Contribution à l’étude des probiotiques et prébiotiques ...

الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية

وزارة التعليم العالي و البحث العلمي

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTAIRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE D’ORAN

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

LABORATOIRE DE GENETIQUE MICROBIENNE

Mémoire de fin d’étude

En vue de l’obtention du Diplôme de Magister

En Biologie

OPTION : Biologie moléculaire et génétique des microorganismes

Thème

Mer AOUES Abdelkader Président Professeur Université d’ORAN

Mme Mesli-Taleb Farida Examinateur Professeur Université d’ORAN

Mer BEKKADA Ahmed Examinateur MCA Centre universitaire Ghelizane

er

2012-2013

Contribution à l’étude des probiotiques et prébiotiques comme alternatives aux antibiotiques

en aviculture

Présenté par : LAROUCI Saliha

M Bensalah Farid Encadreur Professeur Université d’ORAN Soutenue le 20 octobre 2013

Remerciement

Louanges à dieu de nous avoir illuminé le chemin du savoir et nous avoir aidé.

Au terme de ce travail, je tiens à exprimer mes remerciements les plus sincères aux personnes

qui ont contribué de loin ou de prés à l’élaboration de ce mémoire.

J’adresse tout d’abord mes sincères remerciement à Pr BENSALAH Farid, directeur du

Laboratoire de Génétique Microbienne, pour m’avoir encadré et permis de réalisé ce travail

au sein de son laboratoire, je tiens a lui exprimer ma reconnaissance pour la qualité de son

savoir faire, de ses compétences, ses conseils et orientations scientifiques tout le long de ce

travail, je lui exprime ma profonde gratitude pour tout les efforts et le temps qu’il m’a

consacré pour réaliser ce travail.

J’adresse mes vifs remerciements à Pr TALEB- MESLI Farida pour sa gentillesse d’avoir

accepter d’examiner mon travail.

Je remercie aussi les membres de jury :

Pr AOUES Abdelkader de m’avoir honoré en acceptant de présider le jury.

Dr BEKKADA Ahmed d’avoir accepté d’examiner mon travail.

Je témoigne toute ma reconnaissance à mes chers parents, pour leur amour et leur soutien

durant toutes mes années d’études.

Enfin, je remercie tous mes amis, mes proches et toutes les personnes qui me sont chères à

moi pour leur soutien, leur patience, leur compréhension…

Liste des abréviations

Liste des tableaux

Liste des figures

Résumé

Abstract

ملخص

Introduction générale…………………………………………………………………………….

Synthèse bibliographique

Chapitre 1 : Généralités

1. Le microbiote intestinal chez la volaille………………………………………………………

3. Description de la flore digestive du poulet et localisation dans le tractus………………….

2. Description du tube digestif chez la volaille……………………………………………... …..

4. Les pathogènes entériques de la volaille digestif………………………………………..........

4.1. Maladies entériques chez la volaille ……………………………………………………

4.1.1. Escherichia coli ……………………………………………………………………

4.1.2. Salmonella…………………………………………………………………………

5. Contrôle des infections entériques chez la volaille……………………...................................

Chapitre 2 : les probiotiques en aviculture

1. histoire d’utilisation des probiotiques en alimentation animale…………………………….

2. Définition des probiotiques…………………………………………………………………….

3. Les micro-organismes probiotiques autorisés aujourd’hui en alimentation avicole……...

4. Critères de sélection des probiotiques………………………………………………………..

5. Les différents microorganismes probiotiques en aviculture et leurs caractéristiques…….

5.1. Le genre Lactobacillus ………………………………………………………………..

5.2. Le genre Streptococcus………………………………………………………...............

5.3. Le genre Enterococcus………………………………………………………................

5.4. Les genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella …………………………………...

5.5. Les genres Pediococcus ………………………………………………………………..

5.6. Le genre Bifidobacterium……………………………………………………………...

5.7. Les levures……………………………………………………………………………

6. Production de substances antimicrobiennes…………………………………………………

7. Efficacités des probiotique en aviculture……………………………………………………..

7.1 Efficacité sanitaire des probiotiques …………………………………………………..

7.2 Efficacité zootechnique des probiotiques ……………………………………………..

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Chapitre 3 : les prébiotiques

1. Définition Prébiotiques ………………………………………………………………………..

2. Différentes classes des prébiotiques …………………………………………………………

2.1. Les hexoses……………………………………………………………………………….

2.2. Les disaccharides naturels ……………………………………………………………….

2.3. Les oligosaccharides ……………………………………………………………………..

3. Mode d’action des prébiotiques ………………………………………………………………

4. Caractérisation des exopolysaccharides (prébiotique)…………………………………….

4.1 Classification des EPS des bactéries lactiques…………………………………………..

4.2 Production et détection des EPS …………………………………………………….

4.2.1 Détection de polysaccharides exo-cellulaires……………………………………

4.2.2 Examen visuel …………………………………………………………………….

4.2.3 Les colorations…………………………………………………………………….

4.3 Extraction et purification ……………………………………………………………...

4.4 Dosage colorimétrique des EPS purifiés………………………………………………

4.5 Caractérisation des EPS à l’échelle chromatographique…………………………….

5. Effet des prébiotiques en aviculture ………………………………………………………….

Chapitre 4 : Approche moléculaire

1. l’ADNr 16S comme sémantide bactérienne ………………………………………………….

2. Les méthodes d’identification…………………………………………………………………

2.1. Identification des bactéries par l’ADNr-16S………………………………………………

2.2. Identification bactérienne avec amorces oligonucléotidiques (Amplification génique)…

3. Amplification par PCR………………………………………………………………………..

4. Séquençage de l’ADN………………………………………………………………………….

5. Taxonomie des bactéries lactiques ……………………………………………………………

Matériels et méthodes

1.Échantillonnage ………………………………………………………………………………..

2. Isolement et purification des souches…………………………………………………………

3. Conservation des souches……………………………………………………………………..

4. Souche de référence utilisé ……………………………………………………………………

5. Caractérisation phénotypique………………………………………………………………...

5.1. Examen macroscopique………………………………………………………………….

5.2. Examen microscopique…………………………………………………………………..

5.3. Test de la catalase ………………………………………………………………………..

6. recherche des bactéries mucoides……………………………………………………………..

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6.1. Production et caractérisation des exopolysaccharides (EPS)…………………………

6.1.1. formation des exopolysaccharides ………………………………………………

6.1.2. Mise en évidence des EPS Mise en évidence des EPS en milieu solide au rouge

de ruthénium……………………………………………………………………………….

6.1. 3 Mise en évidence des EPS par microscopie………………….………………….

6.1.4. Extraction des EPS...………….…………………………………………………..

6.1.5 Lyophilisation des EPS……………………...……………………………………..

6.1.6 Dosage colorimétrique des EPS ………………………………………………......

6.1 .7. Activité rhéologique………………………………………………………………

6.2. Analyse de la composition des EPS…………………………………………………... ..

6.2.1 L’hydrolyse des EPS………………………………………………………………

6.2.2 Chromatographie sur couche mince des oses constitutifs des polysaccharides ..

7. Etude de l’activité antimicrobienne des souches probiotiques isolées du tractus digestif vis-à-

vis de souches pathogènes………………………………………………………………….

7.1. Nature de la substance inhibitrice ...................................................................................

8. Caractérisation moléculaire des probiotiques ……………………………………………….

8.1. Extraction d’ADN………………………………………………………………………..

8.1.1. Extraction d’ADN par utilisation de MOBIO KIT……………………………...

8.1.2. Extraction d’ADNr 16S dans sa totalité (1500pb)……………………………….

8.1.3. Vérification qualitatif de l’ADN extrait………………………………………….

8.2. Amplification……………………………………………………………………………..

8.2.1. Amplification de la région interne de l’ADNr 16S (480 pb) du genre

Lactobacillus sp……………………………………………………………………………….......

8.2.2. Séquençage et taxonomie des souches lactobacilles de la flore intestinale ……

8.2.3. Amplification du gène ADNr 16S (1500 pb) dans sa totalité…………………..

8.3. Electrophorèse sur gel d’agarose………………………………………………………..

Résultats et discussion

1. Caractérisation phénotypique ………………………………………………………………..

2. Mise en évidence et caractérisation des EPS…………………………………………………

2.1. Production des exopolysaccharides sur milieux solide…………………………………

2.2. Production des EPS en milieux liquide…………………………………………………

2.3. Mise en évidence des colonies mucoïdes blanchâtres en présence de colorant rouge de

ruthénium sur milieu solide ………………………………………………………………….

2.4. Mise en évidence des EPS par microscopie ……………………………………………..

2.5 Extraction des EPS ……………………………………………………………………….

2.6. Lyophilisation des EPS …………………………………………………………………..

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2.7. Propriétés rhéologiques des EPS………………………………………………………..

2.8. Dosage colorimétrique …………………………………………………………………..

2.9. Chromatographie sur couche mince des oses constitutifs des différents

polysaccharides……………………………………………………………………………………

3. Etude de l’activité antimicrobienne des souches probiotique de la collection LGM………

4. Caractérisation moléculaire des souches probiotiques ……………………………………...

4.1. Identification du genre Lactobacillus spp. par amplification d’une région interne du gène

ADNr 16S ……………………………………………………………………………….

4.2 Séquençage et taxonomie des souches de la flore intestinale…………………………..

4.3. Amplification du gène de l’ADNr 16S à base de PCR de quelques isolats…………...

Conclusion et perspective………………………………………………………………………...

Références bibliographiques

Annexes

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Liste des Abréviation

Noms de genres bactériens

E.: Escherichia

Lb.: Lactobacillus

Lc. : Lactococcus

S. : Staphylococcus

St. : Streptococcus

sp. : Espèce non précisée

ssp. : Sous espèce

Unités de mesures

C° : Degré Celsius

cm, mm, nm : Centimètre, millimètre, nanomètre

g, mg : Gramme, milligramme

h, min, s : heure, minute, seconde

l, ml, μl : Litre, millilitre, microlitre

M, mM : Molaire, millimolaire

N : Normalité

rpm : Rotation par minute

U : Unité

UI : Unité Internationale

V/V : Volume par volume

Autres abréviations

ADN : Acide Désoxyribonucléique

AFCA-CIAL : Association des Fabricants de Compléments pour l'Alimentation animale

ATCC: American Type Culture Collection

BET: Bromure d’Ethidium

dNTP :desoxynucléotides

DO : Densité Optique

EDTA : Acide Ethylene Diamine Tetra acétique

EPS: Exopolysaccharides

FAO: Food and Agriculture Organization

FEMS: Federation of European Microbiological Societies

G+C: Guanine + Cytosine

GRAS: Generally Regarded As Safe

INRA: Institut National de la Recherche Agronomique

LAB : bactéries lactiques

LGM: Laboratoire De Génétique Microbienne

M : marqueur de taille

MRS : de Man-Rogosa et Sharp

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

Pb : paire de base

PCR : polymerase chain réaction

pH : Potentiel d’Hydrogène

qsp : Quantité suffisante pour

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

TBE : tris-borate-EDTA

TES : Tris-EDTA-saccharose

Tris : trishydroxyméthylaminométhane

UFC : Unité Formant Colonie

UV: Ultra Violet

WHO: World Health Organization

CCM: chromatographie sur couche mince

TLC: thin layer chromatography

Liste des tableaux

Tableau 1: Nombre de bactéries viables (log10 / g de contenu) des groupes majoritaires dan

le tube digestif du poulet (d’après Smith, 1965)

Tableau 2 : Micro-organismes probiotiques autorisés en Europe pour la volaille (liste publiée

par l’AFCA-CIAL, dernière mise à jour Mars 2009).

Tableau 3 : Principaux critères de sélection des probiotiques. Adapté de (Klaenhammer and

Kullen 1999; Saarela, Mogensen et al. 2000; Ouwehand, Salminen et al. 2002; Gueimonde

and Salminen 2006).

Tableau 4 : Exemples d’effets probiotiques récemment démontrés en élevage avicole (adapté

de Bernardeau et al., 2006).

Tableau 5 : valeurs obtenues permettant de tracer la courbe d’étalonnage de glucose (0-120

mg eq glucose/l).

Tableau 6: Résultats des différentes concentrations des EPS exprimés en mg eq. glucose/l

Tableau 7 : les différent RF obtenus sur le système 1 (acide acétique /chloroforme/ eau).

Tableau 8 : activité antibactérienne des différents isolats LGM contre des souches

pathogènes.

Tableau 9 : effet inhibiteur des surnageants natifs

Liste des figures

Figure 1: Schéma du tractus digestif des volailles et valeurs des pH des contenus digestifs

(Farner 1942).

Figure 2 : Représentation des différents genres microbiens autorisés en tant qu’additifs en

alimentation avicole en Europe (adapté de AFCA-CIAL, Mars 2009).

Figure 3 : les étapes de déroulement de la PCR.

Figure 4 : Arbre phylogénétique des principaux genres de bactéries lactiques et des genres

associés, obtenu par analyse des ARNr 16S (Stiles et Holzapfel, 1997).

Figure 5 : photo d’un tube digestif réalisée au laboratoire

Figure 6: dépôt des échantillons ADN sur gel d’agarose au laboratoire LGM

Figure 7 : montage de l’électrophorèse du laboratoire LGM

Figure 8: photos des observations microscopiques des isolats identifiés au genre

Lactobacillus sp. thermophiles.

Figure 9 : photos des observations microscopiques des lactobacilles mésophiles.

Figure 10 :photos des observations microscopiques des isolats pré-identifiés au Streptococcus

themophilus

Figure 11 : photos des observations microscopiques des isolats pré-identifiés au genre genre

Enteroccus sp.

Figure 12 : photos des observations microscopiques des isolats pré-identifiés à des

pédiocoques.

Figure 13: photos des observations microscopiques des isolats pré-identifiés à des

Leuconostocs.

Figure 14a : photos des observations microscopiques de Levures REF

Figure 14b: photos des observations microscopiques des isolats de levures.

Figure 15 : photos des observations microscopiques des isolats pré-identifiés au groupe

Bacillus.

Figure 16: photos des observations macroscopiques des souches productrices des EPS sur

milieux gélosé hypersaccharosé.

Figure 17 : observation macroscopiques montrant un trouble avec précipité blanc des EPS en

milieu liquide HJL.

Figure 18 : mise en évidence des EPS produits sur milieu rouge de ruthénium.

Figure 19: localisation des EPS par coloration vitale au bleu de toluidine sous microscope

optique GX1000.

Figure 20a : précipitation des EPS à l’éthanol .

Figure 20b : récupération du culot EPS.

Figure 21 : exopolysaccharides lyophilisés.

Figure 22 : activité rhéologique des EPS sur différents milieux.

Figure 23 : dosage colorimétrique de la gamme glucose et des différents échantillons

Figure 24 : courbe montrant les différentes concentration du glucose (20-120mg/l) en

fonction de la densité optique DO (490nm).

Figure 25 : dosage colorimétrique des deux dilution 1/10 et 1/100 des six EPS.

Figure 26 : exemple de résultats des dosages des dilutions finales d’un échantillon EPS.

Figure 27 : histogramme représentatif des concentrations des échantillons EPS des différents

isolats du tractus digestif

Figure 28: profil de la composition en oses des différents EPS par analyse sur ccm d’un

premier essai dans le système 1 (acide acétique : chloroforme : eau).

Figure 29 : profil de la composition en oses des différents EPS par analyse sur ccm d’un

deuxième essai dans le système 1 (acide acétique : chloroforme : eau).

Figure 30: profile de la composition en oses des différents EPS par analyse sur ccm dans le

système 2 (Acétone: Eau).

Figure 31 : activité antagoniste des différents isolats LGM vis-à-vis de S. aureus ATCC25923

par la méthode des disques.

Figure 32 : activité antagoniste des différents isolats LGM vis-à-vis de E. coli ATCC25922

par la méthode des disques.

Figure 33 : activité antagoniste de différents isolats vis-à-vis S. aureus ATCC 43300 par la

méthode des disques.

Figure 34 : activité antagoniste des différents surnageants natifs de différents isolats LGM

vis-à-vis d’E. coli ATCC2592 par la méthode des disques.

Figure 35 : activité antagoniste des différents surnageants natifs de différents isolats LGM

vis-à-vis de S .aureus ATCC25923 par la méthode des disques.

Figure 36 : activité antagoniste des surnageant neutralisé de différents isolats LGM vis-à-vis

d’E. coli ATCC2592 par la méthode des disques.

Figure 37 : activité antagoniste des surnageant neutralisé de différents isolats LGM vis-à-vis

de S .aureus ATCC25923 par la méthode des disques.

Figure 38 : activité antagoniste des différents Lactobacillus spp. vis-à-vis d’Enterococcus

faecalis JH2-2 par la méthode double couche.

Figure 39:activité antagoniste des différents Lactobacillus spp. vis-à-vis d’Enterococcus

faecalis V583 par méthode double couche.

Figure 40 : Amplification du fragment ADN 480 pb du gène de l’ADNr 16S en

électrophorèse sur gel d'agarose 0.8 %.



Contribution à l’étude des probiotiques et prébiotiques comme alternatives aux

antibiotiques en aviculture

Résumé

Le recours aux antibiotiques a connu ses limites en raison de l’émergence de nouvelles

souches multi résistantes causées par l’utilisation abusive de ces composés dans le secteur

avicole, malgré que l’antibioprévention reste actuellement le seul moyen utilisé pour contrôler

les problèmes sanitaires et économiques liés aux pathogènes aviaires, l’utilisation des

probiotiques s’avère nécessaire pour favoriser une bonne microflore antagoniste vis-à-vis des

pathogènes et peut s’inscrire comme stratégie alternative envisagée pour protéger les volailles

des agents pathogènes et pour remplacer les antibiotiques comme facteur de croissance.

Ce travail s’intéresse à l’identification par les méthodes ADN des souches de volaille

productrices de substances inhibitrices vis-à-vis de certains pathogènes Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi. 11 de ces souches ont été retenues suite à leur

forte action inhibitrice. Au total 48 souches ont été isolées à partir de différents

compartiments du tractus digestif de deux coqs de race locale, dont 6 ont été pré-identifiés à

des leuconostocs, 2 à des pédiocoques, 8 à des entérocoques, 22 à des lactobacilles, 5

apparentés au genre Bacillus et enfin 4 autres appartenant à des levures.

Par ailleurs, l’utilisation des amorces d’une région interne de 480 pb du gène l’ADNr 16S

spécifiques au genre Lactobacillus sp. et le séquençage du fragment d’ADN amplifié ont

permis d’identifier les isolats appartenant à la flore lactobacillaire au nombre de 22.

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus crispatus et Lactobacillus

johonossi ont été les souches les plus diagnostiquées par la méthode PCR colonie. Une autre

approche moléculaire a été entamée afin d’amplifier le gène ADNr 16S dans sa totalité 1500

pb chez certaines souches, celui-ci reste un taxon de choix en matière de systématique en

bactériologie. D’autres travaux menés sur la détection et l’extraction des prébiotiques tels que

les polysaccharides exogènes (EPS) ainsi que leur caractérisation par chromatographie sur

couche mince qui a montré une similitude des profils avec le dextrane commercial et leur

dosage colorimétrique qui a été déterminé à 1254 mg/l pour la production d’EPS la plus

élevée chez la souche LGM-IL2.

Mot clés : Lactobacillus spp, ADN, PCR, probiotiques, pathogènes, prébiotiques, CCM.

Contribution to the study of probiotics and prebiotics as alternatives to antibiotics in

poultry

Abstract:

The use of antibiotics had its limitations due to the emergence of new multi -resistant strains

caused by the misuse of these compounds in the poultry sector, despite the antibio-prevention

currently remains the only means used to monitor health problems and economic issues

related to avian pathogens , the use of probiotics is necessary to promote healthy microflora

antagonist towards the pathogen and can register as an alternative strategy intended to protect

poultry pathogens and to replace antibiotics as growth factor.

This work focuses on the identification by DNA methods of producing poultry strains of

inhibitory substances against pathogens such as Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and

Salmonella typhi. 11 of these strains were selected due to their strong inhibitory action. A

total of 48 strains were isolated from different compartments of the digestive tract of two local

cocks , including pre-identified to leuconostocs was 6 , 2 to pediococci , 8 to enterococci , 22

lactobacilli, 5 related to genus Bacillus and yeasts belonging to 4 .

Furthermore, the use of primers a 480 bp internal region of the gene 16S rDNA specific to

the genus Lactobacillus sp. and sequencing of the amplified DNA fragment were identified

isolates belonging to the lactobacilli flora to 22. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus

gallinarum, Lactobacillus crispatus and Lactobacillus johonossi were the most diagnosed

strains by PCR method colony. Another molecular approach has been initiated in order to

amplify the 16S rDNA gene in its entirety in 1500 bp for some strains, which remains a taxon

choice of systematic bacteriology. Other work on the detection and extraction of prebiotics

such as exogenous polysaccharides (EPS) and their characterization by thin layer

chromatography which showed a similarity of profils with commercial dextrane and

colorimetric assay was determined to 1254 mg / l for the highest production of EPS by strain

LGM-IL2.

Key words: Lactobacillus spp, DNA, PCR, probiotics, pathogens, prebiotics, TLC.

كبدائل للمضادات الحيوية في الدواجن دراسة البروبيوتيك والبريبايوتك المساهمة في

ملخص

لقد عرف استخدام المضادات الحيوية حدوده بنسبة كبيرة نظرا لظهور سلالات بكتيرية مقاومة لهذه المضادات و السبب الاستعمال المفرط لها و التي لا تزال الوسيلة الوحيدة المستخدمة لرصد المشاكل الصحية المتعلقة بمسببات إلىراجع

استخدام البروبيوتيك ضروري لتعزيز الميكلوفلور الصحية المضادة للبكتيريا الممرضة أصبح الدواجن.عند الإمراض .الأمراضتسريع عملية نمو الدواجن و حمايتها من مسببات إلىبديلة تحل مكان المضادات تهدف إستراتيجيةباعتباره

النافعة من الجهاز الهضمي لديوك برية و تشخيصها بالوسائل الحديثة كالبيولوجيا السلالاتبعزل هذه الدراسة و لقد اهتمت . E. coli, S. aureusل تثبيط عمل البكتيريا الممرضة مث على و التي لديها القدرة ADNالجزئية المبنية على كشف ال

(probiotique)ذات منفعة لة سلا 48 عزلت بالإجمال .من هذه السلالات تم اختيارها بسبب قدرتها المثبطة القوية 11 , leuconostocs, 2 pédiocoques,8 entérocoques6 ,:منها من مختلف مناطق الجهاز الهضمي

5 Bacillus ,22 lactobacilles4 levures, .

خاصة بالنوع ADNr 16Sلمنطقة داخلية لمورثة الحمض النووي 480pb ذات تباستعمال قطع من النكليوتيدا

lactobacillus sp و تسلسل مورثة الحمض النووي المضخم (séquençage) عزلة من نوع 22سمح لنا بتحديد lactobacillus sp. .

