Caroline SAURET - obs-banyuls.fr

THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE

Spécialité

Microbiologie environnementale

Ecole Doctorale Sciences de l’Environnement d’Ile de France (ED129)

Présentée par

Caroline SAURET

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR de L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE

ECOLOGIE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES MARINES SOUMISES

A UNE POLLUTION PETROLIERE

Influence des facteurs environnementaux, de la prédation et de la

récurrence des pollutions

Soutenue le 15 décembre 2011

Devant le jury composé de :

M. Robert Duran, Professeur, Pau Rapporteur

M. Télesphore Sime-Ngando, Directeur de Recherches, Clermont-Ferrand Rapporteur

M. Stéphane Blain, Directeur de Recherches, Banyuls sur mer Examinateur

Mme Madeleine Goutx, Directeur de Recherches, Marseille Examinatrice

Mme Urania Christaki, Professeur, Lille Examinatrice

M. Jean-François Ghiglione, Chargé de recherche, Banyuls sur mer Directeur de thèse

M. Daniel Delille, Ingénieur de Recherches HDR, Banyuls sur mer Directeur de thèse

THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE

Spécialité

Microbiologie environnementale

Ecole Doctorale Sciences de l’Environnement d’Ile de France (ED129)

Présentée par

Caroline SAURET

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR de L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE

ECOLOGIE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES MARINES SOUMISES

A UNE POLLUTION PETROLIERE

Influence des facteurs environnementaux, de la prédation et de la

récurrence des pollutions

Soutenue le 15 décembre 2011

Devant le jury composé de :

M. Robert Duran, Professeur, Pau Rapporteur

M. Télesphore Sime-Ngando, Directeur de Recherche, Clermont-Ferrand Rapporteur

M. Stéphane Blain, Directeur de Recherche, Banyuls sur mer Examinateur

Mme Madeleine Goutx, Directeur de Recherche, Marseille Examinatrice

Mme Urania Christaki, Professeur, Lille Examinatrice

M. Jean-François Ghiglione, Chargé de recherche, Banyuls sur mer Directeur de thèse

M. Daniel Delille, Ingénieur de Recherche HDR, Banyuls sur mer Directeur de thèse

« Le provisoire est le statut définitif de la science »

Marcel Conche

A mon grand-père.

Remerciements

Voici donc le moment tant attendu et tant redouté des remerciements. Comment

résumer en quelques lignes ces quatre années passées à Banyuls et n’oublier personne ?

Maintenant que je suis arrivée au bilan, je me rends compte que beaucoup de gens ont croisé

mon chemin et contribué de près ou de loin à l’élaboration de cette thèse. Je remercie par

avance tous ceux qui n’apparaitront pas dans cette page.

Ma thèse s’est déroulée au laboratoire Arago de Banyuls sur mer, au LOMIC.

J’exprime toute ma gratitude à Philippe Lebaron, Jean-Marc Guarini d’abord et Stéphane

Blain ensuite pour m’avoir permis d’y travailler. Je n’aurais pu espérer mieux comme cadre

de travail.

Je remercie également Stéphane Blain pour avoir accepté de présider mon jury de

thèse.

J’adresse toute ma gratitude à Robert Duran et Télesphore Sime-Ngando pour

m’avoir fait l’honneur d’être les rapporteurs de cette thèse, ainsi qu’à Madeleine Goutx et

Urania Christaki qui ont accepté d’examiner mon travail et avec qui j’ai eu le bonheur de

collaborer sur plusieurs projets scientifiques.

Je ne saurais comment remercier mes directeurs de thèse, Daniel Delille, pour avoir

accepté de diriger cette thèse et surtout Jean-François Ghiglione qui m’a encadrée durant

mon master, puis mon doctorat. Je te remercie Jeff pour la confiance que tu as su instaurer

entre nous, ta pédagogie, ta présence et ton enthousiasme de chaque instant. A mon arrivée à

Banyuls, je n’étais pas sure de vouloir faire une thèse. C’est toi qui m’en a donné le goût et

qui a fait en sorte que cela se réalise. Merci pour cette belle expérience, ces quatre ans sans

nuage ; je ne suis pas sure que tous les doctorants puissent en dire autant. Encore merci.

Je remercie également les personnes qui ont contribué scientifiquement à cette thèse.

Je pense en particulier à Gilles Vétion pour toute la partie chimie à Banyuls. Gilles, c’est un

plaisir de travailler avec toi. Je pense aussi à Cathy et Marc, avec qui j’ai passé de très bons

moments à Marseille (sur le Seawake II et ailleurs) et pour tous leurs conseils avisés.

Daniela, je t’envoie mes remerciements à l’autre bout du monde, merci pour ton grand

professionnalisme et ta sympathie. Agathe, je te remercie pour ton implication dans

l’expérience en mésocosmes et pour ta gentillesse. Enfin, merci à toi Raphaël, pour ta

précieuse aide pour la qPCR et aussi à toi Sonja pour m’initier aux joies du pyroséquençage.

Je remercie les personnes qui m’on permis de participer à des missions scientifiques :

Xavier Durrieu de Madron pour CASCADE et Chritian Grenz pour le Mexique. Merci Pascal

pour m’avoir accompagnée dans cette mission oh ! combien dépaysante. Je n’oublie pas mes

partenaires d’Atalante, Jocelyne, Tatiana, Marina, et les autres.

J’adresse mes remerciements à l’équipe FLUMECO, Pascal, Audrey, François, pour

m’avoir donné l’occasion de donner des conférences et animer des TP/TD avec une grande

liberté. Ce fut une expérience très enrichissante pour moi.

Je remercie bien sûr toute l’équipe microbio, en particulier tous ceux que je suis

venue déranger pour des questions de débutante : Nyree, Cécile, Clémence, Laurent,

Delphine, Nicole et les autres. Les pauses-café, c’était sympa aussi. Cette année encore, il y

aura une session macarons, c’est promis.

Et puis, j’ai tous mes amis proches et moins proches à remercier, ça fait du monde !

Par ordre d’apparition chronologique (comme ça il n’y aura pas de jaloux), je remercie mes

amis de M2 : Aude, Moinchami, Barbara, Arturo, Guillaume ; j’espère qu’on gardera

contact. Qu’aurait été ma thèse sans ma petite Rozenn, la complice de chaque instant. Qu’est

ce qu’on a pu rigoler, merci pour tout ça. Solveig aussi, je te remercie, tu as toujours le

sourire, c’est magique. Merci à Sabine, toi aussi tu as toujours le sourire, je ne sais pas

comment vous faites les filles ! Merci pour votre soutien inconditionnel et votre gentillesse.

Quand est ce qu’on retourne à la zumba ? C’est à mon tour de te remercier, Mélissa, pour

nos discussions philosophiques. Une grand merci général à, Raph, Loubet, Anaïs, Camille,

Rémy, Marion, Matt, Sabrina, Sophie, Damien, Sébastien, et tous les autres, pour tous les

bons moments passés ensemble. Vivement la reprise des soirées jeux de société et des week-

ends dans les Corbières. Je dis un grand merci à mes « nouvelles » copines, Marine (qui ne

pourra pas assister à ma soutenance de thèse pour une obscure raison, mais je t’aime quand

même), Alicia pour ton tempérament et ta joie de vivre, Julie, mon petit bisounours préféré et

Chloé pour ta contribution à IBISCUS et pour ton soutien sur le bateau bien sûr mais surtout

pour ton amitié. Vous êtes des « vraies » filles, ça fait du bien ! Je remercie aussi d’avance

les nouvelles recrues qui vont devoir me supporter l’année prochaine : Tatiana, Marine,

Nathalie…

Aller, je te consacre un petit paragraphe, ma Chacha, le futur prix Nobel de médecine.

Tout ne rentrerait pas dans ces quelques lignes alors je te dis simplement merci, tu sais ce

qu’il y a derrière.

J’ai aussi une pensée particulière pour mon oncle, Philippe, sans qui je n’aurais peut

être pas eu l’idée de faire des études aussi longues et qui m’a toujours soutenue, ainsi que

pour mon parrain qui a toujours été présent malgré la distance, tu es la crème des parrains

Foinou. Je pense aussi à tous les membres de ma famille qui ont suivi ma thèse de loin : ma

Lolo bien sûr, tu es bien plus qu’une cousine, Adrien, les Tatis, les Tontons et tous les

autres…

Je ne pourrais clore ces remerciements sans citer mes grands parents, qui, seront fiers

de leur petite fille, et mes parents, Marie-Noëlle et Pierre. J’aurais pu choisir n’importe quel

métier, vous m’auriez soutenue, et vous continuez à le faire malgré mes 27 ans bien sonnés.

Un grand merci à vous. Je remercie également mes deux petits bouts qui ne sont plus si petits

que ça. Ma Dadi pour sa joie de vivre et son insouciance et mon Cola, mon futur médecin

préféré, vous êtes mes deux rayons de soleil. Vous savez combien je vous aime tous les

quatre…

Et puis je finirai par une pensée pour mon grand-père, Gabriel, qui aurait adoré lire

cette thèse mais je sais que tu la liras là-haut…

TABLE DES MATIERES

Chapitre 1 : Etat de l’art ..................................................................................................... 15

1. La pollution pétrolière : un problème toujours d’actualité ................................................15

2. Les communautés bactériennes au sein des écosystèmes marins pélagiques et leur réponse

face à un apport de pétrole .........................................................................................................23

2.1. Ecologie des bactéries marines totales et hydrocarbonoclastes ..................................................... 23

2.2. Le métabolisme des hydrocarbures ............................................................................................. 29

2.3. Le pétrole parmi les facteurs de contrainte des communautés bactériennes marines ...................... 31

3. Impact des facteurs environnementaux sur les communautés bactériennes contaminées

par les pétroles et sur la biodégradation des hydrocarbures .....................................................37

3.1. Facteurs abiotiques ..................................................................................................................... 38

3.1.1. Composition et concentration du pétrole ............................................................................. 38

3.1.2. Production de biosurfactants ............................................................................................... 41

3.1.3. Rayonnement UV, température, salinité, ressources en oxygène et pression......................... 43

3.1.4. Ressources en sels nutritifs (« bottom-up ») ........................................................................ 46

3.1.5. Récurrence de la pollution .................................................................................................. 49

3.2. Les facteurs de type « top-down » ............................................................................................... 50

3.2.1. Dynamique de l‘abondance des protozoaires, des virus et des bactéries ............................... 51

3.2.2. Impact des protozoaires et des virus sur la structure des communautés bactériennes ............ 53

3.2.3. Impact des protozoaires et des virus sur l‘activité bactérienne ............................................. 55

3.2.4. Mécanismes de résistance bactériens et interactions virus - protozoaires .............................. 60

4. La bioremédiation des hydrocarbures pétroliers ...............................................................62

4.1. Comment remédier à la pollution pétrolière ? .............................................................................. 62

4.2. Addition de microorganismes hydrocarbonoclastes : la bio-addition ............................................ 68

4.3. Fertilisation organique et inorganique : la biostimulation ............................................................. 70

5. Evolution récente des méthodes d’étude des communautés microbiennes marines totales

et hydrocarbonoclastes................................................................................................................76

5.1. Dénombrement des bactéries totales et hydrocarbonoclastes ........................................................ 77

5.2. Etude de la diversité ................................................................................................................... 79

5.3. Mesure d‘activité bactérienne totale et hydrocarbonoclaste .......................................................... 88

5.4. Lien diversité / activité ............................................................................................................... 90

6. Objectifs de la thèse .............................................................................................................95

Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines

............................................................................................................................................ 99

1. Préambule ............................................................................................................................99

2. Article 1: Spatial and temporal variations of bacterial community structure and PAH-

degrading bacterial abundance in Mediterranean harbors subjected to various PAH-pollutant

levels. .........................................................................................................................................101

Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport

de pétrole et à la biostimulation. ....................................................................................... 133

1. Préambule ......................................................................................................................... 133

2. Article 2: Influence of pollution history on the response of coastal bacterial and

nanoeukaryote communities to crude oil and biostimulation assays. ...................................... 135

Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de

pétrole ............................................................................................................................... 161

1. Préambule ......................................................................................................................... 161

2. Article 3: Strong evidence of top-down control on biostimulated diesel-degrading

bacterial communities ............................................................................................................... 163

Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope

Probing. ............................................................................................................................ 197

1. Préambule ......................................................................................................................... 197

2. Chapitre de livre: Monitoring of oil-degrading bacteria by stable isotope probing. ....... 199

3. Article 4: Dominance of Cycloclasticus sp. as key phenanthrene degrader in pristine and

chronically oil polluted coastal seawaters revealed by DNA-stable isotope probing and massive

pyrosequencing. ........................................................................................................................ 215

Chapitre 6 : Discussions générales et perspectives............................................................ 239

1. Quelle est l’importance de la richesse bactérienne spécifique dans la biodégradation des

hydrocarbures ? ........................................................................................................................ 239

2. Comment améliorer la bioremédiation des hydrocarbures ? .......................................... 243

3. Quel est l’impact du « top-down » sur la biodégradation des hydrocarbures et sa relation

avec le contrôle de type « bottom-up » ? .................................................................................. 245

4. Comment caractériser les assemblages microbiens impliqués dans la dégradation du

pétrole ? ..................................................................................................................................... 247

GLOSSAIRE ..................................................................................................................... 249

REFERENCES ................................................................................................................. 251

ANNEXE .......................................................................................................................... 283

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX

Hors articles :

Figure 1: Principales contributions annuelles pour la pollution pétrolière mondiale entre

1990 et 1999 (en pourcentages), adapté du rapport du National Research Council

(NRC) de 2003. ....................................................................................................... 16

Figure 2 : Principaux accident pétroliers de 1970 à 2010 (Jernelöv 2010). .......................... 17

Figure 3 : Différents exemple de pollution pétrolière de grande ampleur. ............................ 19

Figure 4 : Processus abiotiques et biotiques conduisant à l’élimination naturelle du pétrole

en milieu marin....................................................................................................... 22

Figure 5 : Schéma conceptuel des réseaux trophiques microbiens dans les systèmes

aquatiques pélagiques. Bianchi et al. (1988) ........................................................... 24

Figure 6 : Arbre phylogénétique basé sur le maximum de vraisemblance du domaine des

bactéries. Les phyla sont distingués par la couleur de leur branche et les noms

d’espèces indiquées en rouge appartiennent à la GEBA (Genomic Encyclopedia of

Bacteria and Archaea) (Wu et al. 2009) . ................................................................ 26

Figure 7 : Phylogénie des principaux groupes de bactéries hydrocarbonoclastes marines. En

bleu, les microorganismes qui dégradent les hydrocarbures saturés, en rouge, ceux

qui dégradent les hydrocarbures aromatiques polycycliques et en noir les bactéries

non-dégradantes. .................................................................................................... 27

Figure 8 : Mécanisme général de dégradation aérobie des hydrocarbures par les

microorganismes (Das et al. 2011). ........................................................................ 30

Figure 9 : Diagramme schématique représentant les tendances générales observées dans de

nombreuses études après un apport de pétrole : des changements dans la

composition du pétrole accompagnés par des changements dans l’abondance des

organismes hydrocarbonoclastes clés (Head et al. 2006). ....................................... 35

Figure 10 : Schéma conceptuel des facteurs abiotiques et biotiques pouvant affecter les

communautés bactériennes touchées par la pollution pétrolière et in fine la

biodégradation. ...................................................................................................... 37

Figure 11 : Composés hydrocarbonés et non hydrocarbonés présents dans les pétroles bruts

(Bianchi et al. 1988). .............................................................................................. 39

Figure 12 : Exemple de dégradation d’un pétrole (Head et al. 2006). .................................. 39

Figure 13 : Alternance proie-prédateur entre les abondances bactériennes, virales et/ou de

protozoaires illustrant la dynamique du « killing the winner ». .............................. 52

Figure 14 : Principaux mécanismes d’interactions identifiés entre les bactéries, les HNF et

les virus (Miki et al. 2008; Berdjeb 2010). .............................................................. 61

Figure 15 : Exemple de biofilm formé par Rhodococcus corynebacterioides sur un support

chitineux incubé avec 0, 25% de kérosène (v/v) pendant 120 h vu au microscope

scanner à électron (Gentile et al. 2006). ................................................................. 69

Figure 16 : Historique et évolution étape par étape de l’Ecologie microbienne durant les 50

dernières années (Maron et al. 2007). .................................................................... 76

Figure 17 : Exemple de profil de CE-SSCP avec assignation des pics par construction d’une

banque de clone et migration individuelle des clones. Chaque pic de CE-SSCP (à

gauche) correspond un clone (à droite) qui a été affilié phylogénétiquement

(Rodríguez-Blanco et al. 2009). .............................................................................. 83

Figure 18 : Principe de fonctionnement du pyroséquençage automatisé ultra-haut débit. .... 85

Figure 19 : Exemple d’expérience de microarray avec ADNc. ............................................. 87

Figure 20 : Principe des activités enzymatiques extracellulaires chez les bactéries (selon Van

Wambecke, communication personnelle). ............................................................... 88

Figure 21 : Exemple d’activité hydrolytique extra-cellulaire : la glucosidase. ..................... 89

Figure 22 : Protocole d’expériences en métagénomique, métatranscriptomique et

métaprotéomique. Inspiré de (Shelswell 2006; Maron et al. 2007; Moran 2009). ... 91

Figure 23 : Méthodes d’identification des microorganismes par l’utilisation de radio-isotopes

(Dumont et al. 2005). ............................................................................................. 92

Figure 24 : Schéma synthétique représentant les différentes possibilités pour le marquage des

biomolécules par des isotopes stables (Gutierrez-Zamora et al. 2010). ................... 92

Figure 25 : Ensemble des méthodes utilisables pour l’étude des communautés bactériennes

impliquées dans la dégradation des hydrocarbures en milieu marin. Adapté de Weiss

et al. (2008). ........................................................................................................... 93

Figure 26 : Sites d’échantillonnage de l’étude en Baie de Marseille. ................................. 100

Figure 27 : Photo des erlenmeyers ayant servis à l’incubation des bactéries avec le

phénanthrène marqué au 13

C durant l’expérience de DNA-SIP. Les erlenmeyers les

plus jaunes sont ceux dans lesquels les bactéries hydrocarbonoclastes se sont

développées. ......................................................................................................... 198

Figure 28 : Principe général de l’expérience de dilution-extinction.................................... 240

Figure 29 : Mesures d’activités enzymatiques extracellulaires dans les 11 dilutions

différentes. Protocole indiqué dans l’article 3 de ce manuscrit. ............................ 241

Figure 30 : Evolution des profils CE-SSCP dans les différentes dilutions successives, avant et

après ajout de phénanthrène. En rouge, sont représentés les nombres de ribotypes

détectés dans chaque profil. Ce nombre diminue au cours de dilutions et diminue

encore dans chaque dilution après ajout de phénanthrène. ................................... 242

Tableau 1 : Dégradation des hydrocarbures in situ et in vitro (Bianchi et al. 1988). ............ 21

Tableau 2 : Proportions des différentes familles d’hydrocarbures dans quelques pétroles

couramment utilisés (Bianchi et al. 1988). .............................................................. 40

Tableau 3 : Biosurfactants/bioémulsifiants polymériques (en haut) et glycolipidiques (en bas)

produits par différents types de microorganismes marins (Satpute et al. 2010). ...... 42

Tableau 4 : Efficacité de différents agents d’induction de lyse virale sur des bactéries marines

(Jiang et al. 1996). ................................................................................................. 53

Tableau 5 : Aperçu des études sur le « top-down control » en milieu marin pollué par les

hydrocarbures. ....................................................................................................... 59

Tableau 6 : Liste des 33 substances prioritaires établie dans la circulaire DCE 2007/20 du

05/03/07 relative à la constitution et la mise en œuvre du programme de surveillance

pour les eaux littorales en application de la directive 2000/60/CE du 23 octobre

2000 du Parlement et du Conseil établissant un cadre pour une politique

communautaire dans le domaine de l’eau. En rouge, les molécules potentiellement

présentes dans les pétroles...................................................................................... 65

Tableau 7 : Composants des fertilisants utilisés ou testés comme agents de bioremédiation

(Prince 1993). ........................................................................................................ 73

Tableau 8 : Méthodes d’empreintes moléculaires classiquement utilisées en Ecologie

microbienne. ........................................................................................................... 81

Tableau 9 : Méthodes actuelles de séquençage (Cardenas et al. 2008). ................................ 85

Tableau 10 : Aperçu des différentes méthodes de microbiologie et de biologie moléculaire

utilisées pour l’étude des microorganismes dans les zones polluées par les

hydrocarbures. Adapté de Weiss et al. (2008). ........................................................ 94

Tableau 11 : Conditions proposées pour la mise en place d’une expérience visant à tester

l’impact du « top-down » sur l’efficacité des approches de biostimulation. ........... 246

LISTE DES ABREVIATIONS

ADN/ADNc Acide Désoxyribonucléique (complémentaire)

AIE Agence Internationale de l‘Energie

ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Fragment Analysis

(A)RISA (Automated) Ribosomal Intergenic Space Analysis

ARN/ARNr Acide Ribonucléique ribosomal

BAC Chromosome Bactérien Artificiel

BTEX Benzène, toluène, éthylbenzène et xylène

BP Bacterial Production

CCA Canonical Correspondence Analysis

CEDRE CEntre de Documentation de Recherche et d‘Expérimentation sur les

pollutions des eaux

CTD Conductivity, Temperature, Depth

DAPI 4',6'-diamidino-2-phénylindole

DCE Directive-Cadre Européenne

DOC/COD Carbone Organique Dissout

DGGE Denaturing Grandient Gel Electrophoresis

dNTP Désoxyribonucléotide

EPA Environmental Protection Agency

FL1 Foward scatter

FIC Frequency of Infected Cells

FVIC Frequency of Visibly Infected Cells

FISH Fluorescence in situ Hybridisation

FWHM Full Width Half Maximum

GC-MS Chromatographie en phase Gazeuse couplée à un Spectromètre de

Masse

GF Green cell Fluorescence

HAP Hydrocarbure Aromatique Polycyclique

HCB Hydrocarbonoclastic Bacteria (bactéries hydrocarbonoclastes)

HNF Heterotrophic Nanoflagellates

MCA 7-amino-4-méthylcoumarin

MPN/NPP Most probable number/nombre le plus probable

MUF 4-méthylumbelliférone

OCDE Organisation de Coopération de Développement Economiques

OMI Organisation Maritime Internationale

OPA Oil Pollution Act

OPRC Oil pollution, Prepardness, Response and Cooperation

OTU Operational Taxonomic Unit

pb Paire de bases

PCB Biphenyles polychlorés

PCE Perchloréthylène

PCR Polymerase Chain Reaction

PFGE Pulse Fragment Gel Electrophoresis

COP/POC Carbone Organique Particulaire

ppm Parties par million

REACH Règlement sur l‘enregistrement, l‘évaluation, l‘autorisation et les

restrictions des substances chimiques

rpm Rotation par minute

RT Retro-transcription

S (précédé d‘un

nombre)

Coefficient de sédimentation

SIP Stable Isotope Probing

SML Surface Microlayer

SSC Side Scatter

SSU Small SubUnit

SSW Surface seawater

TCA Acides tricarboxyliques

THC Total Hydrocarbon Compounds

SSCP Single Strand Conformational Polymorphism

tep Tonne équivalent pétrole

TCE Trichloréthylène

TGGE Temperature Gradient Gel Electrophoresis

T-RFLP Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphisms

U Unité

UCM Unresolved complex mixture

UNCLOS Convention des nations unies sur le droit de la mer

UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Averages

UV Ultraviolet

VIBM Viral Induced Bacterial Mortality

ZMPV Zone Marine Particulièrement Vulnérable

ETAT DE L’ART

CHAPITRE 1

15 Chapitre 1 : Etat de l’art

Chapitre 1 : Etat de l’art

1. La pollution pétrolière : un problème toujours d‘actualité

La pollution pétrolière est

une conséquence directe et

inévitable de l’exploitation

massive du pétrole. Tant

que le pétrole sera exploité,

l’ensemble des écosystèmes

seront fortement menacés

par la pollution.

De nos jours, l‘exploitation du pétrole et les dommages qu‘elle

engendre ont atteint leur paroxysme. Alors que le 19e siècle était

celui du charbon, le 20e a été celui du pétrole, une substance

pouvant fournir jusqu‘à deux fois plus d‘énergie pour la même

quantité. La tonne équivalent pétrole (tep) a remplacé la tonne

équivalent charbon comme unité d‘énergie. La découverte de « l‘or

noir » a résolument bouleversé notre mode de vie à tel point que la

quasi-totalité de nos activités dépendent aujourd‘hui de son

exploitation. Le marché du pétrole représente à lui seul 35% des

transports mondiaux de marchandises. Inévitablement, la pollution

marine engendrée par le commerce du pétrole est à la hauteur de

celui-ci. On estime notamment que 70% de la pollution pétrolière a

pour récepteur terminal le milieu aquatique et les quantités de

pétrole déversées dans les océans chaque année se chiffrent en

millions de tonnes. Or les besoins en énergie et donc, pour l‘heure

en pétrole, ne cessent de s‘accroître au fur et à mesure que la

population mondiale augmente. L‘Agence Internationale de

l‘Energie (AIE) estime que la demande mondiale pourrait passer à

près de 125 millions de barils par jour en 2030 contre 85 en 2005 et

seulement 10 à la fin de la seconde guerre mondiale (à noter qu‘un

baril équivaut à 159L de pétrole et qu‘une tonne fait environ 7,6

barils, ce chiffre variant en fonction de la masse volumique du

liquide). Selon l‘AIE, à l‘avenir, même des prix extrêmement élevés

ne diminueront pas l‘évolution de la consommation de pétrole.

Pourtant cette ressource n‘est pas inépuisable. En tant qu‘énergie

fossile, elle est condamnée à disparaitre avant la fin du 21e siècle.

Actuellement les principaux fournisseurs de pétrole se situent au

Moyen-Orient, en Afrique, en Asie centrale et en Amérique latine.

Mais même dans ces sites, la tendance va vers une raréfaction des

NB : Les mots qui apparaissent en orange sont définis dans un glossaire en fin de manuscrit.

Avec le temps, les sources

de pollution se sont

diversifiées.

gisements d‘hydrocarbures exploitables. L‘accroissement de la

demande et l‘appauvrissement de la ressource conduisent

inévitablement à une tension des marchés pétroliers. Cette tension

pousse les industriels à aller chercher le précieux liquide dans des

gisements toujours plus profonds et plus difficilement exploitables.

Ainsi depuis les 30 ou 40 dernières années, nous assistons à un

changement dans la façon d‘exploiter le pétrole. Par répercussion,

les sources et types de pollution ont évolué et se sont multipliées.

Par le passé, sous l‘influence de la nouvelle manne pétrolière et

le manque de vigilance face à la toxicité du produit de nombreux

navires pétroliers se sont brisés en mer (Amoco Cadiz, Exxon

Valdez, Erika, Prestige…) relarguant d‘importantes quantités de

pétrole. Les rejets volontaires de raffineries, et de navires pétroliers

(déballastages, dégazages) ont également fait l‘objet d‘une pollution

plus insidieuse dont les quantités étaient et restent encore

aujourd‘hui supérieures à celles provenant des déversements

accidentels.

Figure 1: Principales contributions annuelles pour la pollution pétrolière mondiale entre 1990 et 1999 (en

pourcentages), adapté du rapport du National Research Council (NRC) de 2003.

Les accidents pétroliers ont

toujours été révélateurs des

effets néfastes du pétrole

sur l’environnement

marin.

Contrairement à ce que l‘on pourrait penser, la principale source

de pollution pétrolière a toujours été le suintement naturel de

gisements de pétrole (Fig. 1). Néanmoins, là où un écoulement

naturel n‘a que peu de conséquences sur l‘écosystème marin car il

est généralement adapté à cet apport continu, les pollutions

massives ont toujours été extrêmement dommageables de part leur

soudaineté dans des espaces très réduits. Par le passé, ce type

d‘accidents pétroliers à répétition et les dommages économiques et

écologiques majeurs qu‘ils ont provoqués ont contribué à marquer

l‘opinion publique. Ils ont attiré l‘attention des autorités

gouvernementales et des scientifiques pour la lutte contre la


pollution pétrolière d‘origine anthropique, ce qui a fortement

contribué à la naissance de l‘Ecotoxicologie. On peut notamment

souligner les travaux d‘Atlas et ses collaborateurs qui font référence

dans le domaine de la microbiologie environnementale appliquée

aux pollutions pétrolières depuis les années 70 (Atlas et al. 1972;

Atlas 1975; Atlas et al. 1977). Les mesures qui ont résulté de cette

prise de conscience ont permis de diminuer progressivement le

nombre d‘accidents et de rejets illicites (Fig. 2).

Figure 2 : Principaux accident pétroliers de 1970 à 2010 (Jernelöv 2010).

Des accidents d’ampleur

sans précédent font leur

apparition.

Malheureusement les accidents de navires pétroliers ont depuis

été supplantés par de nouveaux types de pollution massive. En effet,

sous la menace de la disparition progressive du pétrole,

l‘exploitation de gisements en milieux « extrêmes » (plus de 1000m

de profondeur sous la surface des océans) s‘est intensifiée à la fin

du 20e siècle en dépit des risques de catastrophes majeurs encourus.

La vétusté des sites ainsi que le surcoût lié à leur réparation (plus

élevé que le pétrole lui-même) a conduit à une dégradation de bon

nombre de ces sites d‘extraction. C‘est ainsi que depuis une dizaine

d‘année, certains gisements de grande profondeur notamment en

Russie, dans les états de l‘ex-union soviétique et en Afrique de

l‘ouest menaçaient et menacent encore de rompre. Pourtant, ce n‘est

La catastrophe de l’an

passé dans le Golfe du

Mexique rappelle à tous les

dangers de l’exploitation

excessive du pétrole pour

l’environnement et la santé

publique.

pas dans ces pays mais à 66 Km au large de la Louisiane que le

20/04/2011, la plate-forme pétrolière Deepwater Horizon

(autrement dénommée Macondo/MC 252) a été victime d‘une

explosion suivie d‘un incendie déversant, selon les estimations, de

500000 à 1000000 tonnes de pétrole en moins de 2 mois (Fig. 3),

atteignant ainsi le triste record du plus important déversement connu

à ce jour sur les côtes américaines (la plus importante catastrophe

pétrolière mondiale étant la guerre du Koweit en 1991 qui provoqua

une pollution environ 5 fois plus importante). A titre indicatif, les

déversements massifs d‘hydrocarbures pétroliers et de gaz toxiques

tel que le méthane ont provoqué l‘empoisonnement de 8183 oiseaux

(dont 6104 retrouvés morts), 1144 tortues (dont 609 retrouvées

mortes) et 109 mammifères (dont 100 retrouvés morts). La pollution

a également détruit bon nombre de niches écologiques pour la ponte

des poissons et des crustacés sur les côtes Nord et Est du Golfe du

Mexique (Mascarelli 2010; Steiner 2010; Whigham et al. 2010). Les

dégâts économiques d‘une telle catastrophe se chiffrèrent eux en

milliards de dollars et c‘est une population qui s‘étend sur plusieurs

centaines de kilomètres qui fut directement affectée par la pollution

des ressources alimentaires liées à la pêche et aux zones agricoles.

a. b.


c.

Figure 3 : Différents exemple de pollution pétrolière de grande ampleur.

a. Image satellite du Golfe du Mexique après la catastrophe de la plateforme pétrolière Deepwater horizon dans

laquelle le pétrole est reflété par les rayons du soleil. Source : NOAA

b. Enfouissement de résidus pétroliers issus de l'exploitation des sables bitumineux, Fort Mac Murray, province

de l‘Alberta, Canada. Auparavant, la plaine de la rivière Athabasca était recouverte par la forêt boréale. Pour

extraire les sables bitumineux, la terre a été creusée sur plus de 60 mètres de profondeur. L‘eau pompée dans la rivière sert à séparer le bitume du sable dans de grandes cuves chauffées. Puis ce bitume est transformé en

pétrole liquide. Photo de Yann Arthus-Bertrand (www.goodplanet.com)

c. Inventaire de 2750 sites pollués (par les hydrocarbures principalement) en Arctique. Le réchauffement

climatique provoque depuis quelques dizaines d‘années la fonte progressive des glaces au niveau des pôles.

