic et le pronostic des tumeurs.

III. LES DIFFÉRENTS TYPES DE MUTATION EN ONCOGENÈSE

A. Aneuploïdies

Une aneuploïdie correspond à un nombre anormal de chromosomes qui résulte d’anomalies de disjonction à la mitose.

La technique la plus standard pour observer une aneuploïdie est l’établissement d’un caryotype. On peut aussi utiliser la FISH (fluorescence), la CGH et l’index ADN (technique de cytométrie de flux qui permet de quantifier l’ADN dans la cellule).

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B. Translocations

La translocation est une mutation génétique caractérisée par les échanges réciproques de matériel chromosomique entre des chromosomes non homologues. Les conséquences moléculaires d'une translocation sont de trois types : - Inhibition de l’expression d’un gène par cassure (= perte de fonction d'un gène) - Modification de l'expression d'un gène par échange de promoteur - Création d'un gène hybride avec production d'une protéine de fusion

Modification de l’expression d’un gène par échange de promoteur : Sur cet exemple, on peut observer sur les gènes 1 et 2 un point de cassure entre la région promotrice et l’exon n°1 puis assemblage du promoteur du gène 1 avec la séquence codante du gène 2. Si le gène 2 n’était normalement pas exprimé alors que le gêne 1 était exprimé très très fort. Le gène 2 va donc être exprimé de façon ectopique. Et si ce gène 2 est un gène qui favorise la prolifération, la cellule qui a subi cette translocation va avoir un avantage sélectif et

va donc proliférer plus. Ici on voit comment en échangeant des promoteurs on va produire anormalement une protéine et cette protéine pourra favoriser l'apparition d'une tumeur.

Exemple la translocation (14 ; 18) : La séquence va être coupée au niveau du promoteur des immunoglobulines (enhancer fort) puis transposée dans les lymphocytes B rendant l’expression du gène BLC2 dépendante de ce promoteur. Une cellule mature n’exprime normalement pas BCL2 (contrairement aux cellules immatures), gène anti-apoptotique. Dans le lymphocyte B des centres folliculaires lorsque la translocation survient et que lymphocyte vieillit, au lieu de supprimer l’expression de BCL2 et de basculer vers l’apoptose, celui-ci va continuer à exprimer BCL2 et avoir une survie anormale. Cette translocation est initiatrice dans les lymphomes folliculaires.

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Création d’un gène hybride avec production d’une protéine de fusion : La translocation va cette fois-ci se faire à l'intérieur du gène. La translocation va cette fois-ci se faire à l'intérieur du gène. Le gène 1 subit une cassure entre l’exon 2 et l’exon 3, pareil pour le gène 2 situé sur un autre chromosome. Le gène de fusion (gène « chimère ») obtenu après réunion possède le promoteur du gène 1 (qui est cette fois ci équivalent à celui du gène 2) et la partie 3’ du gène 2. Cette nouvelle séquence va pouvoir être transcrite (on obtient un « transcrit de fusion ») et si le cadre de lecture est

conservé on peut aboutir à l’expression d’une protéine qui n’existe pas habituellement (ce sera une néo-protéine avec des domaines issus du gène 1 et des domaines issus du gène 2, chaque domaine conférant une propriété à la protéine). Mais si le cadre de lecture n’est pas conservé, il va y avoir apparition d'un codon stop et donc perte de la protéine. Si cette protéine confère un avantage sélectif à la cellule cela entraîne l’apparition d’une tumeur.

Exemple de la protéine BCR-ABL : Un exemple de ce type de translocation est celui de la translocation (9 ; 22) entre le gène ABL situé sur le chromosome 9 et le gène BCR situé sur le chromosome 22. Le gène de fusion BCR-ABL a son cadre de lecture conservé par rapport aux gènes initiaux, il aboutit à un ARNm et à une protéine. Cette translocation est retrouvée dans une leucémie particulière, la leucémie myéloïde chronique (LMC). Cette LMC d’âge médian 30-60 ans se caractérise par une splénomégalie et un taux de leucocytes de 100.109 ou plus. Dans cette leucémie on peut mettre en évidence un chromosome, « Philadelphie » (appellation historique), anormal, ainsi qu’un ARNm anormal, tout deux absent d’une cellule normale et qui résultent de cette translocation (9 ; 22). ABL est une protéine localisée au niveau cytoplasmique possédant une fonction kinase, BCR a un rôle mal connu. ABL comme beaucoup de kinases a un système d’auto-inhibition, on retrouve ABL dans le cytoplasme mais celle-ci n’est pas active en tant que telle. Lorsque ABL va fusionner avec la partie 5’ de BCR il y aura possibilité de dimérisation des protéines de fusion grâce à BCR. Les deux parties tyrosines kinases de ABL vont se retrouver à proximité l’une de l’autre dans une configuration qui les rendent plus actives que dans une protéine ABL normale. Cela aboutit à une auto-phosphorylation avec phosphorylation des tyrosines sur la protéine de fusion.

