Cours 5: Du gène à la protéine mutante Exemple de l ...

UE1: Bases moléculaires et cellulaires des pathologies-Biochimie Dr.Yoann Vial Le 08/10/2019 de15h30-17h30Ronéotypeuse: Léna Kozludere / Aziadé BenaneRonéoficheuse: Léna Kozludere

Cours 5: Du gène à la protéine mutante Exemple de l’oncogenèse

(2ème partie)

Le professeur a accepté de relire la ronéo, les modifications seront disponibles sur l’appli.

sur 18

I - Etude de délétions et perte d’hétérozygotie

1- La CGH - Array

La délétion d’un gène entier ou d’un chromosome est une perte de matériel génétique ( à distinguer des petites mutations de quelques nucléotides assimilées aux mutations ponctuelles).

On peut traiter ces délétions par la technique CGH Array. Un rappel rapide : pour faire un CGH Array (Comparative Genomic Hybridization), on compare l’hybridation de deux génomes qu’on va mettre en compétition sur une puce d’ADN. Pour commencer, il faut une puce à ADN, sur laquelle on a posé des séquences d’ADN, qui sont complémentaires du génome. Chaque petit membre sur le puce est un stock, ou il y a plusieurs fois la même séquence. On prend d’un coté l’ADN constitutionnelle du patient, qu’on trouve sur toutes ses cellules, on le fragmente et on colore avec un fluorochrome en vert, de l’autre coté on prend l’ADN du tumeur on fait la même chose, on fragmente, mais cette fois-ci on le colore en rouge. On les mélange de façon équimolaire, pour avoir autant d’ADN tumoral que d’ADN témoin. Et on va les hybrider.

Si on a autant d’ADN témoin que d’ADN tumoral, on aura autant de fragment vert que de fragment rouge qui s’hybrident. Le ratio vert sur rouge sera de 1. Par contre, s’il y'a une délétion de l’ADN tumoral (une délétion d’un gène dans la tumeur), on aura moins de marque rouge que de marque vert au niveau du spot. C’est plutôt l’ADN témoin qui va se révéler. Au contraire s’il y a une amplification d’un gène dans une tumeur, cet ADN aura un avantage de se fixer au niveau de cette région, et il y aura plus de rouge que de vert.

Sur l’image, on voit le chromosome X, plein de sondes qui sont rouges, cela signifie que ce chromosome X est dupliqué dans les tumeurs ou dans quelques cellules. Au contraire si je regarde le chromosome 9, on voit qu’il y'a du rouge sur le bras court, donc c’est plus de l’ADN tumoral, par contre il y'a du vert sur le bras long, donc on a perdu un bras long du chromosome 9. Ce sont les profils qu’on peut trouver sur les cellules tumorales avec des amplifications de certains gènes et des délétions d’autres gènes. Il s’agit d’une technique assez nouvelle d’une dizaine d’années. Avant, on pouvait déjà chercher ce type d’anomalie avec d’autres techniques. C’est ce qu’on appelle l’étude des pertes d’hétérozygotie( Loss of Heterozygositi en anglais ou LOH).

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2-Etude de perte d’hétérozygotie ou LOH (abréviation anglaise) : les marqueurs polymorphes

a- Qu’est ce qu’un marqueur génétique?

Pour étudier ces régions, on peut utiliser des marqueurs génétiques de deux types : soit les marqueurs des régions microsatellitaires, soit les polymorphismes.

Lorsqu’un gène est délété, les marqueurs génétiques flanquant vont souvent être co-délétés. Si les marqueurs co-délétés sont polymorphes, cela va générer une perte d’hétérozygotie de ce marqueur. (le prof n’a pas évoqué, mais c’est sur le diapo) La mise en évidence de pertes d’hétérozygotie par l’étude de marqueurs polymorphes permet de localiser des gènes inactivés dans les tumeurs.

Un marqueur génétique est une séquence d’ADN: -qui peut être identifiée par un test simple -de localisation génomique connue (locus spécifique) Un marqueur polymorphe est une séquence génomique qui diffère entre les membres d’une espèce et/ou entre les 2 allèles d’un individu. Il y'a les microsatellites et les Single Nucleotide Polymorphisms (SNP). Un haplotype est la combinaison des différents génotypes au niveau d’un locus chromosomique. Il correspond au génotype de plusieurs loci étroitement associés (et donc situés à proximité) dans le génome. Les microsatelittes sont des régions de répétitions des régions de 10 nucléotides, 3 à 8 nucléotides, qui sont très polymorphes, c’est à dire que ça varie d’un milieu à un autre. C’est du au fait que lorsque l’ADN polymérase arrive sur ces régions au moment de la réplication, elle voit qu’elle réplique tout le temps la même chose. Elle s’arrête, fait une pause, se repositionne, elle va un peu à l’avant, un peu à l’arrière.

On a souvent des amplifications de triplets, des nucléotides en trop ou en moins. Normalement, le système de réparation des mésappariements est efficace. On devrait pas trouver beaucoup de microsatellites. Mais parfois il n’y a pas de réparation, ces modifications peuvent être transmis d’une génération à une autre. Si on regarde un locus particulier de 24 et 26 répétitions, quelqu’un d’autre aura 27 et 28, etc.

b- Etude des pertes d’hétérozygotie (LOH)

On peut étudier ces microsatellites de manière assez simple. On design les amorces de chaque coté. On amplifie la région. Une fois qu’on a amplifié la région, on l’a fait migrer par électrophorèse sur un séquenceur et on obtient ce type d’image (Diapo 7).