L‘activité humaine en est facilitée dans ces zones, les rejets de polluants de type hydrocarbures et autres se

multiplient alors que leur élimination demeure particulièrement difficile à mettre en œuvre.

(www.robindesbois.org)

Ce type d‘accident n‘est malheureusement pas anecdotique. Il

faut s‘attendre à subir de nouvelles catastrophes dans les prochaines

années. En plus de ce type de gisements à hauts risques qui

menacent de rompre dans certaines régions du globe, l‘industrie

pétrolière est de plus en plus amenée à s‘orienter vers des réserves

dites « non traditionnelles » à savoir des gisements qui ne peuvent

être exploités par des techniques d‘extraction courantes comme les

http://www.goodplanet.com/

http://www.robindesbois.org/

De nouvelles sources de

pollution font leur

apparition en raison des

difficultés de plus en plus

importantes pour prélever

le pétrole.

schistes bitumineux ou les sables asphaltiques. L‘exploration de

zones reculées comme l‘Arctique et les grands fonds marins (plus

de 3000m de profondeur sous l‘eau, puis plusieurs kilomètres dans

les sous-sols marins) est également très sérieusement envisagée

pour l‘exploitation de nouveaux gisements (Fig. 3). Leur

exploitation nécessite bien plus d‘énergie et de ressources que la

production du pétrole traditionnel mais les prix pétroliers en

constante hausse font que ces réserves non traditionnelles

deviennent de plus en plus rentables. Une des conséquences

majeures de ce changement est l‘augmentation considérable des

risques de pollution par les hydrocarbures. Par exemple, les schistes

bitumineux forment une roche-mère argileuse contenant de grandes

quantités de kérogène, matière organique susceptible de donner des

hydrocarbures par distillation. Les ressources mondiales de schistes

bitumineux seraient très importantes et assurément elles devraient

être rapidement exploitées. Mais ce type de gisement est bien plus

polluant qu‘un gisement classique et la quantité de déchets pollués

qui en découlent est extrêmement importante. La technologie pour

éliminer ces déchets n‘est pas encore connue et les experts estiment

qu‘il faudrait des centaines d‘années pour que ce type de site se

décontamine naturellement. En outre, le lessivage de ce type de sol

hautement contaminé produit des effluents extrêmement toxiques

qui polluent non seulement les terrains mais aussi les nappes

phréatiques et les cours d‘eau (in fine la mer) avec des effets quasi-

irréversibles. Ainsi, malgré la raréfaction de la ressource, l‘industrie

du pétrole n‘a pas dit son dernier mot. Puisqu‘il faut des millions

d‘années pour qu‘il se forme, il est incontestable que le pétrole

finira par disparaitre mais d‘ici là il est fortement probable que

l‘homme et son environnement soient exposés à de nouvelles

sources de pollution pétrolière sans précédent dans l‘ampleur et la

difficulté de traitement.

Au regard de ce nouveau comportement face à l‘exploitation du

pétrole, il ne fait aucun doute que la lutte contre la pollution


pétrolière engagée par les autorités gouvernementales et les

scientifiques doive perdurer et s‘intensifier. Cette lutte passe avant

tout par la compréhension et l‘évaluation de l‘impact des

hydrocarbures pétroliers sur les écosystèmes marins. On sait depuis

maintenant quelques décennies qu‘une fois déversé dans l‘eau de

mer, le pétrole est soumis à l‘action d‘un certain nombre de facteurs

physico-chimiques conduisant à son élimination partielle (Fig. 4).

On note ainsi successivement des phénomènes de dispersion du

pétrole, d‘évaporation des molécules les plus volatiles, de photo-

oxydation des hydrocarbures lourds, d‘émulsification des composés

hydrophobes, d‘absorption et d‘agrégation des hydrocarbures avec

la matière organique particulaire (MOP) et de dissolution de ces

composés en matière organique dissoute (MOD) (Bianchi et al.

1988).

Tableau 1 : Dégradation des hydrocarbures in situ et in vitro (Bianchi et al. 1988).

La biodégradation est le

processus le plus abouti

dans l’élimination des

polluants.

Mais en plus de ces facteurs physico-chimiques, la

biodégradation par les microorganismes est indéniablement le

processus le plus abouti dans l‘élimination des polluants d‘origine

pétrolière (Atlas 1981). Même s‘il est relativement lent, ce

processus permet une dégradation quasi-complète (transformation

en CO2) des hydrocarbures (Tableau 1). Neuf genres de

cyanobactéries, 103 de champignons et 14 d‘algues sont connus à ce

jour pour être capables de dégrader les hydrocarbures. Mais il a été

établi que les bactéries (79 genres recensés en 2005) étaient

qualitativement et quantitativement les plus efficaces dans cette

fonction (Prince 2005). Ce processus naturel a pour nom la

bioremédiation. Tout l‘enjeu est de comprendre ce phénomène en

tenant compte de la complexité des processus qui le composent et

les contraintes qui en modifient l‘efficacité de manière à

l‘influencer favorablement lors de pollutions importantes et ainsi

contribuer activement à l‘élimination des contaminants.

Note pour le lecteur : Les Archaea n‘interviennent quasiment pas dans la

dégradation des hydrocarbures. Nous emploierons donc le terme de

biodégradation pour désigner le métabolisme des hydrocarbures par les bactéries

uniquement durant l‘ensemble de ce manuscrit.

Figure 4 : Processus abiotiques et biotiques conduisant à l’élimination naturelle du pétrole en milieu

marin.


2. Les communautés bactériennes au sein des écosystèmes marins pélagiques et leur réponse

face à un apport de pétrole

2.1. Ecologie des bactéries marines totales et hydrocarbonoclastes

Les bactéries marines

jouent un rôle majeur dans

les cycles biogéo-

chimiques.

La « boucle microbienne »

a révolutionné la vision

classique de chaîne

trophique linéaire en

intégrant le rôle clé de

reminéralisation de la

matière organique par les

bactéries et l’apport de

matière organique issue de

leur prédation par les

virus, flagellés et ciliés,

eux-mêmes prédatés par le

métazooplancton.

L‘Ecologie est une science ayant pour objet les relations des

organismes entre eux et avec leur environnement. L‘Ecologie

microbienne marine a connu de nombreuses « révolutions » depuis

la découverte des microorganismes au sein des écosystèmes marins

au début du 20e siècle (Waksman 1934). Il a fallu attendre les

années 70 et la mise au point de techniques élaborées de

microscopie pour s‘apercevoir que l‘abondance bactérienne était en

réalité cent fois plus élevée que les estimations faites à partir des

méthodes cultivables (Hobbie et al. 1977). Dès lors, est née l‘idée

que malgré leur taille (0.2-2µm) et l‘immensité des océans

(1370.106 Km

3), les bactéries marines de part leur abondance (10

5

cellules par millilitre d‘eau de mer en moyenne) devaient jouer un

rôle majeur dans l‘évolution des cycles biogéochimiques (Williams

1981; Kirchman et al. 1982). D‘abord, compte tenu de la surface

des océans (70% de la planète) la respiration aérobie exercée par les

bactéries hétérotrophes marines s‘est révélée jouer un rôle clé dans

les budgets globaux de matière et d‘énergie (Pomeroy 1974).

Ensuite, ce changement a modifié le schéma classique du réseau

trophique linéaire. Le concept de « boucle microbienne », formalisé

au début des années 1980 par un collectif de chercheurs travaillant

en milieu marin (Azam et al. 1983) a donné naissance à l‘Ecologie

microbienne marine moderne dans laquelle les bactéries tiennent

une place centrale dans les flux de matière puisque 10 à 50% de la

matière organique issue de la production primaire est reminéralisée

sous l‘action des microorganismes hétérotrophes (Fig. 5). Ceux-là

sont ingérés par les prédateurs (nanoglagellés et ciliés), eux-mêmes

ingérés par le métazooplancton. Depuis le schéma originel de la

boucle microbienne, le concept a évolué pour aboutir davantage à

un réseau trophique microbien dans lequel les interactions entre les

microorganismes sont plus complexes (Sherr et al. 2009). Par

exemple, la distinction entre microorganismes autotrophes et

hétérotrophes est de moins en moins faite. Il a été montré que 50%

du nano-phytoplancton peut être constitué d‘algues mixotrophes

combinant sources d‘énergies lumineuse et chimique pour assurer

les biosynthèses cellulaires (Sanders et al. 1992; Arenovski et al.

1995; Li et al. 1996). La photo-hétérotrophie bactérienne (capacité

de combiner comme sources d‘énergie la lumière et des molécules

organiques) serait également largement répandue (Kolber et al.

2001). Enfin les adaptations récentes du réseau trophique microbien

prennent en compte le compartiment viral, longtemps ignoré dans

l‘étude des transferts de matière en milieu marin (Wilhelm et al.

1999).

Figure 5 : Schéma conceptuel des réseaux trophiques microbiens dans les systèmes aquatiques pélagiques.

Bianchi et al. (1988)

Du fait de leur taille microscopique, il est apparu rapidement que

les bactéries étaient non seulement particulièrement abondantes

dans les océans mais également quelles étaient capables de

coloniser tous les biotopes marins, de la microcouche de surface,

aux fonds abyssaux, des zones polaires aux tropiques, s‘adaptant à


La culture cellulaire est la

base de la microbiologie

marine. Néanmoins elle est

inadaptée pour l’étude de

la diversité bactérienne.

Durant les 30 dernières

années, les méthodes de

culture ont fait place aux

techniques de biologie

moléculaire pour l’étude de

la diversité bactérienne.

Les méthodes moléculaires

ont permis de révéler la

grande diversité génétique

des procaryotes.

chaque fois aux contraintes environnementales, laissant supposer

une grande diversité génétique et métabolique chez les bactéries

(Woese et al. 1977). Rapidement, le problème de l‘étude de cette

diversité s‘est posé. L‘étude des microorganismes s‘est faite durant

de très nombreuses années par la culture cellulaire. Cette méthode

consiste à prélever un échantillon naturel et à l‘incuber dans un

milieu de culture généraliste ou spécifique puis compter les colonies

en partant du principe qu‘une colonie est initiée par une cellule

unique. Même si incontestablement cette approche comporte des

avantages notamment pour l‘isolation de souches bactériennes

inconnues, l‘étude morphologique de ces souches ainsi que leur

caractérisation génétique et métabolique, elle ne permet d‘obtenir

qu‘une vision très restreinte d‘un assemblage bactérien naturel.

L‘écart entre le nombre de bactéries retrouvé dans les cultures et le

comptage par microscopie à épifluorescence a fait naitre le concept

de « plate count anomaly » (Staley et al. 1985). Il a été estimé que

seulement 0.1 à 1% des bactéries étaient cultivables dans le milieu

marin (Giovannoni et al. 1990). Une alternative permettant d‘éviter

les biais de la culture a été trouvée dans la biologie moléculaire. Les

bases de notre compréhension actuelle de la diversité bactérienne

ont été posées par Carl Woese et ses collègues (1977) lorsqu‘ils ont

démontré par l‘analyse du gène de la petite-sous unité de l‘opéron

de l‘ARN ribosomique que les êtres vivants étaient répartis en 3

grands domaines : les bactéries, les archées et les eucaryotes. A la

suite de cette découverte, des méthodes de clonage et de séquences

spécifiques de gènes provenant de l‘environnement ont été mises au

point (Olsen et al. 1986; Pace et al. 1986) et des inventaires

moléculaires ont pu être réalisés (Giovannoni et al. 1990). Depuis,

les approches moléculaires pour comprendre la diversité

phylogénétique et fonctionnelle des bactéries ont largement

contribué à notre connaissance des microorganismes marins. On

dénombre aujourd‘hui une vingtaine de phyla bactériens différents

(Fig. 6). Parmi ces phyla, on retrouve des espèces bactériennes

extrêmement variées génétiquement et métaboliquement laissant

supposer une place prépondérante de la diversité bactérienne dans la

structure et la fonction des communautés naturelles.

Figure 6 : Arbre phylogénétique basé sur le maximum de vraisemblance du domaine des bactéries. Les

phyla sont distingués par la couleur de leur branche et les noms d’espèces indiquées en rouge

appartiennent à la GEBA (Genomic Encyclopedia of Bacteria and Archaea) (Wu et al. 2009) .

Il a été montré (surtout dans le sol) que la diversité

métabolique, portée par une grande diversité génétique,

favorisait la stabilité des écosystèmes ainsi que leur


La diversité bactérienne est un

facteur déterminant pour la

plasticité des communautés en

milieu naturel comme pour faire

face à un apport de pétrole.

productivité. Une communauté bactérienne très diversifiée sera

plus à même de faire face à une perturbation du milieu et

reviendra plus rapidement à son état d‘origine qu‘une

communauté moins diversifiée (Atlas et al. 1991; Girvan et al.

2005). Cela prend tout son sens dans le cas d‘une pollution

pétrolière. En effet, parmi les bactéries marines, cela fait tout

juste un siècle que des bactéries capables d‘utiliser les

hydrocarbures pétroliers comme seule source d‘énergie et de

carbone ont été isolées pour la première fois (Söhngen 1913),

ce sont les bactéries hydrocarbonoclastes (HCB pour

hydrocarbonoclastic bacteria).

Figure 7 : Phylogénie des principaux groupes de bactéries hydrocarbonoclastes marines. En bleu, les

microorganismes qui dégradent les hydrocarbures saturés, en rouge, ceux qui dégradent les

hydrocarbures aromatiques polycycliques et en noir les bactéries non-dégradantes.

Il n‘est pas étonnant qu‘une telle fonction ait depuis été

retrouvée dans tous les écosystèmes du globe, y compris dans

des zones dites extrêmes comme les régions polaires (Whyte et

al. 1995), les déserts (Al-Hadrami et al. 1995) ou les sources

chaudes (Zarilla et al. 1984), dans la mesure où le pétrole, de

Les bactéries hydrocarbo-

noclastes sont capables d’utiliser

les hydrocarbures comme seule

source de carbone et d’énergie.

Elles sont :

- ubiquistes

-diversifiées

-spécifiques de leur substrat

-plus nombreuses dans les

milieux pollués.

La dégradation totale du pétrole

ne peut se faire que grâce à

l’intervention de plusieurs

groupes bactériens possédant des

équipements enzymatiques

complémentaires.

part son abondance et son aspect hautement réduit, représente

un apport très important en carbone et en énergie utilisables par

les microorganismes. La plupart des bactéries

hydrocarbonoclastes appartiennent aux -protéobactéries. On

peut noter quelques genres majoritaires parmi les 79

récemment répertoriés (Prince 2005) : Acinetobacter,

Alcanivorax, Alcaligenes, Cycloclasticus, Flavobacterium,

Marinobacter, Pseudoalteromonas, Pseudomonas,

Thallassolituus, Oleispira et Vibrio (Fig. 7). De nombreuses

études ont montré qu‘elles étaient ubiquistes et présentes en

faible quantité même dans les environnements dépourvus de

contamination (Colwell et al. 1977; Leahy et al. 1990).

Naturellement, leurs effectifs sont accrus dans les zones

chroniquement polluées par les hydrocarbures et augmentent

après un apport de pétrole (Atlas 1981; Floodgate 1995). Mais

chacun de ces genres bactériens n‘est capable de dégrader

qu‘un nombre restreint d‘hydrocarbures alors que le pétrole est

composé de centaines voire de milliers de molécules

différentes. Par exemple il a été clairement établi que le genre

Alcanivorax est prépondérant dans la dégradation des alcanes

(Yakimov et al. 1998) alors que le genre Cycloclasticus est

associé à la dégradation des hydrocarbures aromatiques

polycycliques (HAP) n‘excédant pas trois cycles benzéniques

(Dyksterhouse et al. 1995). La biodégradation totale d‘un

pétrole n‘est donc possible que grâce à la mise en place d‘un

consortium bactérien comprenant des groupes dont les

équipements enzymatiques complémentaires permettent la

biodégradation quasi-totale de ces différents types

d‘hydrocarbures (Head et al. 2006). Si les bactéries dégradant

les composés les plus simples (comme les alcanes linéaires à

courte chaine) sont abondantes dans l‘environnement, celles

qui possèdent les machineries enzymatiques pour dégrader les

composés les plus complexes (comme par exemple les


Le niveau de dégradation d’un

pétrole dépend des ressources

métaboliques bactériennes

présentes dans le milieu

contaminé.

composés aromatiques de plus de quatre cycles) sont beaucoup

moins répandues (Rodriguez-Blanco et al. 2010). Le niveau de

dégradation des pétroles (mélange de composés facilement

dégradables et de composés récalcitrants) est donc totalement

dépendant de la diversité métabolique des bactéries

hydrocarbonoclastes présentes dans l‘environnement pollué. La

diversité des espèces bactériennes est un facteur décisif dans la

réponse des communautés bactériennes à ce type de variation

environnementale. Son étude est primordiale pour la

compréhension du phénomène d‘élimination naturelle des

polluants pétroliers.

2.2. Le métabolisme des hydrocarbures

La biodégradation des

hydrocarbures fait intervenir le

dioxygène qui sert à l’utilisation

d’enzymes de type oxygénase.

Note pour le lecteur : l‘étude des voies métaboliques des hydrocarbures

n‘ayant pas fait l‘objet de ce travail de thèse, nous présentons ici à titre

indicatif quelques voies métaboliques classiques de manière à avoir une

idée du type de fonctions (et donc de gènes) qu‘il est possible de cibler dans les analyses en PCR quantitative que l‘on abordera un peu plus tard dans ce

manuscrit.

La dégradation des hydrocarbures est une fonction

distribuée dans une grande diversité de groupes

phylogénétiques et les mécanismes qui interviennent sont très

diversifiés, en grande partie à cause de la multitude de

molécules de type hydrocarbure différentes. Toutefois, Das et

al. (2011) ont proposé un schéma général de la dégradation des

hydrocarbures par les microorganismes en condition aérobie,

condition prépondérante en milieu pélagique (Fig. 8).

L‘attaque initiale intracellulaire est un processus oxydatif et

l‘activation ainsi que l‘incorporation d‘oxygène est la clé de la

réaction enzymatique catalysée par les oxygénases et les

peroxydases. Les voies périphériques de dégradation

convertissent les hydrocarbures étape par étape en

intermédiaires du catabolisme, à l‘aide par exemple du cycle

des acides tricarboxyliques (TCA ou cycle de Krebs). La

biosynthèse de molécules pour la biomasse de la cellule se fait

à partir de métabolites précurseurs comme l‘acétyl-CoA, le

succinate ou le pyruvate. Les sucres nécessaires à de

nombreuses biosynthèses et à la croissance sont produits par la

glycogénèse.

Figure 8 : Mécanisme général de dégradation aérobie des hydrocarbures par les microorganismes (Das et

al. 2011).

La biodégradation des alcanes se

fait par l’intermédiaire d’une

mono-oxygénase.

Dans ce processus, on peut distinguer deux grands types de

métabolismes, associés aux deux classes majoritaires qui

composent les pétroles : les alcanes linéaires et les

hydrocarbures aromatiques. Les n-alcanes ayant un nombre de

carbone supérieur ou égal à 9 sont les hydrocarbures les plus

facilement dégradables par une très large variété de micro-

organismes. Le principal mécanisme de dégradation des

alcanes et le plus fréquent est celui correspondant à une

oxydation du groupe méthyle terminal, conduisant à la

formation d‘un alcool primaire, d‘un aldéhyde puis d‘un acide

mono-carboxylique faisant intervenir une mono-oxygénase

(Bianchi et al. 1988). La dégradation des alcanes ramifiés est

plus lente et plus difficile comparativement à celle des alcanes

linéaires. En ce qui concerne la dégradation des hydrocarbures


La dégradation des

hydrocarbures aromatiques

polycycliques est initiée par une

dioxygénase.

aromatiques polycycliques (HAP), plus le nombre de cycles

augmente dans la molécule plus celle-ci est difficilement

dégradable. Ainsi de nombreuses bactéries ont été répertoriées

pour la dégradation de molécules comme le benzène ou le

naphtalène alors qu‘à ce jour seules quelques espèces sont

connues pour dégrader les HAP de plus de 4 cycles tel que le

benzo[a]pyrène (Rodriguez-Blanco et al. 2010). Quel que soit

l‘HAP, la plupart du temps, une dioxygénase assure

l‘incorporation de deux atomes d‘oxygène dans la première

phase de l‘oxydation qui conduit à des diols de configuration

cis. Généralement, l‘oxydation se poursuit par une rupture

ortho ou méta du cycle portant sur les groupements hydroxyle,

avec obtention d‘un nouveau diol ayant un cycle aromatique de

moins que le composé initial et ainsi de suite jusqu‘à la

dégradation de tous les cycles benzéniques (Bianchi et al.

1988).

2.3. Le pétrole parmi les facteurs de contrainte des communautés bactériennes marines

Les communautés bactériennes

naturelles s’organisent dans

l’espace et le temps sous

l’influence des facteurs

environnementaux.

En l‘absence de pétrole, les communautés bactériennes

naturelles s‘organisent dans l‘espace et dans le temps sous

l‘influencent des facteurs environnementaux qui les

contraignent.

Les études portant sur les variations spatiales montrent des

résultats contrastés. Certaines n‘ont pas trouvé de différence

notable entre des sites situés à quelques kilomètres de distance

en Antarctique (Murray et al. 1998) comme à plus de 1500Km

en mer Arabique (Riemann 1999). D‘autres au contraire ont

trouvé des variations dans des sites séparés de 10 km

(Ghiglione et al. 2005 ; Rodriguez-Blanco et al. 2009) ou de

plusieurs dizaines de km entre la côte et le large des côtes

catalanes (Schauer et al. 2000), sur des gradients de salinité en

mer du Nord (Riemann et al. 2002) ou encore dans le panache

du Rhône dans le Sud de la France (Troussellier et al. 2002).

La structure des communautés

bactériennes en milieu marin est

influencée à l’échelle de la

saison.

La température, la salinité, le

DOC et les événements de

blooms phytoplanctoniques

comptent parmi les facteurs

environnementaux capables

d’affecter significativement la

structure des communautés

bactériennes marines.

Ces changements peuvent être expliqués par bon nombre de

facteurs, comme la salinité dans les deux derniers cas cités.

Toutefois, l‘hétérogénéité des résultats tendrait à montrer que

d‘une part certains environnements sont plus stables que

d‘autres (Fuhrman et al. 2008) et d‘autre part que selon la

technique moléculaire employée pour l‘étude des

communautés bactériennes, les changements sont plus ou

moins bien décelés (Jaspers et al. 2001).

Les variations de structuration dans le temps semblent plus

homogènes d‘une étude à l‘autre. Certains trouvent des

variations à micro-échelle de temps (10sec à 30min) (Seymour

et al. 2004; Seymour et al. 2005) ou à l‘échelle de la journée et

jusqu‘à la semaine (Acinas et al. 1997; Fandino et al. 2001).

Mais de manière générale, les plus grands changements

surviennent à l‘échelle du mois voire de l‘année, les

communautés bactériennes évoluant selon les saisons. Cette

tendance a été retrouvée aussi bien en mer Méditerranée

(Ghiglione et al. 2005), qu‘en mer Adriatique (Celussi et al.

2007), dans la mer du Nord (Sapp et al. 2007), l‘Atlantique

(Kan et al. 2006) ou encore le Pacifique (Fuhrman et al. 2006).

Les changements temporels de structure de communauté sont

dus aux facteurs environnementaux qui évoluent selon les

saisons.

Plusieurs études ont évalué statistiquement l‘importance

relative de différents paramètres environnementaux sur les

changements spatio-temporels des assemblages bactériens

(Ghiglione et al. 2008; Lami et al. 2009). Généralement, les

variations de température (été versus hiver), de salinité

(dessalures), de concentrations en sels inorganiques et matière

organique ainsi que la présence de blooms phytoplanctoniques

semblent être responsables des changements de structure de

communauté bactérienne (Ghiglione et al. 2008; Lami et al.

2009). Furhman et ses collaborateurs (2006) ont même


Le pétrole est un facteur

supplémentaire qui contraint les

communautés bactériennes, mais

son importance relative par

rapport à d’autres facteurs

environnementaux est inconnue.

En cas de déversement de

pétrole, les bactéries sensibles

aux hydrocarbures disparaissent

pour laisser la place aux

bactéries hydrocarbonoclastes.

démontré l‘existence de tendances temporelles extrêmement

reproductibles dans la composition d‘une communauté

bactérienne composées de 171 OTUs pendant plus de 4 ans

dans leur Observatoire microbiologique, à 20Km au large des

côtes Sud-Californiennes. Les modèles de distribution et

d‘abondance des taxa microbiens étaient très prévisibles et

fortement influencés par un large éventail de facteurs

abiotiques et biotiques (Fuhrman et al. 2006).

En cas de pollution pétrolière, les hydrocarbures viennent se

rajouter à tous ces facteurs environnementaux avec pour effet

d‘affecter les communautés bactériennes, mais leur importance

relative par rapport aux autres paramètres environnementaux

est aujourd‘hui inconnue.

Si le pétrole peut être toxique pour bon nombre d‘espèces

marines, les bactéries hydrocarbonoclastes sont, au contraire,

favorisées par un apport d‘hydrocarbures. Alcanivorax,

Cycloclasticus, Oleiphilus et Oleispira sont par exemple quatre

genres extrêmement compétitifs qui utilisent préférentiellement

le pétrole plutôt que des sucres comme source de carbone

(Harayama et al. 2004; Kostka et al. 2011). Comme la plupart

des HCB, ces bactéries appartiennent au groupe des -

protéobactéries, particulièrement représenté dans les milieux

pollués. A l‘inverse, les Cytophaga / Flexibacter / Bacteroides

(CFB) pourtant particulièrement présentes dans

l‘environnement marin non pollué sont quasiment introuvables

dans les zones contaminées (MacNaughton et al. 1999). Les -

protéobactéries et les cyanobactéries semblent également

sensibles à l‘apport de pétrole (Harayama et al. 2004).

Cependant, il est difficile de généraliser cette tendance à tous

les memebres de ces phyla. Par exemple, il existe chez les

cyanobacteria certaines espèces capables de dégrader les

hydrocarbures (tel que Agmenellum quadruplicatum qui oxyde

le phénanthrène grâce à un système de mono-oxygénase)

Le pétrole provoque un

bouleversement dans la structure

des communautés bactériennes.

Le pétrole induit la mise en place

d’un consortium bactérien de

biodégradation des

hydrocarbures avec une

alternance de différents types

bactériens comportant des

capacités métaboliques

complémentaires.

(Raghukumar et al. 2001). Mais le plus souvent les pétroles

sont toxiques pour les cyanobactéries car les composés

aromatiques, notamment, inhibent la photosynthèse et la

croissance de ces cellules. Par contre, celles qui résistent au

pétrole pourraient fournir de l‘oxygène et permettre la fixation

de l‘azote au profit de la communauté bactérienne dégradante

(Sorkhoh et al. 2008).

Ces différentes sensibilités au pétrole provoquent des

bouleversements très rapides dans la structure des

communautés bactériennes juste après l‘apport de pétrole. Dès

1976, quelques jours après un accident pétrolier en Alaska, des

changements de la structure des communautés microbiennes

touchées par l‘épandage de pétrole ont pu être observés

(Horowitz et al. 1977). Depuis, de nombreuses études

effectuées autant en microcosmes (Röling et al. 2002; Sei et al.

2003; Cappello et al. 2007) que sur des échantillons naturels

(Peterson et al. 2003; Yakimov et al. 2004; Mascarelli 2010)

ont confirmé qu‘après un apport soudain de pétrole, le ratio

entre HCB et bactéries totales augmentait fortement. On assiste

en générale à une baisse de la diversité totale des communautés

bactériennes au profit de certaines espèces avantagées

sélectivement par la nouvelle source de matière organique et

particulièrement bien adaptées à la présence de certains

hydrocarbures. L‘élimination conjointe des bactéries sensibles

au pétrole et la stimulation des HCB conduit souvent à une

augmentation de l‘abondance bactérienne et à un regain

d‘activité globale de la communauté dans les premiers jours

après la pollution (Atlas 1981). Rapidement un consortium de

biodégradation se met en place. Les bactéries capables de

métaboliser les molécules les plus simples sont sélectionnées

en premier. Lorsque ces composés viennent à disparaitre,

d‘autres bactéries ayant eu le temps de s‘acclimater aux

molécules les plus complexes (les hydrocarbures aromatiques


polycycliques par exemple) prolifèrent à leur tour et prennent

l‘ascendant sur le reste de la communauté (Fig. 9). Cela se

traduit par une alternance de différents groupes bactériens qui

se poursuit jusqu‘à l‘élimination quasi-complète des

hydrocarbures (voir la revue de Head et al., 2006).

Figure 9 : Diagramme schématique représentant les tendances générales observées dans de nombreuses

études après un apport de pétrole : des changements dans la composition du pétrole accompagnés par des

changements dans l’abondance des organismes hydrocarbonoclastes clés (Head et al. 2006).

La résilience des communautés

bactériennes touchées par la

pollution pétrolière semble n’être

que partielle.

Il est relativement difficile d‘évaluer le potentiel de

résilience d‘une zone impactée par les pétroles car cela

nécessite un suivi de la quantité de pétrole, de la toxicité des

molécules et des communautés bactériennes sur de longues

périodes. Certaines études ont montré que la communauté

bactérienne de départ pouvait être partiellement rétablie

(Brakstad et al. 2005; Bordenave et al. 2007). Toutefois, les

bactéries dégradant des composés pétroliers très complexes

(comme les composés aromatiques de plus de quatre cycles) ne

font pas toujours partie de la communauté bactérienne naturelle

soumise à une pollution. Cela conduit à la persistance de ces

Il existe peu d’études permettant

de relier statistiquement la

structure des communautés

bactérienne à la présence de

pétrole.

composés dans l‘environnement, entrainant une toxicité du

milieu à long terme. Pelletier et ses collaborateurs (2004) ont

d‘ailleurs montré que même dans les cas où la dégradation des

hydrocarbures apparaissait totale, il pouvait rester une toxicité

résiduelle due aux composés les plus récalcitrants non détectés

par les méthodes chimiques employées. Il est donc possible

que cette toxicité résiduelle perturbe la flore bactérienne

durablement.

Enfin, même si les travaux sur l‘impact du pétrole sur les

communautés bactériennes sont nombreux, peu d‘études ont

déjà tenté de relier statistiquement la pollution pétrolière aux

variations de structure de communauté. Seuls Denaro et al.

(2005), dans l‘eau de mer du port de Messine en Italie, Ben

Said et al. (2010), dans les sédiments du lagon de Bizerte en

Tunisie ainsi que Zhang et al., (2007), dans l‘eau de la baie

d‘Hong Kong, ont montré que la pollution pouvait affecter

significativement les bactéries marines et que cet effet pouvait

même être prédominant parmi tous les autres facteurs physico-

chimiques. Il reste aujourd‘hui nécessaire de tester ce

paramètre dans d‘autres types d‘environnements afin d‘évaluer

la part de responsabilité du pétrole sur la structuration des

communautés bactériennes parmi les autres facteurs

environnementaux.

Note pour le lecteur : la première étude de ce manuscrit est consacrée à

l‘évaluation statistique de l‘importance relative des HAP parmi d‘autres

facteurs environnementaux sur la structure des communautés bactériennes

dans plusieurs ports de la baie de Marseille.


3. Impact des facteurs environnementaux sur les communautés bactériennes contaminées par

les pétroles et sur la biodégradation des hydrocarbures

Les facteurs physico-chimiques

et/ou biologiques influencent

directement l’évolution du pétrole

dans le milieu marin et les

communautés bactériennes dans

leur fonction de biodégradation

des hydrocarbures.

Depuis les premières investigations sur la pollution

pétrolière, un grand nombre d‘études ont entrepris de

comprendre le devenir du pétrole en milieu marin et les

facteurs environnementaux pouvant affecter l‘élimination des

polluants pétroliers. La température, la pression, les ressources

en oxygène, pour ne citer qu‘eux, peuvent jouer un rôle à la

fois sur la transformation chimique du pétrole mais aussi sur

sa biodégradation par les microorganismes. Néanmoins,

comme nous l‘avons vu précédemment, les bactéries ne sont

pas sans interactions avec d‘autres compartiments biologiques

et l‘importance de la prédation des bactéries par les

protozoaires ainsi que la lyse virale ont été très peu abordés

dans la littérature (Fig. 10). Nous aborderons dans cette partie

les effets des facteurs physico-chimiques et biologiques sur les

communautés bactériennes touchées par une pollution

pétrolière.