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Ces tyrosines phosphorylées vont servir de site d’ancrage à la protéine Grb 2 qui va pouvoir solliciter deux voies cellulaires : la voie PI3K/AKT (responsable de la survie) et la voie RAS/MAPK-ERK (responsable de la prolifération). L’activation de ces voies entraîne la survie cellulaire et la prolifération dans des conditions anormales, ce qui est l’origine de la tumeur. Cette translocation crée donc un récepteur tyrosine kinase dans le cytoplasme à activité constitutive (= non régulée).

La connaissance de ce mécanisme donne des pistes de recherche pour développer des traitements. Le but des recherches a été d’inhiber la fonction tyrosine kinase anormale de BCR-ABL en développant un analogue de l’ATP (substrat de la kinase car donneur de phosphate), l’imatinib. Le développement de cette classe de médicament a permis un bond thérapeutique dans le traitement de la LMC.

C. Amplifications

L’amplification est un évènement d’insertion qui consiste à répliquer en tandem (un morceau à côté d’un autre) d’une séquence donnée (plusieurs centaines de bases). Si on double la séquence on la nomme duplication.

Cette augmentation du niveau d’expression des gènes crée des mini-chromosomes surnuméraires et indépendants appelées « double minute ».

Situation normale : Deux points rouges et deux points verts représentent respectivement les deux allèles de MDM2 et les deux centromères

Cette image représente une amplification de MDM2. Le gène étant hyperactivé, la protéine p53 est surinhibée.

ERB2, aussi nommé HER2 est un récepteur à activité tyrosine kinase dont le gène amplifié est en cause dans le cancer du sein (20% des femmes ayant un cancer du sein ont une mutation de ERB2).

L’immunohistochimie permet de mettre en évidence une surexpression protéique. L’anticorps anti-ERB2 est marqué en marron, le marron étant essentiellement localisé sur la membrane cellulaire, on en déduit que le récepteur ERB2 est bien surexprimé ici.

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Ces cascades de signalisation ont déjà été étudiées dans les cours précédents. Rappel : ERB2 est le récepteur médiateur du Mycobacterium leprae au niveau des cellules de Schwann, responsable de la maladie de la lèpre. Herceptine (anticorps anti-ERB2) est employé à la fois pour la lèpre et le cancer du sein.

D. Gain de gènes extérieurs

Un gène extérieur vient en général d’un virus.

Exemple de l’infection au papillomavirus :

Le papillomavirus est un virus à ADN cancérigène, responsable à 100 % des cancers du col de l’utérus. Le génome viral s’intègre dans le génome cellulaire ce qui surexprime les oncoprotéines virales E6 et E7 qui bloquent p53 et la protéine rétinoblastome (protéines essentielles pour la réparation de l’ADN).

Exemple de l’infection par le virus HTLV-1 : Human T-cell Leukemia Virus

Ce virus est à l’origine d’une leucémie (ATL : Adult T-cell Leucemie) très présente au Japon, mais peu en Europe.

TAX est une protéine virale qui active la PI3K, donc la synthèse protéique, le cycle cellulaire, la survie, et la voie de signalisation NFκb qui est une voie de l’inflammation et de survie cellulaire. 2% des sujets infectés développent un cancer quelques années après. Plusieurs mutations accumulées au cours du temps sont nécessaires pour déclencher la tumeur.

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E. Mutations ponctuelles

Une mutation est dite ponctuelle quand elle ne touche qu’un ou quelques nucléotides dans l’ADN (substitutions, insertions/délétions de quelques nucléotides).

La technique présentée est celle du séquençage de Sanger (sera approfondi en TD). Sur la séquence de référence, le nucléotide en position 235 est une C représenté en vert. Sur la séquence du patient, on relève deux signaux de couleurs différentes pour le même nucléotide, le signal vert indique que certaines séquences n’ont pas subi de substitution et le signal noir indique que d’autres ont subi une substitution C>G. La mutation est dont hétérozygote.

Dans le séquençage nouvelle génération (NGS), on séquence plusieurs fois la même séquence étudiée mais à la différence de Sanger, on ne moyenne pas l’ensemble des séquences, on les observe une par une.

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C > T au niveau de la séquence tumorale, induisant un changement de protéine (sérine > phénylalanine). Il est indiqué que pour ce nucléotide, il y a un rapport de 70C pour 68T : la mutation est donc hétérozygote car il existe deux possibilités dans la cellule, et somatique car elle ne touche pas le tissu sain.

La prof ne veut pas du tout que nous retenions le mécanisme des ATL, elle l’illustre simplement pour que nous puissions comprendre que divers mécanismes interagissent, rendant le processus tumoral complexe.

On a classé par ordre de fréquence les gènes pour lesquels on trouvait une mutation : 40% des mutations concernent le gène PLGC1 (gène de la phospholipase C).

Les mutations non synonymes sont les plus fréquentes, expliquant les altérations fonctionnelles dans la plupart des cas.