On a un allèle paternel avec 12 CA, un allèle maternel avec 16 CA, et voici ce que ça donne quand on fait migrer ce fragment. On a A2 qui est plus long que le fragment A1. Ce qu’on peut voir c’est que la polymérase fait des erreurs dans nos tubes au laboratoire ou il n’y a pas de système de réparation des mésappariements, on voit apparaitre des pics en écho, c’est la polymérase qui a un coup amplifié 16 CA et un coup que 12 CA. On est ici chez un individu qui est hétérozygote pour ce microsatellite, il a d’un coté 16 répétitions et de l’autre 12 répétitions.

Maintenant, s’il a une délétion sur l’allèle paternel, on retrouvera l’allèle maternel mais pas l’allèle paternel. A partir de ces polymorphisme de longueur, on va pouvoir repérer des délétions de gènes et donc ce microsatellite qui a disparu nous importe peu, sauf s’il est dans un gène. Mais en général le microsatellite n’est pas parti seul, c’est toute la région qui a été entrainé. Si ce microsatellite est situé à proximité d’un gène, on peut suspecter que le gène qui été à coté a été emporté. C’est ce qui été utilisé historiquement et cela a permis de faire plein de découvertes de gènes suppresseurs de tumeurs.

Identification de gènes suppresseurs de tumeurs par cartographie délétionnelle

Par exemple, on a plusieurs cas de tumeurs dans des leucémies (Diapo 9). Les points noirs sur le schéma, représente une perte d’hétérozygotie. Les différents points correspondent à différents microsatellites. Téléthon a répertorié l’ensemble des microsatellites qui sont présents sur le génome et a fait les cartes précis, en précisant quel microsatellite s’amplifie avec quelle amorce et il est sur tel chromosome. p12 est un microsatellite situé sur le chromosome 12. C’est très variable. Si on prend la ligne 149 (la troisième ligne), on a une grande délétion ( perte d’hétérozygotie) sur toute les parties du bras court chromosome 12 et qui semble emporter le gène TEL, KIP1 et GDID4. On peut suspecter que l’un des trois gènes est un gène suppresseurs de tumeurs, car délété dans ces leucémies. Pour savoir lequel est un gène suppresseur de tumeurs, on continue de lire les informations des différents leucémies. Par exemple, sur la 538, il y a seulement un polymorphisme homozygote et cela prouve que le gène TEL est suppresseur de tumeurs.

La comparaison des données de cartographie de nombreuses tumeurs permet de restreindre la zone minimale de délétion et ainsi d’identifier précisément quels sont les gènes suppresseurs de tumeurs. C’était la technique historique. On est maintenant passé à une technique informative en étudiant les polymorphismes.

Dans nos cellules, on retrouve tout un cas de variations de nucléotides, la plupart n’ont pas d’impact car elles sont dans les régions non codantes. D’autres auront des impacts, par exemple je métabolise mieux tel médicament, ou je serais plus susceptible à telle infection. Et donc ces polymorphismes d’un seul nucléotide expliquent 90 pour 100 des différences entre deux individus. Ces polymorphisme, il y en a un peu partout sur le génome. Il y en a à peu près 1 sur 300 paires de bases. On les utilise de la même manière que les microsatellites pour repérer les pertes d’hétérozygotie.


Génotypage des SNP par hybridation (SNP Array)

On regarde , s’ils sont homozygotes (on a perdu un des deux allèles) ou hétérozygote ( on a les deux allèles). Pour faire ceci, on fait une technique qui ressemble à la CGH Array, c’est la SNP Array. On a un polymorphisme qu’on souhaite étudier à gauche avec Adénine, Guanine, et on utilise une puce sur laquelle on a mis une séquence complémentaire d’ADN, ces séquences vont être allèle spécifique. C’est à dire qu’on va avoir soit le T qui vas s’hybrider avec le A, soit le C avec le G. Imaginons qu’on a un individu qui ait perdu son allèle G, parce qu’il y aura une délétion qu’importe le gène à coté, il aura dans sa tumeur que l’allèle A. L’allèle A s’hybride parfaitement avec le fragment d’ADN continuant la face T, par contre il a simuler de manière instable avec l’allèle C. L’allèle A reste sur l’ADN. Ce fragment a été marqué initialement et quand on lit les fluorescences, la molécule n’a plus que l’allèle A.

A quoi sert de faire les études de pertes de chromosomes ?

Cela permet de mettre en évidence les haploinsuffisances, c’est à dire les pertes hétérozygotes d’un gène. L’haploinsuffisance est la perte d’un seul allèle fait qu’on produit deux fois moins de protéines, et cette diminution de protéines à elle seule va être délétère.

On peut avoir d’autres situations ou on va avoir la perte d’un allèle d’un coté et sur une autre allèle une mutation. On aura une activation des deux copies de gènes. C’est la description typique des gènes suppresseurs de tumeurs, ex p53, ou le gène qui code pour la protéine rétinoblastome (Rb). Aussi, grâce à ces techniques de pertes d’hétérozygotie, on met en évidence les disomies uniparentales. Dans la tumeur, par exemple sur l’allèle maternel on peut avoir une première mutation dans le gène, à elle seule n’entraine pas d’haploinsuffisance, c’est à dire que si on met moins de protéines, la cellule continue à proliférer normalement, avec un métabolisme tout a fait normal. La tumeur sélectionne, mute et par combinaison de chromosomes elle place la même mutation sur l’autre allèle. Elle recopie le chromosome maternel et le met sur le chromosome paternel. L’allèle maternel étant fonctionnel, il y aura l’activation des deux gènes. C’est un mécanisme qu’on retrouve dans les tumeurs également. On a bien les deux allèles mais si on perd le polymorphisme à proximité du gène, il sera homozygote.

