Cofinancé avec lappui de lUnion européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans...

Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER

Programme Espace Atlantique« Investir dans notre futur commun »

Djamel Drider – Ph.D

Unité de Recherche Biotechnologie de la ReproductionONIRIS - Nantes

02 51 78 55 42 ou 02 40 68 76 46

E-mail [email protected]

Quimper / 18 Novembre 2010



La divercine V41une bactériocine utilisable dans les

domaines de la sécurité alimentaire et de

«l’antibiothérapie »

Les travaux présentés dans le cadre de cette présentation ont été

réalisées au laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle de l’ENITIAA de Nantes.

Grand Merci à tous les étudiants et collègues avec qui j’ai pu travailler sur ce projet



Problématique scientifique

Recrudescence de la multirésistance bactérienne aux antibiotiques

conventionnels

Sécurité microbiologique des alimentsMultiplication des infections

bactériennes- Campylobacter jejuni- Listeria monocytogenes- Salmonella enterica


Programme Espace Atlantique« Investir dans notre futur commun »Figure extraite de Quadri Figure extraite de Quadri et alet al. .

Infect Disord Drug Targets. 2007 Sep;7(3):230-237Infect Disord Drug Targets. 2007 Sep;7(3):230-237

Augmentation de l’incidence des infections à bactéries multirésistantes



Diminution du nombre de nouvelles molécules antibiotiques

Figure extraite de Belguesmia-Naghmouchi-Chihib-Drider Figure extraite de Belguesmia-Naghmouchi-Chihib-Drider In Drider and Rebuffat – Springer 2011In Drider and Rebuffat – Springer 2011



Autorité européenne de sécurité des aliments (European Fodd Safety Authorithy)

En 2008

190566 cas d’infections à Campylobacter

131468 cas d’infections à Salmonella

1381 cas d’infections à Listeria

Campylobacter Salmonella Listeria

2006

2007

2008



Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont:

– - synthétisées par voie ribosomique (RPS)

– - secrétées dans le milieu extracellulaire…

L’activité bactéricide est dirigée contre des souches taxonomiquement proches de l'organisme producteur mais ….

Définition des bactériocines



– Classe I / modifications post-traductionnelles– Acides aminés inhabituels (Lanthionines et β-

methyllanthionine) – Lantibiotiques (Nisine) / additif alimentaire EC 234

Principales classes des bactériocines

Structure 3D de la nisine (Hsu et al., 2004)




Helvéticine J Lactobacillus helveticus

Zoocine A Streptococcus zooepidermicus

Entérolysine A Enterococcus faecalis

Milléricine B Streptococcus milleri

Linocine M18 Brevibacterium linens

Classe III / Bactériolysines- - PM > 10kDa - - Thermolabiles - - Agissent sur la paroi bactérienne en hydrolysant le

peptidoglycane




Classe II / - - Peptides non lantibiotiques (pas d’acides aminés modifiés)- - PM < 10kDa

- - Stables à la chaleur et aux pH extrêmes

- Lactoccine A- Entérocine AS-48- Carnocycline A- Lactocycline Q

- Entérocine L50A/L50B- Lactococcine G- Lactococcine Q

- Pédiocine PA-1- Divercine V41- Entérocine A

Classe IIdClasse IIcBactériocines

circulaires

Classe IIbBactériocines à

deux composantes

Classe IIaPediocin-like



Structure secondaire des bactériocines de classe IIa

Pédiocine box

Feuillet β

Hélices α

N C

YGNGV

KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC

Pédiocine PA-1

Henderson et al., 1992



Structure 3D des bactériocines de classe IIa

Curvacine A

-En région N-terminale : Structure en coude β, portant le motif

YGNGVxCx4C.

- En région C-terminale : Hélices α hydrophobes qui interagissent avec la membrane

NC

Haugen et al., 2005

YGNGV



Mode d’action des bactériocines de classe IIa

Formation de pores Récepteur membranaire



Milieu extracellulaire

Milieu intracellulaire

Agrégation et formation du pore

Mort cellulaire



K+, Acide aminés, phosphate

inorganique, ATP

Modèle de Wedge

+--

+


Naghmouchi Drider and Fliss I.(2007)

J. Applied Microbiology. 102:1508-17.





Récepteur membranaire

Héchard et al., 2001. Microbiology 147, 1575-80

Drider et al., 2006. Microbiol Mol Biol Rev. 70, 564-82.