Dans une tumeur donnée, de nombreux gènes sont touchés par les mutations et il existe plusieurs types d’altérations pour chaque gène. Toutes les tumeurs

présentent des altérations différentes d’un patient à un autre.

Mutation synonyme

Le code génétique est dégénéré, plusieurs codons (appelés codons synonymes) codent pour un seul acide aminé. La substitution d’un nucléotide peut conduire à un codon synonyme, auquel cas la mutation n’aura pas de conséquences sur la protéine traduite.

Mutation faux-sens

Une mutation faux sens entraine la traduction d’une protéine anormale et donc une altération fonctionnelle.

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La prof a proposé un exercice en cours mais a précisé qu’il ne serait pas présent dans les diapos et a refusé que nous prenions des photos des diapos. Nous avons donc essayé d’expliquer au mieux mais cet exercice est juste présent à titre d’exemple et n’est certainement pas à apprendre.

Exercice proposé en cours à ne pas apprendre

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1) Quelle est cette protéine ?

Cette protéine est la protéine kinase C avec un domaine pseudo-substrat, les domaines C1a et C1b qui fixent le DAG et un domaine kinase.

2) Quelle hypothèse peut-on faire ?

Regardons le pseudo substrat dont le rôle est d’inhiber la protéine en fixant le domaine kinase. S’il est muté, le pseudo substrat ne fixe plus la kinase qui sera alors toujours activée : c’est un gain de fonction.

Concernant le domaine kinase, le nombre important de mutations évoque un gain de fonction de la protéine. Une protéine est généralement inactivée par quelques mutations.

Les mutations ne sont pas réparties au hasard, elles sont présentes dans des domaines qui induisent une activation de la protéine.

3) Comment prouver cette hypothèse ?

Pour prouver cette hypothèse de gain de fonction, on observe quelles sont les cibles de la PKC afin de mettre en évidence des anomalies de phosphorylation.

On réalise un western blot avec un gène témoin qui est l’actine dans ce cas.

IKK est une cible de la PKC, avec deux versions d’IKK. On constate qu’en présence de la PKC, IKK1/2 est phosphorylé dans le génome sauvage (WT) et que cette phosphorylation est amplifiée dans le génome muté (D427N).

La mutation de la PKC conduit bien à un gain de fonction qui est une hyperactivation de la kinase.

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Mutation non-sens

L’apparition d’un codon stop conduit à la dégradation de l’ARNm (système RNA decay) ou à la traduction d’une protéine tronquée anormale.

F. Insertions et délétions de quelques nucléotides

- Multiple de 3 : pas de décalage du cadre de lecture, il manquera seulement un ou deux acides aminés

- Non multiple de 3 : apparition d’un codon stop très fréquemment, une protéine plus courte est dégradée le plus souvent. Une protéine tronquée perd ses domaines fonctionnels aux extrémités

Exemple : à ne pas apprendre (plutôt savoir réfléchir à partir de ses connaissances)

Dans les cellules ATL, on trouve un récepteur à 7 domaines TM. On constate que les mutations sont variées, peu ciblées et les délétions évoquent plutôt une perte de fonction.

On étudie le CCR4 : récepteur à 7 DM avec de nombreuses mutations en C ter. L’hypothèse que l’on peut faire est que le récepteur ne peut se coupler à une protéine G (perte de fonction).

Lorsque l’on regarde les cibles de cette protéine G (PKA), celles-ci sont suractivées donc il y a un gain de fonction. On peut penser à la mutation du domaine qui servirait normalement à désensibiliser le récepteur aux effecteurs.

En utilisant la cytométrie en flux avec des anticorps anti CD4 pour cibler le CCR4 et CD4 (antigène spécifique des lymphocytes T), on remarque une surrépresentation à la membrane de la protéine CCR4. Celle-ci est trop synthétisée ou pas assez dégradée. La partie intracytoplasmique où avaient lieu les phosphorylations a été tronquée, empêchant la fixation de la B-arrestine, impliquée dans la dégradation du récepteur.

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Régions non codantes

Il existe beaucoup de polymorphismes dans les régions non codantes, qui restent des terrains d’étude inconnus.

Une substitution nucléotidique dans les régions 5’ non codantes peut conduire à : - Un gain de fonction (silencer) - Une perte de fonction (enhancer, promoteur) La conséquence est une altération de la transcription car le facteur de transcription ne peut se fixer sur son promoteur.

Une substitution dans un site d’épissage conduit à une altération de l’épissage.

La mutation a-t-elle un effet?

On amplifie les exons étudiés de l’ARN. Par électrophorèse, on relève qu’un des fragments a migré moins vite que l’autre. Il est donc de plus grande taille.

Après avoir séquencé ce fragment, on note qu’une séquence d’intron (TGTCAGTT) est anormalement

présente entre les deux exons. L’épissage ne s’est pas déroulé au bon endroit et l’intron va coder potentiellement pour un domaine de protéine.

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