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus crispatus , Lactobacillus johonossi في مجملها ADNr 16Sكما استعملنا منهج اخر لتضخيم جينات . PCR ت الأكثر تشخيصا عن طريقالسلالا.كانت

لبعض السلالات . 1500pbذات

وكذلك تحديد خصائصها (EPS) ريبيوتيك يمتعددة الخارجية اللكشف و استخلاص السكريات ال أخرىدراسات أجريتالتي اظهرت تشابها ملحوظا في التركيبة الجزئية مع ديكسترات CCMعن طريق تقنية كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

(Dextrane) كما تم تحديد الجرعة الخاصة بكل.EPS ب إنتاجكمية أعلىعن طريق التغير اللوني الذي حدد ل./مغ1264

مسببات الإمراض ,بروبيوتيك ,البريبيوتيك ,كرومتوغرافيا ., PCR, ,حمض نوويLactobacillus sp :ة كلمات مفتاحي

1

Introduction

En 2006, l’union Européenne a interdit définitivement l’emploi des antibiotiques comme

promoteurs de croissance en production avicole. L’antibiothérapie a connu ses limites en

raison de l’émergence de nouvelles souches pathogènes multi-résistantes causée par

l’utilisation abusive de ces composés dans le secteur avicole. Récemment de nouvelles

stratégies de prévention ont été proposées comme alternatives aux antibiotiques pour réduire

l’incidence des pathogènes entériques chez la volaille. Parmi ces stratégies le recours aux

probiotiques notamment les lactobacilles (Gionchetti et al., 2000 ; Fritts et al., 2000 ; Jin et

al., 1997) et les prébiotiques (Gibson et Roberfroid, 1995) semblent offrir les résultats les plus

prometteurs. Les microorganismes autorisés aujourd’hui en Europe en alimentation animale

appartiennent aux bactéries du genre Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,

Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus et aux levures, ces additifs probiotiques sont

principalement utilisés en mono-souches ou des multi-souches (Bernardeau et Vernoux,

2009). Les probiotiques sont définis par l’OMS comme des « microorganismes vivants, qui

lorsqu’ils sont administrés en quantité adéquate, confèrent un effet bénéfique pour la santé de

l’hôte au-delà de l’effet nutritionnel premier ». Certains probiotiques comme Lb. johsonii

réduit le potage de salmonella (Casey et al., 2004), bifidobacterium , enterococcus et

pediococcus augmentent les paramètres de performances zootechniques et modulent la

composition de la microflore du caecum (Mountzouris et al.,2007), d’autres parmi eux,

comme pediococuus acidilactici ou Saccharomyces boulardii améliorent la résistance aux

coccidioses (Eimeria acervulina , Eimeria tenella) (Lee et al., 2007) .Par ailleurs, les auteurs

ont rapporté que les avantages dus aux lactobacilles en qualité de probiotiques sont mulitples

tels l’inhibition des campylobacters (Messaoudi et al., 2011) et l’inhibition d’Eimeria tenella

in vitro (Tierney et al., 2004). ainsi que l’action de Lactobacillus johnsonii FI9785 dans le

contrôle des entérites nécrotiques endémiques dues à Clostridium perfringens, réduisant les

pertes économiques et l’utilisation d’antibiotiques (La Ragione et al., 2004) .

Au titre de l’usage des probiotiques, un cadre législatif a été établi sur leur utilisation en 2002

par l’EFSA (European Food Safety Agency) d’où ressort trois pricipaux chapitres; l’identité,

la sécurité et l'efficacité de la souche. L’identification des microorganismes par les méthodes

ADN est devenue une méthode incontournable (Gevers et al., 2001, O’Mahony et al., 2000),

elle est plus résolutive et plus discriminante par rapport aux méthodes d’identification et

classification traditionnelles.

2

L’objectif de ce travail consiste à isoler à partir du tube digestif de la volaille fermière des

souches du genre Lactobacillus sp. à fort potentiel probiotique et de les identifier par les

méthodes d’ADN en utilisant des amorces spécifiques au genre Lactobacillus sp. d’une région

interne du gène l’ADNr 16S de 480 pb par l’utilisation des amorces spécifiques (V3/V4). Les

autres souches de la flore totale ont été au même titre isolées, pré-identifiées par des méthodes

phénotypiques et certaines aptitudes ont été caractérisées, notamment chez les leuconostocs

telles que la mise en évidence des polysaccharides produits par microscopie en utilisant le

colorant bleu de toluidine et la sélection des souches mucoïdes productrices d’EPS par

l’utilisation d’un milieu spécifique au rouge au ruthénium .

En outre, une méthode d’extraction de ces exopolysaccharides au nombre de 8 sera effectué

afin de pouvoir les caractériser au niveau monosaccharidique par la chromatographie sur

couche mince ainsi qu’un dosage colorimétrique sera réalisé.

Dans un autre chapitre, une activité à caractère antagonisme sera recherchée in vitro vis-à-vis

de certains pathogènes, en l’occurrence Staphylococcus aureus (ATCC 25923, ATCC 43300),

Escherichia coli ATCC25922, Enterococcus faecalis V583 Enterococcus faecalis JH2-2 et

Salmonella typhi.

Une amplification du gène ADNr 16S de 1500 pb par l’utilisation des amorces universelles de

quelques souches sera effectuée.

Synthèse Bibliographique

3

Chapitre 1 : Généralités

1. Le microbiote intestinal chez la volaille

Selon la définition d'Isolauri et ses collaborateurs, le microbiote intestinal normal est un

consortium complexe et en équilibre de microorganismes qui habitent normalement le tractus

gastro-intestinal et qui remplissent un rôle dans la nutrition, la physiologie et le

fonctionnement du système immunitaire de l'hôte (Isolauri, Sutas et al. 2001). La composition

de ce microbiote intestinal est en équilibre relativement stable dans le tube digestif. Cet

équilibre peut être rompu avec l'âge, les conditions d'hygiène, le stress ou à la suite d'une

agression extérieure comme lors de l'utilisation d'antibiotiques, de facteurs de croissance

(Gabriel, Mallet et al. 2003). Ainsi, on note des populations microbiennes plus élevées chez

des animaux élevés au sol sur litière propre ou litière contaminée par une bande précédente

par rapport à des animaux élevés en cage individuelle (Gabriel, Mallet et al. 2003). Selon les

conditions d'élevage, l'augmentation de la densité d'élevage ou les stress thermiques semblent

globalement augmenter les bactéries néfastes au détriment des bactéries bénéfiques (Gabriel,

Mallet et al. 2005). Outre ces conditions, la présence de parasites intestinaux comme les

coccidies, peut entraîner la dégradation de la muqueuse intestinale et la production de

nouveaux substrats pour la microflore, modifiant ainsi sa composition (Kimura, Shiosaka et

al. 1976). La flore est modifiée aussi par l'alimentation. Ainsi, le type de céréales en

particulier la présence de polysaccharides non amylacés hydrosolubles (Mathlouthi, Mallet et

al. 2002) ou leur mode de présentation (Gabriel, Mallet et al. 2003) entraînent des

changements de la flore. De même, les matières grasses, ou le type d'amidon peuvent avoir un

effet sur la composition du microbiote (Weurding, Enting et al. 2003).

2. Description du tube digestif chez la volaille

Le tractus gastro-intestinal présente quelques particularités anatomiques (Figure 1). On

distingue différents compartiments ; la cavité buccale ne comprend ni lèvres ni dents, mais un

bec corné qui permet la préhension et une certaine fragmentation des aliments. Les glandes

salivaires sont peu développées. Il n'y a ni voile de palais, ni épiglotte, si bien que la

déglutition est un phénomène uniquement mécanique par redressement de la tête. Dans la

bouche, les aliments sont peu fragmentés et grossièrement insalivés (M. Larbier and

Leclercq1992). L'œsophage contient un renflement dont l'épithélium est riche en glandes à

mucus : le jabot. Cet organe de pH variant entre 4,47 et 4,54 (Farner 1942) peut entreposer


4

des aliments qui s'y humectent et s'y ramollissent, il fonctionne chez le poulet alimenté à

volonté. Il est le lieu d'une digestion microbienne et comporte essentiellement des

Lactobacilles, d'une partie de l'amidon (hydrolyse avec formation d'acides lactique) et de

formation d'acide gras volatiles (M. Larbier and Leclercq 1992). Le proventricule est riche en

glandes sécrétoires (acide chlorhydrique et pepsinogène précurseur de la pepsine) et

permettant la digestion chimique : c'est l'estomac chimique. La protéolyse y débute à pH de 3

à 4,5. Dans le gésier et le proventricule, le faible pH fait chuter la population bactérienne

(Farner 1942). Le gésier, estomac mécanique est caractérisé par une couche superficielle très

dure entourée de muscles puissants. Il y règne un pH très bas (2 à 3,5) et il peut contenir de

petits graviers qui sont nécessaires aux animaux consommant des grains intacts. C'est donc au

niveau du gésier que se produit véritablement la protéolyse sous l'action de la pepsine

(Gabriel, Mallet et al. 2005). Dans l'intestin, l'environnement devient plus favorable à la

croissance bactérienne en raison de la plus faible pression d'oxygène et de la faible

concentration en enzyme et en sels biliaires et d'un pH variant dans le duodénum entre 5,68 et

6,07, dans le jéjunum entre 5,72 et 6, dans le caecum entre 5,6 et 5,83, l'iléon entre 6,18 et

6,50 et dans le colon entre 6,08 et 6,58 (Farner 1942).

À la naissance les poussins sont axéniques. Le microbiote spécifique commence à se

développer dès les deux premiers jours pour donner lieu à une flore microbienne

environnementale spécifique après trois à six semaines (Methner, Barrow et al. 1997). En

effet, après l'éclosion, la flore augmente rapidement. Ainsi dès le premier jour, l'iléon et le

caeum hébergent 108

et 1010

bactéries par gramme de contenu digestif. Leur nombre atteint

109

et 1011 bactéries par gramme en 3 jours et reste relativement stable jusqu'à l'âge de 30

jours (Gabriel, Mallet et al. 2005). La flore est composée essentiellement de bactéries à Gram

positif anaérobies facultatives du jabot à l'iléon terminal, alors que le caecum contient en plus

des anaérobies stricts, ces dernières étant dominantes (Gabriel, Mallet et al. 2005).

D'un point de vue qualitatif, dès le premier jour, les coliformes, les streptocoques et les

clostridies colonisent rapidement le tube digestif, du jabot au caecum, alors que les

lactobacilles et les Bactéroïdes ne sont mis en évidence dans le caecum qu'après 3 jours et 5

jours respectivement (Gabriel, Mallet et al. 2005). Les populations bactériennes présentes

dans le tractus digestif représentent une large gamme de types métaboliques et

morphologiques. Leur nombre total est plus important que le nombre de cellules eucaryotes

constituant le corps de l'hôte. On distingue les bactéries dominantes (>106

UFC /g contenu),

sous-dominantes (105

à 103

UFC / g contenu), et résiduelles (<103

UFC / g contenu). Chez le


5

poulet, les sites principaux d'activité bactérienne sont le jabot, le caecum et, dans une moindre

mesure, l'intestin grêle (Cole and Fuller 1984). Ainsi, dans le caecum et l'iléon, on trouve

respectivement 1011

et 109

bactéries par g de contenu (Apajalahti, Kettunen et al. 2004). Les

études effectuées sur le microbiote des oiseaux ont concerné principalement le caecum

(Gabriel, Mallet et al. 2005).

3. Description de la flore digestive du poulet et localisation dans le tractus digestif :

La flore digestive peut se trouver dans la lumière intestinale ou adhérer à la muqueuse

digestive. La flore luminale dépend des nutriments disponibles, de la vitesse de transit et de la

présence ou non de substances antimicrobiennes. La flore des muqueuses dépend de

l’expression par l’hôte de sites d’adhésion spécifiques sur les membranes des entérocytes, de

la vitesse de production de mucus, de la production d’anticorps (Ig) sécrétoires, et de

l’extrusion de matériel cellulaire de la membrane.

La flore digestive comprend des bactéries et des champignons. Chez le poulet, 29 genres

bactériens ont été identifiés (Fuller, 1984). Chaque genre serait représenté par 3 à 4 espèces,

et chaque espèce par 3 à 4 types métaboliques différents, ce qui ferait plus de 200 types

différents, sachant que seulement 25% des souches seraient identifiées. Le tube digestif

contient donc une large population bactérienne de différents types métaboliques et

morphologiques. Ainsi, le nombre total de cellules bactériennes est plus important que le

nombre de cellules eucaryotes constituant le corps de l’hôte.

Tableau 1: Nombre de bactéries viables (log10 / g de contenu) des groupes majoritaires dans

le tube digestif du poulet (d’après Smith, 1965)

log10 Jabot Gésier Duodénum Iléon Caeca

Lactobacilles 8.7 7.3 8.0 8.6 8.7

Entérocoques 4.0 3.7 4.0 4.2 6.7

Coliformes 1.7 - 2.0 2.7 5.6

Levures 2.7 - 1.7 - 2.0

Clostridies - - (-) (-) 9.0

Anaérobies

obligatoire

non sporulant

- - - - 10.0

Streptocoques

anaérobies

- - - - 10.0


6

Figure 1: Schéma du tractus digestif des volailles et valeurs des pH des contenus digestifs

(Farner 1942).

Chez le poulet, les deux sites principaux d’activité bactérienne sont le jabot et les caeca.

Globalement, la flore du jabot à l’iléon terminal est composée principalement d’anaérobies

facultatifs alors que les caeca contiennent en plus des anaérobies stricts, ces derniers étant

dominants (Fuller, 1984). Dans le jabot, on trouve principalement des lactobacilles qui

peuvent être attachés à l’épithélium en formant presque une couche complète. On trouve aussi

des entérocoques, des coliformes, et des levures. Dans le gésier et le proventricule, le faible

pH fait chuter la population bactérienne. Dans le duodénum, le nombre important d’enzymes,

la forte pression en oxygène et la présence de fortes concentrations de composés

antimicrobiens tels que les sels biliaires limitent la croissance bactérienne. On trouve

principalement des lactobacilles ainsi que des entérocoques et des coliformes. Plus loin dans

l’intestin, l’environnement devient plus favorable à la croissance bactérienne à cause de la

plus faible pression d’oxygène, la faible concentration en enzymes et sels biliaires

(réabsorption et dégradation en partie par la microflore). Si les aliments sont bien digestibles,

par manque de substrat, la flore est limitée. Dans l’iléon, on trouve principalement des

lactobacilles attachés aux entérocytes, des entérocoques et des coliformes. Dans le caeca, on


7

trouve une large population de types morphologiques variés, enfouie dans la couche de mucus

et attachée à l’épithélium. En effet, le contenu de cet organe étant rarement renouvelé (1 à 2

fois/jour), cela le rend favorable au développement des bactéries. On trouve en majorité des

anaérobies stricts comme les Eubacterium, des bifidobactéries ou des clostridies. On trouve

aussi des anaérobies facultatifs comme des lactobacilles, des entérocoques, et des coliformes.

4. Les pathogènes entériques de la volaille

4.1. Maladies entériques chez la volaille

Les volailles sont prédisposées à de nombreuses infections parasitaires, bactériennes,

mycoplasmiques et virales en particulier celles des systèmes respiratoire et gastro-intestinal.

Les maladies entériques à forte prévalence comme la cryptosporidiose ou la paratuberculose,

conduisent à des pertes économiques élevées dans les élevages. De nombreuses espèces de

Salmonella peuvent attaquer les oiseaux adultes et causer des taux élevés de mortalité et de

morbidité. Une autre problématique liée à la présence de ces pathogènes dans le tube digestif

est la contamination des denrées alimentaires provenant de la volaille. Les infections par le

Welchia sont responsables de l'entérite nécrosante. Les infections infracliniques résultent dans

des performances altérées et des lésions du foie. La maladie clinique aiguë entraîne une

mortalité accrue (Chafai 2006).

Le traitement de choix suppose l'utilisation d'antibiotiques, mais ne prévient pas la récurrence

de la maladie après arrêt de la médication. Les mesures de contrôle consistent en une pratique

d'hygiène adéquate dans la chaîne de production et au niveau du consommateur.

4.1.1. Escherichia coli :

Les Escherichia coli aviaires, bien que considérés par beaucoup comme pathogènes

secondaires, représentent à l'heure actuelle l'une des plus importantes causes de pertes

économiques dans le secteur avicole. Les Escherichia coli sont des hôtes commensaux du

tractus digestif de la volaille et la plupart des souches ne sont pas pathogènes. Cependant, un

certain nombre de celles-ci appelées « Avian Pathogenic E. coli » ou APEC et appartenant à

des sérotypes bien particuliers sont associées au syndrome de la colibacillose (Stordeur and

Mainil 2002). La voie d'entrée principale de l'agent pathogène est le tractus respiratoire, via

l'inhalation de particules de poussières contaminées par les E. coli excrétées du tractus

digestif d'animaux sains. Les intestins sont, en effet, le réservoir le plus important des E. coli

pathogènes aviaires ou APEC. Après une première multiplication au niveau du tractus

respiratoire supérieur, les bactéries colonisent les voies respiratoires profondes à savoir les


8

sacs aériens et les poumons. Dans une troisième étape, la bactérie atteint le sang et colonise

les organes internes comme le coeur, le foie et la rate (Jordan and Pattison 1996).

Les colibacilloses sont sans doute les infections bactériennes les plus fréquentes et les plus

importantes en pathologie aviaire. Elles peuvent entrainer de la mortalité, des baisses de

performances et des saisies à l'abattoir (Stordeur and Mainil 2002).

Contrairement aux infections des mammifères, les colibacilloses aviaires prennent des formes

générales, avec une voie d'entrée respiratoire ou génitale (Stordeur and Mainil 2002). L'agent

étiologique de la colibacillose est la bactérie Escherichia coli.

4.1.2. Salmonella

Plus de 60 % des toxi-infections dans le monde sont dues à Salmonella. Les salmonelloses

sont de ce fait, devenues un phénomène de santé publique ce qui justifie l'implication de

l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) dans la lutte contre les salmonelloses (Salm-Surv

2005).

Les salmonelles appartiennent à la famille des entérobactéries, ce sont des bacilles mobiles à

Gram négatif, aéro-anaérobies facultatifs, mésophiles qui se cultivent facilement. À nos jours

plus de 2300 serotypes différents de salmonelles sont identifiés, sur le plan épidémiologique

et sont classées en fonction de leur potentiel pathogène pour l'homme ou l'animal. La

virulence des salmonelles est une notion complexe, résultant de nombreux facteurs encore

largement étudiés, tant au niveau biochimique que génétique. Les principaux facteurs de

virulence sont la mobilité (reposant sur les flagelles), l'adhésion par les pili et les fimbriae

(phénomène actif de reconnaissance spécifique entre une adhésine bactérienne et un ligand

présent à la surface d'une cellule hôte), l'invasion (par endocytose pour les entérocytes, par

phagocytose pour les macrophages), la formation de phagosomes spacieux et la fusion avec

les lysosomes (Feuillet 2007).

Actuellement plus de 200 sérotypes de salmonelles sont connus chez la volaille. Salmonella

enteritidis qui infecte les organes profonds (foie, rate, ovaire) est à l'origine d'infection

durable au niveau des troupeaux alors que Salmonella typhimurium est actuellement le

sérotype le plus incriminé dans les salmonelloses aviaires provoquant les formes cliniques les

plus graves, surtout chez les jeunes poussins prenant une allure septicémique, avec une

mortalité brutale dans les jours qui suivent l'éclosion. On observe également de nombreuses

mortalités en coquille. La première étape de colonisation par les salmonelles est une étape de

colonisation intestinale. La bactérie arrive dans l'intestin grêle, où elle se multiplie en

adhérant à l'épithélium, elle pénètre par un phénomène d'endocytose dans les cellules


9

épithéliales iléales et caecales, notamment les tissus lymphoïdes incluant les plaques de Peyer,

les amygdales caecales et dans les cellules M. Dans le cas des salmonelles provoquant des

maladies systémiques, le site d'attachement préférentiel se situe au niveau des plaques de

Peyer (Feuillet 2007). L'infection est strictement limitée à la sphère digestive et peut

correspondre à un portage latent avec élimination épisodique des Salmonelles dans les fèces.

5. Contrôle des infections chez la volaille

Le recours aux antibiotiques demeure l'approche la plus préconisée pour lutter contre ces

infections. L'utilisation des antibiotiques en alimentation animale s'est progressivement

développée dès le début des années 50 et a permis d'améliorer les conditions sanitaires des

animaux et d'accroître la productivité des élevages en réduisant les coûts de production.

Cependant, l'utilisation abusive de ces antibiotiques qui possèdent beaucoup de similitudes avec

ceux utilisés en médecine humaine a entraîné une augmentation inquiétante du nombre de souches

pathogènes multi-résistantes.

Cette situation a conduit l'Union européenne à décréter, en 2006, l'interdiction complète des

antibiotiques à titre de facteurs de croissance dans les aliments pour animaux dont les premières

espèces animales touchées par cette interdiction sont les porcs et les volailles, principales

productions à recourir à ce type d'additifs. Au Canada, l'utilisation des antibiotiques comme

facteur de croissance n'est pas formellement interdit, mais il est déconseillé. Cependant, le

Québec jouit d'une réglementation unique au Canada puisque tous les médicaments destinés aux

animaux ne sont disponibles que sur ordonnance (CAAAQ 2008). De surcroît, aucun producteur

ne peut détenir ou administrer un médicament à un animal de consommation à moins qu'il n'ait

été prescrit par un médecin vétérinaire (selon l'Ordre des médecins vétérinaires du Québec).

Il est donc clair que la recherche de solution alternative susceptible d'assurer une succession

satisfaisante aux antibiotiques en termes d'effets zootechniques devient une urgence.


10

Chapitre 2 : Les probiotiques en aviculture

1. Histoire d’utilisation des probiotiques en alimentation animale

Les probiotiques ont été commercialisés et utilisés dans les fermes à partir des années

1960.Leur utilisation a été encouragée (1) par le Comité Swann en 1969 qui recommandait de

restreindre l’usage des antibiotiques en alimentation animale à la seule fin thérapeutique (leur

utilisation « facteurs de croissance » étant associée à l’augmentation des résistances

bactérienne) ; (2) par la nécessité de faire face aux conséquences d’une production animale

toujours plus intense et stressante pour les animaux (économie d’échelle, augmentation de la

taille des élevages, concentration des animaux, sevrage précoce, …). Entre les années 1970 et

1990, les micro-organismes probiotiques revendiquaient des propriétés zootechniques,

amélioration du gain de poids, du coefficient de digestibilité, et également des effets sanitaires

(diminution des diarrhées, de la morbidité, …). Mais cette période est aussi marquée par

l’absence de cadre réglementaire contribuant à réduire la confiance des utilisateurs et dès le

début des années 1990, on observe un déclin de l’utilisation des probiotiques sur le marché

européen. Cette première vague d’utilisation des probiotiques en alimentation animale

jusqu’en 1993 a été définie par Bernardeau et Vernoux (2009) comme « la première

génération de probiotiques », caractérisée par une efficacité supposée et un cadre

réglementaire peu adapté. L’absence d’efficacité (Simon et al., 2001), de compréhension du

mécanisme d’action et le manque de données scientifiques ont amené les professionnels de la

production animale (vétérinaires, nutritionnistes, éleveurs) à considérer le concept probiotique

avec grand scepticisme (Bernardeau et Vernoux, 2009).

C’est le formidable essor de l’utilisation des probiotiques en alimentation humaine et les

avancées scientifiques en matière d’écologie digestive et d’interactions microbiennes

(Caramia, 2004) qui vont relancer l’utilisation des micro-organismes en alimentation animale.

Stimulées également par la nécessité de palier à l’interdiction des antibiotiques facteurs de

croissance décrétée en 2006 en Europe, les études scientifiques sur les probiotiques sont

mieux établies, réalisées en double aveugle, contrôlées, plus fiables et la directive Européenne

de 1993 remet les micro-organismes probiotiques à l’honneur en les incluant dans la

réglementation des additifs pour l’alimentation animale. Parallèlement, les productions

animales connaissent entre 1980 et 2000, une série de crises qui va remodeler complètement

le paysage réglementaire, aussi bien au niveau institutionnel (création de l’AFSSA – Agence


11

Française de Santé et Sécurité Alimentaire en France 1998 et l’EFSA – European Food Safety

Agency au niveau européen en 2002) que législatif (refonte complète de la réglementation de

l’utilisation des additifs en alimentation animale – Dir. 70/524/EC et clarification de

l’utilisation des micro-organismes comme additifs Reg. 1831/2003/EC). Cette nouvelle

réglementation très rigoureuse exige de la part des industriels des données scientifiques et

technologiques incluant la démonstration de l’innocuité des micro-organismes (pour l’animal,

le travailleur, le consommateur et l’environnement) et la preuve de leur efficacité en accord

avec les revendications zootechniques et/ou digestives (Mantovani et al., 2006). Les trois

volets du dossier d’enregistrement européen appliqués aux probiotiques sont (1) identité et

qualité: caractéristiques de la souche (taxonomie, métabolisme, propriétés, …), processus de

fabrication, stabilité du probiotique (seul ou en mélange), méthode d’analyse ; (2) sécurité :

pour l’espèce cible (innocuité à 10 fois la dose recommandée), pour le manipulateur, le

consommateur (absence d’antibiorésistance, génotoxicité et mutagénicité) et pour

l’environnement ; (3) efficacité : à démontrer pour l’espèce cible par un minimum de trois

études significatives dans deux lieux différents. Le volet efficacité décrit l’espèce cible, les

conditions (âge, stade physiologique, type de production), les doses d’utilisation, les

performances revendiquées ainsi que les mécanismes d’action possibles. Les allégations

possibles pour des probiotiques peuvent concerner des effets sur la performance animale, la

production animale, le bien-être animal ou l’environnement.