Figure 10 : Schéma conceptuel des facteurs abiotiques et biotiques pouvant affecter les communautés

bactériennes touchées par la pollution pétrolière et in fine la biodégradation.

3.1. Facteurs abiotiques

3.1.1. Composition et concentration du pétrole

La dégradation du pétrole dépend

en grande partie de sa

composition et de sa

concentration. Elle dépend

également de son

« comportement » dans le milieu

marin.

Les alcanes et les hydrocarbures

aromatiques polycycliques sont

deux classes prépondérantes dans

la composition des pétroles.

La composition d‘un pétrole détermine sa toxicité et son

potentiel de dégradation. Une fois déversé dans l‘eau, le

pétrole prend diverses formes qui conditionnent fortement le

temps qu‘il sera nécessaire pour l‘éliminer. Selon sa

consistance, il va former un film hydrophobe à l‘interface eau-

air, former des émulsions dans la colonne d‘eau ou encore

couler au fond des océans sous forme de goudron sous l‘action

de processus hydrodynamiques (Cooney 1984). La dispersion

du pétrole et de manière générale tout processus tendant à

augmenter la surface de contact eau-huile (émulsion « huile-

dans-eau ») permet un meilleur accès à l‘oxygène et aux

ressources en azote et phosphore. Ce phénomène physique

augmente largement la dégradation des hydrocarbures. A

l‘inverse la formation d‘une « mousse au chocolat » (émulsion

« eau-dans-huile ») freine le processus (Bianchi et al. 1988;

Leahy et al. 1990).

Malgré sa complexité, les composés du pétrole sont divisés

en quatre principales familles (Fig. 11) :

- les hydrocarbures saturés (alcanes linéaires et ramifiés,

cycloalcanes) et les hydrocarbures aromatiques mono- ou

polycycliques (2 à 6 cycles de benzène), représentant 30 à

70% de ces composés pétroliers,

- les asphaltènes, composés de haut poids moléculaire et de

structure chimique complexe à base de cycles aromatiques

condensés et d‘hétéroatomes comme l‘oxygène, le souffre ou

l‘azote

- les composés cycliques azotés, soufrés et oxygénés,

- et les métaux (nickel, fer, sodium, cuivre, aluminium).


Figure 11 : Composés hydrocarbonés et non hydrocarbonés présents dans les pétroles bruts (Bianchi et al.

1988).

Comme cela a déjà été évoqué précédemment, tous ces

composés ne sont pas dégradés équitablement (Saliot 1981).

Figure 12 : Exemple de dégradation d’un pétrole (Head et al. 2006). a. Composition d‘un pétrole brut léger de la mer du Nord (en haut) et le résultat de sa dégradation partielle

(en bas).

b. Chromatographes montrant la séparation des composés du pétrole. Le pétrole dégradé est caractérisé

par sa composition ; les hydrocarbures saturés ont été biodégradés, seuls restent les terpénoides

cycliques.

Plus il est raffiné, plus le pétrole

est dégradé rapidement.

Les composés saturés sont dégradés en premier, viennent

ensuite les aromatiques et les asphaltènes et résines résistent à

la dégradation, ce qui entraine une modification dans la

composition du pétrole au cours de sa dégradation (Fig. 12).

Plus les molécules d‘un pétrole sont saturées mieux celui-ci

est biodégradé. A l‘inverse les asphaltènes, les composés

soufrés et les cycles aromatiques compliquent drastiquement

la biodégradation (Jobson et al. 1972; Walker et al. 1976).

Les proportions relatives de ces différents composés sont

reliées au degré de raffinage du pétrole. Un fuel lourd peut

contenir plus de 2000 molécules différentes avec une large

proportion de composés récalcitrants à la dégradation alors

que l‘essence en contient environ 200, majoritairement riches

en hydrocarbures saturés et aromatiques (Head et al, 2006).

Ainsi un pétrole de type « léger d‘Arabie » sera mieux dégradé

qu‘un pétrole brut de type « Bunker C » (tableau 2).

Pétrole Saturés Aromatiques Polaires (résine) Asphaltènes

Louisiane du Sud 69 20 10,3 0,3

Koweit 44 28,3 23,2 4,5

Bunker C 21,1 34,2 30,3 14,4

Léger d'Arabie 48 35 9 7,5

Tunisien (Asthart) 48 32 12 8

Vénézuelien 46 21,6 19,3 9

Tableau 2 : Proportions des différentes familles d’hydrocarbures dans quelques pétroles couramment

utilisés (Bianchi et al. 1988).

Bien sûr, il va de soi que la dégradation du pétrole dépend

également de sa concentration. Plus le pétrole est déversé

rapidement et en quantités importantes (accident pétrolier par

exemple) plus les dommages sur la faune marine macro- et

microscopique sont importants, et plus l‘élimination totale des

polluants est lente et longue.

Ceci peut en partie s‘expliquer par le fait que la

composition et la concentration du pétrole déterminent la

façon dont les communautés bactériennes s‘adaptent à la


Deux types de pétrole différents

ne sont pas dégradés de manière

identique par une même

communauté bactérienne.

pollution. Deux types de pétroles différents induisent des

changements différents sur une même communauté

bactérienne (Rodríguez-Blanco et al. 2010). Il est donc

important de connaitre la composition du pétrole pour évaluer

sa capacité à être éliminé par des processus hydrodynamiques

mais aussi par le compartiment bactérien.

3.1.2. Production de biosurfactants

Les bactéries produisent des

biosurfactants qui leur permettent

une meilleure accessibilité au

pétrole.

Comme on vient de le voir, le pétrole a besoin d‘être

dissout dans l‘eau ou de se présenter sous forme de

microémulsion pour être accessible aux bactéries. Mais en

raison de son hydrophobicité, cet état n‘est pas systématique et

le manque d‘accessibilité du pétrole aux microorganismes est

un réel frein à son élimination. Pour pallier à cette contrainte,

bon nombre de bactéries se sont adaptées au fil du temps pour

excréter des agents tensio-actifs, amphiphiles, appelés aussi

biosurfactants ou bioémulsifiants. Récemment, Satpute et al.

(2010) listaient les biosurfactants et bioémulsifiants produits

par les microorganismes marins révélant la diversité de ces

molécules et leur fort potentiel pour les applications

industrielles (Tableau 3). Elles permettent de réduire l‘énergie

nécessaire au transfert de matière entre la surface du pétrole et

l‘intérieur des cellules bactériennes (Ron et al. 2002). La

nature chimique de ces composés est extrêmement variable

d‘une bactérie à l‘autre. Cela peut être :

- des molécules de faible poids moléculaire de type

glycolipides dans lesquels les carbohydrates sont attachés à

de longues chaines d‘acides aliphatiques ou de lipopeptides

(rhamnolipides, lipides trehalos et sophorolipides)

- ou des composés plus complexes de type polysaccharides,

protéines, lipopolysaccharides, lipoprotéines ou encore un

mélange de biopolymères.

Tableau 3 : Biosurfactants/bioémulsifiants polymériques (en haut) et glycolipidiques (en bas) produits par

différents types de microorganismes marins (Satpute et al. 2010).


Un grand nombre de

biosurfactants sont produits par

des souches du genre

Acinetobacter.

Les premiers permettent de diminuer les tensions de

surface. Ils sont sécrétés par exemple par certaines souches de

Pseudomonas (Lang et al. 1999) ou d’Alcanivorax

borkumensis (Abraham et al. 1998; Yakimov et al. 1998). Les

seconds sont moins efficaces dans la réduction de la tension de

surface mais servent de revêtement pour les gouttelettes de

pétrole et préviennent de leur coalescence (Rosenberg et al.

1997). Cette classe de bioémulsifiants intervient à de faibles

concentrations pour des ratios avec le pétrole de l‘ordre de

1:100 à 1:1000. Leur spécificité pour le substrat est

considérable. Certains peuvent par exemple fonctionner pour

l‘émulsification des molécules aromatiques de haut poids

moléculaire seulement. Les plus étudiés sont les biosurfactants

produits par les différentes souches du genre Acinetobacter

(Navon-Venezia et al. 1995; Rosenberg 2010). La production

de bioémulsifiant est induite par des signaux moléculaires

intervenant dans le « quorum sensing » (Ron et al. 2002). Elle

confère un avantage sélectif aux bactéries qui les produisent et

augmentent la dégradation du pétrole (Nerurkar et al. 2009;

Satpute et al. 2010). C‘est pourquoi elles font l‘objet d‘un

grand intérêt pour les expériences de bioremédiation ; un

aspect que nous aborderons dans la partie 3 de cette

introduction générale.

3.1.3. Rayonnement UV, température, salinité, ressources en oxygène et pression

Les UV modifient la nature des

hydrocarbures et des molécules

aromatiques en particulier.

La photo-dégradation des hydrocarbures par les UV est un

phénomène avéré mais qui a été très peu étudié. Pourtant, ce

processus pourrait être prépondérant dans les zones tropicales,

particulièrement ensoleillées, et/ou pauvres en sels nutritifs

(Ehrhardt et al. 1992). L‘action des UV sur les molécules

aromatiques et polaires, en particulier, libère des radicaux

libres capables de dégrader ces même molécules (Gorman

1992). Ainsi les processus photochimiques peuvent

rapidement altérer la composition initiale du pétrole, ce qui

La biodégradation se fait à un

optimum de température de 25 à

37°C.

peut avoir une influence sur la biodégradabilité des

hydrocarbures par les bactéries (Nicodem et al. 1997).

Même s‘il a été montré récemment que la dégradation de

diesel ou de pétrole brut pouvait aussi bien se faire à 25, 10 ou

4°C en conditions contrôlées avec de l‘eau de Méditerranée

(Rodríguez-Blanco et al. 2010), de manière générale on note

un effet de la température sur la dégradation des

hydrocarbures. D‘abord par ce que la température change la

nature même du pétrole. Lorsque les températures sont basses,

la volatilisation des composés de faibles poids moléculaires,

toxiques pour les microorganismes, ralentit, la viscosité du

pétrole augmente et l‘émulsification est plus difficile. Ce

phénomène diminue l‘étalement des nappes et donc leur

dégradation (Bianchi et al. 1988). Ensuite la température agit

sur la physiologie des microorganismes. L‘oxydation des

hydrocarbures a été observée à la fois à des températures

proches de zéro (ZoBell 1973; Delille 2000) et à des

températures autour de 70°C (Mateles et al. 1967). Mais la

biodégradation optimale a été observée en culture pure autour

de 25 à 37°C, ce qui correspond à l‘optimum de température

de bon nombre d‘enzymes bactériennes. Au-dessous, l‘énergie

à fournir pour le métabolisme des molécules doit être plus

grande et au-dessus, la stabilité des enzymes est compromise.

De ce fait, même si la biodégradation est un processus pouvant

se faire toute l‘année, certains auteurs proposent qu‘elle soit

plus efficace en été qu‘en hiver (Atlas et al. 1973).

A part dans les zones hypersalées,

la salinité n’est pas une barrière

à la dégradation des

hydrocarbures.

Il semblerait que la salinité n‘ait que peu d‘impact sur la

dégradation des hydrocarbures. Le métabolisme de ces

molécules est compatible avec des salinités très faibles (eaux

douces) ou plus élevées (eau de mer) puisqu‘il concerne, dans

ces deux types de milieux, des microorganismes adaptés à ces

salinités. Seules de très fortes salinités comme celles des

marais salants seraient un frein à la dégradation en raison du


manque d‘oxygène régnant dans ces zones (Ward et al. 1978).

L’oxygène est prépondérant dans

le métabolisme des

hydrocarbures.

Les ressources en oxygène constituent un facteur

particulièrement important dans la biodégradation des

hydrocarbures (Cerniglia 1992). En effet, en milieu aérobie, la

dégradation des hydrocarbures est initiée par une étape

d‘oxydation faisant intervenir des hydroxylases et des

oxygénases à forte dépendance en oxygène. En milieu

anaérobie, l‘oxygène est remplacé par d‘autres types

d‘accepteurs d‘électrons mais le rendement y est

drastiquement réduit, la dégradation y est donc

particulièrement lente (ex : sédiments) (Coates et al. 1997).

Les fortes pressions diminuent

drastiquement la dégradation des

hydrocarbures.

Enfin, la pression semble également être un facteur

important dans la dégradation des hydrocarbures. Dans le cas

d‘un accident pétrolier, l‘attention est généralement portée sur

le pétrole qui s‘étale à la surface de l‘eau mais une grande

partie de ce pétrole coule au fond de la mer. Or la profondeur

moyenne des mers et océans est de 3800m, ce qui correspond

à une pression de 380 bars, un état qui ralentit fortement

l‘activité métabolique des microorganismes. Même s‘il a été

observé des phénomène de dégradation sous des pressions très

élevées (4940 m de profondeur) (Schwarz et al. 1975), le

manque d‘oxygène, et la faible température qui règnent au

fond des océans s‘ajoutent à la forte pression et rendent la

dégradation des hydrocarbures particulièrement lente par

rapport à la surface (Leahy et al. 1990).

Pour l‘ensemble de ces paramètres (UV, température,

salinité, ressources en oxygène et pression), les communautés

bactériennes impliquées dans la dégradation des

hydrocarbures présentent des spécificités. Ces contraintes

environnementales peuvent être particulièrement marquées et

variables d‘un endroit à un autre. Qu‘il y ait du pétrole ou non,

les communautés bactériennes y sont généralement adaptées

(Baldwin et al. 2005). Nous pouvons prendre comme exemple

Les facteurs d’origine abiotique

influencent les communautés

bactériennes impliquées dans la

dégradation du pétrole.

marquant les différences qui opposent les communautés

bactériennes hydrocarbonoclastes des milieux pélagiques et

benthiques.

Note pour le lecteur : le benthos est cité ici à titre d‘exemple en

comparaison avec le milieu pélagique mais nous tenons à préciser que

l‘ensemble des travaux de cette thèse reposent sur la dégradation des

hydrocarbures dans la colonne d‘eau uniquement.

La présence d‘oxygène dans le pelagos et l‘anaérobie

présente après quelques millimètres dans le benthos

déterminent complètement la composition des communautés

bactériennes et les métabolismes impliqués dans la

dégradation des hydrocarbures (Miralles et al. 2007). Les

facteurs environnementaux abiotiques sont donc des

paramètres importants dans la réponse des communautés

bactériennes aux hydrocarbures et ont une influence sur leur

biodégradation (Freijer et al. 1996; Sugai et al. 1997). Nous en

avons présenté cinq, dans cette partie, qui contribuent

généralement de manière significative à la structuration des

communautés bactériennes contaminées par le pétrole. Mais

ces facteurs sont bien plus nombreux et d‘autres comme le pH,

la houle ou encore le vent ont également leur importance. Il

serait inutile d‘en faire l‘inventaire complet ici mais nous

pouvons retenir que ces facteurs dans leur ensemble devraient

être systématiquement pris en compte dans les études sur la

biodégradation des pétroles, le choix des facteurs à étudier

dépendant bien sûr du type d‘environnement (zone pélagique

avec la lumière, la salinité, la température versus zone

benthique avec entre autres la pression, la teneur en oxygène

et la granulométrie, par exemple) (Bianchi et al. 1988).

3.1.4. Ressources en sels nutritifs (bottom-up)

Le métabolisme bactérien repose sur l‘utilisation de sels

nutritifs permettant de synthétiser les constituants cellulaires

(glucides, lipides, protéines et acides nucléiques). Ces sels

nutritifs sont :


- le carbone, principal constituant cellulaire

- l‘azote et le phosphore, constituants des acides nucléiques et

des protéines

- le fer, le potassium, le cuivre, le zinc ou le magnésium qui

servent le plus souvent de co-facteurs dans les réactions

métaboliques.

- des éléments à l‘état de traces.

Les sels nutritifs ne sont pas

équitablement répartis dans le

milieu marin.

En milieu naturel, le manque de

ressources nutritives conduit à la

limitation de la croissance et de la

respiration bactérienne.

Un profil « classique » des ressources en azote et phosphore

dans une colonne d‘eau stratifiée montre le plus souvent une

concentration très faible dans la zone euphotique supérieure et

des concentrations plus fortes proches du sédiment. On parle

de nitrocline et de phosphacline pour exprimer la diminution

brutale de ces sels nutritifs avec la profondeur. De même que

généralement les quantités en sels nutritifs sont plus faibles au

large que près des côtes en raison des apports par les fleuves

(Conley 1999). En milieu pélagique, leur consommation

rapide par les microorganismes et le manque d‘apports

allochtones conduisent souvent à des limitations. Des

expériences en mésocosmes ont notamment montré que dans

certaines zones comme la Méditerranée Nord-occidentale, le

phosphore pouvait être un élément limitant pour la croissance

et la respiration bactérienne (Wambeke et al. 2002).

D‘ailleurs, bon nombre d‘études ont révélé que les ressources

nutritives pouvaient expliquer en partie la structuration des

communautés bactériennes aquatiques (Cho et al. 2004;

Ghiglione et al. 2008; Pradeep Ram et al. 2008).

Lors de déversements, le pétrole fournit une grande

quantité de carbone utilisable par les bactéries alors qu‘il ne

contient que très peu d‘azote et de phosphore (sous forme de

molécules particulièrement récalcitrantes à la dégradation la

plupart du temps). Il se crée alors un déséquilibre entre les

ressources en carbone, azote et phosphore, les rapports

stœchiométriques classiques entres les différents éléments

Les ressources en sels nutritifs

limitent la croissance bactérienne

et donc la biodégradation des

hydrocarbures.

En plus de son effet sur

l’abondance bactérienne, le

manque de ressources nutritives

influence la structure des

communautés bactériennes

impliquées dans la dégradation

du pétrole.

(rapport de Redfield : C :N :P = 106 :16 :1) sont bouleversés.

Le développement des bactéries hydrocarbonoclastes est alors

drastiquement limité par les ressources en nutriments

inorganiques ; ceci étant particulièrement valable en zone

oligotrophe (Atlas et al. 1972). La biodisponibilité des

nutriments limitant pour la croissance et la biomasse, en

particulier l‘azote et le phosphore, est un facteur clé dans le

processus de bioremédiation naturelle des hydrocarbures. En

plus de limiter l‘abondance bactérienne, il semblerait que la

disponibilité des nutriments puisse avoir un rôle important

dans la structuration des communautés dégradant le pétrole.

Selon le lieu de la catastrophe et les quantités de sels nutritifs

disponibles, l‘apport de pétrole pourrait sélectionner certaines

bactéries plutôt que d‘autres au sein des communautés en

fonction de leurs besoins en azote et phosphore (Röling et al.

2002; Head et al. 2006). Roling et al (2002) ont montré

qu‘une même communauté bactérienne ne s‘adaptait pas de la

même façon au pétrole selon les quantités d‘azote et de

phosphore disponibles. De plus, en milieu limité, les bactéries

hydrocarbonoclastes seraient en compétition pour les

nutriments avec les bactéries non-dégradantes et le

phytoplancton. Un tel partage des ressources a été

conceptualisé par la « ressource-ratio theory » appliqué aux

milieux pollués (Smith et al. 1998). Cette théorie prédit que la

structure et la fonction des communautés biologiques sont

influencées non seulement par la quantité limitée en

nutriments mais aussi par les besoins de chacun des différents

organismes pour la ressource en fonction de leurs besoins

métaboliques spécifiques. Elle aide à prédire la composition et

les propriétés des communautés bactériennes

hydrocarbonoclastes (Smith et al. 1998; Head et al. 2006).

Note pour le lecteur : le manque de ressources nutritives est un problème

majeur dans l‘élimination naturelle des hydrocarbures. Il sera plus

largement abordé dans la partie « bioremédiation » de cette introduction générale. Nous verrons alors comment s‘affranchir de cette limitation et

quelles en sont les conséquences pour la biodégradation des hydrocarbures.


3.1.5. Récurrence de la pollution

La récurrence des pollutions

pétrolières conditionnent la façon

dont les communautés

bactériennes peuvent réagir à un

apport de pétrole.

Les bactéries provenant d’un site

chroniquement pollué sont

davantage réactives que celles

d’un site dépourvu de pollution.

Différents auteurs ont suggéré que des communautés

bactériennes soumises de manière chronique à des

contaminants pétroliers répondraient plus favorablement à un

nouvel apport que des communautés n‘ayant jamais été

soumises à une contamination (Bartha 1986). Pourtant cette

hypothèse a été très peu testée expérimentalement.

L‘adaptation de certaines communautés bactériennes aux

hydrocarbures s‘explique par trois mécanismes majeurs.

D‘abord, dans la mesure où le pétrole stimule la prolifération

des bactéries hydrocarbonoclastes en leur offrant un avantage

sélectif, les milieux pollués chroniquement sont plus riches en

bactéries hydrocarbonoclastes (HCB). En cas d‘apport soudain

de pétrole, l‘abondance relative de ces HCB permet d‘assurer

la mise en place rapide d‘un consortium de dégradation (Atlas

1981; Cooney 1984). Ensuite, les bactéries sont capables de

transférer des gènes du catabolisme des hydrocarbures par

conjugaison. Toujours en raison du nombre d‘HCB, la

probabilité pour que ce type d‘échange survienne dans un

environnement chroniquement pollué est plus grande (Hada et

al. 1981; Leahy et al. 1990). Enfin, dans les zones polluées,

des mécanismes d‘induction des enzymes d‘intérêt ont été

retrouvés en présence de pétrole (Suzuki et al. 2001; Priefert et

al. 2004).

En terme de structure de communautés, cette adaptation se

traduit par une plus grande stabilité des bactéries face à

l‘apport de pétrole dans les zones chroniquement polluées.

Cette stabilité confère aux bactéries la capacité de répondre

plus rapidement aux nouvelles sources d‘hydrocarbures que

les bactéries dépourvues de contamination (Head et al. 2006;

Maila et al. 2006; Bordenave et al. 2007). Cela leur permet

également de dégrader avec plus d‘efficacité les composés les

plus simples et de débuter la dégradation des composés les

plus complexes plus rapidement grâce à une machinerie

enzymatique pré-adaptée (Riis et al. 1995; Bordenave et al.

2008). Les expériences de bioremédiation devraient donc

prendre davantage en compte l‘historique du site pollué.

Note pour le lecteur : Un des chapitres de cette thèse est en grande partie

consacré à l‘évaluation expérimentale de l‘effet de la récurrence de la

pollution sur la capacité des communautés bactériennes à répondre à un

déversement soudain de pétrole (chapitre 2).

3.2. Les facteurs de type top-down

Nous avons vu précédemment que les communautés

bactériennes pouvaient être affectées par des facteurs

environnementaux abiotiques. Les facteurs biotiques sont

également responsables d‘une grande partie de la mortalité

bactérienne et induisent, tout autant que les facteurs

abiotiques, des changements de structure de communauté chez

les bactéries marines (Miki et al. 2008).

Bien qu’ils jouent un rôle

majeur, les facteurs de type « top-

down » sont très peu considérés

dans les études sur la

biodégradation des

hydrocarbures.

Notre pour le lecteur : il est important à ce stade de l‘introduction de

définir l‘attaque bactérienne par les protozoaires et les virus. La prédation désignant la plupart du temps un mode d‘ingestion, nous choisissons dans

ce manuscrit de le réserver à l‘attaque bactérienne par les protozoaires.

Nous parlerons de lyse virale en ce qui concerne l‘attaque par les virus. De

plus, nous assumons le fait que la prédation des bactéries est

majoritairement assurée par les nanoflagellés hétérotrophes et les ciliés

(tous deux appartenant aux protozoaires). Aussi l‘attention sera consacrée à

ces deux groupes pour évaluer la prédation sur le compartiment bactérien

en milieu aquatique (Atlas et al. 1976).

Les protozoaires et les virus tiennent une place centrale

dans les écosystèmes marins. Comme les bactéries, ils sont

ubiquistes, abondants et diversifiés autant par leur tailles que

par leurs modes nutritionnels (Kirchman et al. 2008). Il ne fait

désormais aucun doute que la prédation par les protozoaires et

la lyse virale jouent un rôle particulièrement important dans la

régulation des communautés bactériennes marines. En cas de

pollution pétrolière, l‘abondance, la diversité et l‘activité

bactérienne sont des paramètres cruciaux dans l‘élimination

des polluants. L‘évaluation du « top-down control » sur ces


paramètres devrait donc être systématique dans les études sur

la bioremédiation des hydrocarbures. Pourtant, si les

connaissances sur les virus et les protozoaires ont largement

progressé ces dernières années, leur considération dans les

milieux pollués est encore très rare et les quelques études qui

leur sont consacrées donnent des résultats contradictoires.

Cette partie a donc pour objectif de faire le point sur les

connaissances actuelles sur les milieux pollués mais aussi

d‘établir un parallèle avec les données acquises en milieux non

pollués.

3.2.1. Dynamique de l‘abondance des protozoaires, des virus et des bactéries

Les protozoaires et les virus ne

sont pas éliminés par les pétroles

et sont capables de limiter la

concentration bactérienne dans

les zones polluées, laissant

supposer un effet négatif sur la

biodégradation des

hydrocarbures.

Les protozoaires phagotrophes et en particulier les

nanoflagellés hétérotrophes (HNF, 2-10µm) ainsi que les virus

sont les premiers responsables de la mortalité bactérienne

(Fuhrman et al. 1995). Par conséquent, ils régulent la

concentration bactérienne en milieu marin (Fuhrman et al.

1995; Zhang et al. 2007). Leurs abondances relatives semble

beaucoup varier dans l‘espace et dans le temps et serait

fonction de l‘état physiologique et de l‘abondance de leur

proies (Guixa-Boixareu et al. 1996; Pedrós Alió et al. 2000).

Les changements successifs d‘abondance des bactéries, virus

et protozoaires forment généralement des cycles proie-

prédateur (Fig. 13) permettant aux trois compartiments de se

maintenir autour de concentrations constantes tout au long de

l‘année (Pernthaler 2005).

Figure 13 : Alternance proie-prédateur entre les abondances bactériennes, virales et/ou de protozoaires

illustrant la dynamique du « killing the winner ».

Alors que les concentrations totales en bactéries et virus restent relativement constantes dans le temps, les

concentrations individuelles des différents groupes changent complètement. Comme le groupe bactérien 1 est abondant, les virus et protozoaires adaptés aux bactéries de ce groupe deviennent abondants à leur tour et

éliminent la population bactérienne. Un deuxième type bactérien est alors avantagé par l‘élimination du

compétiteur 1 et peut se développer. Une population virale et/ou de protozoaires infecte alors ce deuxième

groupe et celui-ci est à son tour éliminé. Une troisième population bactérienne peut prendre sa place et ainsi de

suite. Ce modèle montre des changements drastiques dans la structure de communauté et un maintien de la

diversité bactérienne avec des abondances relatives amplifiées sous conditions de pollution pétrolière, suggérant

un effet notable des protozoaires et des virus sur les bactéries et donc sur la dégradation des hydrocarbures.

Adapté de Kirchman et al., 2008.

De manière générale, les virus sont retrouvés en plus grand

nombre dans les milieux eutrophisés et les zones côtières, où

les bactéries sont plus abondantes (Weinbauer et al. 1993;

Wilhelm et al. 1999). Le nombre de protozoaires est

également plus élevé lorsque l‘abondance bactérienne

augmente (Bak et al. 1987). Comme on l‘a vu plus tôt, dans

les zones polluées par les hydrocarbures, les bactéries se

multiplient largement grâce à l‘abondante quantité de carbone.

Les protozoaires et les virus sont dans un premier temps

affectés par les effets toxiques du pétrole, mais par la suite

leurs effectifs sont augmentés en raison du plus grand nombre

de bactéries (Fig. 13), laissant supposer un effet accru du

« top-down » sur les populations bactériennes (Kota et al.

1999). Toyoda et al. (2005) ont par exemple noté une

augmentation de l‘abondance bactérienne après l‘ajout de

kérosène ou de pétrole de type Bunker-A suivie par une


Les protozoaires seraient plus

sensibles au pétrole que les virus,

offrant à ces derniers un

avantage sélectif dans les milieux

pollués.

prolifération des protozoaires et des virus. Néanmoins, il

semblerait que les protozoaires soient plus sensibles aux

molécules toxiques que les virus. Il a en effet été montré que

certains protozoaires ne survivaient pas à la pollution (Dalby

et al. 2007). Cette sensibilité des protozoaires offrirait aux

virus un avantage certain pour l‘utilisation de la ressource

bactérienne. Toyoda et al. (2005) ont d‘ailleurs proposé que la

sensibilité et la prévalence des protozoaires face au pétrole

puisse être un des facteurs clé dans l‘évolution de la chaine

trophique microbienne dans les environnements pollués. De

plus, il a été montré qu‘un certain nombre de polluants comme

en particulier les HAP, seraient des stimulants de la

production virale, un phénomène appelé « prophage

induction » (Jiang et al. 1996; Cochran et al. 1998). Les virus

seraient donc capables de survivre à l‘apport de pétrole mais

en plus pousseraient les bactéries à rentrer dans un cycle

lytique en présence de certains hydrocarbures (Tableau 4). Ils

auraient donc un impact non négligeable sur l‘abondance

bactérienne en milieu pollué et donc sur l‘efficacité de

biodégradation des polluants.

Tableau 4 : Efficacité de différents agents d’induction de lyse virale sur des bactéries marines (Jiang et al.

1996).

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont les agents qui provoquent le plus la lyse des bactéries parmi

un ensemble de facteurs d‘induction à la fois biochimiques et physiques.

3.2.2. Impact des protozoaires et des virus sur la structure des communautés

bactériennes

Les interactions entre les bactéries, les virus et les

protozoaires sont complexes et portent au-delà de la simple

Les protozoaires et les virus

régulent la structure des

communautés bactériennes dans

les zones polluées.

relation d‘abondance entre les proies et les prédateurs. Non

seulement les protozoaires et les virus ont un impact avéré sur

l‘abondance bactérienne, mais ils sont également capables de

réguler la structure des communautés bactériennes dans les

milieux non pollués (Suzuki 1999; Weinbauer et al. 2004;

Longnecker et al. 2010) comme pollués (Kota et al. 1999;

Danovaro et al. 2003). La probabilité de rencontre entre un

prédateur et sa proie étant aléatoire, plus un groupe bactérien

est abondant, plus il est exposé à la prédation. Les groupes

bactériens majoritaires sont donc plus touchés par les

protozoaires et les virus. Cela conduit à une réduction de leur

effectifs et induit des changements de structure de

communauté, un phénomène appelé « killing the winner »

(Fig. 13) (Thingstad et al. 1997; Thingstad 2000; Pernthaler

2005).

La prédation par les protozoaires

et la lyse virale permettent un

renouvellement des communautés

bactériennes.

En milieu pollué, les communautés bactériennes sont

dominées par quelques groupes majoritaires, avantagés

sélectivement par l‘apport de pétrole. La prédation pourrait

donc affecter préférentiellement ces groupes d‘intérêt (Jürgens

et al. 2000; Jiang et al. 2006) et ainsi diminuer la dégradation

des hydrocarbures. Dans ce cas, les protozoaires et les virus

contraindraient négativement les communautés bactériennes

impliquées dans la dégradation du pétrole. Toutefois, il a été

montré à plusieurs reprises que les effets de type « top-down »

pouvaient être également positifs pour les bactéries car ils

maintiendraient une diversité métabolique chez les

populations bactériennes (Middelboe et al. 2003; Corno et al.

2008). Les données sur ce sujet manquent drastiquement

concernant les environnements pollués, mais on peut supposer

qu‘un tel contrôle des virus et des protozoaires sur les

bactéries puissent être à l‘origine d‘un renouvellement dans

les communautés bactériennes qui permettrait une meilleure

dégradation des hydrocarbures.


La prédation par les protozoaires

se fait le plus souvent en fonction

de la taille des proies

bactériennes.

Les virus sont également

spécifiques de leur hôte, c’est la

condition sine qua none pour que

les virus puissent adhérer à la

surface des cellules bactériennes.

L‘attaque sélective des protozoaires sur les bactéries est un

phénomène répandu et explicable par plusieurs mécanismes.

D‘abord il semblerait que la prédation des protozoaires sur les

bactéries soit taille-spécifique. Les cellules les plus grandes

ont une probabilité de contact avec les prédateurs supérieure

aux autres, elles sont donc davantage impactées par le « top-

down control » (Šimek et al. 1997; Hahn et al. 1999; Jurgens

et al. 1999). Pour la même raison, les cellules en division

seraient aussi plus exposées à la prédation (Sherr et al. 1992).

