MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

ECOLE NATIONALE SUPERIEURE DES SCIENCES DE LA MER ET L’AMENAGEMENT DE LITTORAL

ENSSMAL

Fait par : HAMDI Mohamed Salim

Enseignante : Mlle AMROUCH

- 4ème aquaculture - 2009/2010 -

Plan de travail1- la préparation des milieux de culture pour le contrôle biologique des aliments ; (page 3)

2- recherche et dénombrement de micro-organismes (bactéries et champignons) ; (page 5)

3- isolement et identification des bactéries pathogènes (coloration de gram, tests d’oxydase et de catalase, test sur galerie API) ; (page 8)

4- test de toxicité sur souris ; (page 12)

5- dosage des toxines protéiques (méthode de BRADFORD). (page 14)

INTRODUCTION

ORIGINE DES MICRO-ORGANISMES PRESENTS DANS UN ALIMENT :

Les micro-organismes des aliments ont 3 origines possibles :

-Ils préexistent dans la matière brute ou l’aliment avant toute manipulation ou transformation ;

-ils sont apportés accidentellement lors des manipulations ultérieures de l’aliment ;

-ils sont ajoutés volontairement.

EFFET SUR L’ALIMENT DES MICRO-ORGANISMES NUISIBLES :

Les micro-organismes nuisibles sont les micro-organismes pathogènes (salmonelles et shigelles, staphylocoques, vibrio, sulfito-réducteurs…), responsables d’intoxications alimentaires et les micro-organismes pouvant causer des altérations des aliments.

* les altérations provoquées par les micro-organismes nuisibles se résument aux :

-altérations de l’aspect ou de la texture ;

-altérations du goût et de l’odeur ;

-altérations des qualités nutritives.

PRINCIPES DE L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS :

L’analyse microbiologique des aliments répond à deux nécessités :

L’expertise : Elle permet de déterminer si un aliment est responsable d’une intoxication alimentaire et comment.

La prévention : Elle permet de tester un aliment pour savoir s’il est consommable du point de vue microbiologique, c'est-à-dire :- s’il ne contient pas ou pas trop de bactéries susceptibles de l’altérer, et

s’il pourra être conservé selon certaines règles ;- s’il ne contient pas de micro-organismes toxinogènes ou virulents.

* un certain nombre de difficultés rendent l’analyse microbiologique délicate :

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- l’aliment est rarement stérile. Une bactérie considérée comme pathogène ne provoquera pas forcément une infection. Celle-ci dépend de nombreux facteurs, notamment du nombre de ces bactéries ingérées ;

- la recherche d’un groupe particulier de bactéries parmi d’autres peut être très difficile ;

- le coût des analyses microbiologiques est fort élevé pour une rentabilité faible.

* Que l’aliment soit responsable présumé d’une intoxication alimentaire ou simplement à tester, les recherches sont d’abord orientées vers les micro-organismes responsables des intoxications alimentaires : toxines ou bactéries pathogènes. Ainsi, plusieurs TP ont été effectués, traitant globalement de :

- la préparation des milieux de culture pour le contrôle biologique des aliments ;

- recherche et dénombrement de micro-organismes (bactéries et champignons) ; isolement et identification des bactéries pathogènes (coloration de gram, tests d’oxydase et de catalase, test sur galerie API) ;

- test de toxicité sur souris ;

- dosage des toxines protéiques (méthode de BRADFORD).

I. PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE POUR LE CONTROLE BIOLOGIQUE DES ALIMENTS :

La culture des micro-organismes se fait soit sur milieu solide (gélose) ou sur milieu liquide (bouillon). Les milieux sont à l’origine sous forme de poudre, qu’il faut ensuite préparer.

Les milieux de culture sont pour la plupart sélectifs, c'est-à-dire qu’ils apportent les nutriments essentiels au développement de certains germes, mais contiennent des composés qui inhibent la croissance des autres micro-organismes (voir annexe).

Matériel utilisé :

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- verrerie selon besoins (béchers, éprouvettes, flacons), thermomètre, balance de précision, agitateur, becs bunsen, boites de pétri, autoclave, plaque chauffante.Produits :- Milieux de culture sous forme de poudre- Eau distillée- HCl et NaOH (ajustement du pH)Protocole :· Peser la masse nécessaire de poudre (indiquée sur sa boite).· Dissoudre la poudre dans l’eau distillée à l'aide de l'agitateur.· Chauffer au bec bunsen ou sur plaque chauffante jusqu’à l’obtention d’un liquide homogène. Ajuster le pH au besoin (par ajout de NaOH ou de HCl). Autoclaver le bouillon, si cela est indiqué sur la boite du produit, ou alors ;· Laisser refroidir la préparation · Lorsque la préparation a atteint une température inférieure à 60°C couler dans des boites de pétri.