La difficulté scientifique, la charge financière et la complexité des dossiers d’autorisation ont

définitivement mis un terme à l’utilisation abusive et non fondée des probiotiques en

alimentation animale. Apparaissent alors sur le marché, des probiotiques plus sûrs, plus

efficaces et plus transparents que Bernardeau et Vernoux (2009) caractérisent de «

probiotiques de deuxième génération »

2. Définition des probiotiques

Le terme "probiotique" est un mot relativement nouveau qui signifie "en faveur de la vie". Le

concept probiotique est né de la théorie de la longévité de Metchnikoff en 1907. Il fut le

premier à proposer l'utilisation des Lactobacilles des yaourts pour la restauration du

microbiote dans le tractus gastro-intestinal. Les probiotiques ont d'abord été développés dans

les années 1960 pour les élevages d'animaux afin de prévenir les infections et stimuler le gain

de poids. La première définition officielle a été proposée par Fuller en 1989 qui définit un

probiotique comme étant « un supplément alimentaire microbien vivant qui affecte

positivement la santé de l'animal en améliorant sa balance microbienne intestinale ». Cette


12

définition a été révisée plusieurs fois, notamment par la FAO (Food and Agriculture

Organization of the United Nations) et la WHO (World Health Organization). En 2001, leur

nouvelle définition s'énonce comme suit : « Les probiotiques sont des microorganismes

vivants qui lorsqu'ils sont administrés en quantité adéquate, produisent un effet bénéfique

pour la santé de l'hôte ».

3. Les micro-organismes probiotiques autorisés aujourd’hui en alimentation avicole

De nombreuses espèces microbiennes ont été utilisées en tant qu’agents probiotiques. Ces

micro-organismes appartiennent aux bactéries du genre Bacillus, Bifidobacterium,

Enterococcus, Escherichia coli, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus et aux levures du

genre Saccharomyces. Les micro-organismes utilisés en alimentation animale diffèrent

sensiblement de ceux utilisés en alimentation humaine. Ces variantes intègrent les différences

rencontrées au niveau des objectifs d’efficacité, des aspects sécuritaires, des fréquences

d’ingestion, des contraintes de fabrication ou encore de stockage ou encore de la

réglementation.

Les genres Lactobacillus et Bifidobacterium sont majoritairement utilisés pour des

applications en nutrition humaine, alors que les genres Bacillus, Enterococcus et

Saccharomyces sont les micro-organismes les plus utilisés dans les élevages (Simon et al.,

2001) (Tableau 3). Les souches de Bacillus, plus stables car sporulées, sont plus à même de

résister aux processus d’incorporation dans l’aliment, aux paramètres de granulation et aux

conditions non exigeantes de stockage « longue durée » des aliments pour animaux (Simon,

2005). Inversement, les cellules végétatives sont beaucoup plus sensibles, ce qui explique que

les lactobacilles ou les bifidobactéries, pourtant bien documentées, ont été moins utilisées au

début en alimentation animale. Mais les techniques de stabilisation et de protection évoluant

(enrobage, encapsulation), cinq souches de lactobacilles sont aujourd’hui autorisées et

plusieurs dossiers actuellement soumis à l’EFSA pour homologation portent sur ces

microorganismes autrefois considérés comme sensibles (Bifidobacteria, Lactobacillus…).

Ainsi les lactobacilles, avec une grande diversité d’espèces (Tableau 3), représentent

aujourd’hui 21% des souches utilisées comme additifs en alimentation porcine et avicole,

3ème groupe microbien après les genres Bacillus et Enterococcus représentant chacun 29%

des utilisations (Figure 2). De nouvelles tendances sont également perçues concernant le

nombre de souches constitutives des produits. La première génération de probiotiques était

multi-souches. En 2007, avec la nouvelle réglementation en vigueur, les additifs probiotiques

sont principalement mono-souche (85%), seuls quelques additifs contiennent deux souches


13

(15%). Cette tendance tient vraisemblablement du fait que la préparation des dossiers

scientifiques et le processus d’homologation sont longs et difficiles. Cependant, là encore, la

situation évolue et plusieurs produits contenant deux ou plusieurs souches sont actuellement

examinés par l’EFSA.

Tableau 2 : Micro-organismes probiotiques autorisés en Europe pour la volaille (liste publiée par

l’AFCA-CIAL, dernière mise à jour Mars 2009).

Espèces animales Souches avec appellation commerciale N° Enr

Poulets

d’engraissement

Bacillus subtilis C-3120 –DSM 15544 – CALSPORIN – Calpis

co.Ltd – ORFFA

4b1720

Bacillus subtilis DSM 17299 – O35 / Chr.Hansen 4b1821

Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940- ECOBIAL/ norel SA 4b1822

Sta

bil

isan

te

de

la f

lore

Enterococcus faecium DSM 3530

BIOMIN IMB52 / Biomin GmbH

4b1850

Dindes

engraissement

Bacillus cereus var. toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012

TOYOCERIN/ Rubinum

4b1701

Mic

ro-o

rgan

ism

es

Dindons

engraissement

Bacillus lichenifornis DSM5749 et Bacillus subtilis DSM5750

BIOPLUS2B

E1700

Enterococcus faecium DSM 10663 /NCIMB10415- Oralin E1707

Lactobacillus farciminis CNCM MA 67/4R - BIACTON 12

Poulets

engraissement

Bacillus cereus var. toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012 -

TOYOCERIN

E1701

Enterococcus faecium NCIMB 10415 - CYLACTIN E1705

Enterococcus faecium DSM 10663/NCIMB 10415 - ORALIN E1707

Enterococcus faecium NCIMB 11181 -LACTIFERM 15

Enterococcus faecium ATCC 59519 et Enterococcus faecium

ATCC 55593 - PROPIOS -PIONEER PDFM

E1709

Enterococcus faecium CECT 4515 - FECINOR 18

Pediococcus acidilacti CNCM MA18/5M- Bactocell-

FERMAID

E1712

Lactobacillus farciminis CNCM MA 67/4R - BIACTON 12

Poulets pondeuses Lactobacillus farciminis CNCM MA 67/4R - BIACTON 12

Lactobacillus acidophilus D2/CLS CECT 4529 E1715


14

Figure 2 : Représentation des différents genres microbiens autorisés en tant qu’additifs en

alimentation avicole en Europe (adapté d’AFCA-CIAL, Mars 2009).

Jusqu’à présent, les additifs microbiens selon cette réglementation, peuvent revendiquer des

propriétés zootechniques (relatives aux performances de croissance des animaux), digestives

et stabilisatrices de la microflore intestinale. Cependant force est de constater qu’en élevage,

les propriétés des microorganismes dépassent les seuls effets « croissance », qui doivent

plutôt être considérés comme une résultante de l’amélioration de l’état de santé général de

l’animal. Ces dernières années, des études scientifiquement ont ainsi élargi le potentiel

d’utilisation des souches probiotiques. Des applications préventives de pathologies digestives

ou immunostimulantes ont ainsi été démontrées aussi bien en élevage porcin qu’avicole

(Tableau 3). Dans un contexte d’assainissement des pratiques d’élevage vers une stratégie

plus naturelle et respectueuse de l’environnement et du bien-être animal, les micro-

organismes probiotiques présentent donc un réel potentiel de développement commercial.

4. Critères de sélection des probiotiques

Les micro-organismes doivent posséder diverses propriétés de survie pour répondre à la

définition des probiotiques (Gagnon 2007). Ils doivent présenter une activité positive et

persister durant leur passage dans le tractus digestif. Ces propriétés sont propres à chaque

souche et ne peuvent pas être extrapolables d'une souche à l'autre même au sein d'une même

espèce (Dunne, O'Mahony et al. 2001). Plusieurs critères majeurs de sélection ont été établis

Bacillus 29%

Enterococcus spp.29%

kluyveromyces spp. 4%

Lactobacillus spp. 21%

Pediococcus spp. 4%

Saccharomyces spp. 13%


15

par différents auteurs dans le but de sélectionner les souches potentiellement probiotiques.

Ces critères, résumés dans le tableau 1.3, sont réparties en trois catégories à savoir les critères

de sécurité, fonctionnels et technologiques.

Tableau 3 : Principaux critères de sélection des probiotiques. Adapté de (Klaenhammer and

Kullen 1999; Saarela, Mogensen et al. 2000; Ouwehand, Salminen et al. 2002; Gueimonde

and Salminen 2006).

Critère de

sécurité

• Identification taxonomique précise

• Origine humaine pour utilisation chez l’humain

• Souche caractérisée par des techniques phénotypiques et

génotypiques

• Historique de non pathogénicité et non-invasion de l’épithelium

intestinal

• Pas de transmission possible de gènes de résistance aux

antibiotiques

Critères

fonctionnels

• Tolérance à l’acidité, à la bile et aux enzymes digestives

• Adhésion aux cellules intestinales et persistance dans le tractus

intestinal

•Production de substances antimicrobiennes (bactériocines, acides

organiques, peroxyde d’hydrogène ou autres composés inhibiteurs

et antagonisme envers les pathogènes

• Immunomodulation

• Aptitude à produire des effets bénéfiques sur la santé

Critères

technologiques

• Stabilité au cours des procédés de production et dans le produit

fini

•Conservation des propriétés probiotiques après production

• Non modification des propriétés organoleptiques du produit fini


16

Parmi les critères reliés à la sécurité, l’identification taxonomique de la souche est une étape

importante dans l’établissement de nouvelles souches potentiellement probiotiques (Holzapfel

et al., 2001). Chaque souche doit être identifiée par des techniques moléculaires fiables et

confrontée à une nomenclature actualisée (FAO/WHO, 2002; Gueimonde et Salminen,

2006). Actuellement, l’hybridation ADN-ADN est la méthode moléculaire de référence pour

identifier l’espèce d’une souche, mais cette méthode est longue et requiert une large collection

de souches de référence (FAO/WHO, 2002). Le séquençage de l’ADN codant pour l’ARN

16S ribosomal est considéré aussi pertinent (FAO/WHO, 2002).

Dans ce dernier cas, il est recommandé que la technique soit combinée avec des tests

phénotypiques pour confirmation. L’origine de la souche est également une condition

importante car l’interaction spécifique avec l’hôte est maximisée lorsqu’elle provient du

même habitat (Alvarez-Olmos et Oberhelman, 2001). Les souches probiotiques doivent

également être sans effet négatif et être sécuritaires pour la santé humaine. À ce titre, les

souches potentiellement probiotiques seront évaluées afin qu’aucun des effets secondaires

suivants ne soient détectés: infections systémiques, activité métabolique nuisible, stimulation

immune excessive chez des individus susceptibles et transfert de gènes (par exemple de

résistance aux antibiotiques) (FAO/WHO, 2002). À ce sujet, les souches de lactobacilles et

bifidobactéries associées aux aliments possèdent un historique de sécurité de longue date et

très peu de corrélations existent entre des infections systémiques et la consommation de ces

probiotiques dans la littérature (Borriello et al., 2003; Marteau et al., 2006).

Pour assurer une fonctionnalité optimale, les souches probiotiques doivent conserver leur

viabilité jusqu’à leur site d’action. Cependant, il existe une controverse autour de ce critère

notamment par rapport à l’effet sur le système immunitaire. Même s’il est reconnu que les

cellules bactériennes mortes peuvent apporter des bénéfices physiologiques (Sanders, 2003),

la définition actuelle des probiotiques insiste sur le paramètre de viabilité (FAO/WHO, 2002).

Avant d’atteindre le tractus intestinal, les probiotiques doivent résister principalement à

l’environnement acide de l’estomac (pH compris entre 2,0 et 3,4) et à la bile sécrétée dans le

duodénum (Dunne et al., 2001; Gueimonde et Salminen, 2006). Le degré de tolérance à ces

conditions diffère pour chaque souche (Havenaar et Huis in’t Veld, 1992). Des tests in vitro

sont réalisés pour sélectionner les probiotiques qui maintiendront leur intégrité cellulaire et

leur activité métabolique lors du passage dans le tractus digestif humain.

La capacité d’adhésion à la muqueuse intestinale est également une des propriétés essentielles

que les souches probiotiques se doivent de posséder (Saarela et al., 2000; Tuomola et al.,

2001). L’adhésion permet d’accroître le temps de rétention des probiotiques dans l’intestin et


17

met en contact étroit les bactéries et les cellules épithéliales (Gueimonde et Salminen, 2006).

Ainsi, un probiotique ayant un fort pourcentage d’adhésion pourra éventuellement stimuler le

système immunitaire et prévenir l’implantation de pathogènes sur les cellules épithéliales de

l’intestin par des mécanismes de compétition (Saarela et al., 2000). Les modèles in vitro pour

évaluer l’adhésion des probiotiques font appels à des lignées cellulaires provenant de côlons

humains telles que les Caco-2 et HT-29 et à des techniques conventionnelles de détection de

l’attachement bactérien telles que l’énumération par comptages sur plaques, par coloration

Gram, par marquage radioactif ou par de nouvelles approches comme l’ELISA (Enzyme

Linked ImmunoSorbent Assay) et la quantification par PCR en temps réel (Le Blay et al.,

2004; Servin, 2004; Candela et al., 2005). Grâce à ces techniques, plusieurs études ont montré

le potentiel d’adhésion de nombreuses souches de Lactobacillus et de Bifidobacterium

(Chauvière et al., 1992; Bernet et al., 1993; Crociani et al., 1995; Moroni et al., 2006). La

capacité d’adhésion évaluée à l’aide de ces modèles in vitro est différente pour chaque

souche. Ceci est probablement lié à la physiologie et aux facteurs d’adhésion tels que les

composés protéiques, polysaccharides, charges ioniques et aux acides lipotéichoiques propres

à chaque souche bactérienne (Crociani et al., 1995).

Selon Ouwehand et al. (2002b), l’adhésion aux cellules intestinales humaines en culture n’est

pas un critère suffisant pour décrire les interactions mucosales des probiotiques. Ces auteurs

ont proposé que des pièces de tissus humains seraient plus appropriées pour étudier l’adhésion

des probiotiques. Parmi les souches ayant fait l’objet d’études préalables sur Caco-2, L.

rhamnosus GG adhère fortement au tissu provenant du côlon alors que L. johnsonii La1 et L.

casei Shirota le font à un degré moindre. Ces différences d’adhésion sur le tissu peuvent

s’expliquer par la présence de bactéries du microbiote intestinal. Le microbiote résident

pourrait affecter l’adhésion des souches probiotiques au tissu du côlon et ceci n’est

généralement pas pris en compte dans les modèles d’adhésion (Ouwehand et al., 2002b).

Ainsi, certains auteurs soulignent la limitation de certains critères de sélection et estiment

qu’il faut restreindre la surinterprétation de la signification de telles évaluations (Holzapfel et

Schillinger, 2002; Sanders, 2003). Cependant, les tests in vitro et in vivo sont des moyens

utiles et assez simples à mettre en oeuvre pour évaluer de façon préliminaire le potentiel

probiotique de chaque souche avant de procéder à des essais cliniques chez l’humain.

Parmi l’ensemble des critères présentés au Tableau 3, l’aptitude à produire des effets

bénéfiques sur la santé demeure encore délicat à évaluer dû notamment au fait que les modes

d’action par lesquels les probiotiques exercent un rôle fonctionnel in vivo sont méconnus

(Klaenhammer et Kullen, 1999). Ainsi, comme le soulignent ces auteurs, la compréhension


18

des mécanismes d’action représente un des défis scientifiques majeurs dans le domaine des

probiotiques.

Enfin, du point de vue technologique, les souches probiotiques doivent posséder plusieurs

qualités telles que la facilité à être cultivée à de hautes densités cellulaires tout en conservant

leurs propriétés biologiques et leur stabilité au cours des procédés de production et

d’entreposage (Champagne et al., 2005). À ce titre, de nouvelles technologies permettant de

produire des souches probiotiques à haute viabilité et fonctionnalité sont actuellement

disponibles (Lacroix et Yildirim, 2007).

5. Les différents microorganismes probiotiques en aviculture et leurs caractéristiques

En alimentation animale de nombreux genres bactériens et fongiques incluant Lactobacillus,

Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus, Propionibacterium,

Saccharomyces et Aspergillus sont utilisés, comme probiotique (Tannock 1997). En général,

les souches probiotiques sont sélectionnées pour leurs effets bénéfiques sur la santé tout en

assurant leur sécurité d'utilisation (innocuité). L'utilisation commerciale de probiotiques en

élevages industriels des volailles est relativement nouvelle. Comme pour les autres animaux,

l'utilisation des probiotiques s'est développée à la suite des recherches effectuées sur le tractus

gastro-intestinal qui ont permis une meilleure compréhension du rôle de la microflore et de

son importance sur la santé et l'hygiène digestive des animaux (Gaggia, Mattarelli et al.). Les

différentes études réalisées sur des volailles ont montré que les probiotiques exercent des

activités antibactériennes contre diverses bactéries pathogènes notamment celles responsables

d'infection chez les poulets dont Salmonella sp (Van Immerseel, Cauwerts et al. 2002;

Higgins, Higgins et al. 2008), Campylobacter et Escherichia coli (Zacconi, Scolari et al.

1999; Ragione, Narbad et al. 2004). L'administration de Lactobacillus salivarius A23 à des

poussins a permis d'augmenter le taux des Lactobacilles dans le jabot dès le premier jour

d'administration. Par contre, aucune augmentation significative n'a été observée au niveau du

caecum. Ceci signifie que ce probiotique colonise préférentiellement le jabot (Zacconi,

Scolari et al. 1999). L'administration d'une préparation brut de microflore caecale a permis de

protéger les animaux contre des infections à Salmonella typhimunium et à Salmonella

enteritidis (Andreatti, da Silva et al. 2000; Higgins, Higgins et al. 2008). Enterococcus

faecium J96, une souche probiotique isolée de l'intestin d'une poule a permis de réduire le taux

de croissance de Salmonella pullorum, gallinarum, typhimurim et enteritidis in vitro.


19

L'administration orale de 109

UFC de cette souche à des poussins de 30 h d'âge leur a permis

de résister à une infection à Salmonella pullorum (Audisio, Oliver et al. 2000).

Dans le même ordre d'idée, l'administration simultanée de Salmonella enteritidis et

Lactobacillus salivarius CTC2197 par voie orale à des poussins d'un jour a permis une

élimination complète des Salmonelles (Zacconi, Scolari et al. 1999).

5. 1. Le genre Lactobacillus

Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae, il contient de

nombreuses espèces qui sont des agents de fermentation lactique intervenant dans de

nombreuses industries. Il s’agit de bacilles longs et fins (parfois incurvés) souvent groupés en

chaînes, immobiles, asporulés, catalase négative, se développent à un optimum de température

situé entre 30 et 40°C. Les lactobacilles ont des exigences nutritionnelles très complexes en

acides aminés, en vitamines, en acides gras, en nucléotides, en glucides et en minéraux

(Khalid et Marth, 1990 ; Leclerc et al., 1994).

Le genre Lactobacillus a été subdivisé par Orla-Jensen en trois groupes et cette classification

est encore utilisée en milieu industriel (Tamime, 2002 ; Guiraud et Rosec, 2004) :

Groupe I « Thermobacterium » : comprend les lactobacilles homofermentaires thermophiles

qui se développent à 45°C mais pas à 15°C. Les espèces les plus fréquentes dans

l’alimentation (lait, yaourt, fromage) sont Lb. helveticus, Lb. delbrueckii, Lb. acidophilus.

Groupe II « Streptobacterium » : regroupe les lactobacilles homofermentaires mésophiles et

peuvent être occasionnellement hétérofermentaires en fonction du substrat. Les espèces les

plus fréquentes dans l’alimentation sont Lb. casei, Lb. curvatus, Lb. sake et Lb. plantarum.

Groupe III « Betabacterium » : ce sont des lactobacilles hétérofermentaires. Il comporte les

espèces Lb. fermentum, Lb. brevis et Lb. sanfransisco.

5.2. Le genre Streptococcus

Le genre Streptococcus est toujours large et la classification est très mouvementée. Ce genre

est généralement divisé en trois groupes : pyogène (la plus part des espèces pathogènes et

hémolytiques), oral (tel que St. salivarius, St. bovis) et les autres streptocoques (Scheilfer,

1987). La seule espèce de streptocoques qui soit utilisée en technologie alimentaire est

Streptococcus thermophilus qui a été inclue dans le groupe des « autres streptocoques», mais

ensuite transféré au groupe des streptocoques oraux à cause de leur degré d’homologie avec

l’ADN de Streptococcus salivarius (Stiles et Holzapfel, 1997).


20

Streptococcus thermophilus se différencie par son habitat (lait et produits laitiers) et son

caractère non pathogène. La résistance à la température, la capacité de croitre à 52°C et le

nombre limité des hydrates de carbones permettent de distinguer les St. thermophilus de la

plupart des autres streptocoques (Haddie, 1986 ; Pilet et al ., 2005).

5.3. Le genre Enterococcus

Ce genre regroupe les streptocoques fécaux qui représentent une hémolyse de type λ et β et

qui appartiennent au groupe D. Ce sont des commensaux de l’intestin. Les espèces

rencontrées dans l’alimentation sont essentiellement En. faecalis et les espèces proches. Les

entérocoques sont des coques qui peuvent être mobiles, homofermentaires, généralement

différenciés par la fermentation de l’arabinose et le sorbitol, ils croissent entre 10°C et 45°C

(Tamime, 2002 ; Ho et al., 2007).

5.4. Les genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella

Ils ressemblent les coques lenticulaires en paires ou en chainettes mésophiles, qui possèdent

un caractère hétérofermentaire marqué, avec production d’acide lactique (isomère D), de CO2

et d’éthanol. Les caractéristiques telles que l’hydrolyse de l’esculine, la formation de

dextrane, les conditions de croissance, la capacité à croître à différents pH et température,

l’assimilation de citrate et/ou malate permettent la différenciation entre les genres

Leuconostoc et Weissella (Pilet et al., 1998 ; Ho et al., 2007).

Actuellement, le genre Leuconostoc comprend quatorze espèces, ils sont également

anaérobies facultatifs et exigeants au point de vue nutritionnel et leur croissance est toujours

lente. Le développement des leuconostoc entraîne souvent l’apparition d’une viscosité dans le

milieu grâce à la production des exopolysaccharides. Les leuconostoc principalement Ln.

mesenteroides ssp. cremoris et Ln. lactis sont utilisés en association avec les lactocoques dans

l’industrie laitière pour produire en plus de l’acide lactique et le CO2, des substances

aromatiques telles que le diacétyle et l’acétoïne à partir des citrates du lait (Hassan et Frank,

2001 ; Guiraud, 2003 ; Ogier et al., 2008).

L’espèce Leuconostoc oenos isolée de vins a été classée dans un nouveau genre, Oenococcus

oeni et certaines espèces de lactobacilles hétérofermentaires ont été groupées avec

Leuconostoc paramesenteroides dans le nouveau genre Weissella (Stiles et Holzapfel, 1997).


21

5.5. Les genres Pediococcus

Les Pediococcus sont des coques homofermentaires dont la particularité est le regroupement

en tétrade. Ils sont mésophiles, le plus souvent incapable d’utiliser le lactose, et leur

développement nécessite la présence de divers facteurs de croissance. Certaines espèces se

distinguent par leur capacité à se développer à des teneurs en sels très élevées, comme

Pediococcus halophilus, renommé Tetragenococcus halophilus et Tetragenococcus

muriaticus qui tolère jusqu’à 18% de NaCl (Pilet et al., 2005).