Wotton et al. (2007) ont également trouvé des mécanismes de

reconnaissance des proies chez les protozoaires via des

épitopes de surface cellulaires. Indépendamment de la taille

des bactéries, les protozoaires pourraient donc « choisir » leur

proie.

L‘attaque spécifique des virus pour certains groupes

bactériens a également été vérifiée (Thingstad 2000;

Weinbauer et al. 2004). L‘une des principales raisons est leur

adaptation pour l‘infection d‘hôtes particuliers via des

récepteurs qui leurs sont spécifiques à la surface des cellules

bactériennes (Moebus et al. 1981; Moebus 1992). Un certain

nombre d‘autres effets, plus indirects peuvent être évoqués

pour expliquer l‘impact des virus sur la structure des

communautés bactériennes : par exemple, la libération de

substrat labile lors de la lyse virale peut favoriser certains

groupes bactériens non infectés (Middelboe et al. 2003), les

virus sont capables de transférer des gènes à leurs hôtes ou

encore certains hôtes pourraient trouver un avantage au cycle

lysogénique des virus (Jiang et al. 1998; Wommack et al.

2000). Un grand travail reste à faire concernant la spécificité

des virus pour les bactéries hydrocarbonoclastes en particulier.

3.2.3. Impact des protozoaires et des virus sur l‘activité bactérienne

Les virus et les protozoaires ont un impact à la fois sur

l‘abondance et la diversité bactérienne. C‘est donc sans

surprise que les études sur le « top-down control » observent

également un effet sur l‘activité bactérienne (del Giorgio et al.

1996; Hahn et al. 2001; Danovaro et al. 2003). Le principal

challenge étant de déterminer si cet effet est positif, à savoir

s‘il favorise l‘activité bactérienne (par des phénomènes

indirects de stimulation ; la dégradation des hydrocarbures par

exemple) ou si au contraire il est négatif, en contraignant

l‘abondance des bactéries et donc in fine en limitant l‘activité

bactérienne totale (ralentissement de l‘élimination naturelle du

pétrole).

La prédation et la lyse virale ont

des effets pouvant tout aussi bien

stimuler qu’inhiber l’activité des

communautés bactériennes.

L’effet négatif du « top-down » se

traduit par une sélection de

groupes bactériens peu actifs.

Cela pourrait avoir des

conséquences dramatiques pour

la dégradation des

hydrocarbures.

En réalité, il semblerait que ces effets antagonistes

interviennent tour à tour, les protozoaires et les virus agissant

comme des régulateurs (plus que des stimulants ou des

inhibiteurs à part entière) de l‘activité bactérienne (Miki et al.

2008). Del Gorgio et al. (1996) ont montré que les bactéries

métaboliquement actives subissaient une prédation quatre fois

plus importante que les bactéries non actives. Deux autres

études ont confirmé que la lyse virale des bactéries les plus

actives diminuait la production bactérienne au large de la mer

Méditerranée (Bonilla-Findji et al. 2009) comme près des

côtes (Zhang et al. 2007). La prédation et la lyse virale

sélectionneraient donc des bactéries dormantes ou/et

résistantes faisant diminuer l‘activité bactérienne totale (Hahn

et al. 2001). En cas de pollution pétrolière, les bactéries

avantageusement sélectionnées par l‘apport d‘hydrocarbures

sont généralement très actives (Bordenave et al. 2007;

Cappello et al. 2007; Coulon et al. 2007). Il serait donc

possible que ces bactéries soient particulièrement exposées à

la prédation en raison de leur grande activité, ce qui

reviendrait à éliminer les principaux groupes bactériens

impliqués dans la dégradation des hydrocarbures, avec un effet

supposé négatif sur celle-ci. Pourtant dans leur étude, del


L’effet positif du « top-down »

serait dans le maintien de

l’activité bactérienne globale par

une forte pression de prédation et

une libération de nutriments par

les cellules bactériennes digérées

ou lysées.

Le « priming effect » est l’apport

de matière labile permettant une

meilleure dégradation de matière

difficilement dégradable.

Gorgio et al. (2006) suggéraient que cette attaque

préférentielle des bactéries actives combinée avec la pression

de prédation empêchait l‘ensemble des groupes bactériens de

rentrer en phase stationnaire de croissance, maintenant ainsi

l‘activité globale de la communauté. Ce phénomène serait

expliqué par la libération de matière labile (stérols, acides gras

saturés, etc…) par les protozoaires phagotrophes et les cellules

bactériennes lysées par les virus. Cette idée est d‘autant plus

pertinente pour les virus qui, induisant la lyse bactérienne,

libéreraient de la matière organique très peu altérée et

facilement dégradable alors que le transport de cette matière à

travers les vacuoles phagocytaires des flagellés subirait

davantage de dommages notamment sous l‘action d‘enzymes

hydrolytiques (Noble et al. 1999; Riemann et al. 2002; Salcher

et al. 2007). Là où dans les milieux non pollués, ce relargage

stimule directement les bactéries, un effet supplémentaire

devrait être ajouté en milieu pollué par les hydrocarbures.

Dans ce cas, le carbone n‘est pas limitant. Il serait donc

logique que la matière organique libérée par la lyse des

bactéries et le broutage des protozoaires ne stimule pas ou peu

les bactéries restantes. Toutefois, il a été remarqué dans les

études sur les communautés bactériennes du sol, qu‘une

source de matière organique facilement dégradable pouvait

favoriser la dégradation de matière de moins bonne qualité, un

effet connu sous le nom de « priming effect » (Bingeman et al.

1953; Fontaine et al. 2003). Par cet effet, le métabolisme de la

matière organique labile libère de l‘énergie favorisant

l‘activité générale des bactéries, ce qui leur permet d‘assimiler

plus facilement les composés plus complexes. Bien qu‘il n‘y

ait aucune étude équivalente en condition de pollution par les

pétroles, il vient d‘être montré que cette théorie serait tout à

fait valable, voire même prépondérante en milieu marin

(Guenet et al. 2010). Nous pouvons émettre l‘hypothèse que le

La libération de matière

organique et de sels nutritifs

induite par la lyse virale et la

phagotrophie pourrait stimuler

les bactéries hydrocarbonoclastes

dans leur fonction de

biodégradation des

hydrocarbures.

relargage de matière fraiche par les protozoaires et les cellules

lysées augmenterait l‘activité de la communauté bactérienne

totale et favoriserait les bactéries hydrocarbonoclastes dans

leur fonction de dégradation des hydrocarbures. Si cette

hypothèse s‘avérait juste, elle pourrait offrir de nouvelles

pistes concernant la biostimulation des bactéries

hydrocarbonoclastes (voir partie 3 de cette synthèse

bibliographique).

Outre la matière organique, ce relargage permettrait

également de libérer 50% de l‘azote et du phosphore ingéré

par les flagellés au cours de la prédation sous forme

inorganique (Fenchel 1982; Güde 1985). Dans la mesure où

les bactéries impliquées dans la dégradation du pétrole sont la

plupart du temps limitées par les sels nutritifs, un tel apport

favoriserait radicalement l‘activité bactérienne et la

biodégradation des hydrocarbures. Le peu d‘études qui

évaluent l‘impact de la lyse virale et/ou du broutage par les

protozoaires sur l‘activité bactérienne et la biodégradation

montrent des résultats contrastés et ne permettent pas se

s‘orienter clairement vers les unes ou les autres hypothèses

présentées ici. Alors que Kota et al. (1999) ont trouvé un effet

négatif de la prédation sur la dégradation des hydrocarbures,

Mattison et al. (2005) au contraire, ont démontré que celle-ci

favorisait la dégradation des alkylbenzènes et Tso et Taghon

(2006) arrivèrent à la même conclusion pour la minéralisation

du phénanthrène. Il y a de fortes chances pour que ces effets

soient variables en fonction du lieu de l‘étude et de l‘état

physiologique des communautés de prédateurs et de proies

(Weinbauer et al. 2007; Miki et al. 2008).

Finalement, la plupart des études réalisées par le passé pour

évaluer l‘importance du « top-down » sur les communautés

bactériennes en milieu pollué se sont focalisées sur

l‘abondance des différents microorganismes (tableau 5). Des


études supplémentaires sont nécessaires pour renseigner sur

l‘effet du « top-down » sur la structure et l‘activité des


Tableau 5 : Aperçu des études sur le « top-down control » en milieu marin pollué par les hydrocarbures.

Principe de l’étude Observations Impact sur les

bactéries Référence

Mésocosme avec des protozoaires

pélagiques (<50 µm) et un

traitement aux hydrocarbures

Elimination complète des ciliés sous l‘effet

des polluants

Croissance des HNF en 3 jours

Limitation de l‘abondance

bactérienne par les

protozoaires

Bak et

Nieuwland

(1987)

Induction expérimentale de virus

par ajout de polluants à partir

d‘échantillon naturel

Les polluants induisent le cycle lytique des

bactéries et augmente la production virale

Cochran et al.

(1998)

Prédation des bactéries par le

protozoaire Tetrahymena

pyriformis dans des cultures de

dégradation du toluène

Effet du toluène sur le protozoaire à des fortes

concentrations uniquement


bactérienne par le protozoaire

Cox et al.

(1999)

Effet du pétrole brut de type

Ekofisk sur un écosystème

planctonique

Les polluants inhibent la croissance des

diatomées et des copépodes mais stimule les

bactéries, les choanoflagellés et les ciliés

La prédation n‘affecte pas

l‘abondance bactérienne

Dahl et al.

(1983)

Microcosme pour tester l‘impact

du pétrole sur les microeucaryotes

marins et leur effet sur les


La structure des communautés des

microeucaryotes est modifiée par l‘ajout de

pétrole au profit de Paraphysomonas

foraminifera



microeucaryotes

Dalby et al.

(2007)

Revue sur les virus et la pollution

marine La pollution augmente la production de virus par les bactéries

Danovaro et al.

(2003)

Induction expérimentale de virus

par ajout de polluants à partir

d‘échantillon naturel

Les polluants induisent le cycle lytique des

bactéries et augmente la production virale

Jiang et Paul.

(1996)

Test de l‘influence de la prédation

par les protozoaires sur la

biodégradation du pétrole dans des

sédiments d‘aquifère

Les protozoaires résistent au pétrole



protozoaires

Kota et al.

(1999)

Mésocosmes pour étudier les

changements de communauté de

flagellés et de ciliés marins sous

l‘influence de pétrole brut

Augmentation de l‘abondance des flagellés et

ciliés après l‘ajout de pétrole

La structure des communautés des

microeucaryotes est modifiée par l‘ajout de

pétrole au profit des Euplotidae et des

Scuticociliatia de grande taille

Limitation de l‘abondance et

de la production bactérienne

par les flagellés et les ciliés

Gertler et al.

(2010)

Mésocosme pour étudier

l‘interaction bactéries-HNF-virus

sous addition de pétrole lourd

Virus et HNF résistent à la pollution


bactérienne par les HNF et les

virus

Ohwada et al.

(2003)

Réponse expérimentale d‘un

écosystème marin au pétrole brut

et au Corexit 9527

Augmentation de l‘abondance des bactéries et

des zooflagellés après ajout de pétrole +

Corexit



zooflagellés

Parsons et al.

(1984)

Protozoaires de la subsurface d‘un

sédiment pollué par du gazole

Les protozoaires se multiplient fortement

même sous influence du pétrole

Pas d‘impact sur l‘abondance

bactérienne. Suspicion même

d‘un effet positif des

protozoaires

Sinclair et al.

(1993)

Mésocosme pour étudier les

interactions bactéries-HNF-virus

sous addition de bunker-A ou de

kérosène

Le kérosène inhibe les HNF et les virus alors

que le Bunker-A les stimule

Les Virus et HNF sont en compétition pour

les bactéries


bactérienne par les HNF et les

virus

Toyoda et al.

(2005)

Etude des facteurs qui influencent

la prédation de Cyclidium sp. et

Euplotes sp. (deux ciliés) sur des

bactéries PAH-dégradantes

Les multiples propriétés des bactéries (taille,

hydrophobicité, C : N ratio, contenu en

protéines et capacité de dégradation des PAH)

influence leur sensibilité à la prédation par les

ciliés.

La capacité de dégradation des

PAH n‘a pas d‘importance

dans la sensibilité des

bactéries aux ciliés

Tso et Taghon

(1998)

Effet des protozoaires sur la

minéralisation du naphtalène dans

les sédiments marins

Les bactéries sont 9 fois moins abondantes

lorsqu‘il n‘y a pas de protozoaires

La dégradation du naphtalène

est 4 fois plus importante dans

le milieu avec protozoaires

Tso et Taghon

(2006)

3.2.4. Mécanismes de résistance bactériens et interactions virus - protozoaires

Au cours de l’évolution, les

bactéries ont appris à résister à la

prédation.

Les bactéries

hydrocarbonoclastes résistantes

aux protozoaires et aux virus

pourraient être avantagées par

rapport aux bactéries sensibles

dans la cas d’un pollution

pétrolière.

Les protozoaires peuvent

également ingérer des virus et les

virus peuvent infecter les

protozoaires.

On distingue différentes stratégies chez les bactéries pour

échapper au broutage par les protozoaires. Elles peuvent par

exemple former des filaments (Jurgens et al. 1999), augmenter

leur mobilité (Matz et al. 2002) ou encore se diviser en deux

cellules, une de grande taille très active et une de petite taille

inactive (Lebaron et al. 1999). Les bactéries ont également

développé des mécanismes de résistances contre les virus

notamment par mutation de la structure des récepteurs

membranaires permettant d‘éviter l‘attachement aux virus, la

production d‘ecto-enzymes capables d‘hydrolyser les

protéines de capside virale ou encore la délétion spontanée

d‘une partie de génome bactérien (Weinbauer et al. 2004). Ces

phénomènes de résistance ont un « coût » énergétique qui se

traduit par une baisse de la compétitivité chez certains groupes

bactériens (Lenski 1988). Il est tout à fait probable qu‘en cas

de pollution pétrolière, la résistance aux flagellés et/ou aux

virus soit un avantage sélectif pour certains types de bactéries

et pour les bactéries hydrocarbonoclastes en particulier. Bien

qu‘il n‘existe aucune étude à ce jour sur le sujet, nous pouvons

émettre l‘hypothèse que l‘effet concomitant de la compétition

entre les bactéries pour les ressources en carbone et les

capacités de résistances de certaines d‘entre elles pourraient

conduire à la sélection de groupes bactériens particuliers, tout

à fait spécifiques du milieu et des prédateurs.

Enfin, les interactions entres les flagellés et les virus eux-

mêmes ne peuvent être ignorées car elles pourraient être

déterminantes pour leurs effets synergiques sur les bactéries.

En effet, les protozoaires et les virus sont en compétition pour

la ressource bactérienne (Fuhrman 1999). Les flagellés

peuvent également ingérer des virus. Selon Gonzales et Suttle

(1993), 2,6 à 4,8% de la production virale serait absorbée par


les flagellés en zone côtière marine. Inversement, certaines

études ont montré une augmentation de la production virale en

présence de flagellés via une meilleure activité bactérienne

(Šimek et al. 2001; Sime-Ngando et al. 2005; Weinbauer et al.

2007). Les virus peuvent à leur tour infecter les flagellés

(Massana et al. 2007). Le diagramme de Miki et Jacquet

(2008) ci-dessous (Fig. 14) illustre bien la complexité des

échanges et impacts que peuvent avoir les bactéries, les virus

et les protozoaires entre eux. De nouvelles investigations sont

nécessaires pour évaluer plus précisément l‘importance et

l‘effet de ces interactions sur les assemblages microbiens en

milieu pollué.

Figure 14 : Principaux mécanismes d’interactions identifiés entre les bactéries, les HNF et les virus (Miki

et al. 2008; Berdjeb 2010).

4. La bioremédiation des hydrocarbures pétroliers

4.1. Comment remédier à la pollution pétrolière ?

La pollution d’origine

anthropique du milieu marin est

une conséquence de notre mode

de vie industrialisé et constitue

une préoccupation majeure

depuis ces 50 dernières années.

Toute substance introduite dans l‘environnement en

quantité anormale est considérée comme un contaminant. Un

excès de contaminant peut aboutir à une contamination. Les

effets délétères que les contaminants ont sur la faune et la flore

conduisent à la pollution des écosystèmes. Les pollutions

marines sont définies par l‘organisation maritime

internationale (OMI) comme « l‘introduction dans

l‘environnement marin par l‘homme, directement ou non, de

substance ou d‘énergie générant des effets néfastes sur

l‘environnement ou susceptibles d‘affecter la santé humaine,

les activités halieutiques (pêche), les sites, les aménagements

et l‘utilisation de l‘eau de mer ».

Avec des analogues de polluants tels qu‘on les définit

aujourd‘hui, provenant des activités géothermiques et

volcaniques, des poussières de l‘espace et des comètes, la

« pollution naturelle » représente 100 tonnes de matériel par

jour (Marcano et al. 2003). Toutefois, l‘industrialisation

intensive de ces deux derniers siècles est la source de

nombreuses pollutions bien plus dommageables pour

l‘environnement que la pollution naturelle. Les substances

chimiques sont désormais déversées de manière soudaine, dans

de petites zones et dans des écosystèmes souvent peu adaptés

aux molécules polluantes avec des dommages extrêmement

importants sur les écosystèmes. Les substances chimiques

issues de l‘activité humaine sont nombreuses. On trouve parmi

les polluants les plus courants :

- les hydrocarbures aliphatiques, aromatiques, de type benzène,

toluène, éthylbenzène et xylène (BTEX),

- les hydrocarbures chlorés comme les biphényles polychlorés

(PCB), le trichloréthylène (TCE), le perchloréthylène (PCE),


Les sources et les types de

pollutions sont nombreux et

provoquent des dommages

extrêmement importants sur les

écosystèmes.

Un ensemble de formations

gouvernementales et de

réglementations ont été mises en

place ces dernières années pour

faire face à la pollution

pétrolière.

Au niveau international, on peut

retenir le Oil Pollution Act qui

est un véritable guide de la

pollution pétrolière en milieu

marin.

- les composés nitro-aromatiques et organophosphorés,

- les solvants (ex : white spirit)

- les pesticides

- les métaux lourds

- les dérivés de produits pharmaceutiques…

Quatre-vingt-dix pourcent de la pollution par ces molécules

est directement liée à des défaillances humaines et aux

activités industrielles, volontaires (élimination des déchets) ou

involontaires (accidents pétroliers par exemple) (Zhu et al.

2001).

En raison de l‘ampleur des dégâts, la pollution d‘origine

anthropique est donc devenue une préoccupation mondiale

(Megharaj et al. 2011), un large corpus de recherche sur la

bioremédiation de ces molécules s‘est mis en place ces

dernières décennies (Head et al. 1999) et de nombreuses

règlementations ont vu le jour.

La communauté internationale s'est notamment dotée de

textes précisant les grands principes internationaux en matière

de prévention et de lutte contre les pollutions marines.

La Convention des Nations Unies sur le Droit de la mer

(UNCLOS) comporte par exemple une partie dédiée à la

protection et la préservation du milieu marin: elle fonde la

compétence des états côtiers à réglementer la pollution par les

navires dans le respect du droit international et la possibilité de

créer des zones à protéger (ZMPV). MARPOL 73/78 est une

convention internationale pour la prévention de la pollution

par les navires. La convention OPRC (Oil Pollution

Preparedness, Response, and Cooperation) sur la préparation,

la lutte et la coopération en matière de pollution par les

hydrocarbures encourage, elle, les pays adhérents, l‘industrie

pétrolière et le secteur des transports maritimes à mettre en

place des dispositifs de lutte contre les déversements

d‘hydrocarbures. Aux Etats-Unis, le Oil Pollution Act, établi

Au niveau européen, la directive-

cadre stratégie pour le milieu

marin a pour objectif de

permettre une amélioration de

l’état du milieu marin d’ici une

dizaine d’année.

En France, des mesures ont été

prises de manière à pouvoir

répondre rapidement à une

éventuellement catastrophe

pétrolière.

en 1990 fait référence en matière de lutte contre la pollution

pétrolière.

Au niveau européen, l‘Agence Européenne pour la Sécurité

Maritime (AESM) assiste la Commission et les Etats membres

en matière de sécurité maritime, sûreté maritime et prévention

de la pollution causée par les navires. Dans la réglementation

européenne, on peut citer la directive 2008/56/CE du

Parlement européen et du Conseil du 17 juin 2008 établissant

un cadre d‘action communautaire dans le domaine de la

politique pour le milieu marin (directive-cadre « stratégie pour

le milieu marin »). Cette directive a pour objectif de pousser

les États membres de l‘Union européenne à prendre toutes les

mesures nécessaires pour réduire les impacts des activités sur

le milieu marin afin de réaliser ou de maintenir un bon état

écologique de ce milieu avant 2020. Toujours au niveau

européen, le REACH (règlement sur l'enregistrement,

l'évaluation, l'autorisation et les restrictions des substances

chimiques) a été mis en place en juin 2007 pour assurer un

niveau élevé de protection de la santé humaine et de

l'environnement contre les risques que peuvent poser les

produits chimiques. Enfin, la liste des 33 substances

prioritaires à suivre dans l‘environnement, élaborée dans le

cadre de la directive 2000/60/CE, est toujours d‘actualité. La

moitié des molécules de cette liste peuvent potentiellement

être présentes dans les pétroles (Tableau 6).

En France, un certain nombre de mesures ont été prises

pour la lutte contre la pollution pétrolière. Très concrètement,

le POLMAR est destiné à financer les opérations de

prévention et de lutte contre les pollutions marines

accidentelles. Récemment, le Grenelle de la Mer est venu

compléter les engagements pris lors du Grenelle de

l‘environnement, concernent la mer et le littoral. Il couvre un

large champ sur la thématique de la mer et de sa contribution

http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2008:164:0019:0040:FR:PDF

http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2008:164:0019:0040:FR:PDF


au développement d‘activités durables. Le CEDRE, lui, est un

centre de documentation, de recherche et d‘expérimentations

sur les pollutions accidentelles des eaux, créé au lendemain de

l‘accident de l‘AMOCO CADIZ (1978) afin de conseiller les

administrations dans le choix des techniques et des moyens les

plus appropriés pour faire face à une pollution massive.

Une présentation détaillée de toutes ces mesures

internationales et nationales sont disponibles sur le site internet

du CEDRE.

Tableau 6 : Liste des 33 substances prioritaires établie dans la circulaire DCE 2007/20 du 05/03/07 relative

à la constitution et la mise en œuvre du programme de surveillance pour les eaux littorales en application

de la directive 2000/60/CE du 23 octobre 2000 du Parlement et du Conseil établissant un cadre pour une

politique communautaire dans le domaine de l’eau. En rouge, les molécules potentiellement présentes

dans les pétroles.

Il est important de souligner que l‘ensemble des mesures,

établies durant ces 40 dernières années, ont permis de

diminuer considérablement le nombre d‘accidents pétroliers et

de rejets volontaires. Néanmoins, comme on l‘a vu en

L’élimination du pétrole en

milieu marin est un processus

long qui s’effectue en plusieurs

étapes.

Tout de suite après un épandage

de pétrole, l’objectif est de limiter

la dispersion de la nappe qui se

trouve à la surface

Ce qui n’est pas récupéré est

ensuite dispersé pour favoriser la

dissolution du pétrole dans l’eau.

introduction, la pollution pétrolière est un problème loin d‘être

éradiqué. Voici donc les opérations menées en cas de

déversement accidentel de pétrole en milieu marin.

Généralement après un épandage, on distingue 3 phases

conduisant à l‘élimination du pétrole. Pendant environ 15

jours, le pétrole s‘étend sous forme de nappe, provoquant une

forte mortalité de la faune aquatique. Ensuite la nappe se

stabilise, les processus physico-chimiques et biologiques se

mettent en place pendant quelques mois voir années. Puis

enfin, souvent au bout d‘une dizaine d‘années, on observe en

apparence un retour à l‘équilibre. Il est possible d‘intervenir à

différents moments dans ce processus pour favoriser

l‘élimination des polluants. En premier lieu, il s‘agit de limiter

la dérive de la nappe vers le littoral à l‘aide de barrages

flottants gonflables et de pomper au maximum le pétrole en

surface voir de « l‘écrémer » à l‘aide d‘un tapis roulant, ou

encore de ramasser manuellement les boulettes de goudrons

déjà échouées sur les plages. Cela a pour avantage de

récupérer une petite partie du pétrole et n‘implique pas de

déversement de produit chimique. Néanmoins, ces actions ne

sont possibles que lorsque la mer est calme et que le pétrole

forme réellement une nappe, ce qui est rarement le cas lors

d‘un épandage. Cette intervention physique, ne permet en

général de récupérer qu‘une petite partie du pétrole (5 à 15%

tout au plus). Dans un deuxième temps, l‘objectif est de

disperser et/ou de faire couler la nappe de pétrole à l‘aide de

produits de coulage ou de dispersants. Ce procédé permet

d‘augmenter les surfaces de contact eau/pétrole où ont lieu les

réactions physico-chimiques et de biodégradation. Il a aussi un

intérêt sociétal majeur puisqu‘il fait « disparaitre »

visuellement la pollution. Pour autant, il est de plus en plus

controversé car, d‘une part cela induit de forts dégâts sur les

fonds marins, des zones où la biodégradation est difficile.


La bioaugmentation et la

biostimulation sont les deux

techniques les plus performantes

pour favoriser l’élimination du

pétrole lorsque les méthodes

physiques ont déjà été employées.

D‘autre part, les produits dispersants peuvent être eux même

toxiques pour l‘environnement. Cela a été notamment le cas

lors de la catastrophe dans le golfe du Mexique, où des

quantités gigantesques de Corexit 9500 (4 millions de litres,

c‘est un record mondial) ont été déversées, dispersant le

pétrole mais aussi provoquant une deuxième catastrophe

écologique puisque ce produit est classé dans la catégorie

« toxique pour l‘environnement » (Steiner 2010).

On note bien ici les limites de ce type d‘approche. Une

alternative intéressante à ces méthodes physico-chimiques est

la stimulation des bactéries impliquées dans la dégradation du

pétrole. La biodégradation a pour avantage indéniable qu‘elle

est naturelle, qu‘elle n‘implique aucune intervention humaine,

et donc aucun effet supplémentaire sur la flore aquatique, et

surtout qu‘elle ne coûte rien. Son inconvénient majeur est

qu‘elle peut être très lente. Le challenge est donc d‘accélérer

ce processus naturel (Megharaj et al. 2011). Il existe pour cela

deux principales méthodes : i) l‘addition de microorganismes

hydrocarbonoclastes cultivés en laboratoire dans le milieu

pollué, appelé bioaddition ou bioaugmentation, et ii) la

stimulation des bactéries autochtones par l‘ajout de sels

nutritifs, de molécules surfactantes ou de matière organique,

appelé biostimulation (Swannell et al. 1996). A titre d‘exemple

dès 1976, Atlas et Budosh testaient un système de cylindres en

plexiglas flottant sur une zone pollué en Alaska. Après 21

jours d‘incubation des cylindres, l‘addition combinée d‘un

fertilisant oléophile (octyl phosphate et urée paraffiné) et

d‘une souche de Pseudomonas hydrocarbonoclaste avait

permis de dégrader 65% du pétrole brut, alors que cette

dégradation n‘était que de 51% avec le fertilisant seul, 27%

avec l‘ajout de bactéries hydrocarbonoclastes et 25% sans

intervention humaine. Depuis lors, ces deux techniques ont été

largement employées. Il reste encore pourtant beaucoup de

questionnement concernant la variation dans les résultats

obtenus sur la dégradation des hydrocarbures.

4.2. Addition de microorganismes hydrocarbonoclastes : la bio-addition

La bioaddition est une technique

qui a montré des résultats mitigés

par le passé en raison de la

difficulté des microorganismes

cultivés en laboratoire à

s’adapter au milieu naturel.

La bio-addition a montré des résultats contrastés et il y a eu

un débat sur l‘efficacité de cette méthode (Bartha 1986;

Cunningham et al. 2004). La plupart des expériences de

bioaugmentation ont porté sur des pollutions dans le sol, la

technique étant plus compliquée encore à mettre en œuvre

dans les milieux aquatiques en raison de la forte dilution des

microorganismes ajoutés (Tagger et al. 1983; El Fantroussi et

al. 2005). De manière générale, l‘utilisation de souches

bactériennes sélectionnées pour leur capacités métaboliques

des hydrocarbures a souvent échoué dans les environnements

naturels (Horowitz et al. 1978; Goldstein et al. 1985). La

raison principale évoquée pour expliquer cet échec est que les

bactéries cultivées en laboratoire n‘arrivent pas à faire face aux

stress biotiques et abiotiques des zones dans lesquelles elles

sont ré-introduites (Atlas et al. 1992; Leavitt et al. 1994; Vogel

1996). En plus de ne pas s‘acclimater, elles sont rapidement

diluées et disparaissent après leur ajout sous l‘action de ces

différents stress (MacNaughton et al. 1999). Ainsi le maintien

de l‘activité de ces bactéries sur une période prolongée après

leur inoculation est souvent le principal obstacle à la méthode

(Mishra et al. 2001). Dans l‘optique de l‘améliorer, certains

ont eu l‘idée d‘utiliser des supports comme niche protectrice

pour les inocula bactériens pouvant offrir à la fois une surface

d‘accrochage et un réservoir nutritionnel pour les bactéries

d‘intérêt (Van Veen et al. 1997; Gertler et al. 2009). Bien sûr,

il est nécessaire que le montage perdure suffisamment

longtemps dans l‘environnement pour que la méthode soit un

succès. Mais il faut également que le support soit non toxique,

non polluant, peu onéreux et biodégradable à long terme pour


qu‘une fois la dépollution effectuée, il puisse de lui-même

s‘éliminer sans conséquences pour l‘environnement (Leenen et

al. 1996). L‘ensemble de ces contraintes a conduit par exemple

à l‘utilisation de supports de type chitineux provenant

d‘exosquelettes d‘arthropodes (crevettes, crabes, etc…) séchés

et traités à la soude (Fig. 15) (Li et al. 1992). La chitine est le

deuxième polysaccharide le plus abondant sur terre après la

cellulose et fait l‘objet d‘un grand intérêt industriel

(Muzzarelli 1973). Son utilisation est peu onéreuse et son

application dans les méthodes de bio-addition a largement

amélioré les résultats (Leenen et al. 1996; Gentili et al. 2006).

Figure 15 : Exemple de biofilm formé par Rhodococcus corynebacterioides sur un support chitineux incubé

avec 0, 25% de kérosène (v/v) pendant 120 h vu au microscope scanner à électron (Gentile et al. 2006).

L’amélioration récente des

techniques de bioaugmentation

devrait permettre de révéler le

potentiel de cette méthode.

D‘autres études ont employé des supports permettant en

plus d‘absorber le pétrole comme le « X-Oils® sorbent

material » sur lesquels des biofilms de bactéries

hydrocarbonoclastes (Alcanivorax par exemple) peuvent se

développer avec succès (Suni et al. 2004; Gertler et al. 2009).

Dans leur revue, Gentry et al. (2004) ont proposé d‘autres

solutions possibles pour améliorer l‘efficacité des expériences

de bioaugmentation, dont certaines adaptables au milieu

aquatique : utilisation de cellules encapsulées dans un support

de type alginate ou addition directe de gènes d‘intérêt dans le

but de transférer aux bactéries autochtones des capacités

métaboliques pour la dégradation des hydrocarbures qu‘elles

n‘avaient pas ou peu.

Après un abandon momentané de la méthode en raison des

mauvais résultats, l‘ensemble de ces approches a relancé les

tests et la bio-addition connait un nouvel intérêt dans les

études sur la bioremédiation (El Fantroussi et al. 2005; Gentili

et al. 2006). Il est prévu que les prochaines années apportent

une réponse définitive quant à la pertinence et à l‘efficacité de

la bioaugmentation (El Fantroussi et al. 2005).

4.3. Fertilisation organique et inorganique : la biostimulation

La biostimulation par ajout de

nutriments est une méthode

privilégiée pour améliorer la

biodégradation des

hydrocarbures.

La biostimulation consiste à

stimuler la croissance des

microorganismes autochtone en

levant la limitation par les

ressources nutritives.