c- Applications des études de SNP pangénomiques

Les études SNPs pangénomiques servent à profiler les tumeurs, savoir quels gènes ont été délétés, dans quelle région on a une homozygotie lié à des disomies parentales, etc. (copier diapos) On peut aussi utiliser ces SNPs Array pour étudier le génome constitutionnel des patients. Pour cela, on fait le GWAS ( le genom-wide association study), elle consiste de constituer deux grosses cohortes, une cohorte par exemple de patients qui a développé le cancer du colon , et une cohorte de témoins qui n’a pas développé le cancer. On regarde le cohorte qui a développé le cancer s’il y’a un polymorphisme plus fréquent que dans la cohorte de témoins. On arrive ainsi à mettre en évidence les polymorphismes de susceptibilité à développer tel cancer. On a des polymorphisme qui permettent par exemple de métaboliser tel ou tel médicament, d’autres qui sont promoteurs de cancers, etc. Les études pharmacogénomiques permettent de comprendre le lien entre les polymorphisme interindividuels et l’efficacité ou la toxicité des drogues. Par exemple on prend une cohorte répondeur et une


autre mauvais répondeur, si on trouve des SNPs différents, on suppose qu’il a un impact sur la réponse au traitement.

II - Mutations affectant le cycle cellulaire

Ces études pangénomiques ont permis d’identifier les différentes anomalies qu’on retrouve dans les cancers au niveau du cycle cellulaire. Dans un cycle cellulaire, il y’a quatre phases G1, S, G2 et M et une cinquième phase qui est la phase G0, dans laquelle les cellules sont au repos de cycle cellulaire. En phase de G0/G1, les deux chromosomes, un bleu (chromosome paternel) et un rose (chromosome maternel), sont constitués d’une seule chromatide. Durant la phase S, qui est la phase de réplication, la chromatide est dupliquée. A la fin de la phase S, en phase G2, les chromosomes ont deux chromatides chacun. Pendant la phase M (mitose), les deux chromatides sont réparti dans chacune des cellules filles.

Ce cycle cellulaire est régulé essentiellement par deux points de contrôle: - un point de contrôle qui permet la transition G1/S, c’est le moment d’initiation de la réplication, qui est régulé en grande partie par la protéine Rb (rétinoblastome) - point de contrôle G2 vers M, qui vérifie la bonne qualité de la réplication, et qui est contrôlé en grande partie par la protéine p53

1- Délétion de Rb (Rétinoblastome)

Comment les mutations dans différentes gènes peuvent venir moduler le cycle cellulaire et sa régulation? Le premier exemple est celui des délétions du gène codant pour la protéine Rb. En phase G0/G1, la protéine Rb est normalement non phosphorylé, elle s’accroche alors sur E2F qui est un facteur de transcription. A un moment, la cellule reçoit un signal mitogène, elle le lit, elle va rentrer en réplication et se diviser en deux cellules filles. Ce signal active les kinases dépendantes des cyclines, les CDK2, 4, 6. Les kinases phosphorylent la protéine Rb, qui libère alors E2F. E2F se fixe sur le promoteur de certains gènes, et active leur transcription. Ces gènes permettent la synthèse de certaines protéines et donc le passage de la phase G1 à la phase S.

Quand on perd la protéine Rb (un important gardien du cycle cellulaire), par exemple à cause d’une délétion du gène Rb (13q ), on perd le contrôle G1/S sur le cycle cellulaire, la cellule entre de manière incontrôlé dans le cycle cellulaire en phase S, puis progresser dans le cycle.

2- Délétion du locus INKA4 / ARF


Il y’a d’autres moyens d’agir sur le cycle cellulaire, un autre exemple, les délétions sur le locus INK4 ou comment faire sauter deux verrous d’un coup. Il y’a trois gènes codant des régulateurs négatifs du cycle cellulaire à proximité les uns des autres: - le gène INK4a en vert, qui code pour la protéine p16, qui est un inhibiteur des CDK - le gène INK4b qui code pour la protéine p15, aussi un inhibiteur des CDK - le gène ARF qui est chevauchant avec le gène INK4a, le promoteur du gène ARF est situé en amont du gène INKa, son exon 1 également en amont, mais les exons 2 et 3 de ce gène sont les mêmes exons 2 et 3 que le gène INK4a, sauf que ce n’est pas lu avec la même cadre de lecture, c’est pour cela que la protéine s’appelle ARF ( alternate reading frame). La protéine p14 codée par le gène ARF n’a pas la même fonction que la protéine p16 codée par le gène INK4a, car elle n’agit pas comme inhibiteur de CDK mais c’est un inhibiteur de mdm2. Mdm2 est un inhibiteur de p53, c’est une ubiquitine ligase qui fixe des groupements ubiquitines sur p53, donne l’information au protéasome pour détruire p53.

Si on a une délétion de cette région on perd: - les inhibiteurs de CDK, or les CDK phosphorylent Rb qui libèrent E2F et permettent la transition G1/S, - l’inhibition de mdm2, en perdant ARF, on aura donc plus de mdm2, et moins de p53, donc une augmentation du passage G2/M,

3- Convergence des altérations oncogéniques du cycle cellulaire

On a avec cette délétion une altération au même temps des deux points de contrôle du cycle cellulaire. Ce sont des mutations qu’on peut retrouver dans les cancers sur le contrôle du cycle cellulaire. Par exemple dans les sarcomes on a des amplifications du gène mdm2, un gain de fonction. Les amplifications du gène mdm2 ne peuvent pas être promotrice de tumeur, car quand mdm2 augmente, la cellule commence à entrer plus facilement en phase S, mais il y’a toujours d’autres points de contrôle, et le fait que cette cellule se divise plus active ARF, qui inhibe la surexpression de mdm2.

Dans les tumeurs, il faut avoir plusieurs mutations même dans la même voie, pour finalement permettre à la cellule d’échapper à tout les points de contrôle de la cellule.