Les espèces de Tetragenococcus ont un rôle crucial dans la fabrication des produits

alimentaires à concentration élevée en sel comme les sauces de soja, alors que les

pediocoques sont parfois utilisés comme levains lactiques pour les charcuteries (Guiraud et

Rosec, 2004 ; Tosukhowong et al., 2005).

5.6. Le genre Bifidobacterium

Le genre Bifidobacterium est considéré comme faisant partie du groupe des bactéries

lactiques grâce à la similarité de ses propriétés physiologiques et biochimiques et à sa

présence dans le même habitat écologique, tel que le tube gastro-intestinal. Ces

microorganismes sont phylogénétiquement sans rapport avec ces dernières. Ils sont davantage

liés au phylum Actinobacteria (anciennement Actinomycètes) des bactéries Gram positif dont

l’ADN est à haut pourcentage de G +C. Les bifidobactéries se caractérisent par leur forme très

irrégulière souvent en forme V mais pouvant être coccoïdes, la présence d'une enzyme, la

fructose-6-phosphate phosphocétolase, celle-ci leur permet de fermenter les hexoses en

produisant de l'acide acétique et de l'acide lactique. Leur température de croissance varie de

36°C à 43°C (Axelsson et al., 2004 ; Pilet et al., 2005 ; Ho et al., 2007).

5.7. Les levures :

Les levures sont des champignons chez lesquels la forme unicellulaire est prédominante. Les

cellules végétatives peuvent être sphériques, ovoïdes, allongées, cylindriques, apiculées,

ogivales ou en forme de citron. La taille cellulaire varie de 2-3 μm de long à 20-50 μm. la

largeur des cellules est de 1 à 10 μm. Le mode de reproduction végétative le plus courant chez

les levures est le bourgeonnement.

Depuis de nombreuses années, les levures sont également utilisées en additifs alimentaires

chez les animaux pour améliorer les performances zootechniques et comme régulateur de la

flore intestinale chez l’homme. Ils induisent des effets positifs en termes de performances de


22

productions chez plusieurs espèces des ruminants et monogastriques, mais ne peuvent pas

coloniser le tractus digestif.

Les levures utilisées comme probiotiques sont des souches de Saccharomyces cerevisiae. Une

souche bien déterminée de cette levure est dénommée Saccharomyces boulardii (Rolfe, 2000;

Toma et al, 2005).


23

Tableau 4 : Exemples d’effets probiotiques récemment démontrés en élevage avicole (adapté

de Bernardeau et al., 2006)

Animal Souche probiotique Commentaires Référence

Dindes Lactobacillus sp. Augmente le gain de poids. Diminue

Les couts de production

Torres- Rodriguez

et al,2007

Pou

lets

de

chai

r

2Lb., 1 bifidobacterium

Enterococcus, Pediococcus

Augmente les parameters de performance

zootechniques. Module la composition de la

microflora du caecum

Mountzouris et al.,

2007

Lb-based probiotic

Effets sur l’immunité locale démontré par

(1) une diminution des taux d’invasion

intestinale et du développement d’oocytes

d’Eimeria acervulina (EA), (2) des taux

supérieurs de sécrétion d’IL-2 et

diminution de la production d’oocytes d’EA

Dalloul et al.,2003

Pediococcus acidilactici et

Saccharomyces boulardii

Améliore la résistance aux coccidioses

(Eimeria acervulina, E. tenella) en

augmentant l’immunité Humorale

Lee et al., 2007

Enterococcus faecium

NCIMB10415

B.subtilis, B.Licheniformis

Augmente le gain de poids, le taux de

conversion, la taille des villosités dans

l’ileum.

Samli et al.,2007

Bacillus subtilis & Bacillus

Licheniformis

Pas d’impact sur les performances de

croissance, le poids du tibiotarsi, sa

longueur, sa robustesse et son % de Ca.

Améliore l’épaisseur la paroi du tibia

median et latéral, de l’index tibiotarsal et du

% de cendre

Mutus et al.,2006

Lactobacillus johnsonii

F19785

Contrôle les entérites nécrotiques

endémiques dues à Clostridium perfringens,

réduisant les pertes économiques et

l’utilisation d’antibiotiques

La Ragione et al.,

2004

Lb. espèces Inhibe Eimeria tenella – in vitro Tierney et al.,2004

Poules

pondeu

-ses,

fin de

période

Lb. espèces

Augmente la production d’œufs, diminue la

mortalité, améliore le taux de conversion

mais pas la qualité des œufs.

Yoruk et al.,2004


24

6. Production de substances antimicrobiennes

C’est un mécanisme d’action des probiotiques concernant l’inhibition de la croissance des

pathogènes grâce à des composés antimicrobiens. Les bactéries appartenant aux genres

Lactobacillus et Bifidobacterium d’origine humaine peuvent produire des substances

antimicrobiennes, telles que les acides organiques, qui sont actives in vitro et in vivo contre

les micro-organismes entérovirulents impliqués dans les cas de diarrhées (Servin, 2004).

L’acide lactique et acétique sont produits via la fermentation des hexoses par les lactobacilles

et bifidobactéries. Ces acides organiques peuvent diffuser passivement à travers la membrane

bactérienne sous leur forme non dissociée (Figure 1.6). Ils acidifient le cytoplasme après

dissociation et inhibent l’activité enzymatique cellulaire des pathogènes acido-sensibles

(Deng et al., 1999). Cette diminution du pH peut donc affecter la viabilité des pathogènes

bactériens (Bruno et Shah, 2002; Servin, 2004).

Dans une étude réalisée in vitro, Hütt et al. (2006) ont observé que l’activité anti-Salmonella

produit par trois souches de lactobacilles, L. paracasei 8700:2, L. plantarum 299V et L.

fermentum ME-3, en condition microaérophile de même que l’activité anti-Shigella de deux

bifidobactéries, B. lactis Bb12 et B. longum 46, en condition anaérobie était associée à un

effet du pH. Une corrélation positive entre la production d’acide lactique et l’activité

inhibitrice a été observée. Cependant, la quantité d’acide acétique et l’activité inhibitrice des

lactobacilles et des bifidobactéries cultivées en conditions anaérobiques étaient corrélées de

façon négative.

En utilisant un modèle murin, Asahara et al. (2001) ont observé qu’une infection à

salmonelles induite lors d’un traitement aux antibiotiques pouvait être réduite de façon

importante par la précolonisation de l’intestin avec la souche B. breve Yakult. Selon ces

auteurs, la production d’acides organiques par la souche probiotique et une réduction du pH

fécal seraient importantes pour l’activité anti-infectieuse obtenue contre la souche Salmonella

typhimurium. En utilisant la même souche, ces mêmes auteurs ont observé que la production

d’une forte concentration d’acides organiques peut également jouer un rôle important dans

l’inhibition de la production de toxines par une souche de E. coli O157:H7 dans un modèle

murin (Asahara et al., 2004).

La production d’autres agents antimicrobiens, tels que les bactériocines, ont aussi été

rapportés principalement lors d’études in vitro. Les bactériocines sont définies comme des

composés protéiques ayant une activité inhibitrice contre un large spectre de souches

bactériennes (Klaenhammer, 1993). Elles agissent principalement sur la membrane externe

des bactéries cibles en formant des pores qui mènent à la libération du contenu intracellulaire


25

et à la mort de la bactérie affectée (Klaenhammer, 1993). Les lactobacilles sont souvent

associés à la production de bactériocines (Fooks et Gibson, 2002). La production de

bactériocines par les souches de bifidobactéries est moins documentée. Néanmoins, il a été

rapporté que la souche B. bifidum NCFB 1454 produit une bactériocine active contre Listeria

monocytogenes (Yildirim et Johnson, 1998).

Un composé antimicrobien produit par des bifidobactéries humaines, Bifidobacterium spp

CA1 et F9, a été identifié récemment et il consistait en une ou plusieurs molécules lipophiles

avec une masse moléculaire de moins de 3,500 Da (Liévin et al., 2000). Ces auteurs ont

démontré que ces composés antimicrobiens étaient actifs contre Salmonella typhimurium

SL1334 et qu’une diminution de 4 logarithmes de l’adhésion du pathogène aux cellules Caco-

2 pouvait être obtenue. Ces auteurs ont également évalué cette activité antimicrobienne in

vivo avec des souris axéniques C3/He/Oujco infectées par S. typhimurium C5. Les souris

recevant les bifidobactéries CA1 et F9 étaient protégées de l’infection létale comparativement

aux souris contrôles qui ne vivaient pas plus de 10 jours après l’infection. Cependant, même si

certaines bactériocines présentent une forte activité in vitro et in vivo chez les souris contre

certains pathogènes, la démonstration de la production et l’activité des bactériocines dans le

tube digestif humain est à établir.

Lors d’expérience in vitro, certains auteurs ont proposé une action synergétique entre les

substances protéiques antimicrobiennes et l’acide organique pour expliquer l’action inhibitrice

des bactéries probiotiques. Ainsi, Gopal et al. (2001) ont mené une série d’expériences pour

étudier l’inhibition in vitro d’une souche d’E. coli O157:H7 par L. rhamnosus DR20, L.

acidophilus HN017 et B. lactis DR10. Le pré-traitement d’E. coli O157:H7 avec les

surnageants de culture des bactéries réduit l’association de ce pathogène avec les cellules

Caco-2 et HT-29. Les molécules inhibitrices sécrétées dans les surnageants par ces bactéries

sont partiellement affectées par des traitements avec la lactate dehydrogénase, trypsine et

protéinase K laissant suggérer que les substances protéiques antibactériennes ne sont pas

uniquement responsable de l’inhibition et qu’elles agissent de concert avec l’acide produit.

Selon Servin et al. (2004) ceci s’expliquerait par une diminution du pH qui provoque une

perméabilisation de la membrane externe des bactéries Gram-négatif facilitant ainsi la

pénétration d’autres substances antimicrobiennes telles que les bactériocines.


26

7. Efficacités des probiotique en aviculture

7.1. Efficacité sanitaire des probiotiques

Leur efficacité première se situe au niveau de l’aspect sanitaire. les probiotiques exercent des

activités antibactériennes contre diverses bactéries pathogènes et notamment contre les

microorganismes fréquemment responsable d’infection chez les poulets : Salmonella sp,

Compylobacter, Escherichia coli. (Van immerseel et al, 2002 ; Van immerseel et al, 2005).

De nombreuses expériences confirment les effets des souches probiotiques, notamment les

lactobacilllus contre les souches d’ Escherichia coli et Salmonella :

· L’administration de Lactobacillus salivarius A23 à des poussins nouvellement

éclospermet d’augmenter le poids et de diminuer le taux des pathogènes (coliformes)

et augmenter le taux des lactobacilles dans le jabot dès le premier jour

d’administration. Par contre, aucune diminution significative n’a été observée au

niveau du cæcum. Ceci signifie que le probiotique agit essentiellement au niveau de

jabot (Zacconi et al ,1999).

· L’administration de La microflore cæcale permet de protéger les animaux contre des

infections par des souches de Salmonella Typhimurium et S.Enteritidis (Andreatti

Filho et al, 2000).

· D’autres bactéries que les lactobacilles ont un effet probiotique .Tel est le cas

d’Enterococcus faecium souche J96 isolé de l’intestin d’une poule. Cette souche réduit

le taux de croissance de Salmonella pullorum, gallinarum, typhimurium et enteritidis

in vitro. L’administration de 109 UFC de cette souche à des poussins de 30 h leurs

permet de survivre à un challenge 24 h plus tard avec 105 UFC de Salmonella

Pullorum (Audisio et al, 2000 cité par Van immerseel, 2003).

· Il y a également des rapports concernant l’emploi de mélanges de différentes souches

Lactobacillus Salivarius et Lactobacillus Plantarum inhibent in vitro Escherichia coli

et Salmonella Typhimurium (Murry et al, 2004). Ainsi il a été rapporté récemment que

la croissance de Salmonella Enteritidis était fortement réduite in vitro en présence

d’un mélange des Lactobacillus Crispatus et de Clostridium Lactatifermantans à pH

5.8 (Van Der Wielden et al, 2002). En revanche, l’administration simultanée de

Salmonella Enteritidis et Lactobacillus salivarius souche CTC2197 par voie orale à

des poussins d’un jour a permis une élimination complète des Salmonelles après 21

jours (Pascual et al, 1999).


27

· L.salivarius additionné au suspension fécale affecte positivement le poids des poussins

et l’exclusion compétitive des Salmonelles (Zacconi et al, 1999). De la même façon

une suspension feacale permet de protéger les poussins contre une colonisation par les

souches : Salmonella typhimurium, S. agona, S. infantis, S. enteritidis (Oliveira et al,

2000 ; Denis et al, 2004).

Ces expériences montrent qu’il serait possible de réaliser, dés l’éclosion chez des poussins,

une colonisation dirigée du tube digestif des animaux avec des souches probiotiques à fort

pouvoir inhibiteur plutôt que de laisser s’installer naturellement une flore lactique quelconque

apportée par l’environnement. Il est évident que la microflore complexe du cæcum d’un

adulte exerce une action protectrice contre la colonisation des bactéries pathogènes de type E

coli, Salmonella et Campylobacter. Par contre, chez les poussins l’infection par des bactéries

pathogènes est beaucoup plus fréquente du faite que la flore intestinale n’est pas

complètement établie. De plus, les poussins étant séparés de leur mère dès leur éclosion, ils

n’ont pas la possibilité d’acquérir la microflore protectrice maternelle. Tout ceci met l’accent

sur l’intérêt d’utiliser des probiotiques en aviculture.

7.2. Efficacité zootechnique des probiotiques

Chez l’animal, l’efficacité zootechnique revendiquée des probiotiques est souvent par

l’amélioration de la croissance (GMQ), de l’indice de consommation (IC), et de l’état

sanitaire voire du bien être des animaux établis par la réduction de la fréquence des diarrhées

ou de la mortalité durant certaines phases critiques d’élevage: stress alimentaires (changement

de régime alimentaire, rations riches en concentré), stress sanitaires (densité des animaux...).

En matière de productivité, les données publiées font apparaître une variabilité importante de

la réponse animale pour le GMQ et pour l’IC, la réponse relative étant d’autant plus marquée

que les conditions nutritionnelles et sanitaires sont médiocres (Edens, 2003).

Une telle variabilité en pratique n’est pas surprenante car l’action supposée passe par la

modification de l’écosystème intestinal qui peut largement différer d’un essai à l’autre en

fonction des microorganismes utilisés (souches) ainsi qu’à leur concentration dans l’aliment,

de l’interaction des probiotiques avec certains composants de l’aliment, de l’âge des animaux

(les plus jeunes présentant des flores digestives moins stables que celle des adultes et une

immunité moins établie), et de leur état nutritionnel et sanitaire.

· L’administration d’une souche d’Enterococcus faecium M-74, à des poussins durant

06 semaines améliore les performances zootechniques des animaux par rapport au


28

groupe témoin : le poids final est de 2168.25 g et un IC est de 2.02 pour le lot traité

contre 1956.10 g et 2.16 pour le lot temoin (P<0.01) (Ivanković et al, 1999).

· L’addition d’un probiotique, à base d’Enterococcus faecium M-74, à l’eau de boisson

(3g/100l) des poussins durant 06 semaines améliore la croissance des animaux de

10.8% par rapport au lot temoin (Kralik et al, 2004).

· Yeo et Kim, (1997) ont étudié sur des poussins les effets zootechniques d’une souche

de Lactobacillus casei : gain de poids, indice de consommation, activité d’uréase

intestinal. La ration des poussins est supplémentée avec la souche de Lactobacillus

casei, un antibiotique, extrait de yucca, ou n’est pas de tout supplémentée (lot témoin).

Les résultas montrent que l’addition d’un probiotique favorise l’amélioration de gain

moyen quotidien durant les 3 premières semaines avec diminution de taux d’uréase

intestinales comparativement aux autres lots.

· D’autres paramètres nutritionnels tel que l’activité des enzymes amylases sont

également améliorés en présence des Lactobacillus. (Jin et al, 2000).

· Un essai de supplémentation par la levure Saccharomyces cerevisiae a été conduit sur

des poussins (4.108 UFC), la mortalité a été significativement diminuée dans le lot

traité (Karaoglu et Dardug, 2005).

· Paramètres environnementaux : Dans l’élevage intensif, la principale préoccupation

environnementale concerne les déjections. l’emploi d’additifs probiotiques permet de

réduire la quantité d’azote dans les effluent, ce qui pourrait représenter un gain

d’efficacité alimentaire, à condition toutefois que l’énergie ainsi épargnée soit rendue

disponible à l’animal. Ainsi son importance, d’un point de vue environnemental ;

(Applegate et Angel, 2005 ; Wood et Abuchar, 1998 ; Rotz, 2004; Ferket et al, 2002 ;

Lee et al, 2006). Selon Chang et Chen, (2003) la présence des souches lactobacilli

dans l’aliment réduit l’excrétion d’ammoniac.

· L’addition de jus de rumen lyophilisé augmente le poids des poulets de chair et

améliore la conversion (Kuçukersan et al, 2002).


29

Chapitre 3 : Les prébiotiques

1. Définition Prébiotiques

Par définition les prébiotiques sont des ingrédients des aliments indigestibles, qui ont un effet

bénéfique sur l’animal par le biais d’une stimulation de la croissance et/ou de l’activité d’un

nombre restreint d’espèces bactériennes déjà résidente dans la flore digestive de l’animal ce

qui peut contribuer à l’amélioration de la santé de l’animal (Gibson et Roberfroi, 1995; Piva,

1999; Schrezenmeir et De Vreseal, 2001; Rastall et Gibson, 2004 ; Cummings et Kong, 2004 ;

Fao/Who, 2004). Par conséquent, un produit sera classé comme prébiotique dés qu’il répond

aux trois conditions suivantes : (Suskovic et al, 2001 ; Ferket, 2002 ; Fooks et Gibson, 2002 ;

Gibson et al, 2004).

-être ni hydrolysé, ni absorbé dans le tractus gastro-intestinal.

- être sélectif pour un nombre limité de bactéries endogènes.

-Modifier la microflore intestinale en améliorant sa composition.

-Tout ceci doit nécessairement induire une modification de la composition de la flore,

améliorant ainsi l’état de la santé de l’hôte.

Compte tenu de ces critères particuliers, on constate que la plupart des prébiotiques sont des

hydrates de carbones non digestibles pour l’hôte.

2. Différentes classes des prébiotiques

On distingue différentes classes de prébiotiques, selon la taille de la molécule ou suivant leur

origine, naturelle ou synthétique (Van immerseel al, 2003 ; Gibson et al, 2004).

2.1. Les hexoses, telles que le fructose, glucose, galactose et mannose, et les pentoses tels que

le ribose, xylose et arabinose sont les monosaccharides prébiotiques les plus importants. Le

galactose est disponible sous forme de disaccharides tels que le lactose. Cependant le

monosaccharide le plus couramment utilisé comme prébiotique est certainement le mannose.

2.2. Les disaccharides naturels

Les plus couramment utilisés sont le sucrose, le lactose et le maltose.

2.3. Les oligosaccharides (Conway, 2001)

Sont produits la plupart du temps par synthèse ou par hydrolyse enzymatique, soit à partir des

hexoses monosaccharidiques, soit à partir de la paroi de cellules microbiennes ou par

fermentation de polysaccharides. Parmi les oligosaccharides, les fructo-oligosaccharides

(FOS) occupent certainement une place importante.


30

Les FOS sont produits par hydrolyse d’inuline ou par synthèse à partir de sucrose ou de

lactose. Les FOS réduisent la colonisation de l’intestin par Salmonella. L’administration de

FOS dans les aliments pour volaille semble également réduire la colonisation de l’intestin par

Campylobacter et les salmonelles (Gibson et Fuller, 2000 ; Van immerseel et al, 2003).

De la même façon Oyarzabal et ses collaborateurs (1995) ont mis en évidence l’efficacité

d’une préparation probiotique associant un E.laecium, L. lactis, ar Pediococcus sp, avec FOS

; l’incorporation permet l’exclusion des salmonelles a partir du ceacum.

Les mannane-oligosaccharides (MOS) sont des constituants naturels de la paroi des levures et

des gommes naturelles. Ce produit est constitué d’un lysat centrifugé de Saccharomyces

cerevisiae. L’administration de ces MOS protège la volaille contre plusieurs pathogènes

provoquant des troubles digestifs en stimulant le système immunitaire, modifiant la flore

intestinale et inactivant les aflatoxines (Anonyme, 2002; Revington, 2002).

3. Mode d’action des prébiotiques

Les prébiotiques agissent en amont des probiotiques. Où le probiotique va fournir directement

un micro-organisme aux actions bénéfiques pour l’hôte, le prébiotique se contente d’apporter

une source nutritive sélective d’une flore bénéfique pour l’hôte. Le mode d’action des

prébiotiques est donc à rapprocher de celui des probiotiques.

Les prébiotiques sont généralement des oligosaccharides ou des polysaccharides à courte

chaîne constitués approximativement de deux à vingt unités de sucre. Ils échappent à la

digestion dans l’intestin grêle et sont des substrats potentiels pour l'hydrolyse et la

fermentation par les bactéries intestinales.

Les prébiotiques doivent agir comme substrat sélectif d’une ou d’un nombre restreint de

souches bactériennes bénéfiques qui résident dans le côlon et en stimuler la croissance. Les

bifidobactéries et les lactobacilles sont les micro-organismes du microbiote intestinal les plus

fréquemment ciblés (Marteau et al., 2004).

De plus en plus utilisé en thérapie (Fujimori et al., 2007 ; Larkin et al., 2007), les prébiotiques

sont également grandement utilisés dans les alicaments et dans l’alimentation animale.

Les FOS sont des composants naturels, que nous retrouvons dans divers végétaux (oignon ou

blé par exemple), qui ne sont pas digérés par les Mammifères mais qui peuvent être

métabolisés par certaines bactéries (Willard et al. 1994a). Ils permettraient d’obtenir une

réduction quantitative de la flore intestinale pathogène en étant à l’origine d’un

environnement plus favorable pour les bactéries utiles qui se développent plus vite que les

bactéries pathogènes qui sont incapables d’utiliser les FOS (Lecoindre 2000).


31

4. Caractérisation des exopolysaccharides (prébiotiques)

4.1. Classification des EPS des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques produisent deux principales classes d'EPS. Les homopolysaccharides

et les hétéropolysaccharides.

Les homopolysaccharides sont constitués d'un seul type de monosaccharide joint par

différents types de liaisons et d'embranchements. Ils comprennent, entre autres, les a-D-

glucanes, produits par Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus mutans et Streptococcus

sobrinus; les D-glucanes, produits par Propionibacterium spp. (Deutsch et al. , 2008),

Pediococcus spp. Et Streptococcus spp., ainsi que le levane produit par Streptococcus

salivarius (De Vuyst et Degeest, 1999).

Pour leur part, les hétéropolysaccharides sont des répétitions de plusieurs oligosaccharides,

chacun contenant de trois à huit résidus et possédant un nombre limité de monosaccharides

différents (Degeest et al., 2001a). Des résidus acétyle, amino ou phosphate peuvent également

être retrouvés dans les unités répétitives. Les hétéropolysaccharides sont produits par des

LAB mésophiles, comme Lactococcus lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris, Lactobacillus

casei et L. rhamnosus, et par des LAB thermophiles, notamment Lactobacillus acidophilus,

Lactobacillus helveticus et S. thermophilus (De Vuyst et Degeest, 1999). La structure des

hétéropolysaccharides peut varier, entre les espèces et entre les souches, selon la composition

en sucres, la présence et la nature des chaînes latérales, la masse moléculaire, etc.