La biostimulation consiste à ajouter des nutriments

organiques et/ou inorganiques aux environnements pollués par

les hydrocarbures de manière à éliminer le problème de la

limitation des bactéries par les ressources nutritives (voir

partie 3.1.4, pour l‘effet du « bottom-up » sur les

communautés bactériennes marines). Cette technique a jusque-

là montré des résultats plus encourageants que la

bioaugmentation et reste aujourd‘hui la meilleure façon de

favoriser la biodégradation des hydrocarbures. Son utilisation

très répandue est en grande partie due à son succès lors de la

catastrophe de l‘Exxon Valdez en 1989. Des tests d‘une

ampleur sans précédent ont alors été effectués pour comparer

l‘efficacité de plusieurs types de molécules devant améliorer la

dégradation du pétrole déversé (Venosa et al. 1990).

De manière générale, la biostimulation stimule la

croissance et l‘activité bactérienne, permettant ainsi une

meilleure biodégradation des hydrocarbures (Prince 1993;

Coulon et al. 2003). Elle provoque également la plupart du

temps des changements dans la structure des communautés

bactériennes en promouvant certaines bactéries plutôt que

d‘autres en fonction de leurs besoins nutritionnels respectifs et

leurs capacités de compétition pour la ressource (Smith et al.

1998; Head et al. 1999; Evans et al. 2004; Coulon et al. 2007).

L‘ajout de sels nutritifs inorganiques (ex : KNO3, NaNO3,


Tout le succès de la

biostimulation repose sur le

choix de la quantité optimale de

sels nutritifs à appliquer à la

zone contaminée.

La « ressource ratio-theory » est

une piste permettant de prédire

l’effet de la biostimulation sur les


NH4NO3, K2HPO4 MgNH4PO4) a montré son efficacité par le

passé (Lee et al. 1989; Lee et al. 1991; Lee et al. 1995). Le

plus souvent, ces sels sont libérés sous forme de briquettes ou

de granules pour limiter leur dilution dans l‘eau (Safferman

1991). Il existe un consensus concernant l‘ajout de sels

nutritifs qui est réalisé en général à hauteur de 1 à 5% de la

quantité de pétrole avec un ratio entre l‘azote et le phosphore

de 5 à 10:1 (Swannell et al. 1996). Toutefois des résultats

variables ont été obtenus selon le type et la concentration en

sels nutritifs employés et les caractéristiques du milieu (Lee et

al. 1991). Cette variation dans l‘efficacité de la méthode

s‘explique par la difficulté de planifier des traitements adaptés

aux différents milieux pollués (Head et al. 1999). La plupart

des résultats concernant la biostimulation ont été obtenus

expérimentalement. Par conséquent, il n‘y a pas de schéma

clair permettant d‘adapter les traitements et de prédire la

réponse des systèmes microbiens à ces actions in situ. La seule

piste permettant de poser des bases théoriques à l‘application

de ce traitement est la « ressource-ratio theory » appliquée aux

environnements pollués (Smith et al. 1998). Cette théorie rend

compte de la structure et de la fonction des communautés

bactériennes en compétition pour les nutriments nécessaires à

leur croissance. Smith et al. (1998) ont montré que la

biodégradation d‘hexadécane et de phénanthrène était

influencée non seulement par la quantité absolue de nutriments

ajoutés mais aussi par les rapports relatifs entre l‘azote et le

phosphate. La principale observation faite par les auteurs était

qu‘il existait deux optimums distincts de ratios N:P pour la

biodégradation du phénanthrène à savoir 5:1 et 20:1

impliquant deux types de populations phénanthrène-

dégradantes différentes avec des besoins en nutriments

différents et des voies cataboliques différentes. La dégradation

du phénanthrène et de l‘hexadécane ne nécessitaient pas non

L’ajout de sels nutritifs favorise

certains types bactériens plutôt

que d’autres, induisant des

changements de structure de

communauté.

La biostimulation peut également

se faire par ajout de molécules

complexes organiques permettant

une meilleure accessibilité du

pétrole aux bactéries.

Les « slow release fertilizers »

permettent de libérer des

nutriments en continu.

plus les mêmes quantités en sels nutritifs, révélant que la

dégradation d‘un certain hydrocarbure ne requière pas la

même quantité de nutriments qu‘un autre. Ainsi les bactéries

sont sélectionnées en fonction de la quantité de sels nutritifs

ajoutés et la quantité requise pour la dégradation des

hydrocarbures. Ces auteurs suggèrent donc qu‘il serait possible

d‘influencer la sélection de certaines bactéries particulièrement

performantes dans les systèmes pollués en modifiant le rapport

N :P et ainsi accélérer la dégradation du pétrole (Smith et al.

1998; Head et al. 1999).

La biostimulation ne consiste pas uniquement à ajouter des

billes de sels nutritifs. Très rapidement, devant les limites de la

méthode (éparpillement des ressources ajoutées sous l‘action

des vagues par exemple et dissolution trop rapide des billes),

un certain nombre de produits (engrais) avec des compositions

(organique versus inorganique) et des propriétés variables

(hydrophobe versus hydrophile) ont été mis au point pour

améliorer la biodégradation et proposer des solutions adaptées

à chaque type d‘environnement pollué (Tableau 7) (Swannell

et al. 1996).

L‘utilisation d‘engrais à libération lente (« slow release

fertilizers ») est l‘une des approches les plus utilisées pour

prévenir les problèmes de lavage et pour fournir des sels

nutritifs de manière continue dans les zones pollués (Swannell

et al. 1996). Ces engrais se présentent généralement sous des

formes solides avec des nutriments insolubles ou solubles dans

l‘eau accrochés à des produits hydrophobes de type paraffine

ou huile végétale. Par exemple, lors de l‘accident de l‘Exxon

Valdez, un engrais à libération lente, le Customblen (Sierra

Chemical Co.) a été choisi comme l‘un des agents de

bioremédiation et a été appliqué sur plus de 120 Km de côtes

contaminées entre 1989 et 1990. Cet engrais se compose de

phosphate de calcium, de phosphate d‘ammonium et de nitrate


d‘ammonium combiné à une huile végétale selon un ratio

N:P:K de 28:8:0. Les résultats ont montré que le Customblen

améliorait l‘élimination du pétrole sur certaines côtes de

l‘Alaska (Pritchard et al. 1992).

Tableau 7 : Composants des fertilisants utilisés ou testés comme agents de bioremédiation (Prince 1993).

Les émulsifiants fournissent des

ressources nutritives et

permettent en même temps une

meilleure accessibilité des

bactéries au pétrole.

L‘ajout de matière organique sous forme de produit

oléophile est une autre alternative. Un des problèmes majeurs

dans la dégradation des pétroles est son manque d‘accessibilité

aux bactéries qui pourraient les dégrader. L‘idée d‘utiliser des

molécules permettant de favoriser le contact entre les bactéries

et leur substrat est donc apparue assez rapidement dans les

expériences de biostimulation. Plusieurs produits contenant

des nutriments organiques ont été évalués et identifiés comme

des agents de bioremédiation. L‘Inipol EAP22 (Societé CECA

SA, France) est probablement l‘agent de bioremédiation le

plus connu pour la bioremédiation du pétrole en raison de son

utilisation pour la catastrophe de l‘Exxon Valdez. Ce produit

est une micro-émulsion contenant de l‘urée comme source

d‘azote, du laureth phosphate de sodium comme source de

phosphore, du 2-butoxy-1-ethanol comme surfactant et de

Les réels effets des molécules

d’origine industrielle pour la

bioremédiation des

hydrocarbures sont encore mal

connus.

l‘acide oléique pour rendre le mélange hydrophobe. L‘Inipol

présente plusieurs avantages. Il prévient la formation

d‘émulsions eau-dans-huile en réduisant la viscosité du pétrole

et les tensions inter-faciales, il fournit de manière continue une

source de nutriments utilisables pour la biodégradation des

hydrocarbures, il ne présente pas de toxicité pour la flore et la

faune et se dégrade facilement sous l‘action des

microorganismes (Ladousse et al. 1991). Néanmoins, certaines

études ont remis en question la pertinence de l‘emploi de ce

type de produit. Par exemple, Roberg et al. (2007) ont montré

que l‘Inipol pouvait être préférentiellement utilisé par les

microorganismes comme source de carbone plutôt que le

pétrole, ce qui aurait diminué la biodégradation des

hydrocarbures. Margesin et al (2007) ont suggéré que la

dégradation des hydrocarbures en présence d‘Inipol serait

abiotique.

Les bioémulsifiants et

biosurfactants d’origine

biologique ne souffrent pas d’une

potentielle toxicité pour

l’environnement et sont l’objet

d’un intérêt industriel majeur.

Enfin les biosurfactants/bioémulsifiants naturels sont

également utilisés pour la bioremédiation des hydrocarbures

(Voir tableau 3 dans la partie 3.1.2 de cette introduction). Ces

molécules peuvent servir dans de nombreux domaines (textile,

pharmaceutique, cosmétique, alimentation, exploitation de

minerais), dont la dépollution des milieux contaminés par les

hydrocarbures ou les métaux. De nouvelles recherches sont

toujours entreprises pour découvrir de nouvelles molécules

avec des propriétés inédites (Satpute et al. 2010).

Concrètement ces agents bioactifs sont employés dans de

nombreuses expériences de bioremédiation des hydrocarbures.

Par exemple, l‘Alasan est un bioémulsifiant complexe de haut

poids moléculaire anionique formé de polysaccharides et de

protéines, produit par Acinetobacter radioresistens KA53 qui a

été isolé en 1995 pour ses propriétés chimiques (Navon-

Venezia et al. 1995). Il permet notamment d‘améliorer la

solubilité et la biodégradation des hydrocarbures aromatiques


A l’avenir, les bioémulsifiants et

biosurfactants devraient

largement améliorer les méthodes

de biostimulation des


contaminées.

polycycliques. Il a été testé plusieurs fois expérimentalement

et des taux de dégradation deux fois supérieures du

fluoranthène et du phénanthrène ont été trouvés en sa

présence, révélant son potentiel pour les applications de

bioremédiation (Barkay et al. 1999; Dalby et al. 2007).

Nous attirons l‘attention du lecteur sur le fait que le bioémulsifiant Alasan

est celui qui a été employé dans l‘étude expérimentale du chapitre 3 de ce

manuscrit.

Ces molécules d‘origine biologique sont donc totalement

biodégradables, bien moins toxiques que leurs équivalents

artificiels et favorisent clairement la biodégradation des

pétroles à la fois par des processus physiques (solubilisation

des hydrocarbures) et biologiques (source de nutriments)

(Poremba et al. 1991). Ils offrent ainsi une alternative

intéressante aux produits jusqu‘alors employés. La découverte

de nouvelles molécules ainsi que l‘adaptation des traitements

expérimentaux à l‘environnement devraient permettre

d‘améliorer les méthodes de bioremédiation des hydrocarbures

pétroliers en milieu marin (Satpute et al. 2010).

5. Evolution récente des méthodes d‘étude des communautés microbiennes marines totales et

hydrocarbonoclastes

Un grand nombre de techniques

classiques et récentes sont

nécessaires et disponibles pour

étudier les communautés

bactériennes impliquées dans la

dégradation des hydrocarbures.

L‘étude des communautés bactériennes impliquées dans la

dégradation du pétrole nécessite la mise en place de techniques

diversifiées et complémentaires. Il s‘agit en effet d‘évaluer à la

fois l‘abondance des microorganismes, leur diversité mais

aussi et surtout leur activité, le challenge étant d‘arriver à

suivre spécifiquement les espèces bactériennes ayant la

capacité fonctionnelle de biodégradation des hydrocarbures.

Pour cela un certain nombre d‘outils « classiques » sont

disponibles, mais l‘apparition de technologies plus robustes et

de plus haut débit sont en train de révolutionner notre façon

d‘aborder l‘Ecologie microbienne (Fig. 16).

Figure 16 : Historique et évolution étape par étape de l’Ecologie microbienne durant les 50 dernières

années (Maron et al. 2007).


5.1. Dénombrement des bactéries totales et hydrocarbonoclastes

Pour le dénombrement des

bactéries totales, on dispose :

- des méthodes microscopiques

- de la cytomètrie en flux

Pour le dénombrement de

bactéries présentant des activités

de dégradation des

hydrocarbures, on dispose de :

- la méthode du nombre le plus

probable

- la PCR quantitative

Les méthodes de culture ont été les premières méthodes

permettant de dénombrer les microorganismes. Néanmoins

elle s‘est révélée incomplète dans la mesure où il a été établi

qu‘elle ne permettait d‘isoler que de 0.1 à 1% des bactéries

d‘un échantillon naturel marin (Giovannoni et al. 1990). Elle

reste néanmoins incontournable pour l‘isolement et la

caractérisation de nouvelles souches. La quantification des

microorganismes se fait aujourd‘hui davantage à l‘aide de

microscopes par le biais de marquages fluorescents non

spécifiques (DAPI) ou spécifiques pour la détection de

groupes taxonomiques particuliers à travers la méthode du

FISH (fluorescent in situ hydridization). La cytomètrie en flux

est également particulièrement bien adaptée aux échantillons

liquides et offre un temps d‘analyse largement réduit par

rapport au comptage microscopique.

Plusieurs techniques très différentes permettent de

dénombrer de communautés fonctionnelles en milieu marin.

La méthode de Mac Grady (1918) est une méthode de culture

en dilution qui a été largement employée dans les études de

biodégradation des hydrocarbures (Mills et al. 1978; Delille et

al. 2000; Rodríguez-Blanco et al. 2010). Elle repose sur une

analyse statistique et fournit par calcul des nombres les plus

probables (NPP; MPN en anglais pour « most probable

number ») en utilisant la table de Mac Grady (Mac Grady,

1918). Il existe de nombreuses variantes à la méthode en

fonction de la charge microbienne à évaluer, du milieu

d‘incubation considéré et de la fonction ciblée. Pour évaluer le

NPP de bactéries marines capables de dégrader un ou plusieurs

hydrocarbures, l‘échantillon d‘eau de mer est généralement

dilué en série dans de l‘eau de mer stérile (évite le biais de la

culture sur un milieu riche prédéterminé) et mis en présence

d‘un ou plusieurs hydrocarbures, parfois même d‘un pétrole

La méthode des MPN est une

méthode de culture en dilutions

largement emplyée dans

l’énumération des bactéries

hydrocarbonoclastes.

La PCR quantitative permet de

quantifier le nombre de copies de

gènes de dégradation des

hydrocarbures dans une

communauté.

brut ou raffiné. Les dilutions positives sont identifiées après

incubation en présence d‘un marqueur coloré de respiration du

substrat (les plus utilisés sont la résazurine ou le bleu de

méthylène, indicateurs colorimétriques d'oxydo-réduction).

Cette méthode suppose que le micro-organisme est

normalement distribué dans le milieu et donc qu‘un même

volume d‘échantillon contient en moyenne le même nombre de

microorganismes (en réalité il en contient un peu plus ou un

peu moins); le nombre le plus probable correspond à la valeur

moyenne. L‘inconvénient majeur de cette technique est qu‘elle

a tendance à surestimer les microorganismes ciblés (Johnsen et

al. 2009; Wallenius et al. 2011). La PCR quantitative (qPCR)

est une alternative plus récente (Mackay 2004). Elle permet de

quantifier tout aussi bien les bactéries totales grâce à l‘emploi

d‘amorces universelles (gène ARNr 16S) que des bactéries

appartenant à un groupe particulier comme les bactéries PAH-

dégradantes, par exemple, par ciblage de gènes fonctionnels

(dioxygénase dans le cas des PAH). Elle a pour avantage

d‘être une des rares techniques permettant d‘obtenir un

pourcentage de bactéries ayant une fonction particulière par

rapport à une communauté totale. Cela permet d‘estimer

indirectement le potentiel fonctionnel de ce groupe.

L‘inconvénient de la méthode repose sur le fait qu‘il faille

définir des amorces spécifiques d‘un groupe, polyphylétique

dans le cas de la dégradation des hydrocarbures. Il existe un

risque dans la création des amorces : soit elles peuvent ne pas

être assez spécifiques et donc amplifier des microorganismes

n‘appartenant pas au groupe fonctionnel ciblé, soit elles

peuvent être trop spécifiques et sous-estimer la population

quantifiée (Cebron et al. 2008). En outre pour la dégradation

des hydrocarbures, il existe un grand nombre de gènes

fonctionnels. On ne pourra donc pas quantifier une population

HAP-dégradante totale mais un groupe possédant par exemple


une naphtalène dioxygénase impliquée dans la première étape

de la dégradation du phénanthrène uniquement (Baldwin et al.

2003). Grâce à la création constante de nouvelles amorces, la

qPCR devrait néanmoins être une mesure de routine dans les

prochaines années.

5.2. Etude de la diversité

L’étude de la diversité

bactérienne dépend de la

définition de l’espèce chez les

bactéries et d’outils moléculaires

qui permettent de les discriminer

facilement.

Une espèce procaryotique est

constituée de souches qui

présentent des valeurs

d’hybridation ADN-ADN

supérieures ou égales à 70% et

une valeur ΔTm inférieure ou

égale à 5%.

L‘apparition des méthodes de biologie moléculaire dans les

années 80 a permis de s‘affranchir des biais des techniques de

culture classique et a révolutionné notre façon d‘étudier les

microorganismes. L‘étude des acides nucléiques sur la base du

gène de l‘ARNr 16S a donné l‘accès à une diversité

microbienne jusque-là inexplorée et a permis d‘améliorer

rapidement nos connaissances sur les milieux naturels (Head et

al. 1998). En 1985, Carl Woese dénombrait 11 groupes

bactériens phylogénétiquement différents (Woese et al. 1985)

alors qu‘en 2003, Rappé et Giovannoni en comptaient 53.

Cette « nouvelle » diversité a fait naître un certain nombre de

questionnements à la fois en termes méthodologiques et

Ecologiques.

La définition d‘une espèce bactérienne se heurte à un

problème majeur à savoir l‘absence de sexualité chez les

bactéries. En effet, si la définition d‘Ernst Mayr, « une espèce

est un ensemble d‘individus féconds entre eux et seulement

entre eux» (Mayr 1982), est encore utilisée pour les

organismes supérieurs, elle n‘est pas applicable aux

microorganismes. En outre, si des critères morphologiques

peuvent être utilisés pour la classification des

macroorganismes, ils ne sont pas suffisants pour classer les

microorganismes, trop simples d‘aspect pour être différenciés

à l‘aide de simples observations microscopiques. Aujourd‘hui,

plusieurs critères permettent de définir une espèce

bactérienne : des critères morphologiques ou physiologiques

(présence de flagelle ou non, couleur, forme, par exemple) et

Le gène codant pour la petite

sous unité (16S) de l’ARN

ribosomique est ubiquiste chez

les procaryotes, il contient des

régions conservées mais aussi

suffisamment divergentes d’une

espèce à l’autre pour pouvoir les

différencier.

Les méthodes d’empreintes

moléculaires permettent d’étudier

en routine la structure des


surtout des critères génétiques. Deux individus d‘une même

espèce procaryote présentent des valeurs d‘hybridation ADN-

ADN supérieures ou égales à 70% et une valeur ΔTm

inférieure ou égale à 5% (Wayne et al. 1987). Néanmoins,

cette technique est lourde à mettre en place, nécessite

l‘isolement des bactéries sur un milieu de culture et requiert

une certaine similarité avec les souches déjà identifiées. Pour

discriminer en routine les espèces bactériennes, le gène codant

pour la petite sous unité (16S) de l‘ARN ribosomique s‘est

révélé être le candidat idéal. Il est ubiquiste (puisque la

traduction de l‘ARN messager en protéine est une fonction

universelle chez les êtres vivants), il ne subit pas de transfert

génétique latéraux, il a une taille suffisante (~1500 pb) pour

contenir des informations phylogénétiques et il contient des

régions conservées mais aussi suffisamment divergentes d‘une

espèce à l‘autre pour pouvoir les différencier (Woese et al.

1985). Son analyse permet une classification des procaryotes à

différents niveaux taxonomiques (phylum, classe, ordre,

famille, genre, espèce).

Depuis ces 20 dernières années, le développement et

l‘utilisation en routine de techniques de biologie moléculaire

ont largement amélioré nos connaissances sur les

communautés microbiennes aquatiques. De plus, ces

techniques offrent la possibilité de suivre l‘évolution des

communautés bactériennes sous l‘influence de contraintes

environnementales. Ce sont donc des outils extrêmement

employés pour l‘étude des communautés bactériennes

soumises à des pollutions. La plupart de ces approches

impliquent une étape d‘amplification par PCR de fragments

d‘ADN extraits de l‘environnement (en général, il s‘agit de

l‘opéron ribosomal). L‘amplification est réalisée au moyen

d‘amorces universelles ou spécifiques des microorganismes

étudiés. L‘étape suivante consiste à détecter des variations de


séquence dans les produits de PCR. Il peut être réalisé soit par

une approche « d‘empreinte moléculaire » qui repose sur

l‘analyse d‘un électrophérogramme qui permet la séparation

visuelle du mélange de fragments PCR selon un

polymorphisme de séquence (DGGE, TGGE, CE-SSCP) ou de

longueur (T-RFLP, ARISA) (tableau 8). Une autre approche

consiste à cloner les produits de PCR et les séquencer, ce qui

permet une identification taxonomique et phylogénétique

(Dorigo et al. 2005).

Méthode Principe

Taille des

fragments

Empreintes génétiques basées sur l’ADN génomique

PFGE : Pulse Fragment Gel

Electrophoresis

Migration du génome digéré par des enzymes de restriction Gros fragments

Empreintes génétiques basées sur les opérons ribosomiques

Méthodes basées sur les variations de longueur de fragments de restriction

ARISA : Automated Ribosomal

Intergenic Space Analysis

Examine les variations de longueur des régions intergéniques (ITS)

des ADN ribosomiques

400 à 1200 pb

ARDRA : Amplified Ribosomal DNA

Restriction Fragment Analysis

Séparation de fragments du gène ARNr 16S en fonction de la taille

sur gel d‘agarose

T-RFLP : Terminal Restriction

Fragment Lenght Polymorphism

Mise en évidence d‘un polymorphisme de restriction d‘un gène

particulier après digestion par des enzymes de restriction

< 1500 pb

Méthodes basées sur les variations de séquence ADN

DGGE : Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis

Séparation des ADN double brin par dénaturation à l‘urée-

formamide dans un gel d‘acrylamide

< 500 pb

TGGE : Temperature Gradient Gel

Electrophoresis

Séparation des ADN double brin par un gradient de température

dans un gel d‘acrylamide

< 500 pb

SSCP : Single Strand Conformation

Polymorphism

Séparation d‘ADN simples brins en fonction de la conformation

3D des séquences

< 400 pb

Tableau 8 : Méthodes d’empreintes moléculaires classiquement utilisées en Ecologie microbienne.

Nous pouvons souligner que la technique non destructive

de FISH reposant sur un marquage des cellules avec des

sondes spécifiques associées à un fluorochrome a été proposée

pour étudier la diversité bactérienne. Néanmoins, cette

technique est plus adaptée au suivi de certains groupes

taxonomiques qu‘à l‘analyse de la structure des communautés

d‘un échantillon complexe. En effet, la limitation du nombre

de fluorochromes utilisables par échantillon, le choix des

La CE-SSCP est une technique

d’empreinte moléculaire qui

permet de comparer la structure

des communautés bactériennes

d’un nombre théoriquement

infini d’échantillons.

sondes, les températures d‘hybridation, l‘auto-fluorescence de

certains microorganismes et l‘état physiologique des cellules

marquées sont autant de paramètres qui peuvent affecter le

résultat final, en produisant de faux positifs ou des faux

négatifs (Wagner et al. 2003).

Note pour le lecteur : nous faisons le choix ci-dessous de nous attarder sur

la technique d‘empreinte moléculaire CE-SSCP car c‘est celle qui a été

utilisée pour l‘ensemble de ces travaux de thèse.

Parmi les méthodes d‘empreinte moléculaire, la CE-SSCP

est une méthode qui repose sur le polymorphisme de la

conformation des simples brins par électrophorèse capillaire

(Lee et al. 1996). Brièvement, cette technique nécessite au

préalable une extraction d‘ADN génomique, une amplification

d‘un fragment d‘intérêt (par exemple une partie du gène ARNr

16S) avec des amorces fluorescentes, une dénaturation des

produits PCR et un maintien de la conformation simple brin

des fragments dénaturés par ajout d‘agent dénaturant qui

influent sur la force de stabilisation des liaisons hydrogènes.

Les fragments simples brins progressent à des vitesses

proportionnelles à leurs encombrements tridimensionnels dans

un gel non dénaturant. La technique de SSCP sur gel vertical a

été améliorée par une migration dans un séquenceur capillaire,

qui permet la co-migration des produits PCR de l‘échantillon

marqué avec un fluorochrome avec un standard de taille

marqué avec un autre fluorochrome. En fin d‘électrophorèse,

les fragments sont détectés par un laser grâce aux marquages

fluorescents. Le profil est composé de différents ribotypes qui

donnent une empreinte de la structure de la communauté

étudiée, et le marqueur interne permet de comparer un nombre

théoriquement infini de profils de communautés. L‘aire de

chaque pic composant ce profil est représentatif de la quantité

d‘un ou de plusieurs ribotypes, ce qui rend cette technique

semi-quantitative. Adaptée au milieu marin par Ghiglione et

al. (2005), elle a depuis été considérée par différents auteurs


comme une technique plus sensible et plus reproductible que

d‘autres techniques d‘empreintes moléculaires tels que la

DGGE, la T-RFLP ou la LH-PCR pour length heterogeneity

polymerase chain reaction (Hong et al. 2007; Ducklow et al.

2011). La CE-SSCP peut être couplée au clonage/séquençage

pour obtenir une analyse taxonomique plus poussée des

différents ribotypes (Fig. 17).

Figure 17 : Exemple de profil de CE-SSCP avec assignation des pics par construction d’une banque de

clone et migration individuelle des clones. Chaque pic de CE-SSCP (à gauche) correspond un clone (à

droite) qui a été affilié phylogénétiquement (Rodríguez-Blanco et al. 2009).

Le pyroséquençage est une

méthode récente de séquençage à

très haut débit qui a l’avantage

d’être peu coûteuse et de fournir

une vision beaucoup plus

exhaustive de la diversité

bactérienne d’un échantillon que

les anciennes techniques

reposant sur la méthode Sanger.

La CE-SSCP a été employée avec succès pour l‘étude des

communautés bactériennes polluées par les hydrocarbures

(Rodríguez-Blanco et al. 2010). Néanmoins de nouveaux

outils tels que le pyroséquençage, la métagénomique ou les

microarrays sont en train de supplanter les méthodes

d‘empreintes moléculaires.

Le pyroséquençage est une technique récente de

séquençage très haut débit puisqu‘il permet d‘obtenir plus de

10.000 séquences dans un même échantillon là où l‘on pouvait

en générale en obtenir 200 dans des études de

clonage/séquençage de type Sanger (Fig. 18 et tableau 9).

Grâce au pyroséquençage, l‘analyse de la diversité dans un

échantillon environnemental est plus complète (Margulies et

al. 2005; Rogers et al. 2005). La technique a été notamment

employée récemment pour l‘analyse de la diversité des

microorganismes impliqués dans la dégradation des

hydrocarbures dans le golfe du Mexique, après la catastrophe

de la plateforme Deepwater Horizon (Kostka et al. 2011). Le

coût de la technique était un frein à ses débuts mais il est

devenu moins important que celui des séquençages classiques.

En plus, la méthode est plus rapide et les séquences obtenues

sont de plus en plus longues (une soixantaine de paires de

bases à sa création, plus de 400 aujourd‘hui). La méthode

présente néanmoins certains biais comme la formation de

séquences incorrectes ou de chimères de séquences qu‘il faut

pouvoir distinguer des séquences correctes et elle nécessite

une analyse bioinformatique lourde pour exploiter les données.

Mais le nombre de publications faisant référence à l‘utilisation

du pyroséquençage pour l‘analyse de la diversité bactérienne

est en pleine expansion et cette technique devrait rapidement

rendre obsolètes les méthodes de séquençages traditionnelles

dans les prochaines années.


Figure 18 : Principe de fonctionnement du pyroséquençage automatisé ultra-haut débit.

Un simple brin de chaque fragment d‘ADN à séquencer est amplifié par PCR pour obtenir une banque d‘ADN

simple brin et immobiliser un brin par bille. (a) Chaque bille est capturée dans sa propre micro-chambre et

l‘ADN est amplifié par PCR, le résultat est une bille contenant des millions de copies du simple brin d‘origine.

(b) Pour le séquençage, les billes porteuses de l‘ADN sont placées dans une plaque contenant plus d‘un million

de fibres optiques individuelles avec des puits de capacité de l‘ordre du picolitre de manière à ce que chaque

puits ne contienne qu‘une seule bille. Le séquençage est ensuite réalisé par flots successifs des quatre bases azotées. Le brin se synthétisant est accompagné d‘un relargage de pyrophosphate qui active la luciférine et

provoque un flash lumineux qui est enregistré par la fibre optique (l‘intensité du signal étant proportionnel au

nombre de bases identiques successivement incorporées au brin d‘ADN). Le résultat et un fichier contenant une

succession de pics lumineux correspondant à la séquence du brin amplifié (Owen-Hughes et al. 2007).

Tableau 9 : Méthodes actuelles de séquençage (Cardenas et al. 2008).

La métagénomique est une

méthode en haut débit

permettant l’étude des génomes

dominants d’une communauté

naturelle.

La métagénomique est une approche dans laquelle des

fragments de génomes de très grande taille sont clonés dans

des vecteurs appropriés (chromosome bactérien artificiel,

BAC, par exemple) et séquencés par des méthodes de

séquençage haut débit (Fig. 21) (Shelswell 2006). Le

screening et le séquençage rapide d‘un nombre important de

clones porte le nom de « whole-genome shotgun sequencing »

(Chen et al. 2005), une approche qui a été employée avec

succès pour dresser un inventaire de la diversité bactérienne

dans la mer des Sargasses (Venter et al. 2004). Les données

issues de cette technique apportent des informations détaillées

sur la composition et la diversité de la communauté et donnent

L’utilisation de la

métagénomique dans les

environnements pollués est

facilitée par le nombre réduit de

génomes à étudier.

accès aux génomes quasi-complets des microorganismes les

plus abondants, permettant ainsi de révéler le rôle métabolique

de ces organismes (Handelsman 2004). Le whole-genome

sequencing peut également être appliqué à l‘étude de cultures

pures pour mieux comprendre la physiologie de certaines

souches et développer des outils pour la bioremédiation

(Lovley 2003). La limite de cette méthode est la difficulté à

reconstruire les génomes à partir des fragments et le manque

de génomes connus pouvant servir de modèle à la

reconstruction des métagénomes.

Un des intérêts majeurs à utiliser la métagénomique dans

les environnements pollués est que la plupart du temps, le

pétrole favorise le développement de quelques groupes

bactériens majoritaires et diminue drastiquement la richesse

bactérienne par rapport à un environnement non pollué. Par

conséquent, l‘effort de séquençage nécessaire à l‘analyse des

métagénomes des communautés bactériennes polluées par les

pétroles est moins important que pour des communautés

« classiques » et la reconstitution des génomes s‘en trouve

facilitée. Plusieurs études ont d‘ailleurs montré qu‘il était

possible d‘appliquer les outils de métagénomique avec succès

pour l‘étude des communautés hydrocarbonoclastes.

Ainsi, van Beilen et al. (2003) ont pu, par exemple,

explorer la diversité des alcane-hydroxylases dans

l‘environnement et Jeon et al. (2003) ont découvert une

bactérie contenant une « nouvelle » dioxygénase impliquée

dans la biodégradation du naphtalène dans des sédiments

contaminés. Le développement de cette approche couplée aux

récentes avancées des techniques de séquençage devraient

permettre une meilleure compréhension de la diversité et des

mécanismes physiologiques associés à la dégradation des

hydrocarbures.

Les puces d‘acides nucléiques ou « microarrays » sont une


Les microarrays permettent

l’étudie haut débit de l’expression

des gènes.

technique d‘hybridation dans laquelle de nombreuses sondes

moléculaires sont utilisées pour détecter la présence relative et

l‘expression de multiples organismes et/ou de gènes (Fig. 19)

(Gentry et al. 2006). Dans les études des communautés

microbiennes des environnements pollués, les microarrays ont

été utilisés pour identifier et suivre les membres d‘un

consortium microbien mis en présence de benzène et de

toluène (Koizumi et al. 2002). Là encore, la généralisation de

la technique devrait grandement améliorer les études de

diversité et fonction des communautés hydrocarbonoclastes.