III - Oncogènes et gènes suppresseurs de tumeur

1-Les conséquences des altérations génétiques

Dans cet exemple, on voit des mutations activatrices (dominantes) dans certains gènes et des mutations inactivatrices (récessives) dans d’autres, on a défini les notions d’oncogène et de gènes suppresseurs de tumeurs, qui sont les conséquences des altérations génétiques. Dans les oncogènes, on trouve des mutations activatrices d’un allèle et dans les gènes suppresseurs de tumeurs des pertes de fonction ( c’est ce qu’on a vu un peu la dernière fois). Pour en arriver à inactiver une voie, on peut passer par plusieurs mécanismes différents.

2- Plusieurs mécanismes pour inactiver la réponse de p53 dans les cancers

Plusieurs mutations peuvent intervenir: - l’augmentation de l’expression de mdm2 dans les sarcomes avec l’amplification du gène - la diminution de l’expression de ARF qui est un inhibiteur de mdm2 dans le locus INK4 - on peut avoir directement des mutations de p53, et des mutations des sites de liaison entre p53 et l’ADN - l’apport des protéines exogènes comme dans le cas de l’infection par HPV et la production de la protéine E6 qui vient inhiber directement p53


VI- Séquençage de l’exome ( ou du génome) des tumeurs

La méthode Sanger ou séquençage « classique » permet d’étudier par des techniques ciblées des séquences du génome. Cependant, cette technique présente des capacités limitées et une faible sensibilité (20-25%).

!

De nos jours, et ce depuis quelques années, sont apparues de nouvelles techniques dont le séquençage « nouvelle génération » (NGS) Ainsi, le séquençage NGS a de nombreux points forts dont: - le séquençage de masse - Séquençage de l’ensemble des régions codantes (exome: 34Mb, 160 000 exons de 23000 gènes soit 1.2%

du génome) - Séquençage génome complet (3Gb) - Une « profondeur de lecture » importante (nombre élevé de lectures indépendantes de la séquence)

permettant la détection de mutations dans des sous-clones tumoraux (<1%).

Conséquence: On n’aura pas la séquence d’un seul ADN mais de différents ADN simultanément.

Exemple: On prends une tumeur et on retire l’ADN, on ne retire pas l’ADN d’une seule cellule, mais de plusieurs cellules, des centaines voire des milliers Lors de votre préparation du séquençage « nouvelle génération », vous allez fragmenté votre ADN et selon que votre ADN vienne de telle ou telle cellule il ne sera pas fragmenté exactement au même endroit . On obtient donc plusieurs fois la même séquence: c’est ce qu’on appelle la « profondeur de lecture ». Chaque ligne correspond à un fragment initial (à une cellule présente au début du séquençage). Au début, une première mutation se produit qu’on appelle « mutation initiatrice » puis une deuxième, une troisième etc… Des mutations s’ajoutent au cours du temps, ce qui crée ainsi des cellules tumorales.

On voit ainsi des mutations sous-clonale, des mutations prépondérantes mais également des mutations que l’on retrouve 1 à 2 % dans nos tissus. Cette technique de séquençage NGS permet de voir qu’une tumeur est très hétérogène sur son profil moléculaire.


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Les cellules tumorales ont accumulé plusieurs mutations de l’ADN. Une seule mutation ne suffit pas car comme on le voit, le nombre de mutations identifié dans les cellules tumorales est majoritairement supérieur à 1. D’une part, il y a des tumeurs très mutagène avec plus de 500 mutations retrouvés dans les clones tumoraux comme c’est le cas pour le mélanome. D’autre part, on retrouve des tumeurs moins mutagène qui ont parfois une seule mutation détectée. Le nombre de mutations moyens détectés dans les différentes tumeurs est très variable. Ainsi, un cancer est plus ou moins mutagène.

V- Extension des cibles de l’oncogénèse

On a vu précédemment que les mutations peuvent être la variation d’un seul nucléotide ou aussi l’ajout d’autres mutations qui sont plutôt des modifications épigénétiques. Parmi ces modifications épigénétiques, on retrouve : - les modifications post-traductionnelles des histones - La méthylation de l’ADN - Le remodelage de la chromatine Ces modification vont agir sur la la transcription des gènes.

1- La méthylation de l’ADN: Elle correspond à un ajout réversible d’un radical méthyle (-CH3) en C5 d’une cytosine dans une séquence CG. On obtient une 5-méthylcytosine grâce à ne enzyme : l’ADN méthyle-transférasse (DNMT). Ce marquage se fait au niveau des ilots CpG. Ces derniers sont des régions de plus de 200 pb, et dont le contenu en CG est d’au moins 50%. Ils sont rares, représentent 1 à 2% du génome et sont présents dans la région promotrice des gènes. Il existe aussi des plages CpG qui sont tout de même moins riches en CG et souvent proches des promoteurs. Ainsi, les méthylations de l’ADN joue un rôle primordial car elle conditionne l’expression des gènes et plus particulièrement la répression des gènes lorsqu’un ADN est méthylé.

La DNMT transfère le méthyle sur le C5 d’une cytosine, ce qui entraine une compaction de la chromatine, ferme l’accès au promoteur de ces gènes, inactive la transcription des gènes.

Que se passe t-il quand on méthyle un ilot CpG d’un gène supresseur de tumeur ?

Les méthylations peuvent parfois être altérées : c’est le cas des cancers. Elles peuvent l’être de différentes manières et on retrouve particulièrement 2 types d’anomalies:

-la méthylation des ilots CpG du promoteur d’un gène suppresseur de tumeur : parfois les ilots CpG ne sont pas correctement méthylés ou trop méthylés, ce qui réprime la transcription du gène. Ainsi, certains gènes subissent une extinction épigénétique par méthylatuion de l’ADN ex(CNKN2A)


0.8 3.3

7.1 7.7

12 13 16 16 17 18

21

34 38

46 47

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Num

ber o

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mut

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ns

>76 235 305 502

Muramatsu ASH 2012

Les cellules tumorales ont accumulé plusieurs mutations de l’ADN

Nombres du mutations moyen détectées par exome dans différents types de cancer

Implication de gènes dont les fonctions sont très diverses (non restreintes à la prolifération cellulaire)

- l’hypométhylation d’un oncogène qui correspond à une surexpression d’un oncogène qui normalement est réprimé.