Les différentes structures possibles des EPS affectent le pouvoir texturant de ces

macromolécules dans les produits alimentaires. Étant donné que les EPS varient dans leur

composition, leur arrangement spatial, leur charge, leur rigidité et leurs interactions avec les

protéines, la corrélation entre la concentration des EPS et la viscosité apparente est

habituellement spécifique à chaque EPS. Malgré tout, certaines caractéristiques semblent

communes à plusieurs EPS. Par exemple, les EPS ayant une masse molaire plus élevée

entraîneront habituellement une plus grande viscosité. Aussi, les EPS neutres contribuent

surtout à la viscosité, mais pas à l'élasticité, contrairement aux EPS chargés négativement qui

vont plutôt contribuer à l'élasticité, mais pas à la viscosité (Jolly et al., 2002).


32

4.2. Production et détection des EPS

4.2.1. Détection de polysaccharides exo-cellulaires

II existe plusieurs façons de détecter la présence de polysaccharides. Ces derniers peuvent être

détectés qualitativement par un examen visuel, par coloration ou par microscopie photonique

électronique. La mesure de la viscosité et le dosage des EPS purifiés permet de les détecter

quantitativement.

4.2.2. Examen visuel

La façon la plus simple de détecter la production d'EPS chez une souche consiste à examiner

une colonie sur un milieu gélosé. La colonie d'une souche productrice aura une apparence

brillante et en touchant la colonie avec un cure-dents ou avec une anse à ensemencer (manche

de Koch), il y aura formation de longs filaments visqueux. Cependant, certaines souches de

bactéries lactiques ne produisent pas de polymères sur un milieu gélosé mais en produisent en

milieu liquide sous certaines conditions bien définie.

4.2.3. Les colorations

II est possible de sélectionner des clones bactériens producteurs d’EPS, appelés clones Mut+,

en ajoutant des colorants cationiques dans le milieu de culture. Les clones Muc+ sont révélés

par le masquage de la coloration par le polysaccharide produit.

Les colorants cationiques ont une affinité pour les polysaccharides anioniques et neutres ; ils

développent des interactions ioniques avec les anions organiques ou inorganiques du milieu

environnant. Additionné au milieu de croissance, le colorant cationique se fixe donc sur le

peptidoglycane de la paroi bactérienne, ce qui entraîne une coloration de la colonie d'une

souche non-productrice. Ces colorants ne présentant pas d'affinité pour les polysaccharides

excrétés, les polysaccharides produits masquent alors la coloration et les clones Muc+

apparaissent blancs (Gancel et al, 1988).

Un exemple de colorant cationique est le rouge de ruthénium qui donne une coloration rose

foncé au milieu de culture. Les colonies Muc+ apparaissent donc blanches sur fond rose par le

masquage de la couleur dû aux exopolysaccharides produits. Les clones Muc- apparaissent

rosés. Cette technique a été utilisée par Bouzar et al. (1995) pour la sélection de clones d'une

souche de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus produisant différents niveaux de polysaccharides

extracellulaires. De cette façon, Stingele et al. (1996) ont sélectionné la souche Streptococcus

thermophilus Sfi6 possédant le phénotype de production d'EPS stable.


33

4.3. Extraction et purification

La meilleure façon de doser quantitativement les EPS est de les extraire du milieu de culture

et de les doser. Les polysaccharides bactériens extracellulaires précipitent en présence

d'éthanol. Après les avoir purifiés pour enlever les protéines et les résidus du milieu pouvant

interférer lors du dosage, il est possible de les doser avec une méthode calorimétrique comme

celle de Dubois (1956) à l'acide sulfurique et phénol. Lors de ce dosage, la courbe étalon est

produite avec du glucose et les unités de mesure sont exprimées en mg/l d'équivalents

glucose. Cette méthode a aussi ses limites et un milieu défini est recommandé. En effet,

certains éléments présents dans le MRS par exemple peuvent précipiter avec l'éhano1 et

fausser les résultats de dosage (Garcia-Garibay et Marshall,1991). L'extraction des EPS dans

le lait est plus compliquée ; les constituants du lait peuvent interférer dans la précipitation des

polymères et les EPS bactériens ont tendance à s'associer aux protéines du lait pour former un

complexe glycoprotéique. II faut alors hydrolyser les caséines avec des enzymes spécifiques

et bien purifier les polymères recueillis par une précipitation à l'éthanol (Bouzar et al., 1997).

4.4. Dosage colorimétrique des EPS purifiés

Les exopolysaccharides purifiés et lyophilisés sont resuspendus dans de l'eau dé-ionisée

(Millipore) et dosés selon la méthode de dosage des sucres totaux de Dubois et al. (1956)

modifiée par Gerhardt et al. en 1981.

Le principe de cette méthode repose sur le fait que l'ajout d'acide sulfurique provoque

l'hydrolyse des polysaccharides et la formation de 5- hydroxyméthyl-furfural qui donne, en

présence de phénol, une coloration orangée. L'intensité de la couleur est directement

proportionnelle à la quantité de sucre présent et est directement mesurable par

spectrophotométrie. La réaction est sensible et la couleur est stable. De petites quantités de

Carbohydrates peuvent être détectées et la présence de protéines ou de peptides n'influence

pas le dosage.

Une courbe standard est préparée à partir d'une solution glucose à une concentration donnée.

Chaque échantillon est préparé et pré-dilué si nécessaire. Le blanc est fait avec la

concentration O mg/l.

La lecture de l'absorbance se faite avec un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 499

nm. Les quantités de polysaccharides sont exprimées en mg/l d'équivalent glucose, selon la

courbe standard.


34

4.5. Caractérisation des EPS à l’échelle chromatographique La chromatographie sur couche mince (CCM) est la technique la plus simple, utilisée pour

déterminer la composition qualitative en oses polysaccharidiques. Cette technique a été

utilisée par Souly Frag (1978).

Avant d’être analysés, les polysaccharides doivent subir une hydrolyse acide afin de libérer

les différents oses composants de ce polysaccharide.

Une plaque de chromatographie sur couche mince (TLC, CCM en français) se compose d’un

support, en aluminium ou en verre, sur lequel a été étendue une fine couche d’un milieu de

sorption (p. ex. la silice, SiO2) comme phase stationnaire. Ces plaques sont plongées

d’environ un demi-cm dans une phase mobile. Cette dernière est généralement un mélange

binaire ou ternaire de solvants, adapté au type de séparation recherché. Les composés déposés

à environ un cm du bas de la plaque sont alors humectés et dissous par la phase mobile qui

progresse par capillarité le long de la phase stationnaire.

Selon la nature des phases mobile et stationnaire, deux types de mécanismes d’interaction

permettent la séparation de composés présents en mélange : l’adsorption sur la surface de la

phase stationnaire solide et le partage entre un film de phase stationnaire liquide et la phase

mobile (Pachaly, 1999).

Pour les analyses de routine par TLC des chromatographies monodimensionnelles, on utilise

généralement des plaques de Silicagel 60 F254 prêtes à l’emploi à support en aluminium

(Merck) et celles-ci sont développées dans des cuves en verre conventionnelles (Camag), dont

l’atmosphère aura préalablement été saturée en vapeurs de la phase mobile.

Du fait de ses faibles contraintes techniques, de son emploi simple et de son coût relativement

modeste, la TLC est un outil de choix pour l’analyse de routine d’extraits bruts, de fractions,

ainsi que de produits purs isolés. Les quantités déposées sur les plaques sont normalement de

100 μg pour les extraits et de 10 μg pour les produits purs.

Il s’agit également d’un support facilement utilisable pour caractériser ultérieurement des

substances par leurs réactivités chimiques ou leurs activités sur certaines cibles biologiques.

L’incorporation dans la phase stationnaire des plaques du commerce de produits permettant la

visualisation des composée UV-actifs à 254 nm et 366 nm, augmente le seuil de détection des

produits à faible activité spectrale dans le domaine du visible (environ 450-700 nm).


35

5. Effet des prébiotiques en aviculture

Les prébiotiques constituent une toute autre classe d’additifs. Par définition, les prébiotiques

sont tous les produits ajoutés aux aliments qui sont indigestibles pour le poulet, mais qui

peuvent avoir un effet bénéficiaire sur la santé intestinale par la stimulation spécifique de la

croissance ou de l’activité d’un nombre limité d’espèces bactériennes favorables. Presque tous

les prébiotiques sont des oligosaccharides ou des polysaccharides. Par exemple, plusieurs

études ont montré un effet bénéficiaire de l’utilisation de lactose pendant la période juste

avant l’abattage. Les fructo-oligosaccharides par contre, malgré leur effet bénéficiaire bien

documenté sur la santé intestinale chez l’homme et les mammifères, ne semblent avoir qu’un

effet marginal, voir inexistant, sur la colonisation de l’intestin du poulet par Salmonella. Les

mannan-oligosaccharides cependant ont bien un effet de protection contre les Salmonelles, ce

que s’explique probablement par le blocage de l’attachement des Salmonella sur les cellules

épithéliales de l’intestin. Les auteurs ont montré un effet de protection contre la colonisation

et l’excrétion des Salmonelles dans les fientes d’un additif sur base d’arabinoxylo-

oligosaccharides (AXOS), ce qui est d’autant plus surprenant que les polymères dont ces

AXOS sont dérivés, et qui sont largement présents dans les céréales, tels que le froment et le

seigle, semblent augmenter la sensibilité des poulets pour une infection à Salmonella. Aussi

pour le « guar gum » et « partially hydrolysed guar gum », des effets de protection contre

Salmonella ont été décrits. Il existe encore toute une gamme d’autres prébiotiques, pour

lesquels cependant souvent, les effets de protection contre la colonisation et l’excrétion dans

les fientes des agents zoonotiques n’ont pas été clairement documentés chez le poulet. Les

probiotiques constituent une troisième grande classe d’additifs testés pour une utilisation dans

le cadre de la lutte contre la salmonellose et les autres agents zoonotiques chez le poulet. Les

probiotiques par définition sont des microbes vivants ajoutés aux aliments. La plupart des

souches microbiennes utilisées dans les produits probiotiques appartiennent aux genres

Bifidobacterium ou Lactobacillus. Les lactobacilles peuvent produire des métabolites qui

limitent la croissance des Salmonelles. Ils peuvent, dans certaines conditions, aussi moduler

l’immunité et interférer dans l’attachement des Salmonelles sur les cellules épithéliales de

l’intestin. Par ce biais, les lactobacilles peuvent protéger contre la colonisation par

Salmonella. Certaines souches de lactobacilles ont déjà été mélangées dans les aliments à la

ferme avec de bons résultats. Cependant, la réduction des nombres de Salmonelles retrouvées

au niveau de l’intestin après administration orale de lactobacilles est souvent limitée (Van

Coillie et al., 2007).


36

Les oligosaccharides sont produits la plupart du temps par synthèse ou par hydrolyse

enzymatique, soit à partir des hexoses monosaccharidiques, soit à partir de la paroi de cellules

microbiennes, ou par fermentation de polysaccharides (Iji et Tivey, 1998). Parmi les

oligosaccharides, les fructo-oligosaccharides (FOS) occupent certainement une place

importante. Les FOS sont constitués de courts polymères de fructose (liés en β 1-2). Ils sont

produits par hydrolyse d’inuline ou par synthèse à partir de sucrose ou de lactose (Le Blay et

al., 1999). On a démontré que les FOS réduisent la colonisation de l’intestin par Salmonella

(Fukata et al., 1999), d’autant qu’une flore de compétition est donnée en même temps (Bailey

et al., 1991). L’administration de FOS dans les aliments pour volaille semble également

réduire la colonisation de l’intestin par Campylobacter (Schoeni et Wong, 1994).

L’administration de ces MOS à une concentration de 4000 ppm dans l’aliment de poussins de

3 jours a entraîné une réduction de la concentration de Salmonelles dans les caeca après

challenge de Salmonella typhimurium et de Salmonella dublin (Spring et al., 2000). On a

démontré également que le contenu cæcal des poules recevant des MOS dans les aliments,

administré à des poussins, protégeait ces poussins contre un challenge avec Salmonella

enteritidis (Fernandez et al., 2000).

Les polysaccharides, peu de données sont disponibles, sauf pour la gomme de guar obtenue

par traitement enzymatique des fèves de Cyanopsis tetragonolobus. Le traitement à l’endo-β-

D-mannanase permet de cliver la chaîne centrale de mannose de la gomme. On obtient ainsi

un mélange de galactomannanes que l’on appelle gomme de guar partiellement hydrolysée.

Inclus dans l’aliment pour poule pondeuse à une concentration de 250 ppm cette gomme de

guar partiellement hydrolysée a permis de protéger les poules contre un challenge assez

sévère de Salmonella enteritidis, et en plus, la coquille des œufs ainsi que le blanc et le jaune

des œufs étaient significativement moins contaminés (Ishihara et al., 2000).


37

Chapitre 4 : APPROCHE MOLECULAIRE

Au cours des dernières décennies, différentes méthodes d'identification moléculaire des

bactéries lactiques ont été élaborées afin de réduire le temps d'analyse généralement

nécessaire aux tests phénotypiques. En outre, parce qu'elles ne sont pas influencées par des

facteurs physiologiques et environnementaux, les méthodes moléculaires offrent des résultats

d'identification plus fiables.

Les méthodes moléculaires permettent une identification au niveau de l'espèce et de la souche.

De plus, les souches de bactéries peuvent être différenciées entre elles et, en outre, les souches

porteuses de gènes spécifiques peuvent être détectées quelle que soit l'espèce.

1. l’ADNr 16S comme sémantide bactérienne

De toutes les sémantides bactériennes, le gène de l’ADNr 16S reste certainement la plus

usitée selon Fox et al. (1980) et Weisburg et al. (1991) qui historiquement en firent la

première sémantide bactérienne et la première facilement amplifiable « universellement ».

Aujourd’hui encore, le gène de l’ADNr 16S reste la sémantide la mieux renseignée dans les

bases de données de séquences nucléotidiques (cf figure I.15) et de facto la plus employée

(près de 600000 séquences dans la base « RDPII » (Cole et al., 2007) et plus de 200000

séquences supérieures à 1250 Nt dans la base « Greengenes » en août 2008 (De Santis et al.,

2006).

L’ARN 16S est un constituant de la petite sous-unité ribosomique. De fait, la survie de la

cellule dépend de sa conformation. Or cette dernière dépend de sa séquence et donc la

séquence du gène de l’ADNr 16S est indispensable à la survie de la cellule. Il existe donc des

zones conservées du gène qui sont indispensables à la structure tertiaire de l’ARNr.

Ces régions conservées sont au nombre de dix. De ces régions peuvent être extraits des

amorces ou sondes dites « universelles ». Entre ces régions conservées existent des régions

dites « hypervariables » dont la séquence n’est pas « indispensable » à la conformation

ribosomique. Ces régions hypervariables sont au nombre de neuf et sont représentées et

annotées de V1 à V9 sur la figure I.17. Ces régions hypervariables offrent des possibilités

d’amorçages spécifiques d’un taxon donné ou, couplé avec deux régions conservées et une

amplification, permettent une identification phylogénétique de la bactérie. L’ensemble de ces

régions et la taille relativement restreinte du gène de l’ARNr 16S (1541 bases chez E. coli)

assurent de nombreuses possibilités de travail aux bactériologistes.


38

Malgré son usage intensif, l’emploi de l’ADNr 16S en tant que sémantide dans les études

phylogénétiques souffre néanmoins de plusieurs revers. Dans de tels cas, on peut alors

avantageusement remplacer le gène de l’ADNr 16S par d’autres sémantides bactériennes.

2. Les méthodes d’identification

2.1. Identification des bactéries par l’ADNr-16S

L’indentification des bactéries par les méthodes moléculaires représente un complément

indispensable aux méthodes traditionnelles d’analyse des caractéristiques morphologiques et

physiologiques.

Parmi ces nouvelles techniques, celle basée sur le séquençage direct apparaît comme la plus

efficace : elle consiste à séquencer « litre » une région spécifique du chromosome bactérien

(ADNr-16S) et à comparer cette séquence avec les séquences connues et stockées en banques

de données. Ceci permet de déterminer avec certitude le genre et l’espèce de la souche

étudiée. L’analyse de séquences génétiques discriminantes offre une technique

complémentaire pour l’identification bactérienne de toutes les situations. Le gène codant

l’ADN 16S est l’outil principalement utilisé pour l’identification moléculaire des bectéries.

Il s’agit d’un gène chromosomique d’une taille de 1.500 paires de bases, présent chez toutes

les espèces bactériennes (gène universel), dont la séquence est spécifique de chaque espèce et

dont les extrémités 5’ et 3’ (15 premières et 15 dernières bases) sont conservées dans toutes

les espèces bactériennes.

Techniquement, l’ADN bactérien est extrait par selon des protocoles bien standardisés, puis le

gène ADNr 16S est amplifié par PCR, incorporant deux amorces universelles

complémentaires des extrémités 5’ et 3’ du gène.

Le produit d’amplification est ensuite séquencé et la séquence est alors lue à l’aide d’un

automate, Elle est ensuite comparée par des logiciels aux séquences homologue contenues

dans les banques informatiques (GenBank, EMBL) via le réseau internet par le BLAST.

Le logiciel fournit un pourcentage d’homologie entre la séquence étudiée et celles contenues

dans les banques de banques de données. Une homologie de 99-100% permet d’affirmer

l’identification de la souche bactérienne.

A défaut, la souche peut être positionnée parmi l’ensemble des espèces connues sous forme

d’un arbre phylogénétique car le gène ADNr 16S possède aussi des propriétés d’horloge

moléculaire.


39

2.2. Identification bactérienne avec amorces oligonucléotidiques (Amplification génique)

C’est une méthode génotypique permettant l’identification de locus spécifiques d’ADN des

bactéries au niveau du genre et l’espèce (Jackson et al., 2004), à l’exemple des gènes de

ménages.

De nombreuses méthodes génotypiques utilisant l’analyse de produits d’amplification génique

issus de gènes cibles ont été développées pour identifier les bactéries au niveau de l’espèce.

Ces techniques incluent le séquençage de l’ADNr 16S qui est souvent considéré comme

méthode de référence. Dans ce dernier cas, cependant, l’analyse des données de séquence peut

être compliquée par le fait que des espèces proches peuvent posséder des séquences d’ADNr

16S identiques ou, au contraire, que des séquence d’ADNr 16S différentes peuvent coexister

dans une bactérie donnée.

Pour résoudre ce problème, il est possible d’utiliser des séquences cibles monocopies qui

possèdent une divergence évolutive supérieure à celle de l’ADNr 16S.

Le gène sodA des cocci à Gram positif, qui code pour une superoxide dismutase Mn-

dépendante, satisfait à ces critères et les auteurs ont pu montrer que le séquençage d’un

fragment interne, sodAint, obtenu par PCR à l’aide d’une paire d’amorces dégénérées ou une

paire d’amorces spécifiques à l’espèce permettait l’identification fiable au niveau du genre ou

de l’espèce des streptocoques et des entérocoques.

Des chercheurs ont utilisé la même paire d’amorces universelles pour construire une

génothèque de fragments sodAint correspondant à toutes les espèces de Staphylocoques à

coagulase-négative (SCN) (Poyart et al.,2001), et ont montré que son utilisation permettait

l’identification rapide et fiable d’isolats cliniques de SCN.

Par ailleurs, l’amplification PCR et l’analyse des sequences génétiques discriminantes des

gènes d’aminopeptidases (pepN, pepO), par l’utilisation d’amorces spécifiques (170/171,

493/494) ont permis l’identification de l’espèce Lactococcus lactis (Bensalah et al.,2009).

3. Amplification par PCR

La PCR, réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction), est une

technique permettant d'obtenir, à partir d'un échantillon d'ADN, d'importantes quantités d'une

séquence d'ADN spécifique. Cette amplification repose sur la réplication d'une matrice

d'ADN double brin. Elle se décompose en trois phases : une phase de dénaturation, une phase

d'hybridation avec des amorces et une phase d'élongation. Les produits de chaque étape de

synthèse servent de matrice pour les étapes suivantes, ainsi on réalise une amplification

exponentielle.


40

· Les différentes étapes de la PCR (Figure 3)

A. La dénaturation :

C'est la séparation des deux brins d'ADN, obtenue par élévation de la température.

B. L’hybridation

En abaissant la température, les amorces spécifiques s'hybrident sur les molécules simples

brin d'ADN. Les amorces sont constituées de courtes séquences d'ADN complémentaires de

la séquence de l'ADN à amplifier. Il s'agit toujours d'un couple d'amorces, complémentaire

encadrant le fragment d'ADN à amplifier.

C. L’élongation :

C'est la synthèse du brin complémentaire. Une enzyme polymérase, la Taq polymérase, ajoute

à l'extrémité de l'amorce des oligonucléotides présents dans le milieu de réaction.

Figure 3: les étapes de déroulement de la PCR


41

4. Séquençage de l’ADN

La caractérisation fine d’un gène passe par son séquençage, c'est-à-dire par la connaissance du

nombre, de la nature et de l’ordre des nucléotides qui le composent. Ces agencement permet

de connaître par exemple l’emplacement des différents sites de restriction du gène afin de

mieux le manipuler.

Enfin, la traduction de la séquence nucléotidique en séquence d’acides aminés permet

éventuellement de confirmer ou de proposer une fonction de la protéine par le gène.

Le principe est le suivant :

Le fragment d’ADN à séquencer (il peut s’agir par exemple d’un exon du gène d’intérêt) est

obtenu par PCR puis mis en présence d’un milieu réactionnel contenant :

· L’amorce à partir de laquelle la synthèse du néobrin sera réalisée par une ADN

polymérase,

· Les 4 désoxynucléotides (dA, dT, dC, dG),

· Les 4 désoxynucléotides (ddA, ddT, ddC, ddG) marqués chacun par un fluorochrome

distinct

· Une ADN polymérase (en général la taq DNA polymérase).

L’ensemble est soumis à une succession de cycles de polymérisation au cours desquels l’ADN

polymérase peut, au niveau de chaque nucléotide de l’ADN matrice, incorporer un

désoxynucléotide ou un didésoxynucléotide.

Dans le cas où elle incorpore un désoxynucléotide, la synthèse peut continuer, dans le cas

contraire elle s’arrête. Ce choix étant aléatoire, chaque base de l’ADN matrice aura

statistiquement vu un certain nombre de fois l’incorporation d’un didésoxynucléotide, si bien

que le milieu réactionnel contient l’ensemble des molécules néosynthétisées possibles. Ces

molécules sont ensuite dénaturées puis migrées dans un gel d’électrophorèse afin d’être

séparées selon leur taille.

On peut ainsi reconstituer la séquence en analysant la nature du fluorochrome terminant

chacun de ces fragments néosynthétisées, du plus petit (premier nucléotide de la matrice) au

plus grand (dernier nucléotide de la matrice).

Cette analyse est réalisée à l’aide d’un séquenceur automatique : cet appareil est pourvu d’une

source laser ou infra-rouge qui excite les fluorochromes portés par les didésoxynucléotides

après que les fragments aient migrés sur le gel d’électrophorèse. Cette excitation provoque

une émission de lumière à une longueur d’onde dépendant de la nature du fluorochrome.


42

5. Taxonomie des bactéries lactiques

Depuis la description du Bacterium lactis (actuellement Lactococcus lactis), la taxonomie des

bactéries lactiques est en évolution permanente. Le nombre de nouvelles espèces a augmenté

énormément au cours de ces dix dernières années. Les réorganisations effectuées ont

contribué à fusionner des espèces en une seule, ou identifier une espèce comme un nouveau

genre (Pot, 2008).

La classification des bactéries lactiques peut se faire selon des critères phylogénétiques par

l’utilisation des méthodes moléculaires. Cependant, la caractérisation phénotypique/

biochimique classique demeure pratique dans l’identification préliminaire des

microorganismes. Certaines caractéristiques phénotypiques sont utilisées pour identifier les

espèces à l'intérieur des genres comme la capacité à : fermenter les hydrates de carbone,

tolérer différentes concentrations en bile, produire des polysaccharides extracellulaires, exiger

des facteurs de croissance, produire de l’acétoïne et synthétiser certaines enzymes. La

composition en G+C de l’ADN, la composition en acides gras, la mobilité électrophorétique

de la lactate déshydrogénase sont également d'autres critères qui peuvent être étudiés pour

l'identification des espèces lactiques (Vandamme, 1996 ; Stiles et Holzopfel, 1997 ; Ho et al.,

2007).