Figure 19 : Exemple d’expérience de microarray avec ADNc.

L‘ARN est extrait à partir de différents échantillons et rétro-transcrit en ADN complémentaire (cDNA), phase

pendant laquelle il est marqué à l‘aide de produits fluorescents. Les deux échantillons sont ensuite mélangés

ensemble pour comparaison et hybridation à la puce. Les différences d‘expressions des gènes sont révélées par

les profils de fluorescence sur l‘array (Coe et al. 2004).

Les avantages et inconvénients des techniques brièvement

décrites ci-dessus sont listés dans un tableau récapitulatif

(Tableau 10).

5.3. Mesure d‘activité bactérienne totale et hydrocarbonoclaste

Les mesures d’activité

bactérienne reposent

généralement sur une

incubation en présence d’un

substrat d’interêt marqué

radioactivement ou par un

fluorochrome.

Les méthodes employées pour mesurer l‘activité bactérienne

ont peu évolué depuis ces quarante dernières années.

On distingue la mesure de production bactérienne qui est une

mesure d‘assimilation d‘un substrat radioactif de type 3H-

thymidine ou 3H-leucine comme précurseurs de protéines

(Kirchman et al. 1985; Chin-Leo et al. 1988). La mesure consiste à

quantifier la radioactivité incorporée dans les cellules bactériennes

après un temps d‘incubation optimal et permet, en utilisant un

facteur de conversion, d‘exprimer une quantité de carbone

minéralisé par unité de volume et de temps.

Les mesures d‘activités enzymatiques extracellulaires reposent

sur le fait que dans l‘environnement, la matière organique se

présente majoritairement sous forme de macromolécules ne

pouvant pas être directement assimilées par les bactéries. Les

bactéries expriment donc des enzymes à la surface de leurs

membranes pour les hydrolyser avant de les incorporer pour être

métabolisées (Fig. 20). Il existe une multitude d‘enzymes

différentes selon le type de molécule à hydrolyser (lipase,

aminopeptidase, phosphatase, glucosidase, etc.).

Figure 20 : Principe des activités enzymatiques extracellulaires chez les bactéries (selon Van Wambecke,

communication personnelle).

La mesure de l‘activité enzymatique repose sur l‘emploi d‘un

analogue de substrat couplé avec une molécule fluorescente (Fig.

21). Les mesures d‘activité enzymatique suivent une cinétique de

Michaelis-Menten. La réaction enzymatique est mathématiquement


exprimée par l‘équation: V = (Vmax.S) / (Km + S) où V est la

vitesse de la réaction enzymatique, S la concentration en substrat et

Km la constante de Mickaelis. Il est nécessaire d‘effectuer la

mesure dans un système où la concentration en substrat est

saturante, c'est-à-dire lorsque la vitesse d‘hydrolyse (Vmax)

n‘augmente plus en fonction de la concentration en substrat.

Figure 21 : Exemple d’activité hydrolytique extra-cellulaire : la glucosidase.

Le complexe MUF-β-D-Glucopyranoside, non fluorescent est clivé par une enzyme de type n-glucosidase

extracellulaire pour libérer une molécule de glucose pouvant être intégrée par la bactérie et une molécule de

MUF devenue fluorescente après hydrolyse.

Les cinétiques de

dégradation des

hydrocarbures sont

primordiales dans les études

sur la biodégradation.

Que ce soit pour la mesure de production bactérienne ou celle

des activités enzymatiques extracellulaires, il convient d‘incuber

un échantillon naturel avec un substrat radioactif ou fluorescent

durant un temps optimum. En fin d‘incubation, la radioactivité

incorporée par les bactéries ou la fluorescence libérée par celle-ci

sont mesurées. On peut ainsi estimer une quantité de substrat

utilisé par un certain nombre de cellules pour une période donnée.

Les temps d‘incubation pour les mesures de production bactérienne

et d‘activités extracellulaires n‘excédent pas quelques heures, ces

méthodes sont considérées comme représentatives de l‘activité

instantanée des communautés bactériennes in situ.

Il est également possible de réaliser des cinétiques de

dégradation de substrats d‘intérêt comme les hydrocarbures en

particulier. Il s‘agit alors simplement d‘incuber l‘échantillon

naturel en présence de la molécule, de doser à intervalles réguliers

la quantité restante de substrat et d‘en déduire la vitesse de

dégradation de la molécule. Ce type de méthode est extrêmement

employée dans les études sur la biodégradation des hydrocarbures

puisqu‘elle peut être couplée à des analyses de diversité

bactérienne et/ou de mesure d‘abondance pour obtenir une vision

globale de la dynamique de communauté bactérienne en présence

d‘hydrocarbures (Guha et al. 1999).

5.4. Lien diversité / activité

Tout l’enjeu de la

microbiologie

environnementale est

d’attribuer des fonctions à

des groupes bactériens

particuliers.

La métatranscriptomique et

la métaprotéomique sont

deux nouvelles techniques

permettant l’étude de la

diversité fonctionnelle d’une

communauté bactérienne, à

grande échelle.

L‘ensemble des techniques présentées jusqu‘à maintenant

permettent soit d‘étudier la diversité soit de mesurer l‘activité des

communautés bactériennes. Mais tout l‘enjeu de la microbiologie

environnementale est d‘attribuer des fonctions métaboliques

particulières à des groupes taxonomiques définis. Autrement dit

comment est-il possible de relier la diversité à l‘activité des

différents groupes de microorganismes dans les milieux naturels ?

Pour répondre à cette question, il existe actuellement plusieurs

outils. Le premier est la culture sur des milieux prédéfinis. Cette

technique reste toujours d‘actualité pour étudier la physiologie de

certaines souches. Mais nous avons déjà relevé que cette technique

est trop sélective pour l‘étude des communautés naturelles totales.

D‘autres méthodes sont apparues plus récemment.

La métatranscriptomique et la métaprotéomique sont,

comme la métagénomique, des méthodes d‘analyse des

constituants cellulaires à grande échelle (Maron et al. 2007; Moran

2009). Il a été reconnu clairement que les techniques d‘études des

gènes étaient limitées pour obtenir des informations sur les

fonctions exprimées par les communautés bactériennes in situ. Par

contre, l‘étude de l‘expression génique et la traduction en protéines

dans les milieux naturels sont deux nouveaux champs de

l‘Ecologie microbienne particulièrement prometteurs pour étudier

(i) de nouveaux gènes fonctionnels et de nouvelles voies

métaboliques de dégradation des hydrocarbures, en particulier, et

(ii) pour identifier les protéines préférentiellement associées à

certaines conditions environnementales comme l‘apport de pétrole,

dans des contextes variables (Fig. 22).


Figure 22 : Protocole d’expériences en métagénomique, métatranscriptomique et métaprotéomique.

Inspiré de (Shelswell 2006; Maron et al. 2007; Moran 2009).

Les méthodes

radiographiques tout comme

le SIP permettent

d’identifier des bactéries

particulières dans une

communauté bactérienne

totale.

Encore relativement peu employées, la métatranscriptomique et

la métaprotéomique sont des approches prometteuses pour étudier

les mécanismes moléculaires de la biodégradation des

hydrocarbures.

Les méthodes radiographiques (FISH-microautoradiographie

ou isotope array) permettent également de s‘affranchir des biais

des méthodes culturales (Dumont et al. 2005). Brièvement ces

techniques consistent à incuber un échantillon naturel avec un

substrat radioactif et d‘hybrider les cellules d‘un échantillon à

l‘aide de sondes fluorescentes pour révéler les différents groupes

qui ont incorporé le substrat radioactif (Fig. 23). Comme nous

l‘avons souligné précédemment, cette technique est limitée par le

nombre de sondes utilisable, la rendant inapplicable pour l‘étude

de la diversité spécifique d‘un échantillon complexe. Elle est

également limitée par la connaissance préalable des organismes

ciblés nécessaire à la création des sondes.

Figure 23 : Méthodes d’identification des microorganismes par l’utilisation de radio-isotopes (Dumont et

al. 2005).

Le Stable Isotope Probing (SIP) est la dernière option pour

identifier les bactéries hydrocarbonoclastes au sein d‘une

communauté naturelle. Cette technique se décline selon le type de

biomolécule marquée (Fig. 24).

Figure 24 : Schéma synthétique représentant les différentes possibilités pour le marquage des

biomolécules par des isotopes stables (Gutierrez-Zamora et al. 2010).

Par rapport aux techniques citées précédemment, elle présente

l‘avantage de ne pas nécessiter de connaissance préalable des

microorganismes recherchés et ne fait pas appel à l‘emploi de la

radioactivité (Manefield et al. 2004). Elle a toutefois d‘autres

inconvénients qui seront largement présentés dans le chapitre 5 de

ce manuscrit, entièrement consacré à cette technique.


Finalement, pour clore cette partie consacrée aux méthodes

d‘étude des communautés bactériennes soumises à une pollution

pétrolière, nous proposons de faire ici une synthèse des techniques

présentées ci-dessus sous forme d‘un schéma général (Fig. 25) et

d‘un tableau récapitulatif (Tableau 10) des avantages et

inconvénients de chacune des approches.

Figure 25 : Ensemble des méthodes utilisables pour l’étude des communautés bactériennes impliquées

dans la dégradation des hydrocarbures en milieu marin. Adapté de Weiss et al. (2008).

Methodologie Avantages Limitations

I. Enumération et identification des microorganismes totaux et spécifiques

Microscopie Permet de déterminer le nombre total de cellules,

les vivantes/mortes, actives/inactives avec

l‘emploi de marqueurs adaptés

Peu d‘informations sur l‘identité ou le rôle physiologique des µO* ;

difficile à mettre en place pour des échantillons de sédiment

Cytométrie en flux Grande efficacité due à l‘automatisation, temps

d‘analyse rapide

Idem microscopie

Culture Facile et robuste, idéal pour l‘isolation de souches

d‘intérêt. Média non-spécifiques ou spécifiques

pour examiner la croissance sous conditions

particulières

La plupart des µO provenant de l‘environnement ne sont pas encore

cultivables, en particulier ceux provenant des zones oligotrophes. Non

représentatif de la quantité totale de µO dans un échantillon naturel.

Difficulté de cultiver les anaérobies. La croissance d‘un µO peu être très

lente.

Nombre le plus

probable

Technique simple, quantification d‘une groupe

particulier

Biais de la culture, difficulté de choix dans le protocole, risques de

surestimation

Hybridation (dont

microarray)

Pas d‘étape de culture ni d‘extraction d‘acide

nucléique, aperçu instantané de la communauté

entière ou de groupes spécifiques, rapide et fiable,

possibilité de cibler l‘ARN pour un aperçu de

l‘activité

Difficulté pour l‘utilisation d‘échantillons de sédiment ou d‘échantillons

où les µO sont peu abondants, nécessite de connaitre les séquences

ciblées et d‘avoir des sondes adaptées.

PCR quantitative Détection rapide et quantification du gène de

l‘ARNr 16S ou de gènes fonctionnels

Il peu y avoir plusieurs copies du gène dans chaque cellule, des biais

dans les extractions d‘acides nucléiques, des hybridations non spécifiques

avec d‘autres gènes, nécessite des primers adaptés

Clonage/Séquençage Détection de nouvelles séquences et des espèces

dominantes, identification des séquences à partir

de banques de données

Biais d‘extraction des acides nucléiques, analyse longue, la qualité de

l‘analyse dépend du nombre de clones séquencés

Pyroséquençage Séquençage à heut débit, bien plus performant

que le clonage/séquençage classique,

représentation de la diversité d‘un échantillon

satisfaisante

Analyse des séquences complexe et longue, jusqu‘à présent les séquences

obtenues étaient relativement courtes ne permettant pas toujours une

bonne résolution phylogénétique

II. Détermination de la structure et/ou de la diversité de la communauté bactérienne

Profil physiologique

de la communauté

(Biolog, Inc.,

Hayward, CA)

Disponible dans le commerce, fournit des

informations sur la diversité métabolique dans

une courte période

Pas adapté aux molécules provenant de l‘environnement dans lequel a été

prélevé l‘échantillon, génère beaucoup de données à traiter

statistiquement

PLFA Les lipides totaux peuvent être analysés pour

créer une « empreinte » de la communauté

Le profil PLFA peut être influencé par les stress qui impacte la

communauté et sa physiologie

Empreintes

moléculaires

Rapide aperçu des groupes majoritaires d‘une

communauté, peut être couplées au

clonage/séquençage pour une identification de ces

groupes

Les groupes peu abondants sont difficilement détectables, information

qualitative avec une résolution limitée, peu nécessiter un équipement

sophistiqué

III. Mesures de l’activité

Analyses de l‘ARN Fournit des informations sur les gènes exprimés,

l‘expression de ces gènes peut être liée à une

fonction particulière

Quantité d‘ARN souvent faible, difficile à extraire et qui se dégrade

rapidement

SIP Identification de µO qui assurent une fonction

particulière au sein d‘une communauté naturelle,

peut être couplé à des mesures chimiques et

d‘autres techniques de biologie moléculaire

Les isotopes lourds peuvent être onéreux, difficulté d‘enrichissement des

groupes d‘intérêt et difficulté de séparation des acides nucléiques lourd et

légers

Production

bactérienne

Mesure relativement rapide de l‘activité globale

d‘une communauté

Difficulté dans le choix de la concentration en substrat et du temps

d‘incubation

Activités

enzymatiques

extracellulaires

Diversité dans les activités testées Idem production bactérienne, difficulté d‘interprétation

Expériences de

biodégradation du

substrat particulier

La mesure de la concentration en substrat et de

l‘abondance bactérienne et de la structure de

communauté sur une période de temps données

donne un aperçu de l‘activité de toute une

communauté

Prend du temps et fait appel à plusieurs méthodes d‘analyses très

différentes

IV. Nouvelles techniques, les « omics »

Métagénomique Etude haut débit sur l‘ensemble des génomes d‘un

échantillon naturel : « whole-genome shotgun

sequencing », composition et diversité de la

communauté, étude complète des génomes les

plus représentés

Techniques complexes et longues à réaliser, difficulté dans l‘analyse des

résultats

Métatranscriptomique Etude haut débit sur l‘ensemble des transcrits

d‘un échantillon naturel, évaluation du potentiel

métabolique de la communauté


résultats

Métaprotéomique Etude haut débit sur l‘ensemble des protéines

d‘un échantillon naturel, évaluation des gènes

exprimés par la communauté, test de conditions

particulières


résultats

* « µO » est l‘abréviation de microorganismes dans ce tableau.

Tableau 10 : Aperçu des différentes méthodes de microbiologie et de biologie moléculaire utilisées pour

l’étude des microorganismes dans les zones polluées par les hydrocarbures. Adapté de Weiss et al. (2008).

95

6. Objectifs de la thèse

Au regard des informations apportées dans cette étude bibliographique, il est indéniable

que les connaissances concernant le fonctionnement des communautés microbienne dans les

environnements pollués par les hydrocarbures ont largement été améliorées durant les quatre

dernières décennies. Pourtant, malgré la multitude d‘études réalisées en milieux pollués, les

stratégies de bioremédiation, souvent efficaces en condition contrôlée, donnent des résultats

parfois mitigés lorsqu‘ils sont appliqués à la réalité des environnements naturels. Cela

s‘explique en grande partie par la complexité du processus de biodégradation, de la diversité

génétique et métabolique des microorganismes en jeu, des facteurs environnementaux

affectant aussi bien le pétrole lui-même que les bactéries dans leur fonction de biodégradation

et enfin par la difficulté de prévoir précisément les effets de la bioremédiation sur les

microorganismes autochtones et donc sur l‘efficacité de l‘élimination des hydrocarbures.

Le travail de thèse présenté ici, a été réalisé dans le but de répondre à un certain nombre de

questions encore inabordées dans la littérature ou présentant jusque-là des résultats variables,

de manière à améliorer notre compréhension du processus de biodégradation des

hydrocarbures pétroliers et ainsi contribuer au perfectionnement des techniques d‘élimination

favorisées des polluants. A travers une étude in situ, deux études en milieu contrôlé

(microcosmes/mésocosmes) et en adaptant la technique de Stable Isotope Probing sur les

HAP en milieu marin, nous avons abordé les problématiques suivantes :

Qu‘elle est l‘importance relative de la pollution pétrolière, parmi les autres paramètres

environnementaux abiotiques, comme facteur de régulation de la structure des

communautés bactériennes marines ? (Chapitre 2)

A quel point la récurrence de la pollution influence-t-elle la réponse des communautés

bactériennes à un apport de pétrole ? (Chapitre 3)

Quel est l‘impact des facteurs de type « bottom-up » (nutriments et émulsifiant) et/ou

« top-down » (virus et protozoaires) sur la structure et l‘activité des communautés

bactériennes impliquées dans la biodégradation des hydrocarbures ? (Chapitre 3 et 4)

Comment identifier les bactéries responsables de la biodégradation des hydrocarbures

parmi les communautés naturelles totales en évitant les biais de culture? (Chapitre 5)

97

IMPACT DE LA POLLUTION PAR LES HAP SUR LES

COMMUNAUTES BACTERIENNES MARINES

CHAPITRE 2

99 Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les communautés bactériennes marines

Chapitre 2 : Impact de la pollution par les HAP sur les

communautés bactériennes marines

1. Préambule

Nous avons évoqué dans l‘introduction générale (Chapitre 1) la difficulté de prédire en

condition naturelle l‘impact relatif du pétrole sur les communautés bactériennes marines par

rapport à d‘autres paramètres environnementaux. Pour répondre à cette question, il est

primordial de réaliser des analyses in situ qui ne souffrent pas d‘éventuelles conditions

artificielles dues à l‘incubation en conditions de laboratoire. Pourtant, en comparaison aux

études menées en laboratoire, les études in situ demeurent relativement rares en raison de la

difficulté de mise en place d‘un suivi spatio-temporel à bord d‘un navire scientifique, de la

multitude des paramètres à mesurer pour une compréhension du milieu la plus complète

possible et donc du coût et du temps investis.

Nous proposons dans ce premier chapitre de résultat une étude in situ réalisée en baie de

Marseille (Fig. 26). Nous avons délibérément choisi de faire des transects bord-large dans

différents sites côtiers subissant des pollutions chroniques volontaires, dont 3 ports plus ou

moins ouverts à la mer et soumis à des pollutions variables et une station au niveau des rejets

d‘eaux usées de la ville de Marseille, en comparaison avec une station de référence côtière du

réseau national SOMLIT (station SOFCOM) censée être moins soumise aux pollutions. Nous

avons ciblé l‘impact sur les bactéries marines de la pollution par les hydrocarbures

aromatiques polycycliques (HAP), molécules prioritaires de la liste établie par l‘agence de

protection environnementale. Nous avons fait le choix d‘effectuer cette analyse à deux

saisons différentes de manière à observer les réponses de consortium bactériens différents à

des pollutions pétrolières plus ou moins marquées.

Tout l‘intérêt de cette étude reposait sur le large spectre des paramètres mesurés à la fois

pour le dosage chimiques des HAP (méthode fluorimétrique et dosage par chromatographie

en phase gazeuse), la mesure de nombreux paramètres environnementaux classiques

(température, salinité, pH, sels nutritifs, carbone organique dissout…) et les paramètres

bactériens comprenant l‘étude de la structure de communautés bactériennes dans les

différentes stations par CE-SSCP, l‘abondance des bactéries totales (cytométrie en flux) et

hydrocarbonoclastes par deux techniques complémentaires (MPN et PCR quantitative). Une

originalité de ce travail a consisté à évaluer par des analyses statistiques robustes (analyse

multivariée directe par analyse canonique de correspondance) l‘influence relative de la

pollution par les HAP parmi les autres facteurs environnementaux sur la structuration des

communautés bactériennes. Les résultats principaux de ce travail ont été de montrer que (i) les

HAP contribuaient significativement avec d‘autres paramètres environnementaux à la

structuration des communautés bactériennes dans les différents ports, (ii) que l‘abondance

relative des bactéries HAP-dégradantes dans les différents sites pouvait être indicatrice du

degré de pollution pétrolière.

Figure 26 : Sites d’échantillonnage de l’étude en Baie de Marseille.


2. Article 1: Spatial and temporal variations of bacterial community structure and

PAH-degrading bacterial abundance in Mediterranean harbors subjected to

various PAH-pollutant levels.

List of authors : Caroline Sauret1,2

, Marc Tedetti3,4

, Catherine Guigue3,4

, Chloé Dumas5 ,

Raphaël Lami1,2

, Madeleine Goutx3,4

, Jean-François Ghiglione1,2

(1) CNRS, UMR 7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC, F-66651

Banyuls-sur-Mer, France;

(2) UPMC Univ Paris 06, UMR 7621, Observatoire Océanologique, F-66651 Banyuls-sur-

Mer, France;

(3) CNRS, UMR 6117, Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et Ecologie Marines

LMGEM, 13009 Marseille, France;

(4) Aix-Marseille Université, UMR 6117, Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et

Ecologie Marines LMGEM, 13007 Marseille, France;

(5) CEntre de Formation et de Recherche sur l'Environnement Marin (CEFREM), Université

de Perpignan, 66860 Perpignan, France

Correspondence:

Jean-François Ghiglione

CNRS, UPMC Univ Paris 06, UMR7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC,

Avenue Fontaulé, F-66651 Banyuls-sur-Mer, France. Tel.: +33 4 68 88 73 16; fax: +33 4 68

88 73 98

E-mail address: [email protected] (J.F. Ghiglione)

Running title : Impact of PAH-pollution on coastal marine bacteria.

Keywords: PAH pollution, bacterial community structure, MPN, qPCR

Abstract

Most of the experiments exploring the effect of oil pollution on bacterial communities have

been conducted under controlled micro- or mesocosms experiments. However, in situ studies

dealing with environmental complexity are rare. In this study, short transects were done, at

two seasons, in 3 harbors, one wastewater effluent site and one reference control, along the

NW Mediterranean coast. We monitored the relative effect of polycyclic aromatic

hydrocarbons (PAH) on total and active bacterial community structures and on the PAH-

degrading functional group in particular. Most of the harbors presented high levels of PAH

contamination. In both seasons, significant correlations were found between PAH

concentration and PAH-degrading bacteria for the more enclosed harbors but not in the more

sites. Molecular fingerprint also showed clear changes in total and active bacterial

communities between harbors and coastal waters at both seasons. At each site, surface

microlayer from the harbors presented an original bacterial community structure together with

the highest PAH concentration and PAH degraders counts. Direct statistical multivariate

analysis confirmed the significant effect of PAH concentrations in the spatial distribution of

bacterial community structure in the NW Mediterranean coastal sites among other

environmental variables such as salinity, inorganic nutrients, temperature and chlorophyll.


Introduction

The shorelines are highly vulnerable to anthropogenic pressures (Rabouille et al. 2001;

Valiela 2006). Among the major hazardous pollutants, hydrocarbons are known to deeply

impact coastal communities. These chemicals comes from rivers (Fernandes et al. 1999),

atmospheric depositions (Lim et al. 2007) as well as discharges of effluents (Singh et al.

2004) or boat traffic (Birpinar et al. 2009). One particular aspect of their toxicity is that

hydrocarbons are accumulated in marine organisms causing important damages on marine life

and seawater quality (Moore & Dwyer 1974, Thakker et al. 1985, Baussant et al. 2001, Wurl

& Obbard 2004). The Mediterranean Sea is one of the most polluted areas, receiving around

20% of the global marine oil pollution including several major oil spills whereas it represents

less than 1% of the total ocean surface. It is bordered by 46 000 km of coasts that support

several high harbor activity stations and particular tourism pressure (Gomez 2003).

Bacteria constitute the main sink for hydrocarbons in marine environments (Paerl et al.

2003; Head et al. 2006). Thus, in order to better understand the process of biodegradation, it

is of major interest to monitor bacterial communities in oil polluted context (Head et al.

2006). Because of the difficulty to explore natural complex systems, most of studies that

investigated the effect of pollution on bacterial assemblages, simulated oil spills in artificial

conditions (Cappello et al. 2007; Gertler et al. 2009; Lekunberri et al. 2010). However, even if

such experiments present advantages for raising clear tendencies, field investigation remains

an essential approach for the study of in situ processes.

The quantification of PAH-degrading bacteria among natural communities is generally

achieved by two different methods, the most-probable-number (MPN) and the quantitative

PCR. The first is the classical cultivation-based approach that has been successfully employed

in the past for the estimation of hydrocarbon-degrading bacterial number, in situ as well as in

laboratory experiments (Mills et al. 1978; Johnsen et al. 2009; Rodríguez-Blanco et al. 2010).

The second is a recent molecular technique allowing the quantification of the number of

copies of genes responsible for the metabolism of hydrocarbon (Cebron et al. 2008). Even if

they give complementary results, their coupling for a better representation of hydrocarbon-

degrading bacterial potentialities in natural environments has been very few tested (Pérez-de-

Mora et al. 2010).

Concerning the assessment of bacterial community structure, a privileged way has

often been the high-throughput 16S rRNA-gene-based methods (Denaro et al. 2004; Brown et

al. 2005; Ghiglione et al. 2005; Miralles et al. 2007). Coupled with environmental parameter

measurements, multivariate statistical analyses revealed the factors that constrained bacterial

communities in space (Ghiglione et al. 2008) as well as in time (Lami et al. 2009) and

provided a detailed description of aquatic ecosystem functioning over large-scale sampling.

However, data about variations in bacterial community structure in the first meters from the

shore are particularly scarce (Zhang et al. 2007; Zhang et al. 2009) and studies including

pollutants as a driving parameter are almost inexistent (Ben Said et al. 2010).

Furthermore, among the hot spot for sampling strategies, the sea surface microlayer

(SML, uppermost 1-1000 µm layers) has received a belated interest. It can be enriched in

pollutants by up to 1500 times relative to concentrations occurring in the subsurface water

(SSW) (Wurl et al. 2004). Bacterioneuston (bacteria that compose SML) is there generally 102

to 104 more abundant that bacterioplankton (Hardy 1982). Thus, SML has been clearly

identified as a unique microbial ecosystem. It is of first importance in the degradation of

hydrocarbons that especially accumulate to the surface because of their hydrophobicity

(Hardy 1997; Agogué et al. 2005). Nevertheless, few studies investigated the structure of

SML bacterial community in the past (Franklin et al. 2005; Cunliffe et al. 2011).

In this study, we first looked at the relation between PAH concentrations and PAH-

degraders. Second, we evaluated the relative impact of PAH concentration together with the

environmental parameters on total and metabolically active bacterial community structures in

four different harbors in the NW Mediterranean Sea impacted by variable hydrocarbon

pollution levels.


Material and methods

Figure 1: Sampling sites of the study.

Study sites and sampling

As part of the EC2CO IBISCUS program, five sites were investigated in the coastal

Northwestern Mediterranean Sea (Southern France): one site located in the Gulf of Fos-sur-

mer (Port Bouc, 43°24.167'N, 04°59.024'E) and four sites in the Bay of Marseille (Saumaty,

43°21.476'N, 05°19.517'E, Vieux Port, 43°17.765'N, 05°22.417'E , Cortiou, 43°12.746'N,

05°24.091'E and SOFCOM, 43°14.3'N, 05°17.3'E) (Fig. 1). These sites were chosen because

they present contrasted sources of anthropogenic inputs. Port Bouc (PB, 5 m depth) is a

harbor subjected to discharges of petroleum hydrocarbons from the Fos-sur-mer

petrochemical complex, which includes shipping and industrial activities related to oil (Mille

et al. 2007). Port Bouc may also receive some freshwater inputs coming from the Rhône

River and the Berre Lagoon (Ulses et al. 2005). Saumaty (SA, 4 m depth) and Vieux Port

(VP, 6 m depth) are two harbors characterized by an intense maritime traffic, especially

during the summer. Vieux Port is a marina and is the main recreative harbor of Marseille.

During strong rainfalls, Vieux Port can overflow and receive large amounts of highly

hydrocarbon-loaded freshwaters. Saumaty is a dynamic fishing harbor that combines trawlers,

tuna boats and wholesale trading centers. Cortiou (CO, 10 m depth), in the south Bay of

Marseille, is the discharge area of the secondary-treated sewage effluent from Marseilles City

and fifteen surrounded municipalities. By dry weather, the sewage effluent is released with a

daily average flow rate of 2.3 m3 s

-1. SOFCOM (SOF, 60 m depth), situated near Frioul

Islands (5 km off Marseille), is the nearshore observation station of the Oceanology Center of

Marseille. It belongs to the Service d‘Observation en Milieu LITtoral (SOMLIT;

http://www.domino.u-bordeaux.fr/somlit_national/) and was chosen as a pristine reference

(i.e. unpolluted by petroleum).

Sampling was carried out in summer (June 2009) and winter (January 2010) aboard

the R/V Antédon II. For all these sites (except SOFCOM that represented a unique station

named SOFCOM-D0), five stations were sampled along a coast-open sea transect (D0-D4),

D0 being the station at 1-10 m from the shore and D4 the offshore station, located about 2 km

from D0. Seawater samples were collected in the morning in the subsurface seawater (SSW at

~ 0.1-0.5 m depth) using a 5-L Niskin bottle equipped with silicon ribbons and Viton o-rings.

Seawater was transferred (without silicon tubing) from the Niskin bottle into 5 L plastic

bottles (for microbial analyses) and 4 L Nalgene® polycarbonate bottles (for PAH and

biogeochemical analyses). At D0 stations, samples were also collected in the surface

microlayer (SML) using a stainless-steel screen (0.8 m × 0.6 m, 2 mm mesh) according to the

method by Garret (1965). The metal screen was deployed from an inflatable boat under very

low wind (< 2 m s-1

) and calm sea conditions. SML samples were poured into the

plastic/Nalgene®

bottles by means of a precombusted (450 °C, 6 h) glass funnel. The bottles

were washed with 1 M hydrochloric acid (HCl) and ultrapure water (i.e. Milli-Q water, final

resistivity: 18.2 MΩ cm-1

) before use, rinsed three times with the respective sample before

filling and placed in the dark after the sample collection.

Along with the discrete water samples, profiles of temperature, salinity and

chlorophyll a (Chla) concentration were obtained from a Seabird Electronics 19plus

conductivity temperature depth (CTD) profiler equipped with a WETStar Chla fluorometer

(WETLabs Inc, USA). In situ measurements of ultraviolet (UV) fluorescence were also

conducted with an EnviroFlu-HC fluorometer (TriOS Optical Sensors, Germany) to assess the

PAH global levels in the water column (see § ―Measurements of PAH fluorescence‖).

Analyses of DOC and nutrients

Samples for dissolved PAH and dissolved organic carbon (DOC) analyses were

filtered under a low vacuum (< 50 mm Hg) through precombusted GF/F (~ 0.7 µm) glass

fiber filters (47 mm diameter, Whatman) using polysulfone filtering systems. Filtered water


for DOC (duplicate) was transferred into pre-combusted 10 ml glass ampoules, sealed after

addition of 10 µl of 85% phosphoric acid (Sigma-Aldrich). DOC was measured on 2

replicates by high-temperature catalytic oxidation using a Shimadzu TOC 5000 Total Carbon

Analyzer according to Sohrin & Sempéré (2005). The accuracy and system blank of the

instrument were determined by the analysis of reference material including deep Atlantic

water and low carbon water reference standards (D. Hansell, Rosenstiel School of Marine and

Atmospheric Science, Miami, USA). The nominal analytical precision of the measurement

was within 2%.

Samples for nutrients were analyzed without being filtered. Samples for nitrate (NO3-),

nitrite (NO2-) and phosphate (PO4

3-) determination were collected into 50 ml polyethylene

flasks and stored frozen until analysis. Samples for ammonium (NH4+) determination were

collected into 60 ml polycarbonate tubes and analysed directly. NO3-, NO2

- and PO4

3- were

analyzed using automated colorimetric method as described in Aminot & Kérouel (2004,

2007). The detection limits were 0.05 µM for NO3- and NO2

-, and 0.02 µM for PO4

3-. NH4

+

concentration was measured by using the fluorescent procedure of Holmes et al. (1999),

offering a detection limit of 0.005 µM.