2- Modification post-traductionnelle des histones

On peut également retrouvé au niveau des cellules tumorales des modifications épigénétiques car elles n’interviennent pas directement sur l’ADN mais sur les protéines associées à l’ADN.

Les histones sont des octamères de protéine qui sont constitués de 8 protéines 2H2A, 2H2B, 2H3 et 2H4. L’ADN vient s’enrouler autour de cette histone pour former le nucléosome qui ce dernier est fermé par une histone H1. Les nucléosomes peuvent être plus au moins écartés les uns des autres, ce qui va laisser plus au moins accès au promoteur des gènes. Ainsi, les modifications post-traductionnelle des histones ont lieu sur l’extrémité N-terminale. Les histones peuvent etre acétylées ou méthylées. En cas d’acétylation, on observe une décompaction de la chromatine, ce qui active l’expression des gènes. Cependant, la méthylation de ces queues d’histone va entrainer une répression de l’expression des gènes

Exemple de mutation d’un sytème de modification post-traductionnelle des histones :

Plusieurs mutations ont été découvertes dans certains cancers, ce qui implique des gènes codant pour des protéines qui marquent les histones.

Par exemple, le complexe protéique Polycomb 2 (PRC2) est constitué de plusieurs protéines dont la protéine EZH2 qui est Histone-Lysine-N-methyltransférase. Il s’agit d’une enzyme qui est capable de méthyler la lysine 27 de l’histone H3. Ce qui entraine une compaction de la chromatine, donc une a une diminution de l’expression du gène qui est en aval de ces histones méthylées.

Dans certains cancers PRC2 est inactif , on a donc plus d’action de la méthyle transférase. Nos histones ne sont plus méthylées, ce qui laisse libre cours à d’autres protéines d’agir. Les histones sont alors acétylées, ce qui ouvre la chromatine et lui permet d’être reconnue par des protéines à bromodomaines. Ces dernières se déplacent avec les facteurs de transcription jusqu’à activer l’expression de ces gènes.

Ainsi, des mutations dans les gènes des protéines qui codent pour le

complexe PRC2, entrainent une dépression transcriptionnelle des gènes régulés par ce complexe.

Les systèmes cellulaires ciblés par les mutations convergent sur les voies multiples, complémentaires et qui s’ajoutent entre elles pour acquérir un génotype cancéreux.


PRC2 actif PRC2 inactif

Le complexe répresseur polycombest inactif dans certaines tumeurs

Protéines à bromodomaines

Dérepression transcriptionnelle des gènes régulés par le PRC2

Modifications épigénétique/transcription

¾ Exemple de mutation d’un système de modification post-traductionnelle des histones

Mutation dans les cancers

EZH2 : Histone-lysine N-methyltransferase

Complexe répresseur Polycomb (PRC2)

PRC2 : Polycomb repressive complex 2

Extension des cibles de l’oncogénèseau contrôle de l’expression des gènes

Chaque mutation va apporter une ou éventuellement deux caractéristiques ou marques aux cellules tumorales. Par exemple: -l’inactivation de RB1 donne comme marque génétique à la cellule une insensibilité aux inhibiteurs de prolifération. -Quand on active la voie RAS par les facteurs de croissance, on donne à la cellule la possibilité d’activer des circuits de prolifération. -Quand on inactive p53, la cellule est donc capable de résister à la mort cellulaire.

Ainsi, la cellule doit accumuler plusieurs altérations de l’ADN pour acquérir un phénotype cancéreux. Aucune mutation ne rend compte à elle seule de l’ensemble des perturbations.

Complémentarité des altérations oncogéniques :

Parfois, les mutations peuvent arriver dans les mêmes voies génétiques. Comme vu précédemment, dans une cellule normale, si j’amplifie mdm2 , elle va activer l’expression de ARF. Ce dernier inhibe mdm2 et élimine cet effet tumorogène de mdm2 dans la cellule. Il va donc falloir une deuxième mutation sur la même voie. Ainsi, ces cellules doivent énormément mutées pour devenir tumorale.

VI- Le développement d’un cancer

Le cancer est un processus multi-étapes, la cellule doit accumuler plusieurs altérations de l’ADN pour acquérir un phénotype cancéreux. Le développement d’un cancer s’explique par des arguments épidémiologiques (la vieillesse), anatomo-pathologiques et expérimentaux. Il faut un certain temps pour développer un cancer.

Par exemple, le cancer colorectal débute par un colon tout à fait normal et un épithélium colique normal. L’acquisition d’une première mutation de APC, qui est une protéine permettant de vérifier la bonne ségrégation des chromosomes dans la cellule, amène à la formation de polypes qui sont de petit adénomes bénins. Une deuxième mutation dans la voie RAS peut intervenir. Celle-ci active la prolifération et la formation d’adénomes malins. Suite à ce smutations, la cellule sera insensible à l’apoptose. Enfin, des mutations de PI3K donne naissance à un carcinome qui est une tumeur maligne du cancer du colon.