Voie de synthèse

Spectre d’action

Concentration requise pour l’activité

Différences entre bactériocines et antibiotiques !

Ingolf Nes in Drider and Rebuffat. (2011)



Divercine V41 / modèle d’investigation

Bactériocine de classe IIa

Carnobacterium divergens V41 (bactérie lactique isolée de viscères de poisson)

La divercine V41 possède:

- une activité anti-Listeria très élevée - deux ponts disulfure importants pour l’activité antibactérienne- des acides aminés essentiels : tyrosine (Y) et tryptophane (W)

TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC



Etude structure fonction

Clivage par une endoprotéase Asp-N

N-term hydrophile C-term hydrophobe

Bhugaloo-Vial et al., 1999 (Appl. Environ. Microbiol.)

Activité anti-ListeriaPas d’activité anti-Listeria

Rôle important des acides aminés aromatiques

1 Trp

3 Tyr

Réduction chimique des ponts disulfures perte de l’activité anti-Listeria

une perte totale de l’activité



DvnRV41 AMDPTKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC

W19F TKYYGNGVYCNSKKCWVD F GQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKCQ21S TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGSASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKCA22G TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQGSGCIGQTVVGGWLGGAIPGKCS23Y TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQAYGCIGQTVVGGWLGGAIPGKCV30F TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTFVGGWLGGAIPGKC L35F TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWFGGAIPGKC A38V TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGVIPGKC P40V TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIVGKC

1 10 20 30 40

Synthèse des variants structuraux de DvnRV41

Aa / Divercine V41 Aa / bactériocines de classe IIa

Rihakova J, Petit VW, Demnerova K, Prévost H, Rebuffat S, Rihakova J, Petit VW, Demnerova K, Prévost H, Rebuffat S, Drider D.Drider D. (2009)(2009)

Appl Environ Microbiol.75:1811-1819Appl Environ Microbiol.75:1811-1819



PeptidesAcide aminé

Changé L. monocytogenes EGDe

DvnRV41 None 0.1 ± 0.01

variant 1 W19F 21.1 ± 0.9

variant 2 Q21S 18.3 ± 0.9

variant 3 A22G 8.6 ± 0.01

variant 4 S23Y 0.1 ± 0.01

variant 5 V30F 1.3 ± 0.4

variant 6 L35F 0.7 ± 0.2

variant 7 A38V 1.5 ± 0.4

variant 8 P40V 2.5 ± 0.9

DvnRV41 et variants structuraux / CMIs (µg/ml) de

Rihakova J, Petit VW, Demnerova K, Prévost H, Rebuffat S, Rihakova J, Petit VW, Demnerova K, Prévost H, Rebuffat S, Drider D.Drider D. (2009)(2009)

Appl Environ Microbiol.75:1811-1819Appl Environ Microbiol.75:1811-1819



Consommation de saumon

Produit de consommation quotidienne !

En France la consommation [20,000,000 kgs/an] (augmentation de la consommation nationale d’un facteur de 6 depuis 1980

Production UE est leader dans le monde [80%]

Production Française (40 entreprises / 300,000,000 €)

Sources bibliographiques variées et à actualiserSources bibliographiques variées et à actualiser



Contamination des aliments et infection

100 bactériesGramme d’aliment

RisqueInfection

ListériosesTraitement

Production deDvnV41

Tirer

Cb. divergens V41

L. monocytogenes



Mic

roflore

d

u s

au

mon

fu

mé Les Bactéries à Gram Négatif

Les Bactéries à Gram Positif

A la sortie de l’usine / La contamination des produits peut atteindre 102 à 106 UFC/g (Unités formant colonies)

La microbiologie du saumon




Les bactéries à Gram Négatif

Les bactéries à Gram Négatif

Photobacterium phosphoreum Shewanella putrefaciens Vibrio spp. Serratia liquefaciens

Acetinobacter spp. Hafnia alvi

Enterobacter agglomerans Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas spp. Moraxella spp. Aeromonas spp