1-1- Milieux pour la recherche des germes pathogènes :

Les milieux de culture que nous avons préparé en TP sont (certains sont à titre indicatif seulement):

1-1-1- Pour les Salmonelles :

Bouillon d’enrichissement SFB

Milieu gélosé SS-Agar (Salmonelles, shigelles)

1-1-2-Vibrions :

Bouillon d’enrichissement (EPA): Eau pepetonée alcaline (10 fois concentrée)

Milieu gélosé thiosulfate citraté bilié sucrose (TCBS)

1-1-3-Les sulfito-réducteurs (anaérobies)

Milieu gélosé viande-foie

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1-1-4- Les staphylocoques :

Milieu Chapman1-2- Milieux pour la recherche des germes indicateurs (de pollution

fécale) :

1-2-1- Coliformes (coliformes totaux et fécaux) :

Milieu solide : Tergitol + additifs (Tergitol + TTC) Gélose désoxycholate à 1%

1-2-2-Streptocoques fécaux : Milieu Slanetz et Barthely

1-3- Recherche de levures et moisissures :

Milieu Sabouraud

II. RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE MICRO-ORGANISMES (BACTERIES ET CHAMPIGNONS) :

2-1- Préparation de la source de contamination (chair de la sardine) :

Matériel utilisé :

- pipette de 1 ml± 0.01ml- éprouvette de 25 ml± 0.25ml- bécher de 250 ml- tubes à essais- fiole de 500 ml- mixeur- balance de précision- boites de pétri de 5.5cm de diamètre- bec bunsen

Mode opératoire :

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A l’aide d’un mixeur stérile on broie 25g de chair de la sardine avec 225ml d’eau physiologique :

A / Préparation de la solution mère : 10 -1

1- Lavage du poisson à l’eau de robinet, enlever les écailles, la peau…etc.

2- Peser 25g de chair

3- Mettre 225ml d’eau physiologique dans le mixeur avec les 25g de chair puis mixer jusqu’à l’obtention d’une solution homogène (bouillon).

B / Préparation des solutions filles :

a- dilution 10-2 :

Mettre dans une éprouvette de 25ml, 1ml de lasolution mère puis on complète à 10 ml avec de l’eau physiologique.

b- Dilution 10-3 :

Mettre dans une éprouvette de 25ml, 1ml de dilution 10-2 puis on complète à 10 ml avec de l’eau physiologique.

2-2- Ensemencement des coliformes en milieu solide :

Leur culture se fait en profondeur : A l’aide d’une pipette pasteur, on met dans une boite de pétri, 20 gouttes (correspond à ~ 1ml) d’une dilution, on coule la gélose désoxycholate à 0.1%, puis on procède à un étalement en faisant des mouvements de huit.

Incubation :

-Une série de boites sera incubée à 37°C, pendant 24 à 48 h et servira à la recherche de Coliformes totaux,

-l’autre série sera incubée à 44°C pendant 24 à 48 h et servira à la recherche de Coliformes fécaux..

Que se soit à 37 ou à 44°C, les premières lectures se feront au bout de 24 h et consistent à repérer les petites colonies rouges ayant poussé.

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2-3- Ensemencement des Streptocoques fécaux:

Il se fait en surface sur une boite de pétri contenant le milieu Slanetz. On verse à l’aide d’une pipette pasteur, 100µl de dilution. L’incubation de fait à 37°c.

2-4- Ensemencement des Staphylocoques :

Il se fait en surface sur une boite de pétri contenant le milieu Chapman. On verse à l’aide d’une pipette pasteur, 100µl de dilution. L’incubation de fait à 37°c.

2-5- Ensemencement des levures et moisissures :

Il se fait en surface sur une boite de pétri contenant le milieu Sabouraud. On verse à l’aide d’une pipette pasteur, 100µl de dilution. L’incubation de fait à température ambiante.

2-6- Ensemencement des sulfitoréducteurs :

Ce sont des organismes anaérobies => l’ensemencement se fait dans un tube à essai (qui sera fermé ensuite) : 100 µl + milieu gélosé viande-foie. On agite le tube à essai en essayant de ne pas toucher le bouchon avec la gélose liquide. L’incubation se fait à 37°c.

* Il faut prendre le soin de bien étaler sur toute la surface de la boite.

* La lecture se fait 24 à 48 heures après.