Systèmes cellulaires cibles par les mutations

Activation des circuits de

prolifération

Résistance à la mort cellulaire

Capacité d’angiogénèse

Insensibilité aux inhibiteurs de prolifération

Capacité d’invasion et de métastase

Immortalité (perte de la senescence)

Inactivation P53Inactivation

P53, ARF, RB1, CDKN2A, …

Activation de la signalisation par les facteurs de croissance (RAS, HER2, PI3K, …)

D‘après Hanahan et Weinberg (Cell; 2011)

Aucune mutation ne rend compte à elle seule de l’ensemble des perturbationsLa cellule doit accumuler plusieurs altérations de l’ADN pour acquérir un phénotype cancéreux

Complémentarité des altérations oncogéniques

GoG1

SG2

M

E2F pRB

CDK2/4/6

CDK1/2

P21 P53 mdm2 ARF RASBCR-ABL…

P15INK4B et P16INK4A

�

�

�

� �Certains oncogènes n’exerceront leur effet que si le point de contrôle a été inactivé

Le développement d’un cancer

Arguments épidémiologiques, anatomo-pathologiques et expérimentaux

� Le cancer est un processus multi-étapes

� La cellule doit accumuler plusieurs altérations de l’ADN pour acquérir un phénotype cancéreux

Progression du cancer colorectal avec polypose

Vogelstein et al., 2015

VII. Clonalité tumorale

Toutes les cellules tumorales proviennent d’une même cellule à l’origine. La cellule dans laquelle s’est produite l’altération initiatrice de la tumeur( mutation activatrice d’un oncogène ou inhibitrice d’un gène suppresseur de tumeur), va donner naissance au clone tumoral. Ensuite, l’accumulation au cours du temps, de mutations somatiques dans une partie des cellules donnent naissance à des sous-clones qui sont en compétition les uns des autres. On assiste à un processus de mutations/sélections successives avec des interactions entre la tumeur et l’environnement comparable à la sélection naturelle de Darwin. Du fait donc de l’accumulation et des mutations secondaires, on un matériel tumoral très hétérogène.

Par exemple, une cellule donne un sous-clone, et une nouvelle mutation apparait. Si la mutation est avantageuse, il sera mieux dans son environnement et arrivera plus facilement à récupérer des nutriments. Le sous-clone se divise plus, prends plus de place et donne plus de cellules filles.

Il existe deux modèles de développement tumoral, dépendant de la cellule développant le clone. D’une part, le développement linéaire qui est un processus long. Une première mutation, mutation initiatrice, donne un sous-clone qui lui transmet une autre mutation à la génération qui suit jusqu’à aboutir à une cellule tumorale plutôt hétérogène. D’autre part, il existe un modèle de développement ramifié. Une cellule possède une mutation initiatrice, et chaque sous-clone ayant acquis une mutation se prolifère ainsi de son coté. En fait on aura tout un tas de cellules avec des mutations différentes au sein de la tumeur. Ce modèle est plus rapide que le développement linéaire.

Grace aux nouvelles méthodes de séquençage, on est capable d’identifier les mutations sous clonale au niveau de chaque cellule. Ce qui permet de mieux comprendre l’hétérogénéité des cellules tumorales. Cela permet également de réduire les impacts cliniques,. En effet, dans le cas ou un clone s’est fortement multiplié, en traitant le patient avec une thérapie ciblée permettra d’éliminer le clone voulu. Cependant, il restera d’autres clones qui vont pouvoir entrainer une rechute.


Progression tumorale par acquisitions successives d’anomalies génétiques

Modèle de développement linéaire

Population cellulaire normale

Homéostasie :Maintien d’un pool de cellules souches et production régulée de cellules matures

Modèle de développement ramifié









Diagnostic de la tumeur


L’hétérogénéité d’une tumeur renseigne sur la séquence d’apparition d’une mutation

Exemple d’une tumeur solide, un tumeur rénale.

Si on étudie les cellules de cette tumeur, on remarque qu’elles auront pas tout à fait les mêmes mutations. Toutes les cellules auront la même mutation initiatrice A, qui a permit a la cellule d’avoir un avantage sur les cellules rénales. De plus, on constate que la mutation B est identique pour les cellules tumorales des 2 régions contrairement aux mutations C et D.

Et de la même manière, si on prends la métastase pulmonaire, on aura la même mutation initiatrice mais aussi d’autres mutations qui vont donner a la cellule des propriétés migratoires. Ainsi, en séquençant des tumeurs entières, on peut reconstruire l’arbre phylogénétique qui a permit son apparition et l’acquisition du caractère métastase.

VIII- Comment une cellule tumorale parvient à accumuler plusieurs altérations de son ADN

Il existe un tas de système de réparation, de contrôle et de rétro-contrôle dans les cellules. De ce fait, comment une cellule peut devenir tumorale ? Pour qu’une cellule devienne tumorale, différentes mutations doivent apparaitre et survenir sur des gènes particuliers. Elles peuvent activatrices dans certains gènes ou inhibitrices dans d’autres gènes. Elles peuvent etre dues à l’exposition de la cellule à différentes agressions exogènes (environnement, agents chimiques, rayons X, UV, virus), à l’exposition aux agressions endogènes (radicaux libres), aux altérations spontanées, au erreurs de réplication de l’ADN et à la fidélité du système de réparation.

1-Qu’est ce qui va promouvoir l’apparition des mutations ?

Tout d’abord, l’exposition aux agents mutagènes : tabac, pollution, type de régime alimentaire. Puis, la fidélité du système de réparation.Ainsi, plus une cellule se divise et plus elle a de chance d’accumuler des mutations. Cela a été démontré par Tomasetti et Vogelstein. Ils étudient les différents tissus de l’organisme et les classent en fonction du nombre de divisions cellulaires et du risque de développer un cancer. Par exemple, les cellules du tube digestif se divisent énormément et mettent du temps à se renouveler. On constate aussi que le cancer du colon est le plus fréquent. En revanche, certaines cellules se divisent plus lentement comme les cellules ostéosarcome de la tête. Ainsi, plus une cellule se divise et plus elle accumule des évènements qui permettent l’apparition d’une tumeur.