La morphologie est considérée comme la caractéristique clé pour décrire et classifier les

genres des bactéries lactiques. De ce fait, les bactéries lactiques peuvent être divisées

arbitrairement en bacilles (Lactobacillus et Carnobacterium) et coques (tous les autres

genres). Le genre Weissella, récemment décrit, est le seul genre qui comporte à la fois des

bacilles et des coques (Collins et al., 1993 ; Ho et al., 2007).

A ce groupe de bactéries lactiques, appartient plusieurs genres comme Aerococcus,

Atopobium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,

Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella. (Stiles

et Holzapfel, 1997 ; Pot, 2008). Des genres nouveaux, par exemple Alloiococcus,

Dolosicoccus, Dolosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helococcus,

Ignavigranum et Lactosphaera, ont également été décrits, comportant des souches qui

montrent des liens physiologiques et phylogénétiques avec les groupe des bactéries lactiques

(Broadbent, 2001 ; Axelsson, 2004).

Le genre Bifidobacterium est actuellement considéré par plusieurs auteurs comme genre de

bactéries lactiques, bien qu’il se distingue par un pourcentage en G+C de 55%, largement

supérieur à celui des autres genres et par une voie métabolique de fermentation des sucres

particulière. Les études phylogénétiques basées sur l’analyse des séquences des ARN


43

ribosomiques ont confirmé l’appartenance de ces différents genres à un même groupe qui

inclut également Clostridium, Bacillus et Propionibacterium (Figure 4) (Stiles et Holzopfel,

1997 ; Pilet et al., 2005).

Figure 4 : Arbre phylogénétique des principaux genres de bactéries lactiques et des genres associés, obtenu par analyse des ARNr 16S (Stiles et Holzapfel, 1997).

Matériels et Méthodes

44

1.Échantillonnage

Deux coqs fermiers ont été sacrifiés et leur tube digestif transporté au laboratoire dans des conditions stériles à froid et disséqués en zone aseptique.

Figure 5 : photo d’un tube digestif réalisée au laboratoire.

2. Isolement et purification des souches

Des prélèvements ont été réalisés à partir de différents compartiments des coqs fermiers :

Jabot, gésier, duodénum, jéjunum, colon… dans des conditions stériles, chaque échantillon

prélevé a été ensemencé en milieu lait liquide et mis en incubation à différentes températures

30°C et 45°C. Après 24h d’incubation toutes les cultures ont été diluées et ensemencées sur

milieu gélosé MRS et incubées en anaérobiose dans les mêmes conditions de température. La

purification des souches a été établit par réalisation de subcultures sur milieux liquide et

gélose MRS jusqu'à l’obtention de colonies bien distinctes et homogènes, la pureté des

souches a été vérifiée par observation microscopique.

3. Conservation des souches

A partir des cultures jeunes des souches sur milieu liquide, 1.5 ml de culture est transféré

dans un tube eppendorf stérile. Les cellules sont récupérées par centrifugation à 3000

tours/min pendant 10min, après élimination du surnageant le culot est resuspendu dans le

milieu de conservation MRS additionné de glycérol à 15%. Les échantillons sont portés au

congélation -20°C.


45

4. Souches de référence utilisées

Deux souches de référence ont été utilisées et représentent des espèces types appartenant à la

collection INRA : Lactobacillus delbreuckii ATCC 11842 et Streptococcus thermophilus

CNRZ 1066.

Les souches pathogènes de références utilisées sont Staphylococcus aureus (ATCC 25923,

ATCC 43300), Escherichia coli ATCC25922 et Enterococcus faecalis (V583 et JH2-2).

5. Caractérisation phénotypique

5.1. Examen macroscopique

Les colonies obtenues sur les boites pétri sont observées à l’œil nu afin de déterminer la

forme, la taille, l’aspect, le contour des colonies ainsi que la couleur.

5.2. Examen microscopique

Sur des cultures jeunes, des colorations de Gram ont été réalisées, l’observation

microscopique s’est faite au grossissement (Gx1000) ce qui permettra d’observer la

morphologie des cellules bactériennes (la forme, le mode d’association, taille …) et le type

de Gram des différents isolats.

5.3. Test de la catalase

La catalase est une enzyme qui permet la dégradation de peroxydase d’hydrogène (H2O2).

Le test de catalase est réalisé afin de vérifier l’appartenance des souches isolées au groupe des

bactéries lactiques en mettant en contact une colonie avec une goutte de H2O2, un résultat

positif est estimé par effervescence, les bactéries lactiques étant catalase négatif.

6. Recherche des bactéries mucoïdes

6.1. Production et Caractérisation des exopolysaccharides (EPS)

6.1.1. Formation des exopolysaccharides

Il existe plusieurs milieux de culture pour le développement d’une meilleure production des

exopolysaccharides sur gélose qui est le milieu HJL et le milieu hypersaccharosé. Il existe

aussi plusieurs façons de détecter la présence de polysaccharides. Ces derniers peuvent être

détectés qualitativement par un examen visuel, par coloration ou par microscopie. La mesure

de la viscosité et le dosage des EPS purifiés permet de les détecter quantitativement.


46

Les souches à tester ont été ensemencées en stries sur milieu gélose hypersaccharosé et

incubées à 37°C pendant 24h, la production des exopolysaccharides se manifeste par

l’apparition de colonies larges et gluantes (Leveau et al., 1991).

6.1.2. Mise en évidence des EPS en milieu solide au rouge de ruthénium

La production des EPS peut être visualisée en milieu gélosé par coloration au rouge de

ruthénium, un colorant cationique qui se fixe aux composants de la paroi bactérienne

(Stingele et al., 1996).

Il est possible de sélectionner des clones bactériens producteurs d’EPS appelés clone Muc+,

en ajoutant des colorant cationiques dans le milieu de culture, les clones Muc+ sont révélés

par masquage de la coloration par le polysaccharide produit.

Le colorant cationique additionné en milieu de croissance se fixe donc sur le peptidoglycane

de la paroi bactérienne, ce qui entraine une coloration de la colonie d’une souche non

productrice. Ces colorants ne présentent pas d’affinité pour les polysaccharides excrétés, les

polysaccharides produits masquent la coloration et les clones Muc+ apparaissent blancs

(Gancel et al ., 1988).

Un exemple de colorant cationique est le rouge de ruthénium qui donne une coloration rose

foncé au milieu de culture, les colonies Muc+ apparaissent donc blanches sur fond rose par le

masquage de la couleur du aux les exopolysaccharides produits. Les clones Muc- apparaissent

rosés.

6.1.3. Mise en évidence des EPS par microscopie

Le colorant bleu de toluidine est utilisé pour une coloration vitale. La réalisation de cette

coloration se fait entre lame et lamelle, on dépose une goutte du colorant bleu de toluidine

préparé en solution a 1% sur laquelle on étale quelques cellules d’une colonie. On procède à

une observation sous microscope optique (Sheehan DC, Hrapchak BB. 1980).

6.1.4. Extraction des EPS

Les exopolysaccharides sont extraits selon la méthode modifiée par Evans LR and Linker M,

(1973) qui consiste à récupérer la totalité des exopolysaccharides produits sur milieu gélosé

et les faire homogénéiser dans 10 ml d’eau distillée stérile. La suspension obtenue est

centrifugée à 3000 tours pendant 1h.


47

Apres récupération du surnageant, on additionne trois volumes d’éthanol à 95% et on laisse

précipiter à froid pendant la nuit. On réalise une dernière centrifugation pour la récupération

du culot contenant les EPS extraits.

6.1.5. Lyophilisation des EPS

La lyophilisation consiste en l'élimination progressive de l'eau du produit préalablement

congelé (phase solide) par passage à la phase vapeur, sans passer par la phase liquide. Ce

changement d'état s'appelle la sublimation.

Les extrait d’EPS ont été congelé a -20°C pendant 24h suivi d’une lyophilisation pendant 48h

avec un appareil CHRIST, ALPHA 1-2 MODEL, Germany. Ce travail a été réalisé au

laboratoire de Nutrition du département de Biologie de l’université es-sénia.

6.1.6. Dosage colorimétrique des EPS

Les exopolysaccharides purifiés et lyophilisés sont resuspendus dans 10 ml d'eau dé-ionisée

(Millipore) et dosés selon la méthode de dosage des sucres totaux de (Dubois et al., 1956)

modifiée par Gerhardt et al. (1981).

Le principe de cette méthode repose sur le fait que l'ajout d'acide sulfurique provoque

l'hydrolyse des polysaccharides et la formation de 5- hydroxyméthyl-furfural qui donne, en

présence de phénol, une coloration orangée. L'intensité de la couleur est directement

proportionnelle à la quantité de sucre présent et est directement mesurable par

spectrophotométrie. La réaction est sensible et la couleur est stable. De petites quantités de

carbohydrates peuvent être détectées et la présence de protéines ou de peptides n'influence pas

le dosage.

Une courbe standard de 0 à 120 mg/l est préparée à partir d'une solution stock. Chaque

échantillon est préparé trois fois et pré-dilué de la manière suivante : les échantillons de

polysaccharides ont été dilués dans un premier temps au 1/10, cependant la concentration des

EPS est restée trop forte, ce qui a emmener à réaliser une deuxième dilution au 1/100 qui n’a

pas donnée les résultats souhaités. Une troisième dilution au 1/200 (20 µl Écha/3980 µl eau)

qui a permis de doser convenablement par spectrophotomètre les échantillons préparés. Le

blanc est fait avec la concentration 0 mg/l. A l‘aide d'une micropipette calibrée, 1 ml de

standard (Glucose) ou d'échantillon (EPS) est placé dans un tube à essai en verre propre. En

utilisant la même micropipette, 1 ml de Phénol 5% est ajouté. Finalement, 3 ml d'acide

sulfurique sont ajoutés au mélange. Les tubes sont immédiatement agités au vortex et


48

refroidis pendant environ 10 minutes à température ambiante. A noter que l’acide sulfurique

provoque une augmentation de la température.

La lecture de l’absorbance est faite avec un spectrophotomètre Biochrom Libra S6 à une

longueur d'onde de 490 nm. Les quantités de polysaccharides sont exprimées en mg/l

d'équivalent glucose.

Le taux de sucre est déterminé en se référant à une courbe d’étalonnage tracé avec du glucose.

· Préparation d’une gamme étalon glucose

Une série de dilutions a été effectuée à partir d’une solution mère de glucose à concentration

120 mg/l.

6.1.7. Activité rhéologique

Ce test a été réalisé par ensemencement du lait écrémé stérile par 1ml d’EPS natif.

L’incubation a été faite à température ambiante. Le levain lactique possède un pouvoir

épaississant si le gel formé présente une certaine rhéologie visqueuse (Bourgeois et Leveau,

1991).

6.2. Analyse de la composition des EPS

Les exopolysaccharides selon leur propre origine peuvent présenter des chaines linéaires, des

chaines ramifiées ou des chaines complexes. La nature des sucres qui composent ces chaines

diffère d’un EPS à un autre, en effet certains sont riches en un seul ose (glucose pour

dextrane) et d’autres montrent une diversité (Xanthane).

L’hydrolyse permet une fracture de ces bio –polymères en sucres plus simples tel que les oses

ou disaccharide.

La chromatographie sur couche mince permet de déceler la nature de ces sucres en fonction

de leur migration sur plaque et leur rapport frontale (Rf).

6.2.1. L’hydrolyse des EPS

L’hydrolyse des polysaccharides conduisant à l’identification des monosaccharides s’est

poursuivie sur une période de 4h à 100°C. Un volume de 2 ml d’acide sulfurique a été ajouté

à 20 mg de polysaccharide séché et purifié. L’hydrolyse a été neutralisé avec de l’hydroxyde

de baryum (Graber et coll., 1988) puis centrifugé à 3500 rpm pendant 10min. Le surnageant a

été filtré par l’utilisation de filtre millipore de 45µm (Millex®-GS Sterilizing Filter Unit

SLGS025BS).


49

6.2.2. Chromatographie sur couche mince des oses constitutifs des polysaccharides

Il s’agit d’une méthode chromatographique qui permet, suivant un procédé simple et rapide,

l’identification et la séparation d’un très grand nombre de substances organiques et minérales.

On l’utilise dans cette étude afin de séparer les composants des exopolysaccharides extraits et

donner une identification aux monosaccharides constituants ces biopolymères.

La chromatographie sur couche mince a été réalisée selon la méthode décrite par Souly Frag

(1978).

Le protocole de migration se présente comme suit :

· Solution à analyser

10 mg de chacun des échantillons obtenus ainsi que les sucres standards sont dissouts dans

1ml d’un mélange méthanol et eau (1 :1).

Les sucres utilisés : Glucose, Raffinose, Arabinose, Saccharose, Galactose, Lactose et

dextrane.

· Préparation de la cuve

1ère technique utilisée : le mélange solvant chloroforme-acide acétique-eau (30 :35 :5)( est

introduit au fond de la cuve bien fermée par l’étanchéité du couvercle (Souly Frag 1978).

1h d’attente est nécessaire pour assurer la saturation de l’atmosphère de la cuve.

2ème technique utilisée : le travail s’est accompli dans les mêmes conditions précédentes à

l’exception du système solvant utilisé qui est Acétone /Eau 15 :85 (Soczewi ński E et al., 1998)

· Dépôt des échantillons

A l’aide d’un micro-tube capillaire on dépose 20 µl de chaque échantillon sur une plaque de

silice (TLC Silica-gel 60 F254 MERCK).

A la fin, chaque dépôt est bien séché.

· Développement du chromatogramme

Les échantillons déposés sur la plaque ont migré dans une cuve saturée selon les deux

systèmes de solvant décrits si dessus.


50

· Révélation

Les solutés étant incolores, il faut les faire apparaître par une réaction chimique. On utilise

pour cela un révélateur : 50 ml de permanganate de potassium à 20 g/l mélangé au moment de

l’emploi à 50 ml de carbonate de sodium anhydre à 40 g/l dans un vaporisateur.

Après le dépôt de la plaque sur une table propre, on vaporise le révélateur sur l’ensemble de la

surface. Le séchage de cette dernière est réalisé à l’aide d’un séchoir.

Pour identifier les constituants du mélange des différents échantillons on calcule le rapport

frontal de chaque tâche de migration (Rf= distance parcourue par la substance (centre de la

tache) / distance parcourue par le solvant).

Le rapport frontal Rf est caractéristique d’une substance donnée dans un solvant donné.

7. Etude de l’activité antimicrobienne des souches probiotiques isolées du tractus digestif

vis-à-vis de souches pathogènes

Des interactions bactériennes englobant les isolats du genre Lactobacillus et des souches

productrices des EPS pré-identifiés à des Leuconostoc et Pediococcus ont été utilisées à

l’encontre de souches pathogènes de référence afin de sélectionner des bactéries d’intérêt

productrices de substances inhibitrices vis-à-vis des bactéries non désirables, utilisées

notamment contre Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus (ATTC25923,

ATCC 43300), Salmonella typhi, et Enterococcus faecalis (V583/ JH2-2).

Deux méthodes ont été utilisées à savoir celle des disques (porte germes) selon Tadesse et al.

(2004) qui consiste à :

· inonder en surface les boites de Pétri contenant le milieu MH par quelques millilitres

des pré-cultures de la souche pathogène (souche indicatrice),

· laisser sécher les boites pendant 30 min à 37°C, après séchage, déposer à la surface de

la gélose des disques en papier buvard stérile préalablement imprégnés par la pré

culture des bactéries lactiques, ensuite sécher encore une fois les boites pendant 30

min.

· Mettre les boites à 4°C pendant 4h pour assurer la diffusion des substances

responsables de l’interaction, enfin incuber les boites à 37°C pendant 24h.

· L’inhibition de la souche indicatrice se traduit par la formation de zones claires autour

des disques dont le diamètre est mesuré à partir du centre du disque en mm.


51

En deuxième lieu, une seconde méthode celle de la double couche selon Fleming et al.

(1975) a été utilisée et qui consiste à :

· Les souches à tester (supposées être inhibitrices) sont ensemencées par spot à la

surface d’un milieu MRS solide. Les boites de pétri ainsi ensemencées sont incubées

pendant 18h (pré-incubation) dans les conditions favorables de la souche.

· Les souches indicatrices (souches pathogènes) sont ensemencées en masse, un volume

de 0.5 ml de culture d’une souche pathogène est rajouté à 7 ml de gélose molle. Ce

mélange est versé sur la surface des boites pétri pré-incubées.

· Après solidification du milieu, une deuxième incubation est nécessaire à 30°C pendant

24h.

· La formation des halos claires autour de la souche indique une inhibition vis-à-vis le

pathogène testé.

7.1. Nature de la substance inhibitrice

Pour montrer que la substance inhibitrice n’est pas d’origine acide (acide lactique), le

surnageant doit être traiter. Une culture de 10 ml a été centrifugée à 3000 tour/min pendant 10

min pour éliminer les cellules bactériennes, puis une neutralisation de l’acidité du milieu a été

effectuée par ajustement du pH du surnageant avec du NaOH 2N suivi d’une filtration à

travers un filtre millipore de 0.22µm (Millex®-GS Sterilizing Filter Unit SLGS025BS).

Le surnageant obtenu a été utilisé en interaction avec les pathogènes.

8. Caractérisation moléculaire des souches probiotiques

A ce titre, un cadre législatif a été établi sur les probiotiques en 2002 par l’EFSA (European

Food Safety Agency) d’où ressort trois principaux chapitres : l’identité, la sécurité et

l'efficacité de la souche.

L’identification des microorganismes par les méthodes ADN est devenue une méthode

incontournable, elle est plus résolutive et plus discriminante par rapport aux méthodes de

classification traditionnelle. La taxonomie des probiotiques utilisés comme additif en

aviculture est régie par la loi.


52

8.1. Extraction d’ADN

8.1.1. Extraction d’ADN par utilisation de MOBIO KIT

Les examens macroscopiques et microscopiques étant réalisés, les tests Gram positif et

catalase négative des différents isolats nous ont conduit à une identification préliminaire à des

lactobacilles. En matière de diagnostic de ces souches, une approche plus approfondie a été

consacrée à l’amplification de l’ADNr 16S par la technique PCR en utilisant des amorces

spécifiques d’une région interne du gène de l’ADNr 16S préconisant ainsi un fragment de 480

pb.

Afin d’amplifier par PCR des cours fragments, la méthode d’extraction avec MOBIO KIT est

utilisée. Dans ce cas c’est une région interne de 480 pb de l’ADNr 16S spécifique au genre

Lactobacillus. Au total 13 souches ont été testées en utilisant le couple d’amorce V3/V4

(amorces INRA, communication personnelle).

V3 5’-CTC CTA CGG GAG GCA GCAG-3’

V4 3’-GGA CTA CCAGGGTATCTAAT-5’

Le protocole d’extraction appliqué se présente comme suit :

1. Mettre 1.8 ml de culture microbienne dans un tube de capacité de 2ml, le faire centrifuger à

10.000 tours/min pendant 30 secondes à température ambiante. Eliminer le surnageant.

2. Resuspendre le culot dans 300 µl de la solution Microbead et vortexer. Transférer les cellules

resuspendues dans le tube Microbead.

3. Ajouter 50 µl de solution MD1 au tube Microbead. Vortexer à la vitesse maximale pendant 10

minutes.

4. S’assurer que les tubes de Microbead de 2 ml tournent librement dans la centrifugeuse sans

frottage. Laisser centrifuger à 10.000 tours/min pendant 30 secondes à température ambiante.

5. Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes propres de 2 ml. Prévoir 300 µl ou 350 µl

de surnagent.

6. Ajouter 100 µl de solution MD2 au surnagent, vortexer pendant 5 secondes et incuber à 4°C

pendant 5 minutes.

7. Centrifuger les tubes à 10.000 tours/min pendant 1 minute.

8. En évitant le culot, transférer le volume entier du surnagent dans des tubes propres de 2 ml.

Prévoir 450 ml en volume.

9. Secouer la solution MD3 avant l’emploi. Ajouter 900 µl de cette solution au surnagent et

vortexer pendant 5 secondes.

10. Charger environ 700 µl dans le spin-filter et centrifuger à 10.000 tours/min pendant 30

secondes à température ambiante. Jeter le surplus, ajouter le surnagent restant au spin-filter,


53

centrifugé à 10.000 tours/min pendant 30 secondes. Un total de 2 ou 3 chargements sont

nécessaires pour chaque échantillon pour avoir le maximum d’ADN concentré.

11. Ajouter 300 µl de la solution MD4 et centrifuger à 10.000 pendant 30 secondes, puis jeter le

surplus.

12. Centrifuger à température ambiante à 10.000 tours/min pendant 1minute.

13. Faire attention à ne pas éclabousser le liquide sur le support de spin-filter, puis le placer dans

un nouveau tube de 2 ml.

14. Ajouter 50 µl de la solution MD5 au centre de la membrane blanche du filtre.

15. Centrifuger à température ambiante à 10.000 tours/min pendant 30 secondes.

16. Jeter le filtre de rotation, l’ADN dans le tube est resuspendu dans 50 µl d’eau distillée

stérile et enfin prêt pour n’importe quel autre application.

Les solutions du KIT

-Solution MD1 : contient le détergeant SDS et d’autres agents de perturbation nécessaires

pour la lyse cellulaire.

-Solution MD2 : contient des réactifs pour la précipitation des matériaux organiques et

inorganiques non-ADN y compris les débris cellulaires et les protéines.

-Solution MD3 : est une solution de concentration élevée en sels, utilisée pour lier l’ADN

avec la membrane du Spin-filter tube.

-Solution MD4 : solution de lavage à base d'éthanol, utilisée pour éliminer les résidus de sel et

d’autres contaminants.

-Solution MD5 : tampon d'élution, contient le Tris 10mM à pH8.

8.1.2. Extraction d’ADNr 16S dans sa totalité (1500pb)

Afin d’uniformiser cette méthode à l’ensemble des souches du laboratoire, des amorces

universels ont été appliquées à 5 genres différents, dont l’un d’eux a été pré-identifié à un

pédiocoque LGM Clo1.

La technique de Gevers et al. (2001) est utilisée dans ce cadre. Des amorces universels

8UA/1492R (Sato T et al.,2003) sont utilisées dans la réaction mix PCR.

Le protocole d’extraction ADN se présente comme suit :

-Les cellules à partir d’une colonie sont resuspendu dans 1ml d’eau distillée stérile et

centrifuger à 3000 tours/min pendant 10 minutes et stocker le culot à -20°C pendant 1h.

-Le culot est ensuite lavé dans 1ml de tampon TES (6.7% sucrose, 50 mM Tris-Hcl pH 8,

1mM EDTA) et resuspendu dans 300 µl de tampon STET (8% sucrose, 5% Triton X-100,

50mM Tris-Hcl pH 8, 50mM EDTA).


54

- 75 µl de tampon de lyse (TES contenant 1330U/ml mutanolysine et 40 mg/ml lysosyme)

sont ajoutés à la suspension et incubés à 37°C pendant 1h.

-Ajouter par la suite 40 µl de SDS préchauffé (37°C) dans un tampon TE (10 mM Tris-Hcl,

1mM EDTA, pH 8), les cellules sont vortexées pendant 60 secondes et incubées à 37°C

pendant 10 min suivi d’une incubation à 65°C pendant 10 min.

- 100 µl de tampon TE sont ajoutés et le lysat est extrait avec 1volume de

(phénol/chloroforme/isoamylalcool).

- Les phases sont séparées par centrifugation à 3000 tour/min pendant 20 min. La phase aqueuse est mixée avec 70 µl de NaCl 5M et 1 ml d’isopropanol, l’ADN est précipité dans la

glace pendant 15 min.