Measurements of PAH fluorescence (EnviroFlu-HC fluorometer)

The EnviroFlu-HC submersible UV fluorometer is a commercially available

instrument dedicated to the in situ and real time quantification of PAHs from raw (unfiltered)

water. It provides an excitation light at 254 nm with a Full-Width Half-Maximum (FWHM)

of 25 nm (254 ± 12.5 nm), and detects an emission light at 360 nm with a FWHM of 50 nm

(360 ± 25 nm). The EnviroFlu-HC fluorescence domain fits very well with that of

phenanthrene, which is one of the most fluorescent PAHs found in the aquatic environment

(Tedetti et al. 2010). Hence, the sensor was calibrated in the laboratory before each series of

cruises with standard solutions of phenanthrene (≥ 98%, Sigma-Aldrich) in the range 0.01-10

µg L-1

according to the procedure described in Tedetti et al. (2010). Linear regressions of

calibration curves had coefficients of correlation (R) > 0.99. The phenanthrene detection and

quantification limits were 0.12 and 0.40 µg L-1

, respectively, whereas the saturation value was

around 20 µg L-1

. For in situ measurements, the EnviroFlu-HC was set up on the 19plus

CTD. The EnviroFlu-HC/CTD system, managed from the rear of the ship, was first immersed

in the SSW and then deployed in the whole water column (Tedetti et al. 2010). SML

measurements were made in the laboratory on discrete water samples. Therefore, in this work,

the EnviroFlu-HC fluorescence data of SSW and SML samples are given in µg L-1

equivalent

phenanthrene with an average coefficient of variation of 10%. Although these fluorescence-

derived concentrations cannot be considered as ―real‖ concentrations of Phenanthrene, they

are used as indicator of the abundance of PAHs in the different samples. We then validated

the use of the EnviroFlu-HC fluorometer as an indicator of the PAH levels in our samples by

comparing the data with PAH quantification by gaz chromatography according to Guigue et

al. (2011). As expected, we observed a significant linear relationship (R = 0.69, n = 19, p =

0.001) between the phenanthrene concentrations issued from the EnviroFlu-HC fluorometer

and total dissolved PAH concentrations determined from GC-MS (r2=0.93, n=6, p<0.01).

Bacterial abundance

Total bacterial counts were determined by flow cytometry (Lebaron et al. 1998).

Briefly, 2 mL seawater samples were fixed with 2% formaldehyde for at least 1 h at 4°C. A 1

mL sub-sample was incubated with SYBR Green I (final conc. 0.05% [v/v] of the commercial

solution) for at least 15 min at 20°C in the dark and analysed with a FACS Calibur flow

cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) equipped with an air-cooled argon laser (488

nm, 15 mW). Stained cells were enumerated according to their side-angle-scattered light

(SSC) and green cell fluorescence (GF) collected through a 530 ± 30 nm bandpass filter.

Yellow–green fluorescent beads (1 μm diameter, Polysciences) were systematically added to

each analyzed sample to normalize SSC and GF emission. Data acquisition and analysis were

done with Cell-Quest software (Becton Dickinson). Acquisition was triggered by GF. The

volume analyzed and subsequent estimation of cell concentrations were calculated by

measuring the remaining volume and subtracting it from the initial volume. Sheath fluid was

seawater filtered through a 0.22 μm pore size membrane.

Quantification of PAH-degrading bacteria by Most-Probable-Number

The quantification of PAH-degrading bacteria was first performed by the most-

probable-number (MPN), A total of 100 μL of each sample was introduced in triplicate in a

48-well microplate with 900 μL of sterile culture medium (Marine Broth®

reconstituted without carbon source and one milliliter of resazurin per liter of medium). 16

dilutions/extinctions were carried out successively in the same medium for each sample. A

mixture of six PAHs (naphthalene, fluorene, phenanthrene, fluoranthrene, pyrene and benzo-

α-pyrene) prepared in dichloromethane was introduced into each well at a final concentration

of 10 µg mL-1

. Finally 10 μL of sterile silicone oil were also added in order to increase the

accessibility of PAHs to bacteria. The microplates were sealed with a sterile plastic film


and encircled with parafilm to prevent evaporation. The incubation took place in the dark at

room temperature for one week. After incubation, the wells that have changed color (from

blue to pink) due to oxidation of the resazurin contained in the medium were counted.

Classical MPN table gave the most probable number of bacteria able to degrade the mixture

of six PAHs.

Identification of PAH genes

All PAH genes were recovered using primers described previously (Cebron et al.

2008). Ten nanograms of DNA was used in PCR amplifications, with the following

conditions: one cycle of 94°C, 2 min, followed by 30 cycles of 94°C, 30 s; 52°C, 30 s; and

72°C, 30 s. Final concentrations of primers and MgCl2 were 2 mM. The PCR products were

subjected to electrophoresis (1.5% agarose), and the products of the expected size were

excised from the gel and eluted with a Gene Clean gel extraction kit (Q-Biogene). The

purified fragments were cloned with a TOPO TA cloning kit for sequencing (Invitrogen)

according to the manufacturer‘s instructions. Colonies were screened via PCR to determine

the insert size, and 120 clones of the expected size were sequenced by standard Sanger

sequencing. Sequences were trimmed of the vector sequence and aligned using the CLUSTAL

program in Mega version 3.1. Sequences were added to an alignment containing most of the

known PAH sequences. Within-group mean distances were calculated in Mega 3.1.

Phylogenetic trees of the translated sequences were constructed in Mega3.1 with the default

parameters, based on both neighbor-joining and minimum evolutionary algorithms with 500

bootstrap replicates. The PAH gene sequences from the clone libraries were submitted to

GenBank.

Quantification of PAH and 16S rRNA gene abundance

One group of PAH genes, related to Proteobacteria, was targeted by qPCR. This

group was selected because of its relative abundance in PAH clone libraries (see Results).

Primers for this PAH group were designed using ARB with an alignment containing a set of

environmental and strain-derived PAH sequences. One PAH-containing plasmid was used as

a positive control and for standard curves in the qPCR assays. The PAH-containing plasmid

related to the targeted PAH group was isolated from environmental clones (Qiaprep kit,

Qiagen). Products were quantified in triplicate using the picogreen assay. Standard reactions

with plasmid contained approximately 101-10

6 copies per reaction. All standard curves were

linear within the ranges tested. Quantitative PCR was performed in triplicate or quadruplicate

with 1 mL of diluted DNA (0.1 ng mL-1

) in a final volume of 12.5 µL using the Stratagene

SYBR green mix with an ABI 7500 (Applied Biosystems). The PCR conditions were an

initial denaturation step at 95°C (10 min), followed by 40 cycles of amplification at 95°C for

15 s, 60°C for 45 s, and 72°C for 45s, with a final dissociation step. Final primer

concentrations were 0.5 mM. Only single peaks were observed in the dissociation curves for

both the standards and samples, indicating specific amplification with each set of primers.

Amplification efficiencies were between 91% and 110%, and no inhibition was detected when

a known quantity of standard was added to each sample (data not shown). The detection limit

of qPCR assays was about 10 copies. To verify the specificity of the PAH primers, the qPCR

primer pair was used to amplify PAH genes from the experiment and the resulting products

were cloned. PCR products were cloned and sequenced as described above. Of 20 clones that

were analyzed all contained the expected PAH sequences related to the targeted group.

Nucleic acid extraction, 16S PCR amplification and CE-SSCP analysis

Back to the laboratory, samples for microbial analyses were successively filtered onto

2 µm pore-size filter (47 mm, PC Nuclepore) and 0.2 µm Sterivex and stored at -80 °C until

nucleic acid analysis. DNA and RNA extractions and 16S cDNA synthesis were performed

from Sterivex as previously described (Ghiglione et al. 2009). Both DNA and cDNA served

as a template for PCR amplification of the variable V3 region of the 16S rDNA using w49F

and fluorescently 5‘-labeled with phosphoramidite (TET, Eurogentec) w34R primers

according to Ghiglione et al. (2005). CE-SSCP and analysis of the electropherograms were

performed as described in a previous paper (Ghiglione et al. 2008). All peaks were checked

manually for correct retention time (i.e. 1 OTU, ±6 retention time AU) and shape.

Electrophoregrams were transferred to the SAFUM software (Zemb et al. 2007) to render a

profile of fluorescence intensity as a function of retention time per sample. It allowed the

comparison of CE-SSCP profiles based on the presence and intensity of each individual peak

and analysis using indirect multivariate analysis. Similarity matrices based on Bray-Curtis

distances and ordination analyses along with their corresponding dendrograms were generated

by the unweighted pair group method using average linkages (UPGMA) by using the

PRIMER 5 software (PRIMER-E, Ltd., UK).

Statistical analysis

To test the null hypothesis that there was no difference between bacterial communities

of different experimental conditions we conducted an analysis of similarities with the


subroutine ANOSIM of PRIMER according to a protocol previously described (Ghiglione et

al. 2008).

Data were also analyzed using CANOCO (Ter Braak et al. 2002) version 5.0.

Fingerprints were analyzed by their peak areas, generating an intensity matrix. The similarity

matrix was computed using Steinhaus‘s similarity index. A canonical correspondence analysis

(CCA) was used to investigate the variations in the intensity matrix under the constraint of

our set of environmental variables. Significant variables (i.e. variables that significantly

explained changes in 16S rDNA and 16S rRNA signals) in our data set were chosen using a

forward-selection procedure and 999 permutations.

Results

Environmental parameters

First of all, as expected the temperature of seawater in sampled sites was higher in

summer (mean= 19 and 11, SD=3 and 2.2, n=21 in summer and winter respectively, Table 1).

The temperature was also higher in enclosed harbors than in opened sites in summer whereas

it was the opposite in winter. The salinity was clearly decreased in Port Bouc station, near the

Rhône River (26.8) from the classical values of seawater (37.8), and Chlorophyll a (Chla) was

increased in this site in comparison to the others. The dissolve organic carbon (DOC)

concentration was approximately the same between the two seasons (mean= 125 and 104,

SD=65 and 45, n=26 in summer and winter respectively). However, the surface microlayer

(SML) was systematically enriched in DOC compared to the underlying seawater (mean=205

and 133, SD=77 and 52, n=5 in SML and mean=106 and 97, SD=47 and 42, n=21 in SSW in

summer and winter respectively).

Station Location

Site

depth

(m)

T (°C) S (psu) Chlα (µg.L-1) DOC (µM) NH4 (µM) NO3+NO2 (µM) PO4 (µM)

Sum. Win. Sum. Win. Sum. Win. Sum. Win. Sum. Win. Sum. Win. Sum. Win.

Sofcom * D0 43°14.3'N, 05°17.3'E 60 nd nd nd nd nd nd 132.1 65.1 10.05 0.85 6.5 1.55 0.25 0.06

Sofcom D0 43°14.3'N, 05°17.3'E 60 15.03 12.46 37.87 37.92 0.50 1.2219 61.6 61.8 0.14 0.04 0.5 2.37 0.05 0.02

Cortiou * D0 43°12.746'N, 05°24.091'E 10 nd nd nd nd nd nd 209.7 108.5 overload 50.41 45.25 20.27 3.74 1.27

Cortiou D0 43°12.746'N, 05°24.091'E 10 15.06 13.34 37.92 37.60 0.26 2.4094 111 161.4 overload 184.59 56 39.21 1.84 3.19

Cortiou D1 43°12.709'N, 05°24.056'E 20 15.13 13.31 37.85 37.20 0.28 2.9378 179.1 83.4 overload 53.60 57.75 18.43 3.93 1.05

Cortiou D2 43°12.571'N, 05°24.069'E 30 15.15 13.31 37.32 37.66 0.29 2.7152 101.9 67.1 overload 15.39 50.5 6.84 1.16 0.30

Cortiou D3 43°12.353'N, 05°24.042'E 50 15.01 13.24 37.95 37.42 0.23 2.5227 68.4 67.2 0.51 4.01 0.75 4.09 0.10 0.18

Cortiou D4 43°12.0'N, 05°24.0'E 60 14.90 13.17 37.93 37.52 0.27 2.5594 62.5 72.5 0.25 15.19 1.25 9.07 0.05 0.44

Saumaty * D0 43°21.476'N, 05°19.517'E 4 nd nd nd nd nd nd 321.7 176.4 4.21 3.40 26.5 17.09 1.75 0.64

Saumaty D0 43°21.476'N, 05°19.517'E 4 18.00 11.30 37.72 37.08 3.19 2.7391 180.6 78.6 6.66 0.82 9 10.35 0.16 0.13

Saumaty D1 43°21.400'N, 05°19.590'E 3 17.84 11.58 37.82 37.13 3.56 3.1004 71.4 76.9 0.70 0.60 8 12.76 0.03 0.12

Saumaty D2 43°21.413'N, 05°19.478'E 4 17.85 12.03 37.76 37.36 4.05 5.3989 72.1 72.9 0.72 0.47 3.25 8.98 0.10 0.14

Saumaty D3 43°21.433'N, 05°19.011'E 5 19.33 12.26 37.79 37.43 0.17 1.3727 66.9 74.4 0.26 1.13 1 7.34 0.04 0.04

Saumaty D4 43°21.060'N, 05°18.301'E 28 19.57 13.01 37.76 37.91 0.13 1.2572 67.3 66 0.19 0.09 1 1.45 0.08 0.04

Vieux Port * D0 43°17.765'N, 05°22.417'E 5 nd nd nd nd nd nd 138.7 123.3 0.75 1.76 0.75 9.16 0.77 0.34

Vieux Port D0 43°17.765'N, 05°22.417'E 5 20.13 8.63 37.97 37.31 0.58 1.7398 86 105.7 1.74 2.42 0.75 7.65 0.25 0.27

Vieux Port D1 43°17.696'N, 05°22.225'E 5 21.49 8.80 37.62 37.32 10.66 1.9543 83 82.8 0.14 1.09 1.25 5.86 0.20 0.16

Vieux Port D2 43°17.665'N, 05°21.891'E 5 21.49 9.03 37.51 37.38 7.69 0.2822 81.6 79.4 0.12 0.54 6.25 4.73 0.07 0.09

Vieux Port D3 43°17.796'N, 05°21.563'E 5 20.40 11.39 37.71 37.71 1.92 0.5044 77 75.6 overload 0.16 2 2.56 0.08 0.04

Vieux Port D4 43°17.909'N, 05°20.879'E 30 21.14 12.29 37.87 37.98 0.10 0.7137 66 69.5 0.11 0.17 1.5 1.83 0.08 0.04

Port Bouc * D0 43°24.167'N, 04°59.024'E 5 nd nd nd nd nd nd 224.7 193.8 6.61 2.83 4 19.16 0.34 0.16

Port Bouc D0 43°24.167'N, 04°59.024'E 5 22.52 8.00 26.73 32.26 5.90 3.4921 191.7 196.4 7.30 2.32 3.75 19.12 0.26 0.12

Port Bouc D1 43°24.030'N, 04°59.050'E 6 22.60 7.03 26.29 27.50 5.67 3.9899 163.7 184.4 5.26 1.80 3 18.46 0.25 0.08

Port Bouc D2 43°24.027'N, 04°59.245'E 6 22.53 6.75 26.23 26.93 5.47 4.0517 179.1 147.2 4.68 1.83 1.25 17.48 0.12 0.12

Port Bouc D3 43°23.788'N, 04°59.109'E 12 22.08 8.57 27.92 30.49 4.15 2.0944 169.8 149.1 4.79 1.76 1.5 17.63 0.24 0.07

Port Bouc D4 43°23.402'N, 04°58.889'E 12 22.26 11.89 36.02 37.14 0.96 0.9516 98.3 71.3 0.77 0.25 1.5 4.01 0.15 0.05

nd:not determined

Table 1: Physico-chemical characteristics of the stations located in the Marseilles Bay and

Fos-sur-mer gulf.


The concentrations in inorganic nutrients (NH4, NO3+NO2, PO4) were slightly higher

in summer with quantities means of 2-2.6µM for the NH4 (SD=3.2 and 3, n=21), 11-11.3 for

the NO3+NO2 (SD=8 and 18, n=26) and 0.35-0.6 for the PO4 (SD=0.6 and 1, n=26) in winter

and summer respectively. The most important difference was found for the wastewater

effluent site (Cortiou) that reached very high values of inorganic nutrients compared to the

other stations (Table 1).

PAH fluorescence

In summer, the maximal phenanthrene concentrations derived from the PAH-

fluorometer were found in the subsurface seawater (SSW) and the surface microlayer (SML)

of Port Bouc-D0 station (35.4 and 87.9 µg L-1

equivalent phenanthrene, respectively) and in a

lesser extent in the SSW and SML of Saumaty-D0 station (6.9 and 51.3 µg L-1

equivalent

phenanthrene, respectively, Fig. 2). Surprisingly, phenanthrene concentration in the SML of

SOFCOM-D0 (9.8 µg L-1

equivalent phenanthrene) was higher than those observed in the

SML of Cortiou-D0 and Vieux Port-D0 (~ 6 µg L-1

equivalent phenanthrene), while

concentration in the SSW of SOFCOM-D0 was roughly undetectable (0.08 µg L-1

equivalent

phenanthrene). The enrichment factor (EF: concentration in the SML / concentration in the

SSW) ranged from 1.7 (Cortiou) to 120 (SOFCOM). In Port Bouc, Vieux Port, Saumaty and

Cortiou sites, phenanthrene concentrations decreased noticeably along the coast-open sea

transect (from D0 to D4). In winter, phenanthrene concentrations were much lower than in

summer (Fig. 2). The highest values were recorded in SML of Saumaty-D0 and Vieux Port-

D0 stations, with 5.6 and 4.3 µg L-1

equivalent phenanthrene, respectively. Concentration in

the SML of SOF-D0 was much lower than in summer (0.5 µg L-1

equivalent phenanthrene).

EF were also lower than in summer, ranging from 0.95 (Cortiou) to 8.4 (SOFCOM). The

same trend was observed with a decrease in phenanthrene concentrations from D0 to D4 (Fig.

2).

Total bacterial abundance

The total bacterial abundance was until 6-fold higher in the Port Bouc site compared to

the others (Fig. 2). All sites included, bacterial abundance exhibited a coast-offshore gradient,

varying from 3.08 106 or 0.94 10

6 cells mL

-1 in the subsurface seawater at the harbors (D0)

down to 0.72 106 or 0.46 10

6 cells mL

-1, at the offshore stations (D4), in summer and winter

respectively. Thus, the D4 stations of the four transects reached approximately the same

values as the SOFCOM station (Fig. 2). The number of bacterial per milliliter was 3-times

higher in summer than in winter with averages of 2.28 106 and 0.75 10

6 cells mL

-1,

respectively. At both seasons, the minimum bacterial abundance were found at the D4 station

of Saumaty (3.38 105 3.21 10

5 cells mL

-1 in summer and winter, respectively). As for PAH,

the SML contained 0-2.16-fold more bacteria than the underlying seawater. The maximum

was found in the SML of D0 Saumaty in summer (7.18 106 cells mL

-1) and in the SML of the

Vieux Port in winter (1.18 106 cells mL

-1).

Figure 2: Quantification of PAH, copy number of PAH-degradation genes, most-probable-

number of PAH-degrading bacteria and total bacterial abundance in all sampled sites during

summer 2009 (black) and winter 2010 (White).


Abundance of PAH-degrading bacteria

The PAH-degrading bacterial abundance was determined by two different methods

that showed complementary results (Fig. 2).

By using the Most-Probable-Number method, the tendencies were almost the same

than fluorometer-quantified PAH and total bacterial abundance with (correlation between the

MPN and the PAH concentration in Vieux Port and Saumaty, R²=11.47, p<0.01) an

enrichment of the Port Bouc site and the SML of all sites together with a harbor-large gradient

and an increase in PAH-degrading bacterial number during the summer season (Fig. 2). The

results from the quantification of PAH-RHD genes by quantitative PCR were different. The

designed primers for qPCR targeted specific catabolic genes that were found in a small

proportion of PAH degrading bacteria mostly belonging to Cycloclasticus, Sphingomonas,

Sphingobium, Novosphingobium, Acidovorax, Burkholderia, uncultured Comamonas and

Pseudomonas genera (Fig. 3). As for MPN, when detected, such genes were practically

always present at higher abundance in summer than in winter (Fig. 2). However they were

only occasionally detected in SOFCOM, Cortiou and Port Bouc sites, whereas they were

almost always found in Saumaty and Vieux Port transects. The maximum of copies was for

the Vieux Port SSW-D0 station in summer with 6.3 104 copies mL

-1. The SML was not

enriched in PAH-RHD genes and not clear gradient of such genes could be found between

coast and offshore seawaters (Fig. 2).

Figure 3: Phylogenetic tree of PAH-degrading gene in coastal Mediterranean waters based

on a neighbour-joining analysis of translated nucleotide sequences. Numbers on branches

represent bootstrap proportions from 500 replicates.

Bacterial community structure analysis

Figure 4: UPGMA dendrogram generated from the DNA (D-) and RNA-based (R-) CE-SSCP

patterns of bacterial communities originated from Cortiou, Vieux Port, Saumaty, SOFCOM

and Port Bouc sites. D0 to D4 indicate the coast-large gradient in sampled stations in each

site, samples with an (*) correspond to the surface microlayer, S means summer and W means

winter.


The major variations in bacterial community structure were found in site origins of

samples (Fig. 4). ANOSIM was used to determine the significant differences among bacterial

communities from the different stations. Three different clusters were formed with samples

most coming from (i) Cortiou, (ii) Vieux Port and Saumaty and (iii) SOFCOM and Port Bouc

(ANOSIM R=0.451, p=0.001). However, all sites were significantly different between each

other with the highest value of R between Vieux Port and Port Bouc (R=6.22, p=0.001) and

the lowest value between Vieux Port and Saumaty (R=0.108, p=0.009). Some D3 and D4

samples from Cortiou, Vieux Port and Saumaty presented some similarities with samples

from SOFCOM and Port Bouc, revealing a coast-offshore gradient in bacterial community

structure. ANOSIM confirmed that samples from D0 to D2 were significantly different to

samples from D3 to D4 (R= 0.215, p=0.001). Most of the time, DNA and RNA-based samples

were separated (R=0.118, p=0.001), especially in the Port Bouc site. One exception could be

found for the SML of Vieux Port and Saumaty for which total and active bacterial community

structures were particularly closed and not significantly different (R=-0.018, p=0.5).

Although, the SML was different from the underlining seawater (R=0.103, p=0.002)

especially in Vieux Port and Saumaty (Fig. 4). Generally, winter and summer samples were

different (R=0.099, p=0.001).

Bacterial community structure and physico-chemical variables ecological analysis

We performed canonical correspondence analysis (CCA) using all physic-chemical

parameters as constrained variables of the bacterial community structure determined by CE-

SSCP fingerprints of all environmental samples. First of all, we separated the samples in two

groups according to nucleic-acid based profile (DNA or RNA-based community structure).

A summary of the results of CCA is shown in Table 2.

CE-SSCP samples DNA-based RNA-based

Total inertia 0.720 0.928

Sum of all canonical eigenvalues 0.290 0.415

Axis 1 Axis 2 Axis 1 Axis 2

Eigenvalues 0.113 0.066 0.179 0.105

Species-environment correlations 0.762 0.866 0.823 0.820

Cumulative percentage variance of

- species data 15.7 24.9 19.3 30.6

- species-environment relation 38.9 61.7 43.2 68.6

Table 2: Summary of results from canonical correspondence analyses of the bacterial

community structure data when constrained by physico-chemical variables.

The total percentage of variance of samples diversity data when using physico-

chemical variables to explain their bacterial community structure was 40.3% or 44.7% for

DNA and RNA-based analysis respectively, as indicated by the ratio between the sum of all

canonical eigenvalues to the total inertia (Ter Braak et al. 2002). The same physico-chemical

variables were necessary to build the model for both DNA- and RNA-based analysis, i.e.

salinity, temperature, phosphate, chlorophyll a and to a lesser extend dissolved organic

carbon, nitrate, nitrite and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). Among all monitored

physico-chemical parameters, the PAH concentration was not the most determinant factor but

contributed significantly to the shaping of the bacterial community structure (p=0,002).The

cumulative percentage variance of species-environment relation indicates that the first and

second canonical axes account for 38.9 and 61.7% for DNA-based samples and 43.2 and

68.6% for RNA-based samples of this variance respectively (Table 2). Consequent axes

accounted for less than 10% of the variance each, and are not further considered here. The

eigenvalues of the ordination analyses, which also measure their relative importance are small

(<0.3) implying that CCA does not strongly separates species niches and therefore the biplot

rule must be used to interpret the fitted relative abundances of samples with respect to

physico-chemical variables in the CCA ordination diagram (Fig. 5).

Monte Carlo test for first and all canonical axes were highly significant (p<0.01)

indicating that the parameters selected are good explanatory variables of the community

structure. The first canonical axis of DNA-based analysis was highly positively correlate with

salinity (ca. 0.8) and to a lesser extend with nutrients (PO4, NO3NO2 and NH4; ca. 0.3 to 0.4)

chlorophyll a, temperature (ca. 0.1 to 0.2, respectively) and PAH (ca. less than 0.1) (Fig. 5).

The second axis was more positively correlated with nutrients (ca. 0.6) chlorophyll a and

temperature (ca. 0.5) and to a lesser extent positively correlated with DOC and salinity (ca.

0.1 to 0.2 respectively). The same parameters explained also the first two axis of RNA-based

analysis, with higher positive correlation of the first axis with salinity and nutrients (ca. 0.9 to

1.2). The second axis was positively correlated with temperature (ca. 0.7), nutrients (ca. 0.4 to

0.6), DOC and PAH (ca. 0.3) and negatively correlated with chlorophyll a and salinity (ca.

0.3). In both DNA- and RNA-based analysis, the two synthetic gradients clearly separated

samples from their geographic origin (Vieux Port and Saumaty different from Port de Bouc

and from Cortiou) observed when using diversity data alone indicating that their community

composition varies with different concentrations of these parameters (Fig. 5).


Figure 5: Canonical correspondence analysis of bacterial community structure from samples

in all stations using physico-chemical parameters. Arrows point in the direction of increasing

values of each variable. The length of the arrows indicates the degree of correlation with the

represented axes. The position of samples relative to arrows is interpreted by projecting the

points on the arrow and indicates the extent to which a sample bacterial community

composition is influenced by the environmental parameter represented by that arrow. Samples

are colored in blue for Cortiou, in yellow for Port Bouc and SOFCOM and in orange for

Saumaty and Vieux Port according to clusters determined by the CE-SSCP dendogram.

Discussion

Impact of PAH pollution on total and PAH-degrading bacterial abundances

The pollution by PAH (substances on the priority list of the United States

Environmental Protection Agency) monitored in the sampled area reveled various oil-

pollution levels and attested of the impact of anthropogenic pollutants in harbors and coastal

marine environment. Certainly because of oil-shipping and anthropogenic coastal activities,

all stations were PAH-enriched compared to the SOFCOM reference, especially during the

summer (Fig. 2). Total bacterial abundance was also increased in harbors sites certainly

because of combined effects of terrigenous inputs of organic matter and nutrients,

anthropogenic pollution from harbor activities and by-products of primary production (Zhang

et al. 2007; Zhang et al. 2009). As expected, most probable number (MPN) enumeration of

indigenous PAH-degrading microorganisms (mix of six PAH as sole source of carbon)

followed the same patterns of PAH concentrations (Atlas 1991). In Vieux Port and Saumaty

especially, MPN were directly correlated to PAH concentrations (R²=11.47, p<0.01).

Moreover, whereas MPN-PAH-degrading bacteria represented around 1% of total bacterial

abundance in Cortiou, Vieux Port, Saumaty and SOFCOM, this proportion was increased

until 2-5% in Port Bouc, the most polluted site.

The quantification of PAH-degrading genes by quantitative PCR showed

complementary results. By contrast to the MPN method, the designed primers for qPCR

targeted specific catabolic genes that were found in a small proportion of PAH degrading

bacteria mostly belonging to Cycloclasticus, Sphingomonas, Sphingobium, Novosphingobium,

Acidovorax, Burkholderia, uncultured Comamonas and Pseudomonas genera (Fig. 3). The

qPCR has the advantage to focus on specific bacteria that serve as pollution indicators but

also reveal different variations of sub-groups of bacteria from general patters of total PAH-

degradation bacterial populations (Baldwin et al. 2003; McKew et al. 2007; Smith et al.

2009). Thus, we found that PAH-degrading genes were particularly detected in Saumaty and

Vieux Port sites whereas they were almost not found in Port Bouc while total PAH-degrading

bacterial populations detected by MPN were the most abundant. This combined approach of

MPN and qPCR showed that Vieux Port and Saumaty, on one hand, and Port Bouc, on the

other hand were composed by different PAH-degrading bacterial communities that were

certainly adapted to different types of complex oil-pollutants.

Differences between MPN and qPCR-based results were also found in the coast-

offshore gradient and the SML versus SSW (Fig. 2). MPN-PAH-degrading bacteria


particularly enriched the SML. Such high concentration of bacteria highlighted the relative

importance of the SML environment in the degradation of oil-pollutants (Guerin 1989). By

contrast, specific bacteria targeted by qPCR were not more abundant in the SML than SSW

contrasting once again with MPN results. Indeed, the SML was clearly enriched by total

PAH-degrading bacteria but not by all ribotypes. This observation constituted the first

relevancy of a specific colonization of the SML by particular bacteria meaning that even if

they possess metabolic capacities for the degradation of PAH, some bacteria were not able to

survive in this particular micro-environment. Moreover, whereas MPN-PAH-degrading

bacterial concentration decreased from the harbors to the large, PAH-degrading genes

abundance was more homogeneous over the stations (Fig. 2). Even in SSW, specific PAH-

degrading populations did not necessarily follow total PAH-degrading communities. Finally,

identical patters in MPN and qPCR results were found in seasonal variations. In summer,

PAH concentrations together with total bacterial abundance and PAH-degrading bacteria were

drastically increased. Thus, both total and specific PAH-degradation metabolic capacities

were stimulated by higher pollutant levels (Medina Bellver et al. 2005). Further investigation

on such PAH-degraders, and their activity in particular, would allow a better comprehension

of natural oil-bioremediation process in highly oil-impacted areas.

Environmental factors driving spatial and temporal variations of bacterial community

structure in harbors

In order to evaluate the relative impact of PAH contamination on bacteria among other

environmental parameters, we first explored the bacterial community structures in the

different areas. The similarity comparison of CE-SSCP profiles revealed that bacterial

assemblages were clustered according to three main groups with a majority of samples from i)

Cortiou ii) Vieux Port and Saumaty and iii) SOFCOM and Port Bouc (Fig. 4). Such clustering

was in accordance with origin of samples, distance between sites and type of pollutions (Fig.

1). Indeed, Cortiou was the most eastern station (nearest station, at 13 Km to SOFCOM)

which is classically characterized by its consistent and daily discharge of partially treated

wastewaters from the city of Marseille. Such specificity in bacterial community structure has

already been found in same type of environment in the Hong Kong bay where strong

anthropogenic pollutions (complex mix between chemical and biological pollutants) are

responsible for disturbance of natural bacterial community (Zhang et al. 2007; Zhang et al.

2009). Vieux Port and Saumaty are two enclosed harbors, separated by only 7 Km (closest

stations) and are characterized by oil-pollution especially during tourism periods. Their

isolation could explain the specific acclimation of bacterial communities in each site (Ben

Said et al. 2010). Thought, as those harbors presented similar characteristics, their bacterial

community structures were not radically different (Fig. 4). Last, bacterial community

structure from Port Bouc (most western site) was totally different from the others, certainly

because of contrasted types of pollution from others harbors. Port Bouc is a chronically oil-

polluted harbor which is more open to sea than Vieux Port and Saumaty (Mille et al. 2007).

Such characteristic would have explained why samples from Port Bouc and SOFCOM were

grouped in a same cluster even if they were separated by 34 km.

Bacterial community structure in each site formed a very short gradient between

samples from the shore (D0, less than 10m from the dock or the shore) to samples at 2 Km

further (D4). Whereas D0, D1 and D2 samples showed particular community structures in

each sites, D3 and D4 samples were more similar to the SOFCOM station suggesting an

impact of anthropogenic pollutants in the very first meters of the shoreline. Only Zhang et al.,

(2007, 2009), studying bacterial community structure in marine areas submitted to

anthropogenic pressure sampled seawater as close to the shore as we did. Such approach

contrasts with numerous studies that did not start their sampling before at least 2.7 Km

offshore (Ghiglione et al. 2005). Previously changes in bacterial community structure were

observed at 9.3 Km (Ghiglione et al. 2005) or at 95 Km from the coast (Schauer et al. 2000)

in the NW Mediterranean sea. Probably, the distance to the coast of sampling was not suitable

to highlight the small-scale variations in bacterial community structure, especially in waters

directly impacted by anthropogenic activities.