Watson, Nat Rev Genet 2013

Tissus normal

Métastase

Tumeur primaireRégion 1

Tumeur primaireRégion 2

Mutation AintiatriceTumeur rénale - région 1

Tumeur rénale - région 2

Métastase pulmonaire

L’hétérogénéité d’une tumeur nous renseigne sur la séquence d’apparition des mutations

Vogelstein and Tomasetti, Science 2015

“Tomasetti and Vogelstein reasoned, the tissues that host the greatestnumber of stem cell divisions are those most vulnerable to cancer.When Tomasetti crunched the numbers and compared them with actualcancer statistics, he concluded that this theory explained two-thirds ofall cancers.”

Pourquoi un cancer ? Pourquoi des mutations ?

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2-La leçon des éléphants

Suivant ce principe, plus un animal est gros, nombreuses sont ses cellules. De ce fait, plusieurs divisions ont eu lieu pour atteindre cette taille.Il a donc plus de chance de développer un cancer. Ainsi, certains chercheurs classent les animaux en fonction de leur taille, de leur durée de vie et également du pourcentage de tumeur rencontré pour chacun d’eux.

Si le nombre de cellules et de divisions cellulaires sont les principaux déterminants de l’accumulation de mutations oncogéniques, alors le risque de cancer devrait augmenter avec la taille corporelle (nombre de cellules) et la durée de vie (nombre de division cellulaires) des animaux.

Prenons l’exemple des mammifères. On remarque que le tasmanian développe un taux élevé de tumeurs par rapport à leur poids et leur taille. Cependant, l’éléphant ayant un gros gabarit et une longue vie, ne développe presqu’aucune tumeur.

On prends les lymphocytes d’éléphant et on les compare avec des lymphocytes humains. Puis, on leur administre des radiations ionisantes entraînant des cassures de l’ADN pour après mesurer le taux de mort cellulaire par apoptose. A la même dosée radiations ionisantes, les cellules lymphocytaires de l’éléphant vont beaucoup plus entrer en apoptose que les cellules humaines. Notons que l’apoptose est une protection en cas de cassure de l’ADN car on active p53 pour freiner le cycle cellulaire. En effet, pour 6 graines, on remarque au bout de 24h que 50% des cellules de l’éléphant rentre en apoptose contrairement à l’ Homme ou on en retrouve que 30%. Ainsi, l’éléphant a la capacité de se protéger des radiations ionisantes en faisant mourir ses cellules beaucoup plus que l’Homme, il a donc une meilleure régulation exogène. Cela est due au fait que l’éléphant possède 40 copies du gène p53. A présent, si on compare l’éléphant, l’homme sain ayant deux copies de l’allèle p53 et une personne atteinte du syndrome de Li Fraumeni. Cette maladie rend compte de mutations constitutionnelles (faux-sens ou délétions) du gène p53. Il n’y a donc qu’un seul allèle fonctionnel du gène p53. Ainsi, chez ces individus, la réponse aux irradiations est moins importante avec seulement 2.5% des cellules en apoptose.

Les personnes atteintes du syndrome de Li-Fraumeni développent des cancers à répétition car ce au cours de leur vie et cela dès leur plus jeune âge. Ces patients ne peuvent recevoir de radiothérapie car cela entrainerait les cellules vers l’apoptose en formant des tumeurs secondaires en réponse aux irradiations.

On constate une corrélation entre le nombre de copies de p53 et la protection face aux cancers. Ainsi, nous ne sommes pas tous égaux face au cancer.

3-Signatures mutationnelles

Le taux et la nature des mutations varie énormément d’un type de cancer à l’autre. Par exemple, les tumeurs pédiatriques, contiennent peu de mutations car l’organisme n’a pas eu le temps de les accumuler. En revanche, les organes en contact avec l’extérieur, subissent plus de mutations par les agressions exogènes.


Abegglen et al., JAMA 2015

Si vous aviez comme moi 40 copies de

P53!

La leçon des éléphants

Abegglen et al., JAMA 2015

Si vous aviez comme moi 40 copies de

P53!

La leçon des éléphants

Les signatures mutationnelles correspondent en fait à des processus oncogéniques distincts.

De plus, l’exposition à des toxiques est à l’origine du cancer du poumon entrainant des transversions G>T dues aux hydrocarbones aromatiques (tabac). Aussi, le mélanome entraine des transitions TT>GT (dipyrimidines) dues aux UV. Concernant les tumeurs liées au vieillissement, elles sont composées d’altérations spontanées accumulées au cours du temps. De meme , on a mis en évidence des signatures mutationnelles qui témoignent d’une instabilité du génome.En général, il s ‘agit de défaut de systèmes de réparation (ex: lymphocytes et recombinaison V(D)J)

4-Les différents points de contrôle

Lors d’un cancer, les différents points de contrôle peuvent etre altérés: - controle de la stabilité chromosomique: point de contrôle G2/M (p53). ex: syndrome de Li-Fraumeni : les mutations de p53 entraine une perte de la stabilité chromosomique et donc diminue l’apoptose et favorise le passage de G2/M.

-Sytème de réparation des mésappariements: intervient lorsque les mutations de l’ADN résultent d’erreurs de la réplication (dérapage de l’ADN polymérase)

-Système de réparation NER (Nucleotide Excision Repair) Système de réparation de mutations induites par des carcinogènes environnementaux (UV, carcinogènes chimiques).

5-Système de réparation des mésappariements

Il intervient lorsque les mutations de l’ADN résultent d’erreurs de la réplication (dérapage de l’ADN polymérase). Il comprends les gènes hMSH2, hMLH1, hPMS2, hMSH6.