- L’extrait ADN est collecté par centrifugation 3000 tours/min pendant 20 min et le culot est lavé dans de l’éthanol froid à 70%.

-Le culot ADN est resuspendu dans 50 µl d’eau distillée stérile pour des fins analytique.

8.1.3. Vérification qualitatif de l’ADN extrait

Afin de vérifier la qualité de l’ADN après extraction, la technique la plus commune est la

migration de l’échantillon sur gel d’agarose 1 % suivi d’une visualisation sous lumière UV.

Si les ADN migrent sous la forme d’une trainée (smear) l’échantillon d’ADN a sans doute

subi une dégradation majeure.

8.2. Amplification

8.2.1. Amplification de la région interne de l’ADNr 16S (480) du genre Lactobacillus spp.

L'amplification d'ADN a été effectuée avec un thermo-cycler d’amplification de type PCR

TECHNE TC-312 (Barloworld Scientific Ltd, stone ST 15 OSA, UK) selon le programme

d’amplification suivant :

Pré-dénaturation à 95°C pendant 5min,

- Dénaturation à 94°C pendant 30 secs

- Hybridation à 60°C pendant 30 sec 35 Cycles

- Elongation à 72°C pendant 1 min

Enfin une étape d’élongation 72°C pendant 7 min.


55

8.2.2. Séquençage et taxonomie des souches lactobacilles de la flore intestinale

L’ADN total des différents isolats à été extrait selon la méthode appropriée à MOBIO KIT.

L'amplification d'ADN a été effectuée avec un thermo cycler d’amplification de type PCR

TECHNE TC-312 (Barloworld Scientific Ltd, stone ST 15 OSA, UK) suivant un programme

d’amplification spécifique. La présence des produits amplifiés par PCR est révélée en

électrophorèse sur gel d'agarose à concentration 1.3 % en utilisant un marqueur de taille

Smart Ladder 200 pb. Les réactions de séquençage sont effectuées suivant une méthode

dérivée de celle décrite par Sanger et al.(1977) à l’aide du kit « BigDyeTM Terminator Cycle

Sequencing. Un seul brin a été séquencé, et chaque séquence a été comparée aux séquences

disponibles dans les bases de données du NCBI GenBank en utilisant l’outil de recherche

Blast. Cette partie de l’étude a été réalisée et traitée à l’INRA de Jouy-en-Josas.

8.2.3. Amplification du gène ADNr 16S (1500 pb) dans sa totalité

L'amplification d'ADN a été effectuée dans le même thermo-cycler du laboratoire cité ci-

dessus suivant un programme d’amplification :

Pré-dénaturation à 95°C pendant 15min,

- Dénaturation à 94°C pendant 1min,

- Hybridation à 60°C pendant 1min 35 Cycles

- Elongation à 72°C pendant 1.5min

Enfin une étape d’élongation finale a 72°C pendant 10min.

Les couples d’amorces universels utilisés (Sato et al., 2003) :

8UA: 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’

1492R : 3’-TACGGGTACCTTGTTACGACTT-5’

· Les mélanges réactionnels utilisés pour les deux amplifications PCR, sont réalisés à un

volume final de 25 µl contenant :

- 2.5 µl 10X tampon PCR (Takara),

- 2µl dNTP (Takara),

- 0.5 µl de chaque amorce,

- 0.25 µl de taq ADN polymerase (Takara)

- H2O stérile en qsp.

Le produit de PCR est une bande ADN préconisé à 1500 pb pour le gène ADNr 16S et une

bande de 480 pb pour la région interne du gène ADNr16S du genre Lactobacillus spp.


56

8.3. Electrophorèse sur gel d’agarose

5 µl des produits PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1.3% pour la

visualisation des grands fragments d’ADN à 1500 pb et 0.8% pour les petits fragments de 480

pb à 100 V pendant 60 minutes.

La présence des produits amplifiés par PCR est révélée en électrophorèse sur ce gel en

utilisant un marqueur de taille Smart Ladder 200 pb.

· Préparation du gel

- Peser 1.3 g d’agarose (pour la recherche des grands fragments d’ADN) et 0.8% (le cas

des petits fragments d’ADN) dans un Erlenmeyer de capacité suffisante.

- Ajouter l’agarose à 100 ml de TBE.

- Chauffer avec agitation jusqu’à ébullition et disparition du trouble, laisser refroidir

jusqu'à ce qu’il devienne possible de saisir le flacon à main nue (température environ

45-50 °C).

- Ajouter 1μl de BET (Bromure d’éthidium) au gel TBE (voir composition dans

l’annexe), agiter doucement pour éviter la formation de bulles d’air.

- Préparer le moule à peigne pour couler le gel.

- Placer le moule sur une surface bien horizontale.

- Couler lentement le gel sur 3 à 5 mm d'épaisseur et laisser se solidifier dans la cuve.

- Laisser refroidir 30 minutes environ avant d’enlever délicatement le peigne.

- Les puits sont placés du côté de la cathode.

- Le gel est enfin prêt pour le dépôt des échantillons.

· Dépôt des échantillons (produits d’amplification)

- Mélanger la solution de charge (bleu de bromophénol et glycérol) avec l’ADN sur une

petite plaque à dépôt (5 μl d’ADN et 3 μl de la solution de charge) avec une

micropipette.

- Remplir les puits du gel avec ce mélange en faisant attention à ne pas déchirer le fond

du gel avec la pointe de l’embout (figure 6).


57

Figure 6: dépôt des échantillons ADN sur gel d’agarose au laboratoire LGM

· Migration

- Fermer la cuve, brancher les fils et exercez un voltage de 80 v jusqu’à 100 v

- Laisser migrer jusqu’à ce que le colorant de charge arrive à proximité du bord du gel

(environ 40 minutes).

- Une fois le témoin de migration (colorant bleu) atteint l’extrémité du gel, on arrête la

migration.

Figure 7 : montage de l’électrophorèse du laboratoire LGM


58

· Visualisation La visualisation de l’ADN sur le gel d’agarose est réalisée grâce à un colorant fluorescent le

bromure d’éthidium (BET). Ce composé possède la propriété de s’intercaler entre les paires

de bases des acides nucléiques. Le gel est visualisé dans l’obscurité à l’aide d’une plaque à

UV (uvitec SXT-F26M, 312nm, power 180W) puis photographié avec un appareil numérique.

Résultats et Discussion

59

1. Caractérisation phénotypique

Au total 48 isolats de différents compartiments du tube digestif des coqs fermiers ont été

recensés et sélectionnées dans des conditions d’ambiance appropriées et de milieux adéquats

pour une durée de 24 à 48h d’incubation.

Toutes les souches sont de Gram positif et catalase négative et ont été identifiées à des

bactéries lactiques, dont 22 identifié d’une façon préliminaire sur la base d’une étude

phénotypique, selon les critères aspect, forme et la couleur des colonies ainsi que

l’observation des cellules bactériennes en forme de bâtonnets fin longs, moyens, épais courts,

incurvés et absence de spores ont orientés la pré-identification des différents isolats au genre

Lactobacillus (figure 8).

On signale la présence de la diversité d’une flore particulièrement assez riche en forme de

coques en petite en grande structure, en chainettes coutes et longues ainsi que de bacilles

justifiant l’existence d’autres espèces à intérêt telles que les bactéries lactiques de différents

genres dont 6 ont été pré-identifiés à des leuconostocs, 2 à des pédiocoques, 8 à des

entérocoques, ainsi qu’à deux autres groupes non lactiques dont 5 apparentés au genre

Bacillus et 4 appartenant à des levures.

Les résultats des observations microscopiques des souches isolées sont regroupés dans les

figures 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15.

2. Mise en évidence et caractérisation des EPS

2.1. Production des exopolysaccharides en milieu solide

L’ensemencement des échantillons sur les différents milieux de cultures à permis d’isoler un

certain nombre de bactéries productrices d’exopolysaccharides. On a pu obtenir 8 souches

bactériennes (LGM-IL2, LGM-CLO1, LGM-Co1, LGM-CA1, LGM-Ja1, LGM-Il3, LGM-

Pro4, LGM-jb2) capable de se développer sur milieu hypersaccharosé après 24 à 48 h

d’incubation en anaérobiose à 30°C.

Ces isolats se caractérisent par la formation de colonies mucoïdes à aspect gluant sur ce

milieu gélosé témoignant d’une production massive d’un biopolymère épaississant,

exopolysaccharides (EPS) (figure 16).

Ces résultats rejoignent celles de Bouzar et al. (1997) qui avaient constaté que l’espèce Lc.

lactis est capable de produire des EPS, en culture pure comme en association avec St.

thermophilus. Ainsi, Looijesteijn et al. (2001) ont rapporté qu’au sein d’une même espèce de

bactéries lactiques, les résultats peuvent être différents. Ces auteurs ont pu identifier des


60

souches productrices d’EPS (voire très fortement) et des souches non productrices sans que ce

caractère n’engendre des disparités de croissance.

2.2. Production des EPS en milieu liquide

La production en EPS des bactéries isolées a été observée également sur milieu HJL liquide,

où l’apparition d’un trouble voir un biofilm est constatée au bout de 24 à 48 heures

d’incubation en anaérobiose à température égale à 30°c. Les résultats sont groupés dans la

figure 17.


61

La souche LGM- jé1 La souche LGM -jé2

La souche LGM –G2 La souche LGM-jé3

La souche LGM-G7 La souche LGM-C1


62

Figure 8 : photos des observations microscopiques des isolats identifiés au genre

Lactobacillus sp. thermophiles

La souche LGM-CO1 La souche LGM-PRO6

La souche LGM-CO5

La souche LGM-4’IL

La souche LGM-IL7G

La souche LGM-L3


63

Figure 9 : photos des observations microscopiques des lactobacilles mésophiles

La souche LGM-Jé2

La souche LGM-IL2

La souche LGM-CA7


64

Figure 10 : photos des observations microscopiques des isolats pré-identifiés au

Streptococcus themophilus

La souche LGM-J3

La souche LGM-J1

La souche LGM-Duod


65

Figure 11 : photos des observations microscopiques des isolats pré-identifiés au genre

Enteroccus

La souche LGM-Gé 7p

La souche LGM-Jé

La souche LGM-Il2p

La souche LGM-Co(1)

La souche LGM-J5

La souche LGM-Duo45


66


pédiocoques

La souche LGM-IL2

La souche LGM-CLO1


67

La souche LGM-jb2(5)

La souche LGM-Pro4

La souche LGM-Il3

La souche LGM-Ja1

La souche LGM-CA1

La souche LGM-Co1


leuconostocs


68

La flore non lactique

Figure 14b : photos des observations microscopiques des isolats LGM de Levures

La souche LGM-Clo1

La souche LGM-Gé2

La souche LGM-Co3

La souche LGM-Ca8

Figure 14a : photos des observations microscopiques de Levure du genre Kluyveromyces (Kourkoutas et al.,2002)


69

Figure 15 : photos des observations microscopiques des isolats pré-affectés au groupe

Bacillus

La souche LMG-9Bc

La souche LGM-7Bc

La souche LGM-15EIBc

La souche LGM-PRG Bc

La souche LGM-14EIBc


70

Production des EPS sur milieu gélosé hypersaccharosé (production du dextrane)

Production des EPS sur milieu liquide HJL (production de biofilm)

Figure A: Production des EPS par la souche LGM-IL2 Figure B : Production des EPS par la souche LGM-CLO1

Figure C : Production des EPS par la souche LGM-JAB2

Figure D : Production des EPS par la souche LGM CA1

Figure E : Production des EPS par la souche LGM JAB1

Figure F : Production des EPS par la souche LGM PROV4

Figure 16 : photos des observations macroscopiques des souches productrices des EPS

sur milieu gélose hypersaccharosé


71

Figure 17 : observations macroscopiques montrant un trouble avec précipité blanc d’EPS

en milieu liquide HJL

TEMOIN


72

2.3. Mise en évidence des colonies mucoïdes blanchâtres en présence de colorant rouge

de ruthénium sur milieu solide

L’examen de la présence des exopolysaccharides se fait comme suit; les souches productrices

d'EPS demeurent de couleur blanche car les EPS empêchent le colorant de teinter leur paroi

cellulaire (Gancel et al., 1988). Par contre, les souches non-productrices se colorent en rouge

du fait de l'affinité du colorant pour le peptidoglycane de leur paroi cellulaire (figure 18).

Cette technique a été utilisée par Bouzar et al. (1995) pour la sélection de clones d’une souche

de Lb. delbruckii spp. bulgaricus produisant différents niveaux de polysaccharides

extracellulaires. De cette façon, Stingele et al. (1996) ont sélectionné la souche Streptococcus

thermophilus Sfi6 possédant le phénotype de production d’EPS.

2.4. Mise en évidence des EPS par microscopie

La localisation des EPS produits se fait par observation microscopique d’un frottis vital par la

technique de coloration au bleu de toluidine à 1% (Figure 19).

EPS

Figure 18 : Mise en évidence des EPS produits sur milieu rouge de ruthénium

Figure 19 : localisation des EPS par coloration vitale au bleu de toluidine sous

microscope optique GX1000 (zoom d’appareil photos)


73

2.5. Extraction des exopolysaccharides (EPS)

Après avoir ajouté l’éthanol, la précipitation des exopolysaccharides se fait après 24h à froid

(figure 20.a) et le culot contenant les EPS extraits est récupéré après centrifugation (figure

20.b).

Figure 20a : précipitation des EPS à l’éthanol Figure 20b : récupération du culot EPS

2.6. Lyophilisation des EPS

Obtention du lyophilisat soumis à une action du lyophilisateur pendant une période de 48 h

(figure 21).

Figure 21: exopolysaccharides lyophilisés


74

2.7. Propriétés rhéologiques des EPS

Le produit lyophilisé a été ajouté à 10 ml du lait liquide stérile et à de l’eau distillée stérile.

Ces derniers sont devenus filants et visqueux, lorsqu’ils coulent sur la paroi interne des tubes

présentent une viscosité élevée d’où le caractère épaississant de l’EPS (figure 22).

Un intérêt grandissant est porté aux exopolysaccharides produits par les bactéries lactiques.

En effet, ceux-ci ont le grade alimentaire GRAS (generally regarded as safe) et ils possèdent

aussi des propriétés rhéologiques particulières permettant d’améliorer la texture des produits

fermentés (Ruas-Madiedo et al., 2002).

D’après Béal et al. (2008), certaines bactéries lactiques sont capables de produire des EPS

dont l’accumulation provoque une viscosité des milieux.

Selon Lin et Chien (2007), la production des EPS dépend des bactéries lactiques et la durée de

la fermentation. Chamba (2008) a rapporté que les lactocoques comme les leuconostocs sont

capables de produire des EPS, ce caractère est généralement porté par un plasmide.

Eau

LAIT EAU

Figure 22 : activité rhéologique des EPS sur différents milieux


75

2.8. Dosage colorimétrique des exopolysaccharides

Pour une meilleure interprétation des résultats, l’intensité de la couleur obtenue est

directement proportionnelle à la quantité de sucres présents dans l’échantillon

.

· Résultat colorimétrique de la gamme glucose

Figure 23 : dosage colorimétrique de la gamme glucose et des différents échantillons

Tableau 5 : valeurs obtenues permettant de tracer la courbe d’étalonnage de glucose (0-120

mg eq glucose/l)

Concentrations (mg eq glucose)

20 40 60 80 100 120

DO 0,39 0,68 1,00 1,35 1,52 1,84

Les résultats obtenus dans la gamme de sucre sont représentés dans la figure suivante (figure

24).

EPS Témoin- La gamme glucose


76

De cette manière, la courbe étalon glucose a été établie.

Figure 24: courbe montrant les différentes concentrations du glucose (0-120mg/l) en fonction

de la densité optique (DO 490nm)

R2 : coefficient de corrélation ≥0.95 (liaison forte entre les 2 séries)

.

· Résultats du dosage colorimétrique des différents EPS

Au total, le dosage a été effectué pour 6 polymères extraits.

Figure 25: dosage colorimétrique des deux dilutions A (1/10) et B (1/100) des 6 EPS (E1, E2,

E3, E4, E5, E6)

y = 0,0788x

R² = 0,9873

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

0 5 10 15 20 25 30

Série1

Linéaire (Série1)

De

nsi

té O

pti

qu

e (

DO

49

0n

m)

A B E1 E2 E3 E4 E5 E6 E1 E2 E3 E4 E5 E6


77

Figure 26 : exemple de résultats des dosages des dilutions finales d’un échantillon EPS

(A : 1/10, B : 1/100, C : 1/200)

· Résultats des différentes concentrations des EPS

Les résultats obtenus des différents dosages nous ont permis de dresser le tableau suivant.

Le calcul des différentes concentrations a été effectué en se basant sur la formule y = 0.0788x

Tableau 6: Résultats des différentes concentrations des EPS exprimés en mg eq. glucose/l

Les résultats de dosage des différents échantillons d’EPS produits par les six isolats,

notamment LGM-Jb2, LGM-Jb1, LGM-IL3, LGM-Clo1, LGM-IL2 et LGM-PRO4 sont

représentés dans l’histogramme suivant.

Echantillons C équivalent glucose (mg/l) E1 (LGM-Jb2)

E2 (LGM-Jb1)

E3 (LGM-IL3)

E4 (LGM-Clo1)

E5 (LGM-IL2)

E6 (LGM-PRO4)

134 654 716 750 1264 978

A B C


78

Figure 27 : histogramme représentatif des concentrations des échantillons EPS des différents

isolats du tractus digestif

Les résultats de dosage des différents polymères obtenus montrent que les concentrations des

EPS varient d’un échantillon à un autre, selon la capacité de production de chaque souche.

Par ailleurs, la concentration la plus élevée produite est de 1264 mg/l obtenue avec la souche

LGM-IL2 pré-identifiée au genre Pediococcus sp. et la concentration la plus faible est celle

produite par la souche LGM-Jb2 pré-identifiée au genre Leuconostoc sp. qui est de l’ordre de

134 mg/l.

En général, les résultats obtenus des différentes concentrations des EPS produits à partir de

différents isolats de la collection LGM varient entre 134 mg/l et 1264 mg/l, ce qui concorde

avec celles produites par S. thermophilus d’une gamme de 50 à 350 mg/l (Cerning et al,

1988; Doco et al, 1990), celles produites par Lb bulgaricus de 60 à 150 mg/l (Cerning et al,

1986; Garcia-Garibay and Marshall,1991), et de 80 à 600 mg/l pour celles produites par Lc

lactis subsp cremoris (Cerning et al, 1992).

La quantité des EPS produite par différentes espèces varient considérablement selon la

littérature, d’autres auteurs ont trouvé des concentrations importantes et plus élevées (plus de

1200 mg/l), ce qui concorde avec la production d’EPS produit par la souche LGM-IL2 pré-

identifiée au genre Pediococcus (Van de Berg et al., 1995; De Vuyst and Degeest, 1999).

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

E1 E2 E3 E4 E5 E6

E1

E2

E3

E4

E5

E6


79

2.9. Chromatographie sur couche mince des oses constitutifs des différents

polysaccharides

Les figure 28,29 et 30, laissent apparaitre les résultats d’analyse par chromatographie sur

couche mince des différents extraits de polysaccharides hydrolysés produits par les isolats

LGM pré-identifiés aux genres Leuconostoc et Pediococcus.

Figure 28: Profil de la composition en oses des différents EPS par analyse sur ccm dans le

système 1 (acide acétique : chloroforme : eau)

1 : Raff, 2 : Glu, 3 : Gal, 4 : Sac, 5 : Ara, 6 : Lac, 7: CLO1, 8: CLo1’, 9:IL2, 10:IL2’,

11:JAB1, 12:Co2, 13: IL3, 14:Pro4, 15: Dextrane

Les résultats obtenus montrent une similitude des profils chromatographiques des différents

extraits avec l’échantillon commercial le dextrane, dont on note la présence de 3 spots à

Rf1=0.112, Rf2=0.264 et Rf3=0.5.

Le profil des oses obtenu montre une prédominance du glucose qui est le constituant majeur

du dextrane.

Rf2

Rf3

Rf1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15


80

L’analyse des différents oses constitutifs des polysaccharides a montré que les 6 échantillons

ainsi que le dextrane commercial contiennent principalement une tache dont le Rf2=.0264 et

qui correspond au glucose, on note aussi la présence d’autres taches dont le Rf1=0.112 et

Rf3=0.5 de nature non déterminée.

Cela laisse supposer que, soit l’hydrolyse des polysaccharides était partielle et a libéré

certainement différents tri ou disaccharides plus lourd que le glucose, soit ces échantillons

contiennent plusieurs composants de nature glucidique ou autre non déterminés de Rf

différents.

Calcul du facteur de rétention (Rf) des différents sucres et échantillon

Tableau 7 : les différent RF obtenus sur le système 1 (acide acétique /chloroforme/ eau)

Sucres standards

Rf Échantillons EPS Rf

Glu Ara Gal Sac Lac Raf

0.264 0.364 0.225 0.178 0.092 0.059

IL2 0.264 0.112

JAB1 0.264 0.112

CLO1

0.264 0.112

PRO2(4)

0.264 0.112

COL2(1)

0.264 0.112

IL2(3) 0.264 0.112

Dextrane commercial 0.264 0.112


81

Figure 29 : Profil de la composition en oses des différents EPS par analyse sur ccm dans le

système 1 (acide acétique : chloroforme : eau)

La figure 29 laisse apparaitre le profil des différents oses constitutifs de polysaccharides

analysés par chromatographie sur couche mince.

D’après la figure, on remarque une similitude des profils de différents échantillons (de 8 à 13)

avec le dextrane commercial (14) et notamment une diversité de composants révélés pour

chaque échantillon, on note principalement la présence d’une tache dont le Rf2=0.36 et qui

correspond à celle du glucose (piste 7).

Par ailleurs, on remarque la présence de différentes autres taches dont le Rf1=0.2 qui a migré

un peu moins que celui du glucose, ce qui laisse supposer selon les résultats obtenus par

Boual et al.( 2011) et Guillaume T. et al.(2006) qui montrent une migration d’acide

gluccuronique et d’acide galacturonique à un Rf juste en dessous de celui du glucose, donc

vraisemblablement les échantillons analysés contiennent ce composant. D’autre part, à un

Rf3=0.6 et un Rf4=0.73 qui montre des spots avec une migration plus importante, laisse

suggérer que ce sont des composants plus léger peut être des acides comme le montre le

témoin de la piste 1 (acide ascorbique).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Rf 2 Rf 3

Rf 4

Rf 1


82

Figure 30: Profile de la composition en oses des différents EPS par analyse sur ccm dans le

système 2 (Acétone: Eau)

L’analyse de cette chromatographie, montre une diversité dans les profils obtenus pour

chaque échantillon, dont on note principalement la présence chez touts les échantillons

analysés (6-10) ainsi que le dextrane commercial (11) d’une tache à Rf2=0.5 correspondant à

celle du glucose.

D’autres taches sont présentes chez quelques échantillons (9, 10, 11) dont le Rf1=0.20 et qui

est approximativement semblable à celui du raffinose (2) à Rf=0.24, cela laisse supposer que

ces échantillons n’ont pas subit une hydrolyse totale ce qui a engendré la migration de

composés complexe lourd à ce Rf.

Par ailleurs, la présence de taches à Rf3=0.7 et Rf4 =0.8 est remarquable pour touts les

échantillons analysés, et qui ont migré fortement prés du front de migration se localisent à un

niveau rapproché que celui l’acide ascorbic (1) utilisé dont le Rf=0.6. cela peut traduire que

ces échantillons contiennent d’autres composés de nature non glucidique (acide ou autre

dérivés).

Rf 1

Rf 2

Rf 3

Rf 4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


83

Les résultats obtenus par les ccm réalisées lors de cette étude, semblent similaires à celles

d’autres auteurs qui ont monté que le glucose et le galactose sont les sucre neutres retrouvés

souvent dans la composition des polysaccharides des LAB (De Vuyst et al., 1998;

Cerning,1990, 1995, Nakajima et al., 1990; Grobben et al., 1995; Gruter et al., 1993).