2-7- Dénombrement :

Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte des facteurs de dilutions, de plus :

- ne dénombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies,- multiplier le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution, - faire la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions.- On ne doit pas trouver plus de Coliformes fécaux que de Coliformes totaux. III. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES BACTERIES PATHOGENES

(COLORATION DE GRAM, TESTS D’OXYDASE ET DE CATALASE, TEST SUR GALERIE API) :

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3-1- Isolement de quelques bactéries :

Vibrio sur TCBS

Salmonelles sur le milieu SS

Mode opératoire :

On ensemence une boite de pétri en faisant des stries ce qui permet d'obtenir des colonies pures et isolées les unes des autres. A l’aide d’une pipette pasteur stérile on prend une seule colonie après avoir flambé la pipette et on fait des stries dans la boite (moitié) puis flamber la pipette et la refroidir, puis tourner la boite 90° puis faire d’autres stries, arrivé au dernier carré, on fait une sorte de S, comme indiqué sur la figure ci-dessus.

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Figure 1: technique d'ensemencement

Figure 2: type de résultat obtenu

3-2- Coloration de gram :

La coloration de Gram est la méthode de coloration la plus utilisée en bactériologie médicale; elle permet de colorer les bactéries et de les distinguer à l'examen direct par leur aptitude à fixer le violet de gentiane (Gram +) ou la fuschine (couleur rose) (Gram -). Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme.

Mode opératoire :

Réaliser un frottis ou un étalement Fixer la préparation à la flamme, sécher soigneusement puis laisser

refroidir la lame. Immerger les lames dans la solution de Violet de Gentiane pendant

1mm. Lavage à l'eau en transvasant les lames Immerger les lames dans du Lugol en les agitant (2 fois pendant 20

seconde) Laver à nouveau à l'eau Décolorer jusqu'à disparition de la couleur violette dans l'alcool en

faisant couler goutte à goutte sur la lame inclinée pendant 45 secondes. Laver à l'eau. Contre colorer avec la solution de fushine pendant 20 à 30 secondes.

Laver à l'eau et sécher à l'air. Observer à l’objectif X100, en immersion avec de l'huile.

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3-3- Test d’oxydase :

Bactérie sur disque oxydase changement de couleur oxydase positive.

Principe :

Si une bactérie possède l'enzyme respiratoire membranaire, appelée la cytochrome oxydase (dernière enzyme de la chaîne respiratoire), alors elle peut faire la réaction d’oxydase qui va colorier les pastilles d’oxydase. Manipulation :

- On prend un disque d’oxydase (0.8 mm de diamètre)

- On met dessus une goutte d’eau stérilisée

- avec une pipette pasteur, on prend une colonie bactérienne et on la met sur le disque -> le test est positif si la colonie devient violette et est négatif si rien ne se passe.

Résultat :

Vibrio oxydase - (en TP les disques oxydase étaient périmés. Le résultat aurait dû être positif pour les vibrio)

3-4- Test de catalase :

Bactérie isolée sur lame + gouttes de H2O2 (eau

oxygénée)

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Figure 3: exemple de bactéries G+ (violet) et de bactéries G- (rose)

Figure 4: pastille carrée d'oxydase (ici oxydase +)

Absence de bulles d’air (réaction) catalase – (pas de réaction)

Présence de bulles d’air catalase + (dégradation de H2O2 selon la réaction suivante) :

H2O2 H2O + ½ O2

Résultat :

3-5- Test sur galerie API 20E:

3-5-1- Présentation de la galerie :

Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 20 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE.

3-5-2- Manipulation :

- On choisit 1 colonie de la souche bactérienne à identifier ;

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- On la met dans ~5 ml d’eau distillée (stérilisée) ;

- A l’aide d’une pipette pasteur stérile, on remplit les cupules avec la suspension bactérienne ;

- pour certains caractères, on ajoute de l’huile de vaseline pour que le produit ne se volatilise pas ;

- Remplir d’eau, les puis du couvercle qui accompagne la galerie, pour éviter l’assèchement de l’eau des galeries, une fois mise en incubation ;

- Après ~ 24 h d’incubation à 37°c, on peut lire le résultat à l’aide du changement de couleur (ou pas) et en se rapportant au catalogue de la galerie

3-5-3- Exemple d’un résultat obtenu après incubation :

IV. TEST DE TOXICITE SUR SOURIS

*Les tests de toxicité permettent entre autres, de :

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- quantifier spécifiquement la toxicité d’un produit chimique pour un organisme ;

- fixer des limites maximales ou tolérables ;

- retirer de la circulation des composés toxiques.