Par exemple, les enfants lune s’ils sont exposés aux UV, ils développent systématiquement des mélanomes dès leur plus jeune âge (4 ans). Leur seule solution est de les préserver de la lumière. Ils présentent des mutations constitutionnelles dans des gènes de réparation et entraine la formation des digères de thymine. Ces mutations interviennent soit directement au niveau des protéines qui permettent l’excision des dimères de thymine, soit au niveau d’un autre complexe protéique qui s’appelle TL2H. Ce dernier va devancer l’ARN polymérase lors de la transcription et va repérer les dimères de thymine. Les protéines du système NER vont réparer ces dimères de thymine pour reprendre la transcription. Ainsi, les gènes transcrits peuvent etre réparé grâce aux différents points de contrôle.

Le sytème de réparation des mésappariements est un système de réparation qui est très conservé et met en jeu diverses protéines.

Prenons l’exemple des régions satellitaires. La polymérase se décroche, ne se fixe pas au bon endroit et entraine l’ajout d’un dinucléotide ou d’un trinucléotide. Or, lorsque le système de réparation des mésappariements ne fonctionne pas correctement, les mésappariements ne sont pas réparés ce qui entraine une extension de ces régions microsatellitaires. Ainsi, des instabilités au niveau de ces régions peuvent apparaitre. Si elles surviennent dans des régions non exogéniques, cela importe peu. Par contre, s’il s’agit d’exons, cela aboutira à la synthèse de protéines tronquées ou l’arrêt de la synthèse de protéines.


Muramatsu ASH 2012

0.8 3.3

7.1 7.7

12 13 16 16 17 18

21

34 38

46 47

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Num

ber o

f som

atic

mut

atio

ns

>76 235 305 502

Agressions exogènes

Tumeurs pédiatriques

Signatures mutationnelles

Le taux et la nature des mutations varie énormément d’un type de cancer à l’autre � « Signature mutationnelles » correspondant à des processus

oncogéniques distincts

Exemple: Le cancer du colon héréditaire non polyposique (HNPCC) En cas de mutations constitutionnelles dans les gènes qui codent pour des protéines du système de réparation des mésappariements, et particulièrement MLH1, cela est responsable de forme familiale de cancer du colon. Il s’agit généralement d’une maladie à transmission autosomique dominante. Il existe également une prédisposition génétique, car dans ces familles on constate une augmentation du nombre de cancers de colon de génération en génération.

Au niveau des amorces qui se mettent de part et d’autres d’un microsatellite, on constate 2 pics au niveau des cellules normales. En revanche, au niveau des cellules tumorales, on constate tout un tas de pics ce qui souligne la variation du nombre de microsatellites et donc de l’hétérogénéité génétique existante.

Si ces modifications du nombre de répétition intervient dans des microsatelites qui sont intergéniques (qui ne sont pas dans des gènes) cela n’a pas d’importance. Cependant si cela intervient au niveau d’un gène particulier, cela peut entrainer la perte de la fonction de ce gène.

6-Extension de la notion de gène suppresseur de tumeur:

Il existe différents gènes suppresseurs de tumeurs à savoir, les anti-oncogènes, les gènes de contrôles des altérations de l’ADN et les gènes de réparation. Lorsqu’ils sont inactivés, ils donnent un risque plus important d’avoir une tumeur. La conséquence sera indirecte puisqu’elle va favoriser la mutation de gènes suppresseurs de tumeurs et augmenter le taux de mutation dans la tumeur.

On sait maintenant détecter les mutations, le nouveau défi des années qui viennent est de comprendre les conséquences fonctionnelles des mutations car même s’il y a 500 mutations, à priori toutes ne vont pas être nécessaire. Un certain nombre de mutations seront conductrices, c’est-à-dire qui conduisent et activent la progression tumorale, et d’autres mutations passagères qui n’ont pas de rôle propre fonctionnelle dans les tumeurs.


Instabilité des microsatellites

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

¥

¥

ctttttttcc tggcaggttt atcttttttt aaaatatcag ccaccagtca gacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cgcacaccca ctcccacaac acacacaatc ccactcacaa ttttttattg tgtatggtac atttagcagt tggggaagaa tgtaacttta

1-6 pb répétitions en tandem ex : (CA)n

[D9S171]

Cellules normales

Cellules tumorales

Allele 1 (A1)(origine paternelle)

Allele 2 (A2)(origine maternelle)

(CA)12

(CA)16

Chr 9

9p13

Comment diagnostiquer une tumeur avec instabilité de la réparation des mésappariements très simplement à partir de la tumeur ?

Cancer du colon héréditaire non polyposique(HNPCC)

Propriétés facilitatrices

Caractéristiques émergentes

Reprogrammation énergétique

Instabilité génomique

Echappement immun

Inflammation

Les cellules tumoralespartagent certaines propriétés

Hanahan et Weinberg (Cell; 2011)

7-Tout ça pourquoi?

L’identification des oncogènes/gènes suppresseurs de tumeur et la compréhension de la structure des tumeurs permet: -de caractériser les propriétés des cellules tumorales - d’améliorer le diagnostic, la classification et l’évaluation pronostique des cancers - d’envisager des « thérapeutiques ciblées »


Pour les partiels, vous devez connaitre les différentes grandes définitions, les grands principes des cellules

cancéreuses:

- mutations constitutionnelles, somatiques

- gènes suppresseurs de tumeurs, les oncogènes

- mutations activatrices des oncogènes, inhibitrice des gènes suppresseurs de tumeurs

- tumeurs hétérogènes

- quelques exemples du cours

- voies biochimiques qui sont dans les autres cours et que l’on va voir en ED (comprendre les conséquences des

mutations sur les cellules cancéreuses )

- le cycle cellulaire

- HER2 (mutation)

- marques de cancers

sur 18

Cours 5: Du gène à la protéine mutante Exemple de l ...

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