Les monosaccharides les plus retrouvés dans divers EPS produits des LAB sont le rhamnose

(Cerning et al., 1986, 1988; Nakajima et al., 1990, 1992; Gruter et al., 1993; Grobben et al.,

1995), le mannose (Petit et al., 1991), le fructose (Manca de Nadra et al., 1985), l’arabinose

et le xylose (Cerning et al., 1988, 1992) ou les dérivées des sucres tels que le N-

acetylgalactosamine (Doco et al., 1990; Petit et al., 1991) et le N-acetylglucosamine (Cerning

et al., 1994) sont aussi retrouvés.

3. Etude de l’activité antimicrobienne des souches probiotiques de la collection LGM

L’activité antibactérienne se révèle par la présence d’une zone transparente autour des disques

imprégnés avec les cultures des souches à tester (figure 31). Les souches de la flore totale de

la collection développée lors de cette étude synthétisent une substance inhibitrice de nature

inconnue dirigée contre les pathogènes et qui pourrait vraisemblablement être une

bactériocine. L’activité antagoniste se traduit par la présence d’un halo clair autour du

probiotique notifiant la sensibilité du pathogène suite à l’élaboration de cette substance.

La présence d’une zone d’inhibition peut être due à la production des substances

antimicrobienne comme les bactériocines, des acides organiques, des peroxydes ou dioxyde

de carbone (Piard, Desmazeaud M,J ; 1992).

Au total 20 souches probiotiques ont été utilisées parmi eux des Leuconostoc (LGM-jb2,

LGM-Ca1), des pediocoques (LGM-CLo1, LGM-IL2) et notamment des Lactobacillus spp.

(LGM-CA7, LGM-IL2L, LGM-Jé2L, LGM-7G, LGM-4’L).

D’autres inhibitions ont été réalisées par d’autres bactéries non lactiques à l’exemple de

Bacillus isolé lors de ce travail (LMG-9Bc, LGM-7Bc, LGM-PrGBc, LGM-14EIB), nous

faisons remarqué que ce genre est utilisé comme probiotique en aviculture (Mutus et al.2006).

Ce travail a pu montrer qu’au niveau de la collection de souches élaborée, 11 isolats ont

exercé un effet inhibiteur pour les différents pathogènes utilisés, et cela par la méthode des

disques (Tadesse et al.,2004) et que par ailleurs, leur extrait (surnageant) a au même titre

engendré un effet neutralisant la croissance de ces pathogènes.

Les résultats de ces interactions sont illustrés dans les figures (figure31 au 39) et tableaux

suivants (tableau 8,9).


84

Tableau 8 : activité antibactérienne des différents isolats LGM contre des souches

pathogènes

pathogènes S.aureus

ATCC

25923

E.coli

ATCC

25922

S.aureus

ATCC

43300

Souches

probiotiques

LGM-CA7

LGM-IL2L

LGM-Jé2L

LGM-7G

LGM-4’L

LGM-Jb1o

LGM-IL2O

LGM-Clo1O

LGM-7Bc

LMG-9Bc

LGM-PrGBc

-

+

-

+

+

+

-

-

-

+

+

-

+

+

-

-

+

+

/

-

-

/

+

+

+

-

-

/

/

/

-

/

+

Selon les résultats montré sur le tableau 1, on note que la souche pathogène S. aureus ATCC

25923 a été inhibée par 6 cultures probiotiques parmi 11 utilisées, et que les souches E. coli

ATCC 25922 et S. aureus ATCC 43300 ont été inhibées seulement par 4 cultures différentes

de nature probiotique.

Ces résultats indiquent que les isolats LGM sont capables de synthétiser des substances

inhibitrices ayant une activité antibactérienne. L’ensemble des souches testées ne présentent

pas le même spectre d’action vis-à-vis des bactéries pathogènes notamment S. aureus ATCC

25923, E. coli ATCC 25922 et S. aureus ATCC 43300.

Par ailleurs, les LAB sont connues par la production d’une multitude de composés

antimicrobiens : les acides organiques, les bactériocines, le diacétyl et le peroxyde

d’hydrogène (Titiek et al.1996 ; Aslam et Qazi, 2010).

Charlier et al. (2009) ont montré que Lactococcus sp. et Leuconostoc sp. présentent une

inhibition à spectre élargie vis-à-vis de Staphylococcus aureus qui est induit par l’effet de

l’acide lactique et des bactériocines.

La capacité inhibitrice in vitro des LAB vis-à-vis des germes pathogènes semble être une

bonne propriété probiotique (Ammor et al., 2006).


85

Tableau 9 : effet inhibiteur des surnageants natifs

Les résultats du tableau 2 résument la résistance et la sensibilité des différentes souches

pathogènes testées aux composants des surnageants natifs de quelques isolats LGM.

Pathogènes S.aureus

ATCC

25923

E.coli

ATCC

25922

Salmonella

typhi

Souches

probiotiques

LGM-CA7

LGM-IL2L

LGM-Jé2L

LGM-7G

LGM-4’L

LGM-IL2O

LGM-Clo1O

LGM-Jb1o

LMG-9Bc

LGM-7Bc

LGM-PrGBc

LGM-14EIBc

-

-

-

+

+

ND

ND

ND

+

-

+

+

+

+

+

-

-

+

-

+

ND

ND

+

+

+

+

+

-

-

-

-

ND

ND

ND

ND

ND

+ : sensibilité, - : résistance, ND : non déterminée

D’après les résultats obtenues sur le tableau 2, on remarque que la souche Salmonella typhi a

été inhibée par l’effet de 3 surnageants, la souche S. aureus ATCC 25923 a été inhibée par

l’effet de 5 surnageants natifs, et que la souche E. coli ATCC 25922 a été inhibée par l’effet

de 7 autres surnageants différents.

Selon les résultats obtenus, on constate que l’activité antibactérienne des surnageants natifs

des différentes souches n’est pas semblable envers la collection des souches pathogènes. En

effet, les diamètres des zones d’inhibition varient d’une souche à une autre.

Il apparaît que les surnagenants des isolats LGM-CA7, LGM-IL2L, LGM-Jé2L n’arrivent pas

à inhiber la croissance de S. aureus ATCC 25923, alors qu’ils présentent une bonne activité

antimicrobienne contre E. coli ATCC 25922 et Salmonella typhi.

La fraction extracellulaire correspondant au surnageant présente un fort pouvoir antibactérien,

ce qui confirme la production d’agents antimicrobien par les souches lactiques dans le milieu.


86

Plusieurs études ont montré que la fraction extracellulaire contient des substance responsables

de cette interaction (Metlef et Bouras,2009) .

Les lactocoques sont capables de produire deux substances majeures (acide lactique et

bactériocines) responsables de l’effet antagoniste. Les LAB hétérofermentaires peuvent

produire des quantités notables d’acides organiques autres que l’acide lactique et c’est le cas

des leuconostocs qui produisent autant d’acétate que de lactate. L’acide acétique excerce une

forte action inhibitrice à l’encontre de nombreux micoorganismes (Bourgeois et

Larpents,1996).

Ø Effet du surnageant neutralisé

Après élimination de l’effet des acides organiques, les surangents neutres ont été testés au

nombre de 12 pour leur activité inhibitrice contre deux germes S .aureus ATCC25923 et E.

coli ATCC 25922.

Lés résultats obtenus (figure 36, 37) montrent une perte de l’activité inhibitrice pour les

surnageants utilisés, seulement deux parmi eux (souche LGM-Jé2L et LGM-14EI) sont

arriver a engendré une neutralisation à l’encontre des deux pathogènes testés.

Cela laisse supposer que l’inhibition majeure est due aux acides organiques produits par les

souches LGM. L’apparition de l’activité antagoniste pour les 2 souches LGM-Jé2L et LGM-

14EI, après élimination de l’effet de l’acide, confirme l’existence des autres substances

antibactériennes telles que le diacétyl, le peroxyde d’hydrogène et les bactériocines.

L’intervention du peroxyde d’hydrogène dans le phénomène d’inhibition par les bacteries

lactiques a été établie. Lorsqu’il est libéré à des concentrations suffisantes, il peut provoquer

l’auto-inhibition ou inhiber d’autres contaminants de l’environnement (Bourgeaois et Larpent,

1996).

Par ailleurs, les lactocoques produisent des bactériocines à spectre varié d’inhibition où deux

ont été caractérisées : la nisine produite par Lc. lactis spp. lactis a un spectre d’inhibition large

touchant la plupart des germes à gram positif, et la pedioccine produite par Lc. lactis spp.

cremoris (Bourgeois et Larpent, 1996 ; Campos et al., 2006).

Trias et al. (2008) ont observé un effet antimicrobien exercé par des souches de Leuconostoc

mesenteroides vis-à-vis de Listeria monocytogenes. Les acides organiques, le peroxyde

d’hydrogène et les bactériocines ont été détectés en tant que principaux mécanismes

d’inhibition.


87

Ø La méthode de la double couche (Fleming et al., 1975)

Cette méthode a été réalisée pour 10 souches appartenant au genre Lactobacillus spp.,

seulement 6 ont montré une inhibition vis-à-vis deux pathogènes d’Enterococcus faecalis

V583 et Enterococcus faecalis JH2-2 (figure 38,39). A ce titre, la méthode de double couche

n’a pas donné satisfaction de la démarche escomptée par rapport aux autres protocoles

réalisés.


88

Figure 32 : activité antagoniste des

différents isolats LGM vis-à-vis d’E. coli

ATCC25922 par méthode de disques.

Figure 31:activité antagoniste des différents

isolats LGM vis-à-vis S. aureus ATCC25923

par la méthode des disques

Figure 33: activité antagoniste des différentes souches LGM vis-à-vis S. aureus ATCC 43300 par la méthode

des disques


89


surnageant natifs de différents isolats LGM

vis-à-vis S. aureus ATCC25923 par la méthode

des disques

Figure 34 : activité antagoniste des surnageants

natifs de différents isolats LGM vis-à-vis d’E.

coli ATCC2592 par la méthode des disques


neutralisés de différents isolats LGM vis-à-vis

d’ E. coli ATCC2592 par la méthode des disques


neutralisés de différents isolats LGM vis-à-vis S.

aureus ATCC25923 par la méthode des disques


90


Lactobacillus spp. vis-à-vis d’Enterococcus

faecalis V583 par méthode double couche


Lactobacillus spp. vis-à-vis d’Enterococcus

faecalis JH2-2 par la méthode double couche


91

4. Caractérisation moléculaire des souches probiotiques

4.1. Identification du genre Lactobacillus spp. par amplification d’une région interne du

gène ADNr 16S

Une bande d’ADN de 480 pb a été amplifié pour les 13 souches de lactobacilles ainsi que

pour la souche de référence Lactobacillus delbruekii ATTC 11842 utilisée témoin positif,

aucune présence de bande significative n’a été constatée pour la souche Streptococcus

thermophilus CNRZ 1066 de référence utilisée comme témoin négatif (figure 40).



M: marqueur de taille 200 pb (Smart Ladder), piste 1: témoin positif (Lb. delbruckii ATTC

11842), pistes 2.3.4.5.6.7.8.10.11.12.13.14.15: (isolats lactobacilles), piste 9: témoin négatif

(St. thermophilus CNRZ 1066)

4.2. Séquençage et taxonomie des souches de la flore intestinale

Le séquençage des différents amplifias obtenu a été réalisé et les scores affichés lors de

traitement des séquences par le BLAST via internet ont montré une forte homologie avec les

séquences déposées dans la banque de donnée. Cette forte homologie aux environs de 99% de

similitude entre séquences a notifié la présence de Lb. acidophilus, Lb. gallinarum, Lb.

Crispatus, Lb. Johnossi, Lb. Fermentum et Lb. Helveticus pour la majorité des isolats

examinés. A ce degré d’investigation, les souches sélectionnées ne peuvent être affectées au

niveau de l’espèce et se regroupent dans le genre Lactobacillus spp.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

480 pb

400 pb

200 pb


92

4.3. Amplification du gène de l’ADNr 16S à base de PCR de quelques isolats

On note la présence de bande d’ADN de poids moléculaire à 1500 pb comparativement aux

bandes du marqueur de taille Smart Ladder 200 pb (figure 41).

L’ADNr 16S reste un taxon de choix en matière de systématique en bactériologie.

Le séquençage de cette bande permettrait de donner une affiliation résolutive de l’espèce une

fois que cette séquence sera traitée au niveau d’une base de données par logiciel BLAST.



M : marqueur de taille 200 pb ( Smart Leader), piste 1,2 : S1,S2 (Streptomyces), piste 3 :

N1(lactobacille), piste 4 :R1(Rhodococcus), piste 5 : V1 (leuconostoc) , piste 6 :L2 (tetra

pediococcus ), piste 7 : S3( Streptomyces), piste 8,9 : R2,R3 (Rhodococcus), piste 10 : L3

(leuconostoc), piste 11 : L4 (lactobacile )

Au total 11 souches du laboratoire ont fait l’objet d’une extraction ADN (Gevers et al., 2001)

et une amplification PCR par l’usage d’amorces universelles ADNr 16S (8UA/1492R) et

l’amplifiât est estimé à 1500 pb.

Au total quatre souches appartenant à des genres différents ont montré des amplifias à 1500

pb. La méthode d’extraction ADN peut être optimisée pour les souches n’ayant pas montré un

résultat positif.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M

M

1500 pb

1000 pb

800 pb

600 pb

400 pb


93

Dans le contexte de cette étude, le genre Pediococcus produisant des EPS a révélé la présence

de l’amplifiât ADN (piste 6).

L’amplifiât chez les quatre souches a une taille de 1500 pb, ces résultats concordent avec ceux

de la littérature (Sato et al.,2003) .

Il serait intéressant de séquencer la bande ADN afin de confirmer d’une manière résolutive la

taxonomie de ces souches.

La méthode RFLP par digestion de l’ADNr 16S totale avec des enzymes de restrictions

permettait l’obtention de profils de digestion dont l’analyse trancherait quand à la similitude

et l’homologie des séquences ADN des souches du même genre et aiderait à les différencier.

Conclusion et perspectives

94

La microflore présente au niveau du microbiote intestinal montre une diversité enrichissante

de microorganismes dont le profil phénotypique peut être exploité dans le domaine de lutte

contre les pathogènes et aussi par la production de polysaccharides en qualité de prébiotique.

Les souches isolées ont été identifiés au genre Lactobacillus par l’amplification d’un fragment

de 480 pb, ces résultats concordent avec ceux de Dubernet et al. (2002) qui, par

l’amplification d’une région partielle de 250 pb, entre les régions ADNr16S et ADNr 23S ont

démontré l’appartenance de leurs souches au genre Lactobacillus. Les travaux réalisés dans

cette étude sur les inhibitions ont montré que les lactobacilles du tractus digestif se

caractérisent par un large spectre d’action antagoniste à l’égard de pathogènes utilisés en

l’occurrence Staphylococcus aureus et Salmonella typhi. Les études de Makras et al. (2006),

ont déjà confirmé l'activité antagoniste des bactéries lactiques contre les bactéries pathogènes.

Les propriétés antibactériennes des LAB dépendent de plusieurs critères: le pH, le milieu de

croissance et la production de substances antibactériennes comme les bactériocines, les acides

organiques, les acides gras et le peroxyde d'hydrogène (Huttunen et al., 1995). L'acidification

du milieu par l'acide lactique joue un rôle considérable dans la capacité inhibitrice des LAB

contre plusieurs bactéries pathogènes. Hicks et Goepfert (1968) ont bien confirmé que l'acide

lactique et l'acide acétique produits par les bactéries lactiques participent à l'inhibition de

Staphylococcus aureus et les travaux de Sakaridis et al. (2012) ont montré que les LAB se

caractérisent par une forte inhibition vis-à-vis de Salmonella sp. et de Listeria monocytogenes.

Récemment de nouvelles stratégies de prévention ont été proposées comme alternatives aux

antibiotiques pour réduire l’incidence des pathogènes entériques chez la volaille, parmi ces

stratégies, le recours aux probiotiques et prébiotiques semblent offrir les résultats les plus

prometteurs. Notre travail nous a permis de révéler la présence d’une flore digestive riche et

diverse où on retrouve les différents groupes de probiotiques cités dans la littérature

(Bernardeau et Vernoux, 2009 ; Capcarova et al., 2011), à l’exemple des lactobacilles, des

pediocoques, des leuconostoc, des streptocoques, des entérocoques, des Bacillus et

notamment des levures.

Par ailleurs, l’ADNr 16S a permis d’identifier un premier groupe appartenant au genre

Lactobacillus spp., au nombre de 22 dont 13 ont été identifiés par les techniques de biologie

moléculaire, un deuxième groupe dont 06 en forme de coques ovoïdes et longues chainettes ,

pré-identifiée au leuconostoc, 02 en forme de tétracoques pré-identifiés au pédiocoques, 06 en

forme coques en amas pré-identifiés au groupe des entérocoques et 03 en forme de longues

chainettes coques pré-identifiés à Streptococcus thermophilus, et enfin un troisième groupe

Conclusion et perspectives

95

non lactique au nombre de 09 dont 04 levures et 05 Bacillus. Au total 48 souches ont été

répertoriées et conservées.

Les EPS qui ont été repérés chez certaines souches en particulier les leuconostocs et les

pédiocoques ont fait l’objet d’une extraction, purification, et dosage après hydrolyse en

présence d’acide sulfurique, les résultats sont fort intéressants dont le dosage de la production

la plus élevée en EPS à été déterminé par 1264 mg/l, ces travaux concordent avec Van de

Berg et al., 1995 et De Vuyst and Degeest, 1999 .

D’autre part, la chromatographie sur couche mince de différents EPS extrait a conduit à une

similitude des profils avec le dextrane commercial, en montrant une diversité de dérivés dans

le profil ccm. Ces résultats sont en convergence avec ceux de De Vuyst et al., 1998 et

Cerning,1990.

En matière de perspective, en premier plan, un diagnostic moléculaire à base de PCR et

séquençage s’avère plus que nécessaire afin de déterminer l’exactitude de la taxonomie des

bactéries les plus performantes. En second plan, ces souches peuvent faire l’objet d’études

ultérieures dans l’alimentation avicole, afin de valoriser leur potentialité en qualité de

probiotique, en étudiant la prévention de maladies entériques dues à des pathogènes et par la

même occasion, évaluer leurs aptitudes dans le contexte des performances zootechniques et

prévention sanitaire à l’exemple de la souche Pediococcus LGM-IL2 dont les performances

ont été testées par plusieurs auteurs à l’exemple de Pediococcus acidilactici (MA 18/5M)

(Temim et al.,2009).

Les souches productrices d’exopolysaccharides méritent un suivi et doivent être exploitées

pour une éventuelle caractérisation et production de ces prébiotiques. Il a été montré que les

Mannan-oligosaccharides présentent un effet de protection contre les salmonelles chez la

volaille ainsi que les AXOS ( Arabinoxhylo-oligosaccharides) qui ont montré le même effet

de protection de la colonisation de l’épithélium, en plus l’excrétion des salmonelles a été

retrouvée dans les fientes après un aditif de ces prébiotiques (Fukata et al.,1999). Des travaux

peuvent être dirigés contre certaines pathologies, en l’occurrence les coccidioses.

Selon plusieurs chercheurs, les probiotiques et prébiotiques sont bien placés pour prendre la

relève des antibiotiques en raison de leurs aptitudes nutritionnelles et antimicrobiennes fort

intéressantes.

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Annexe 1 : Composition des milieux de culture et tampon

Milieu MRS (pH 6.5) Peptone ......................................................................................10g

Extrait de viande ....................................................................... 10g

Extrait de levure ..........................................................................5g

Glucose ......................................................................................20g

Tween 80....................................................................................1ml

Phosphate bipotassique .............................................................. 2g

Acétate de sodium .......................................................................5g

Citrate d’ammonium ...................................................................2g

Sulfate de magnesium, 7 H2O ................................................ 0.2g

Sulfate de manganèse, 4 H2O .................................................0.5g

Agar .........................................................................................15g

Eau distillée qsp ................................................................ 1000ml

Gélose hypersaccharosée (pH 6.8)

Extrait de viande ....................................................................10g

Extrait de levure ..................................................................... 3g

Peptone................................................................................ 2.5 g

Saccharose.......................................................................... 150 g

K2HPO4 .................................................................................2 g

NaCl .......................................................................................1 g

MgSO4, 7H2O .....................................................................0.2g

Agar ......................................................................................15g

Eau distillée qsp ............................................................. 1000 ml

Milieu HJL (pH6.5)

Tryptone ………………………………………………….3g

Extrait de bœuf …………………………………………0.2g

Extrait de levure …………………………………………..1g

Lactose ……………………………………………….......1g

KH2PO4 …………………………………………...…...0.5g

Eau distillée qsp……………………………………….100 ml

· Stérilisation des milieux de culture par autoclavage à 120°C pendant 15 min.

Tampon TBE (pH8)

Tris-Hcl 30mM

Acide Borique 89mM

EDTA 2mM

Annexe II : Coloration de Gram

La coloration de Gram a été réalisée selon la technique suivante :

· Sur une lame, fixer à la chaleur une culture bactérienne ;

· Recouvrir la lame avec la solution de violet de gentiane pendant une minute ;

· Ajouter du lugol pendant 30 secondes ;

· Décolorer avec de l’alcool 95°, puis rincer à l’eau ;

· Faire une contre coloration en utilisant la fuschine et laisser agir 20 à 30 secondes ;

· Laver à l’eau ;

· Après séchage, soumettre la lame à une observation microscopique à immersion

(x100).

Les bactéries à Gram positif apparaissent en violet et les bactéries à Gram négatif en rose

RésuméLe recours aux antibiotiques a connu ses limites en raison de l’émergence de nouvelles

souches multi résistantes causées par l’utilisation abusive de ces composés dans le secteur

avicole, malgré que l’antibioprévention reste actuellement le seul moyen utilisé pour contrôler

les problèmes sanitaires et économiques liés aux pathogènes aviaires, l’utilisation des

probiotiques s’avère nécessaire pour favoriser une bonne microflore antagoniste vis-à-vis des

pathogènes et peut s’inscrire comme stratégie alternative envisagée pour protéger les volailles

des agents pathogènes et pour remplacer les antibiotiques comme facteur de croissance.

Ce travail s’intéresse à l’identification par les méthodes ADN des souches de volaille

productrices de substances inhibitrices vis-à-vis de certains pathogènes Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi. 11 de ces souches ont été retenues suite à leur

forte action inhibitrice. Au total 48 souches ont été isolées à partir de différents

compartiments du tractus digestif de deux coqs de race locale, dont 6 ont été pré-identifiés à

des leuconostocs, 2 à des pédiocoques, 8 à des entérocoques, 22 à des lactobacilles, 5

apparentés au genre Bacillus et enfin 4 autres appartenant à des levures.

Par ailleurs, l’utilisation des amorces d’une région interne de 480 pb du gène l’ADNr 16S

spécifiques au genre Lactobacillus sp. et le séquençage du fragment d’ADN amplifié ont

permis d’identifier les isolats appartenant à la flore lactobacillaire au nombre de 22.

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus crispatus et Lactobacillus

johonossi ont été les souches les plus diagnostiquées par la méthode PCR colonie. Une autre

approche moléculaire a été entamée afin d’amplifier le gène ADNr 16S dans sa totalité 1500

pb chez certaines souches, celui-ci reste un taxon de choix en matière de systématique en

bactériologie. D’autres travaux menés sur la détection et l’extraction des prébiotiques tels que

les polysaccharides exogènes (EPS) ainsi que leur caractérisation par chromatographie sur

couche mince qui a montré une similitude des profils avec le dextrane commercial et leur

dosage colorimétrique qui a été déterminé à 1254 mg/l pour la production d’EPS la plus

élevée chez la souche LGM-IL2.

Mot clés :Lactobacillus Spp; ADN; PCR; Probiotiques; Aviculture; Pathogènes; Activité Inhibitrice;

Prébiotiques; CCM; Souche LGM-IL2.

Contribution à l’étude des probiotiques et prébiotiques ...

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