*Les inconvénients de ces tests peuvent se résumer en ce qui suit :

- Ces tests sont des tests dépendants du temps (24 à 96h) ;

- Ne reflètent pas les conditions environnementales ;

- Ces tests sont hautement spécifiques et les résultats ne sont pas forcément extrapolables à d’autres espèces.

4-1- Préparation de la dose à injecter:- On prend 10 grammes de chair ou de l’aliment + 100 ml de TSE (tryptone, sel, eau) ou de l’eau physiologique 9%, ou à défaut, de l’eau distillée stérile- broyage- centrifugation (1000 rpm, +4°c)- on obtient deux phases, avec un surnageant et un dépôt au culot. C’est le surnageant qui peu contenir la toxine- Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre seringue 0,45-0,2mm (voir photo ci-dessus)

- injection du filtrat en une seule dose (500µl), en intrapéritonéale, avec une seringue à aiguille fine et sur des souris de 18-22 gr.

4-2- manipulation des souris :

- Soulever la souris par la queue et la poser sur le toit de la cage, sans lâcher la queue ;

- prendre la souris par les oreilles et la retourner (sans lâcher les oreilles);

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- coincer la queue entre les 2 derniers doigts de la main, tout en maintenant la souris par les oreilles et retournée ;

-la souris s’immobilise, permettant ainsi de faire l’injection intrapéritonéale (voir photo ci-dessus)

4-3- Résultats :*Une seule souris a reçu une dose de toxine botulique très diluée. Elle a

manifesté quelques signes de « début » de paralysie, mais sont état de santé ne semblait pas s’aggraver dans le temps, même après l’ajout d’autres injections (surement à cause de la forte dilution de la toxine).

*Les autres souris ont été injectées avec de l’eau distillée, seulement pour un but pédagogique ; elles n’ont donc manifesté aucun signe d’aggravation de leur état de santé.

V. DOSAGE DES TOXINES PROTEIQUES (METHODE DE BRADFORD) :

5-1- Principe :

La méthode de Bradford est un dosage colorimétrique, basé sur le changement d'absorbance (la mesure se fait à 595 nm), se manifestant par le changement de la couleur du bleu de Coomassie après liaison (complexation) avec les acides aminés aromatiques (tryptophane, tyrosine et phénylalanine) et les résidus hydrophobes des acides aminés présent dans la ou les protéines.

La forme anionique (liée) du colorant est bleue, et possède un spectre d'absorption maximal estimé historiquement à 595 nm. Les formes cationiques (libres) du colorant sont rouges et vertes, absorbant à 465-470 nm. Le

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changement d'absorbance est proportionnel à la quantité de colorant lié, indiquant donc la concentration en protéines dans l'échantillon.

Contrairement aux autres méthodes de mesure des protéines, la méthode de Bradford est moins sensible aux interférences par divers agents présents dans les échantillons de protéine. Elle est toutefois affectée par les détergents, modifiée par le pH, et donne un résultat positif également aux polyphénols hydrosolubles de haut poids moléculaire (tanins).

5-2- Préparation du réactif : bleu de coo massie (R250) (50mg) :

- Alcool- ethanol absolu : 25 ml

- Orthophosphate 80% : 50 ml

- qsp d’eau distillée : Vf: 500 ml

* La coloration bleue doit disparaitre après ajout d’eau.

* Le produit final aura une couleur ~ gris-brun, ensuite c’est le virage vers le bleu qui indique la présence de protéines

* Il faut bien mélanger le produit et le sticker à l’abri de la lumière à +4°c.

5-3- Préparation de la gamme étalon :

Le réactif utilisé pour la préparation de la gamme étalon est les BSA (Serum Albumine Bovine)- On pèse 20mg de BSA (poudre) et on le dilue dans 1ml, puis il est mit dans un microtubule.- nous avons besoin de seulement 1mg/ml de BSA => on prélève 50µl de la première solution et on ajoute 950µl d’eau distillé pour atteindre les 1000µl (1ml)* La gamme étalon choisie, ainsi que les absorbances sont reportées dans le tableau suivant :

N° tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ech

BSA (µg) 0 5 10 20 30 40 50 60 70 80 100 x

H2O (µl) 100 95 90 80 70 60 50 40 30 20 0 50

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Réactif Bradford (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Absorbances 0 0.052 0.127 0.137 0.138 0.162 0.231 0.307 0.312 0.34 0.427 0.38

*Avant la lecture au spectrophotomètre, il faut mélanger les tubes à la main et les incuber à l’abri de la lumière pendant 5 à 10 minutes

* La lecture au spectrophotomètre se fait à la longueur d’onde de 595 nm.