Après le fumage et au moment du conditionnement




-Altération des qualités organoleptiques du poissonPoissons frais: Le Cabillaud, Lee Hareng, Le BarPoissons fumés: Le Saumon-Production de TMA (Triméthylamine)-Production d’H2S et odeurs putrides dans le saumon fumé

Shewanella putrefaciens

Impact de la Flore à Gram Négatif

Photobacterium phosphoreum

-Altération des qualités organoleptiques du poisson*Emballé sous atmosphère modifiée et calamar-Production de TMA (Triméthylamine)-Production d’amines biogènes (histamine)




Les bactéries lactiques

Les Bactéries à Gram Positif

Brochotrix thermosphacta

Carnobacterium piscicola Carnobacterium divergens Lactobacillus alimentarius Lactobacillus bavaricus Lactobacillus curvatus Lactobacillus homohiochii Lactobacillus casei subsp. tolerans Lactobacillus coryneformis Lactobacillus farciminis Lactobacillus plantarum Lactobacillus sakei Lactococcus sp. Leuconostoc carnosum Leuconostoc mesenteroides




• Maladie à déclaration obligatoire depuis 1998

• 17 décès au Canada (Eté 2008)

• Taux de mortalité avoisinant les 30 % chez la femme enceinte

• 220 cas sporadiques de listériose recensés par an en France.

La listériose

Informations génériques disponibles en ligneInformations génériques disponibles en ligne



Bactérie à Gram positif, distribution ubiquitaire Températures de développement 4 à 45°C. Concentrations en NaCl tolérées 10 à 20%.

Cette bactérie à des capacités d’adaptation extraordinairesGandhi M, Chikindas ML.Gandhi M, Chikindas ML.Int J Food Microbiol. 2007 Jan 1;113(1):1-15. Epub 2006 Sep 28. Int J Food Microbiol. 2007 Jan 1;113(1):1-15. Epub 2006 Sep 28. Review.Review.

Systématique et bactériologie

Listeria monocytogenes

Colonies typiques sur gélose sélective

http://en.wikipedia.org/wiki/Listeria_monocytogenes



Relation listériose et consommation de saumon ou de truite fumés

Suède 9 personnes touchées dont 2 décès

Finlande: 23 cas de listériose ont été recensés en Finlande entre juin 1999 et Février 2000, probablement liés à l’ingestion de poisson fumé ou salé à froid.

Normes !Pas d’accord international sur le niveau acceptable de L. monocytogenes

Remarque / En France et dans d’autres pays Européens, la législation tolère jusqu’à 100 UFC/g dans le saumon fumé à la DLC à condition que les entreprises ait effectué des études vieillissement de leurs produits prouvant que le seuil de 100 UFC/g n’est jamais dépassé à la DLC. (AFSSA, 2000; DGAL N98/N°8088, 1998).



Inhibition de L. monocytogenes dans le saumon fumé

(BRILLET et al, 2004. JAM. 97: 1029-1037)

Listeria monocytogenes

L. monocytogenesCb. divergens V41

0

1

2

3

4

5

6

0 7 14 21 28

Temps (jours)

log1

0 (U

FC/

g s

au

mon

)

1 UFC/g



Origine de cette inhibition ?

Action inhibitrice de DvnV41 (in situ)?

Compétition nutritionnelle entre L. monocytogenes et Cb. divergens V41 ?

Isolement et caractérisation d’une souche mutante déficiente dans la production de la divercine V41



1 2 3

Souche cible = Listeria

monocytogenes

Antagonisme microbien par production de peptideTest de diffusion sur boite

Souche 1Cb. divergens NCDO2763

(contrôle)

Souche 3Cb. divergens V41C9

(souche mutante)

Souche 2Cb. divergens V41(souche sauvage)

Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003Lett Appl Microbiol. 36:288-292.Lett Appl Microbiol. 36:288-292.



Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3

DO

40

5 n

m


(contrôle)


(souche mutante)





400 pb

300 pb

200 pb

1 2 3

Approche moléculaire (Amplification et séquençage du gène

dvnV41


(contrôle)


(souche mutante)





0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 5 10 15 20 25 30 35

Time (days)

log

(U

FC

/g s

alm

on

)

L. monocytogenes

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 5 10 15 20 25 30 35

Time (days)

log

(U

FC

/g s

alm

on

)

L. monocytogenes + C.b divergens V41C9

Souche mutante

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 5 10 15 20 25 30 35

Time (days)

log

(U

FC

/g s

alm

on

)

L. monocytogenes + Cb. divergens V41

Souche sauvage

Ric

hard

C, B

rille

t A

, Pile

t M

F, P

révost

H,

Ric

hard

C, B

rille

t A

, Pile

t M

F, P

révost

H,

Dri

der

D. 20

03

Dri

der

D. 20

03

Lett

Appl M

icro

bio

l. 3

6:2

88-2

92

.Le

tt A

ppl M

icro

bio

l. 3

6:2

88-2

92

.



J0 J13 J20 J27

0102030405060708090100

% C. divergens V41

autres Carnobacterium ssp

Suivi de l’implantation de C. divergens V41, parmi la flore lactique du saumon fumé inoculé,

par la technique de PCR-Multiplex

Sur colonies de la flore lactique

Connil N, Prévost H, Dousset X. 2002. J Appl Microbiol.92:611-617.



Expériences sur les animaux (souris, Balb/c) ont été réalisées dans le respect des principes éthiques

fondamentaux.

Activité In-vivo de la divercine recombinante

Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564.Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564.



Stratégie expérimentale sur modèle murin « in vivo »

Utilisation DvnRV41 et peptides altérés (W19, Q21, A22, P40)

Protocole expérimental (Ingham et al. 2003; modifié)




T= 0: Injection iv. de L. monocytogenes EGDe 1,5 x 103 UFC/ml

T= 30 min : Injection iv de peptides (2 µg/50 µl)

Peptides injectés (DvnRV41; W19F; Q21S, A22G, P40V)

Groupes 1 à 5 / (Post challenge test)



T= - 15 min: Injection iv de peptides (2 µg/50 µl)

T= 0 min : Injection iv de L. monocytogenes 1,5 x 103 UFC/ml

Groupes 6 – 10 / (Pré challenge test)




OBSERVATION des souris pendant 72 heures

- Diarrhée- Vomissement- Dépression

Euthanasie par dislocation cervicale

- Extraction organe (rate)- Isolement et dénombrement de L.

monocytogenes




Résultats Groupes 1-5 / (Post- challenge test)

3.23 ±1.881/5 (20)2 / (30)1.5 x 1035P40V5

3.14 ± 2.932/5 (40)2 / (30)1.5 x 1035A22G4

3.10 ± 2.932/5 (40)2 / (30)1.5 x 1035Q21S3

4.41 ± 2.461/5 (20)2 / (30)1.5 x 1035W19F2

0.97±2.174/5 (80)2 / (30)1.5 x 1035DvnRV411

nombre UFC (Log10)/rate)

Nombre des souris avec la

culture négative /

totale ; exprimé en

(%)

Quantité de peptide

µg /temps (min)

Quantité de L. monocytogen

es EGDe introduite

Nombre de

sourisinfecté

es

PeptideGroup

e

6.25 ± 0.190/5 (0)1.5 x 1035NC11

NC = contrôle négatif




Résultats Groupes 6-10 / (Pré challenge test)

4.25 ±2.381/5 (20)2/ (15)1.5 x 1035P40V10

4.43 ± 2.501/5 (20)2 / (15)1.5 x 1035A22G9

2.83 ± 2.752/5 (40)2 / (15)1.5 x 1035Q21S8

3.92 ± 2.321/5 (20)2 / (15)1.5 x 1035W19F7

3.13 ±2.86

2/5 (40)2/ (15)1.5 x 1035DvnRV41

6

nombre CFU (Log10)/rate)

Nombre des souris avec la

culture négative /

totale ; exprimé en

(%)

Quantité de peptide

µg /temps (min)

Quantité de L.

monocytogenes EGDe introduite

Nombre de

sourisinfecté

es

PeptideGroup

e

6.25 ± 0.19

0/5 (0)1.5 x 1035CN11CN = contrôle négatif




Publicité et bonnes œuvres

Société Française des Peptides [email protected] ou [email protected]

Third International Symposium on Food, Veterinary and Medical Applications (Lille 2012)[email protected] ou [email protected]

Procaryotic antimicrobial peptides: from genes to biotechnologies. Edited by D. Drider and S. Rebuffat. (Springer, NY-USA. 2011)

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