On présente ci-dessous la courbe d’étalonnage :

5-4- Calcule de la concentration de l’achantillon :

*Nous obtenons un très bon coefficient de corrélation (0.927 très proche de 1), ce qui démontre que la gamme étalon a été faite correctement, et cela va nous permettre de calculer la concentration de l’échantillon avec une bonne précision.

*Grâce à la droite de régression nous pouvons calculer la concentration de l’échantillon en connaissant son absorbance, ainsi :

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Equation de la droite de régression :

Y= 0.004 X 0.38 = 0.004 [Ech] [Ech] = 0.38/0.004 [Ech]= 95 µg/µl

ANNEXE :

Présentation de quelques milieux de culture utilisés en TP :

1/ milieu SS :

Gélose Salmonella-Shigella.

Milieu sélectif permettant l’isolement d'entérobactéries pathogènes.

Il est très utilisé pour la recherche de Salmonella dans les selles et les denrées alimentaires peu pour les Shigella car trop sélectif.

Composition :

Formule en g/L d'eau distillée : Extrait de viande de bœufBio-polytoneSels biliaresLactoseCitrate de sodiumThiosulfate de sodiumCitrate ferriqueVert brillantRouge neutreAgarpH = 7,0

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8,5108,58,51

0,330 mg0,02513,5

Lecture :

Colonies rouges : lactose +

Colonies incolores : lactose –

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Colonies à centre noir : H2S +

2/ milieu TCBS :

La gélose TCBS est un milieu sélectif, préconisé par l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé) pour la recherche et l'isolement des vibrions pathogènes présents dans les prélèvements poly microbiens. La forte concentration en bile et en citrate, associée à un pH élevé (pH = 8,6) permet l'élimination de nombreuses bactéries. La croissance des Entérobactéries et des Enterococcus n'est cependant que ralentie.

 

Composition :

Formule en g/L d'eau distillée : 

Peptone de caséine 5,0 gPeptone de viande 5,0 gCitrate de sodium 10,0 gCitrate de fer III 1,0 gBile de bœuf desséchée 8,0 gThiosulfate de sodium 10,0 gNaCl 10,0 gSaccharose 20,0 gBleu de bromothymol 0,04 gBleu de thymol 0,04 gAgar 14,0 gEau distillée (qsp) 1000 mL

3/ gélose BAIRD PARKER :

Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus.

Composition :

Le tellurite et le jaune d'œuf sont ajoutés au milieu au moment de l’emploi.

Formule en g/L d'eau distillée :

 Bio-Trypcase 10Extrait de viande de bœuf 5Extrait de levure 2Chlorure de lithium 5Pyruvate de sodium 10

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Glycocolle 12Tellurite de potassium 1 mLEmulsion de jaune d'œuf à 10 % 1 mLAgar 15   pH = 7,2  

Lecture :

S. aureus donne des colonies :

- noires- brillantes, convexes- de 1 à 2 mm de diamètre- entourées d'un halo clair.La plupart des autres espèces de staphylocoques sont inhibées ou ne produisent pas de colonies caractéristiques en 24 heures.

Les microcoques, Bacillus et quelques levures peuvent pousser sur ce milieu.

4/ milieu SABOURAUD :

La gélose de Sabouraud constitue un milieu classique pour la culture, l'isolement et l'identification des levures et des moisissures saprophytes ou pathogènes.

Elle est recommandée essentiellement pour l'isolement des moisissures dans les prélèvements peu chargés en bactéries, les contrôles de stérilité des produits pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires, la culture des moisissures en vue de réaliser leur identification.

Dans le cas de prélèvements fortement contaminés, il est préférable d'utiliser la gélose Sabouraud + chloramphénicol.

Composition :

En g par litre de milieu : 

Peptone pepsique de viande 10Glucose  35Agar agar 15

 pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 5,7 +/- 0,2.500 g de poudre permettent de préparer 8,3 litres de milieu

5/ gélose lactosée au desoxycholate 0.1% :

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Milieu de dénombrement des coliformes en microbiologie alimentaire (analyse des eaux et des aliments).

Il sera incubé à 37°C pour la recherche des coliformes totaux et à 44°C pour la recherche des coliformes thermotolérants.

Composition :

Formule en g.L-1 d'eau distillée : PeptoneLactoseCitrate de sodiumRouge neutreDésoxycholate de sodiumChlorure de sodiumHydrogénophosphate de potassiumAgar pH = 7,3

10101

0.0315213  

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