A particular attention should be paid for the SML that occasionally presented

particular characteristics in the oil polluted harbors (ANOSIM R=0.215, p=0.001, Fig. 4). A

sine qua non condition for the investigation of the SML was its complete formation. Indeed,

the most distinct SML was found for Saumaty and Vieux Port, the two sites that are the most

isolated from open sea, where there was the lowest wind disturbance during sampling and

where SML could maintain during several days. Those environmental conditions together

with the sampling method of SML (metal screen in our case) could explain contrasted results

found in our study and the literature (Cunliffe et al. 2011). For example, whereas Agogué et

al. (2005) did not detected consistent difference between SML and SSW in the Bay of

Banyuls-sur-Mer (France) and the Olympic Harbor in Barcelona (Spain), other authors found

distinct bacterial community compositions in UK North Sea coast (Franklin et al. 2005) and

Pacific Ocean (Cunliffe et al. 2009). The specificity of bacterial community structure of the


SML could be explained by numerous particular conditions, such as high UV radiations,

water-air surface exchange, specific organic film, enrichments in nutrients, pollutants and

microbes that made the SML a unique micro-environments where only few species could live

(Hardy 1982; Wurl et al. 2004; Guitart et al. 2010). Moreover, the comparison of rDNA-based

and rRNA-based CE-SSCP profiles from SML revealed that active bacterial community

structure were almost similar to total community while active and total fractions differed in

SSW. Thus, we showed for the first time that SML could be a particular ecological niche

where only active adapted bacterial OTUs are able to survive. In the rest of SSW samples,

total and active fractions of bacterial community structure were significantly dissimilar, a

tendency that was in accordance with previous studies showing that most of ribotypes are not

always active in natural environments (Moeseneder et al. 2001; Lami et al. 2009).

All those observations were available in summer as in winter period. Nevertheless,

bacterial community structures from each site varied according to the season (Fig. 4). Such

change was not surprising as most previous studies exposed seasonal patterns of bacterial

community composition in sites very close to our sampling area (Banyuls-sur-Mer, Ghiglione

et al., 2005), in others Mediterranean Sites (Schauer et al. 2003; Pinhassi et al. 2006), in

Atlantic Ocean (Kan et al. 2006) as well as Pacific Ocean (Fuhrman et al. 2006) and others

locations (Morris et al. 2005; Mary et al. 2006; Riemann et al. 2008). Our result showed that

harbor bacterial communities were as dynamic as communities from the large and were

sensitive to seasonal fluctuations.

To explain such spatial and seasonal variations in bacterial community structure we

performed statistical analysis canonical correspondent analysis (CCA) of CE-SSCP profiles

together with complex environmental data set including concentration pollutants (PAH). This

method has already showed its efficiency in the comprehension of pristine marine

environment (Ghiglione et al. 2008). However very few studies have integrated the pollution

factor in their environmental data set (Ben Said et al. 2010). Our statistical analysis revealed

that environmental parameters could explain 40.27 to 44.71% of the variance of the bacterial

community structure. Among parameters, the salinity, temperature, phosphate and chlorophyll

a were the most important factors and DOC, nitrate, nitrite and PAH contributed to a less

extend to the variation of bacterial community structure in the sampled area (Fig. 5). The

PAH concentration estimated by the PAH-fluorometer, in particular, contributed significantly

to the shaping of the bacterial community structure but was not the most important factor by

contrast with Ben Said et al.‘s (2010) results on the oil-polluted Bizerte Lagoon sediments.

Zhang et al. (2009) showed also that in some cases the anthropogenic pollution could

substantially affect the bacterial community and disturb the natural patters of bacterial

community structure produced by seasonal changes of the ecosystems. In the present study,

such massive impact of pollutants was not observed. Bacterial communities in sampled

harbors were clearly impacted by oil-pollution but this effect did not surpassed the effect of

others physic-chemical parameters such as temperature and salinity. Zhang et al. (2009)

indicated that it was not contradictory to reach such conclusion as probably major bacterial

groups composing total bacterial community would follow general seasonal patterns, while

other factors as pollutant concentrations would ―stimulate or repressed‖ minor bacterial

groups. Further investigations should put the light on specific effects of pollutants on

particular groups composing total bacterial community.

Acknowledgments

This study is part of a research project ―IBISCUS‖ (Indicateurs Biologiques et

chImiques de Contaminations UrbaineS) from Université Aix-Marseille2/CNRS-INSU, which

aim at developing observation tools for pollution assessment in urban coastal marine

environnement and funded by 1) the Continental and Coastal Ecosphere (EC2CO) program

from CNRS and the Institut des Sciences de l‘Univers (INSU), and 2) ―ANR-ECOTECH 09-

ECOT-009-01‖, Agence Nationale de la Recherche (ANR) – Ademe/Ecotechnologies

program, both labeled by the Competitivity Cluster ―Pôle Mer PACA‖.


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131

IMPACT DE LA RECURRENCE DES POLLUTIONS SUR LA

REPONSE DES BACTERIES A L’APPORT DE PETROLE ET

A LA BIOSTIMULATION

CHAPITRE 3

133

Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la biostimulation.

Chapitre 3 : Impact de la récurrence des pollutions sur la

réponse des bactéries à l’apport de pétrole et à la

biostimulation.

1. Préambule

Nous avons vu dans le premier article l‘intérêt incontestable des études in situ. Néanmoins,

afin de permettre une meilleure compréhension de l‘impact des hydrocarbures sur les

communautés bactériennes et la façon de les stimuler, il est également nécessaire de réaliser

des expériences en conditions contrôlées, en laboratoire, qui permettent de mieux maîtriser la

complexité des facteurs environnementaux. Ce type d‘approche a plusieurs avantages : (i) elle

permet de simuler des déversements soudain de pétrole et de suivre l‘évolution des

communautés bactériennes en réponse aux hydrocarbures, ce qui peut s‘avérer difficilement

faisable dans l‘environnement, (ii) elle permet de tester différentes hypothèses en contrôlant

les paramètres expérimentaux et (iii) elle permet l‘utilisation de contrôles expérimentaux ainsi

qu‘une meilleure reproductibilité. Il s‘agit en général de simuler une pollution sur des

échantillons naturels dans des systèmes expérimentaux de type microcosmes (<100 L) ou

mésocosmes (>100 L). Par ce type d‘approche, il est possible de suivre la dynamique de

l‘ensemble des populations microbiennes (bactéries mais aussi protozoaires et virus) sous

l‘influence de différents facteurs comme les ressources en sels nutritifs, l‘oxygénation, la

température, les populations de prédateurs de bactéries, et bien d‘autres.

Au regard de ce qui a été discuté en introduction générale, il ne fait aucun doute que

certains paramètres influençant la dégradation des hydrocarbures ont été par le passé

davantage étudiés que d‘autres. De manière surprenante, la question de l‘effet de la récurrence

des ajouts de pétrole n‘a pratiquement pas été abordée alors que plusieurs auteurs ont émis

l‘hypothèse d‘un rôle non négligeable des déversements chroniques dans la réponse des

communautés bactériennes à un apport d‘hydrocarbures. L‘effet de la prédation par les

protozoaires est également un facteur qui a été pris en compte que très tardivement dans les

expériences de bioremédiation. Par conséquent, les informations sur le contrôle de type « top-

down » en milieu pollué sont encore relativement rares et surtout elles ont donné des

tendances contradictoires. Enfin, bien que nombreuses, les expériences de biostimulation par

ajout de sels nutritifs et d‘émulsifiants montrent toujours des efficacités variables et surtout ne

prennent jamais en compte la récurrence des pollutions et le contrôle « top-down ».

Nous avons donc proposé d‘aborder l‘ensemble de ces aspects dans une expérience

intégrative en microcosmes (75 L) avec deux échantillons d‘origines différentes : un site

pollué chroniquement et un autre site dépourvu de pollution. Nous avons simulé un

déversement accidentel de pétrole brut sur les échantillons provenant de chaque site, avec ou

sans biostimulation (ajout de sels nutritifs ou de bioémulsifiant). Il s‘agissait de suivre à la

fois l‘évolution du compartiment bactérien mais aussi celui des nanoflagellés hétérotrophes,

leurs prédateurs directs, sous l‘influence du pétrole, durant environ 10 jours. Nous savions au

préalable que cette période correspondait en général à la mise en place d‘un consortium

bactérien de biodégradation des hydrocarbures mais également qu‘elle permettait d‘observer

des changements d‘abondances entre les bactéries et leurs prédateurs formant un cycle

s‘étalant approximativement sur cet intervalle de temps.

Comme attendu, l‘ajout de pétrole a eu un effet plus marqué sur la communauté

bactérienne originaire du site dépourvu de pollution que celle originaire du site

chroniquement pollué. Un consortium de biodégradation s‘est mis en place plus rapidement

dans le site chroniquement pollué et la dégradation des molécules les plus complexes (HAP) a

été meilleure. Toutefois, la biostimulation par ajouts de nutriments ou d‘émulsifiants a été

tout aussi efficace dans un site que dans l‘autre, permettant aux bactéries d‘être plus actives et

ainsi induisant une meilleure dégradation des hydrocarbures. Enfin, la prédation par les

protozoaires a provoqué une forte mortalité chez les bactéries se traduisant par une légère

baisse de la dégradation des hydrocarbures, révélant le rôle prépondérant du contrôle de type

« top-down » dans les stratégies de biostimulation.

135


2. Article 2: Influence of pollution history on the response of coastal bacterial and

nanoeukaryote communities to crude oil and biostimulation assays.

Soumis à Aquatic Microbial ecology.

List of authors: Caroline Sauret1,2

, Urania Christaki3, Paraskevi Moutsaki

4, Ioannis

Hatzianestis5, Jean-François Ghiglione

1,2

(1) CNRS, UMR7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne LOMIC, F-66651 Banyuls-

sur-Mer, France;


Mer, France;

(3) Université Lille Nord de France, INSU-CNRS, UMR 8187, LOG, Laboratoire

d‘Océanologie et des Géosciences -, 32 avenue Foch, F-62930 Wimereux, France

(4) Technological Educational Institute of Crete, Sitia, 72300, Greece

(5) Hellenic Centre for Marine Research, Institute of Oceanography, 46.7 km Athens-Sounio

aven., 19013 Anavyssos, Greece

Correspondence:




88 73 98


Running title: Influence of pollution history in biostimulation assays.

Keywords: pollution history, biostimulation, 16S rDNA/rRNA, 18S rDNA

ABSTRACT

The pollution history has often been proposed to explain site-dependent

bioremediation efficiencies, but this hypothesis remains poorly explored. Here, microcosm

experiments were designed to evaluate the importance of the pollution history on the response

of microbial communities to crude oil and biostimulation assays. Pristine vs. chronically oil-

polluted seawaters from coastal Aegean Sea were supplemented with crude oil ± nutrients or

emulsifier and monitored above 10 days in microcosm experiments. The kinetics of bacterial

and heterotrophic nanoflagellate (HNF) abundances and community structures were followed

by microscopy counting and SSU rRNA gene community profiling, respectively. The addition

of crude oil had a more visible effect on bacteria originated from the pristine site with a higher

increase of the activity of given OTU and inactivation of other petroleum-sensitive bacteria,

as revealed by DNA and RNA-based comparison. Such changes resulted in a delay in the

apparition of a peak of bacterial abundance and in a lower bacterial degradation of the more

complex hydrocarbons. Biostimulation provoked a selection of different bacterial community

assemblages and stirred metabolically active bacteria, resulting in a clear increase of the peak

of bacteria and their HNF predators and higher oil degradation, independently of the pollution

history of the site. The present study gives a better knowledge of environmental

characteristics such as pollution history or top-down vs. bottom-up controls on oil bacterial

degraders which is crucial for the advance of site-specific bioremediation strategies.

137


Introduction

Hydrocarbon-degrading bacteria are ubiquitously distributed in marine environments

and are responsible for most of the petroleum degradation (Leahy et al. 1990; Yakimov et al.

2007). With regard to the low rates of natural biodegradation, bioremediation aims to

stimulate this process as an oil spill countermeasure within marine environments (Atlas 1981;

Prince 1993; Van Hamme et al. 2003). Among the environmental factors controlling bacteria,

the limitation by nutrient resources (Atlas et al. 1972) and the petroleum bioavailability

(Leahy et al. 1990) have been often considered to have a major impact on the rate of

hydrocarbon biodegradation. Biostimulation by nutrients (mainly nitrogen and phosphorus)

and/or surfactant (emulsifier) amendment remains the most commonly used strategy to

enhance bacterial degradation (Kasai et al. 2002; Head et al. 2006; Van Hamme et al. 2006).

Biostimulation may increase significantly the hydrocarbon biodegradation but it could also be

ineffective because of its unpredictable effects on the complex food web (Head et al. 1999).

The heterotrophic nanoflagellates (HNF, 2-10 µm in size) in particular have been clearly

identified as major players in the regulation of marine bacterial production and diversity

(Suzuki 1999; Jürgens et al. 2002; Longnecker et al. 2010). Atlas (Atlas et al. 1976) reported

that one of the major changes in microbial communities after oil pollution was the dominance

of flagellated protozoa (heterotrophic nanoflagellates - HNF) over other heterotrophs. In a

single study dealing with HNF diversity based on 18S rDNA clone libraries, it was shown that

cosmopolitan non-specialists can grow efficiently in oil-polluted seawater and control

bacterial abundance (Dalby et al. 2007). Compared to the number of studies investigating the

bacterial limitation by resources (―bottom-up effect‖ reviews by Van Hamme et al. 2003, and

Head et al., 2006), very few studies have investigated the influence of grazers (―top down

control‖) in a biodegradation context (Kota et al. 1999) and even fewer under biostimulation

conditions (Dalby et al. 2007; Gertler et al. 2010).

Bacterial degradation of hydrocarbons and biostimulation efficiencies could also be

dependent of the considered environment and especially its pollution history, enlightening the

difficulty of planning site-specific treatment strategies (Head et al. 2006). If enzymatic

capacities of a single cell are limited, an entire bacterial community presenting high metabolic

capacities is primordial in the degradation of complex mixtures of hydrocarbon such as crude

oil (Van Hamme et al. 2000). Such capacities may be higher for already acclimated bacterial

communities in chronically polluted site compared to a pristine environment (Bartha 1986),

but this hypothesis has been poorly explored in the literature.

Most of the studies using new culture-independent 16S rDNA-based methods showed

that biostimulation led to a decrease of the number of bacterial open taxonomic units (OTUs),

with fewer dominant groups and radical shifts in the bacterial community structure (Kasai et

al. 2002; Röling et al. 2002; Rodríguez-Blanco et al. 2010). 16S rDNA-based methods

describe the relative composition of the total bacterioplankton community, and previous

studies used 16S rRNA-based methods to characterize the active fraction of bacterial

communities in different environments (Moeseneder et al. 2001; Ghiglione et al. 2009; Lami

et al. 2009), based on the observation that the number of ribosomes per cell is proportional to

the growth rate (Kemp et al. 1993). Notably, Rodríguez-Blanco et al. (2010) underlined the

importance of coupling 16S rDNA- and 16S rRNA-based fingerprints to get a better view of

changes after a biostimulation treatment in both total (including dormant, senescent or dead

cells) and metabolically active communities.

The aim of the present study was to compare the responses of the bacterial

communities originated from a chronically oil-polluted environment (POLL) and from a

pristine environment (OLIG) to oil addition and biostimulation in presence of their HNF

predators. We hypothesized that the POLL site would be able to adapt easier to the oil input

than the OLIG pristine site because of his pre-exposition to hydrocarbons. Bacterial and

nanoeukaryotic consortia were assessed with the highly sensitive and reproducible capillary

electrophoresis single strand conformation polymorphism (CE-SSCP) technique (Ghiglione et

al. 2005) to follow the temporal changes of both total (based on 16S rDNA) and active (based

on 16S rRNA) bacterial community structure and total HNF community structure (based on

18S rDNA) during the course of the experiment. To the best of our knowledge, no study

exists on the community dynamics of both bacterial and their eukaryotic predators in oil-

polluted marine water.

139


Materials and methods

Microcosm experiments

Seawater samples from an unpolluted oligotrophic site (OLIG – Anavissos Bay,

Aegean Sea) or a chronically oil-polluted mesotrophic site (POLL – Elefsina Bay, Aegean

Sea) were collected in April and June 2005, respectively. The water was passed through a 10

µm Polycarbonate Nuclepore™ filter (147 mm) (Whatman plc, UK) in a gravity filtration

device (Bailey‘s Plastic Fabrication, Dartmouth, NS, Canada) to screen out larger organisms.

The seawater was then distributed evenly into four 75 L glass aquaria. One of the four

microcosms served as the control and nothing was added in the seawater. The following were

added to each of the other three microcosms: (i) crude oil (100 ppm), (ii) crude oil (100 ppm)

and 0.1 g L-1

of bat-guano as nutrients (containing KH2PO4 0.0077 g L-1

, NH4Cl 0.02 g L-1

and NaNO3 0.01 g L-1

), and (iii) crude oil and Alasan emulsifier (100 and 10 ppm,

respectively). Alasan (Navon-Venezia et al. 1995) is a bioemulsifier complex of an anionic

polysaccharide and proteins (provided by M. Yakimov, Istituto Sperimentale Talassografico –

CNR, Messina, Italy). We evaluated the initial total hydrocarbon (THC) concentration (same

protocol as described in section 2.2) to 0.0014 ppm for Anavyssos sample and 0.171 ppm for

Elefsina sample. Gentle continuous water mixing in each microcosm was accomplished by

using a commercial fish pump (Tunze, Italy) with 35 L h-1

circulating capacity. Incubations

took place in 21°C in the dark. Microcosm incubations lasted 10 days.

Hydrocarbon analysis

Oil composition was determined for the Anavissos experiment (OLIG) at time zero

and 62, 86, 134 and 254 hours after the crude oil addition and for the Elefsina experiment

(POLL) at time zero and at 62, 134 and 206 hours. For the hydrocarbon analysis 100 mL of

each microcosm were collected and, after the addition of n-C24D50, phenanthrene-D10,

pyrene-D10 and chrysene-D12 used as surrogate standards, were extracted with 20 ml of n-

hexane. The hexane extract was dried by passing through Na2SO4 and concentrated to a final

volume of 1 ml. Hydrocarbons were determined in the final solutions by gas chromatography

– mass spectrometry (Hewlett Packard 6890 GS/MSD). A CP-Sil 8 MS analytical column (30

m x 0.25 mm i.d. x 0.25 µm film thickness) was used and the oven temperature was

programmed from 60°C (1 min) to 300°C (10 min) at 5°C min-1

. The following compounds

were quantified: n-alkanes from C12 to C34, the unresolved complex mixture (UCM) of

hydrocarbons, the resolved compounds and some representative polycyclic aromatic

hydrocarbons (phenanthrene, chrysene, methyl- and dimethyl phenanthrenes and methyl-

chrysenes). The quantification was based on calibration curves obtained by injecting standard

solutions containing n-alkanes (C12 – C34) and the PAH compounds. The sum of the

concentrations of n-alkanes, UCM, resolved compounds and the PAH quantified in this study

is referred as total hydrocarbons (THC). The recoveries of the surrogate standards were

always above 80%. Replicate analyses showed that the variability of measured values was

always less than 10%. During the incubation time, to distinguish between physical removal

(mostly evaporation) and biodegradation, hydrocarbon concentrations were expressed relative

to 17α(H),21β(H)-hopane, a known degradation-resistant compound present in crude oil. The

percentage of biodegradation was calculated by dividing the concentration of individual

compounds relative to that of 17α(H),21β(H)-hopane at the time of measurement by the

concentrations relative to that of 17α(H),21β(H)-hopane at the start of the experiment.

Bacterial and nanoflagellate cell counts

To enumerate HNF and bacteria, 5-15 mL and 1-5 mL aliquots, respectively, were

sampled at 0, 19, 40, 65, 90, 114, 137, 185, 237 h for the POLL experiment ant at 0, 65, 86,

93, 110, 134, 164, 231, 255 h for the OLIG experiment. Samples were preserved with

formaldehyde at a final concentration of 2% kept at 4°C in the dark, filtered on black

Nuclepore filters (pore size: 0.8 µm and 0.2 µm for nanoflagellates and bacteria,

respectively), stained with DAPI (Porter et al. 1980) and stored at -20°C until counting.

Heterotrophic nanoflagellates and bacteria were enumerated using an Olympus AX-70

PROVIS epifluorescence microscope at 1000X.

Nucleic acid extraction, 16S and 18S PCR amplification and CE-SSCP analysis

Five hundred milliliters of seawater was filtered on 0.2 µm-pore-size filter (47 mm,

PC, Nucleopore) and frozen until nucleic acid extraction. Samples were taken during the

course of the experiment in time 0, 40, 65 and 114 h in the POLL microcosms and 0, 65, 93

and 134 h in the OLIG microcosms, according to the maximum bacterial and HNF

abundances (see results Fig. 2). DNA and RNA extractions and 16S cDNA synthesis were

performed as previously described (Ghiglione et al. 2009).

Both DNA and cDNA served as a template for PCR amplification of the variable V3

region of the 16S rDNA using w49F and fluorescently 5‘-labeled with phosphoramidite (TET,

Eurogentec) w34R primers according to Ghiglione et al. (2005).

141


DNA served also as a template for PCR amplification of the V8 variable region of the

18S by using phosphoramidite (TET)-labeled Uni1392r (5‘-ACG-GGC-GGT-GTG-TRC-3‘)

(Lane et al. 1985) and Euk1209f (5‘-CAG-GTC-TGT-GAT-GCC-CGC-3‘) (Giovannoni et al.

1988) primers. 18S rDNA amplification was done with the same products and thermocycler

as for 16S PCR amplification but using the following protocol: 94°C for 1 min, 65°C for 1min

and 72°C for 1min, 10 touchdown cycles of denaturation at 94°C for 1 min, annealing at 65°C

(with the temperature decreasing 1°C each cycle) for 1 min, and extension at 72°C for 1 min,

followed by 15 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min and 72°C for 1 min and a final

elongation step at 72°C for 10 min.

CE-SSCP and analysis of the electropherograms were performed as described in a

previous paper (Ghiglione et al. 2008). All peaks were checked manually for correct retention

time (i.e. 1 OTU, ±6 retention time AU) and shape. Electrophoregrams were transferred to the

SAFUM software (Zemb et al. 2007) to render a profile of fluorescence intensity as a function

of retention time per sample. It allowed the comparison of CE-SSCP profiles based on the

presence and intensity of each individual peak and analysis using indirect multivariate

analysis. Similarity matrices based on Bray-Curtis distances and ordination analyses along

with their corresponding dendrograms were generated by the unweighted pair group method

using average linkages (UPGMA) by using the PRIMER 5 software (PRIMER-E, Ltd., UK).

To test the null hypothesis that there was no difference between bacterial communities of

different experimental conditions we conducted an analysis of similarities with the subroutine

ANOSIM of PRIMER according to a protocol previously described (Ghiglione et al. 2008).

DNA- and RNA-based fractions of each sample were also compared manually. A matrix was

established according to the presence or absence of peaks. It allowed to calculate for each

sample the percentage of peaks that were common in both DNA- and RNA-based fractions

(DNA+RNA+), that were only present in DNA-based fraction (DNA+RNA-) or only present

in RNA-based fraction (DNA-RNA+).

Results

Changes in hydrocarbon composition of crude oil

The total hydrocarbon concentration (THC) decreased linearly in both oil amended waters

with higher degradation observed at the end of the experiment for OLIG (51% remaining, Fig.

1A) compared to POLL experiment (77% remaining, Fig. 1B). Addition of nutrients and

emulsifier resulted in a more rapid and more efficient degradation of THC in the OLIG (52%

and 42% remaining in nutrients and emulsifier amended microcosms, respectively) as well as

in the POLL (44% and 59% remaining in nutrients and emulsifier amended microcosms,

respectively) (Fig. 1). In both nutrients and emulsifier amended microcosms, the degradation

of THC was severely reduced after 120 h.

Figure 1: Quantities (in percentage) of total hydrocarbon compounds (THC), n-alkanes and

polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in the oligotrophic site (OLIG) and the chronically

polluted site (POLL) during the microcosm experiments.

The general dynamic of two oil-representative classes of hydrocarbons, i.e. n-alkanes

and PAH, showed two stages. During the first 62 h in the POLL (Fig. 1B) or the first 86 h in

the OLIG conditions (Fig. 1A), we observed a maximal degradation of alkane but lower

143


degradation of PAH. This trend was inverted in a following stage with a slowdown of alkanes

degradation and an acceleration in PAH degradation in both conditions. This trend was

particularly marked for nutrients and emulsifier amended microcosms. After 200 h of

incubation, the decrease of n-alkanes and PAH was almost 2-times higher in the oil amended

POLL (remaining of 17% of n-alkanes and 37% of PAH, Fig. 1B) compared to the OLIG

(remaining of 30% of n-alkanes and 64% of PAH, Fig. 1A). In the nutrients and emulsifier

amended microcosms, a complete degradation of n-alkanes was observed after 136 h in the

OLIG site (Fig. 1A) whereas it occurred after 200 h in the POLL microcosm (Fig. 1B). We

also found a higher decrease of PAH compounds in nutrients or emulsifier amended

microcosms with higher degradation in the POLL compared to OLIG conditions. Indeed,

PAH remaining in the OLIG microcosm (Fig. 1A) at the end of the experiment were 57%,

64% and 31% of the initial quantity in the oil, oil+nutrients and oil+emulsifier microcosms,

respectively. These percentages were respectively of 37%, 9% and 13% in the POLL

conditions (Fig. 1B).

Bacterial and HNF abundances under oil pollution

The initial bacterial abundance was higher in the POLL (4.1 106 cells mL

-1) compared

to the OLIG (7.6 105 cells mL

-1). The addition of crude oil provoked a peak of the bacterial

abundance in the OLIG (5.5 106 cells mL

-1 after

93 h). The peak of bacterial abundance in the

oil polluted POLL (5.5106 cells mL

-1 after

65 h) was similar to the peak in the control

condition (6.7 106 cells mL

-1 after

65 h). In both sites, the HNF abundance remained relatively

low during the course of the experiment in both control and oil supplemented microcosms

(below 1.0 103 cells mL

-1). The addition of oil+nutrients or oil+emulsifier resulted in a drastic

increase of bacterial abundance (peak of 1.3 107 or 6.4 10

6 cells mL

-1 in the OLIG and

1.1 10

7

or 1.2 107 cells mL

-1 in the POLL, respectively) followed by a large increase of HNF

abundance (5.7 103 or 8.6 10

3 cells mL

-1 in the OLIG and 1.1 10

4 or 1.3 10

4 cells mL

-1 in the

POLL, respectively). The biostimulation also reduced the initial lag time of bacterial and HNF

increase in both OLIG and POLL relative to oil only condition (Fig. 2). Bacterial abundances

peaked later in the OLIG microcosms (93, 86 and 62 h for oil, oil+nutrients and

oil+emulsifier respectively) compared to POLL microcosms (40, 65 and 40 h for oil,

oil+nutrients and oil+emulsifier respectively) in response to oil or oil+nutrients or

oil+emulsifier addition (Fig. 2). HNF peaks always followed bacterial peaks, and occurred

between 86 and 134 h in the OLIG and between 65 and 114 h in the POLL site.

Figure 2: Bacterial and nanoflagellates abundances in the control, oil, oil+nutrients and

oil+emulsifier conditions in the OLIG and POLL microcosms.

Community structure of total (16S rDNA) and metabolically active (16S rRNA) bacteria

Community structure of total and metabolically active bacteria was obtained by

comparing 16S rDNA- and 16S rRNA-based CE-SSCP profiles, respectively. At the

beginning of the experiment, the number of DNA and RNA ribotypes in the OLIG (38 and 40

peaks, respectively) was higher than in the POLL microcosms (30 and 29 peaks,

respectively). The number of CE-SSCP peaks varied greatly in the OLIG microcosm with a

clear decrease in both DNA (from 38 to 27 ± 3, n=4) and RNA (from 40 to 22 ± 8, n=4) peaks

from the beginning to the end of the experiment in all conditions (Table 1). The largest

decrease in the number of peaks was found at the RNA level in the nutrients and emulsifier

conditions (from 40 to 19 and 14 peaks, respectively), whereas their decrease at the DNA

level was as high as for the control (Table 1).

145


During the course of the OLIG experiment, the percentage of peaks common to both

16S rDNA and 16S rRNA-based fingerprints (DNA+RNA+) decreased below 53% in all the

oil polluted microcosms, including nutrients and emulsifier conditions (mean= 39 ± 7%, n=9)

whereas it remained stable in the control samples (more than 64%, maximum of 81%,

mean=75 ± 8.3%, n=4) (Fig. 3A). The percentage of peaks unique to the 16S rDNA

fingerprints (DNA+RNA-) in the oil polluted microcosms varied between 18% and 56%

(mean=33.5 ± 11.4%, n=9) and remained always higher than in the control (mean=10 ± 1.9%,

n=4). The number of peaks unique to the 16S rRNA fingerprints (DNA-RNA+) also increased

drastically in the oil polluted microcosms (mean= 27.6 ± 3.9%, n=9) compared to the control

(mean=15.6 ± 6.9%, n=4) (Fig. 3A).

OLIG POLL

Time (h) 0 65 93 134 0 40 65 114

Bact

eria

DN

A Control 38 31 29 27 29 26 38 25

Oil 38 22 24 24 29 27 28 24

Oil + nutrients 38 35 27 28 29 22 24 29

Oil + emulsifier 38 26 22 30 29 28 25 30

RN

A Control 40 33 29 32 30 31 28 23

Oil 40 27 28 24 30 28 25 27

Oil + nutrients 40 36 26 14 30 30 30 41

Oil + emulsifier 40 25 22 19 30 27 29 28

Eu

kary

ote

DN

A Control 23 15 10 8 13 13 9 8

Oil 23 16 12 8 13 13 13 10

Oil + nutrients 23 16 10 6 13 13 11 10

Oil + emulsifier 23 6 5 6 13 9 11 10

Table 1: Number of detected ribotypes in CE-SSCP patterns of bacterial DNA and RNA-

based profiles and of eukaryotes DNA-based profiles in oligotrophic (OLIG) and chronically

polluted (POLL) sites in control, oil, oil+nutrients, oil+emulsifier at different times (0, 65, 93

and 134h for OLIG and 0, 40, 65 and 114h for POLL).

The number of CE-SSCP peaks were much more stable from the beginning to the end

of the POLL experiments on both DNA (from 29 to 27 ± 2, n=4) and RNA levels (from 30 to

29 ± 8, n=4) (Table 1). The differences in the presence/absence of DNA and RNA peaks

observed in the OLIG experiment between control and oil amended samples were less visible

in the POLL experiment with no clear difference between the trend of DNA+RNA+,

DNA+RNA- or DNA-RNA+ in control and oil polluted microcosms, including nutrients and

emulsifier conditions (Fig. 3B).

Figure 3: Percentage of ribotypes unique to the 16S rDNA (DNA) or the 16S rRNA (RNA)

CE-SSCP fingerprints, or common to both (DNA+RNA).

UPGMA dendrograms based on both presence/absence and relative abundance of CE-

SSCP peaks showed different bacterial community structures in OLIG and POLL microcosms

(data not shown, R=0.265, p=0.001) where clusters were different. In the OLIG experiments,

significant differences were found by the ANOSIM statistical test between three clusters in (i)

control (control versus oil R=0.337, p=0.006), (ii) oil only (oil versus nutrients and emulsifier

R=0.566, p=0.001) and (iii) oil with nutrients or emulsifier (nutrients versus emulsifier

R=0.098, p=0.19) (Fig. 4A). Incubation of water in confined conditions resulted in rapid

changes (less than 65 hours) in bacterial community structures for all conditions. In control

and oil amended clusters, bacterial community structure did not changed dramatically after 65

hours. In both clusters, RNA-based profiles formed a separated sub-cluster different from

DNA-based profiles (Fig. 4A). Changes after 65 h were more pronounced in the oil+nutrients

and oil+emulsifier microcosms. In one hand, oil+nutrients profiles were different at 65, 93

and 134 h with close DNA- and RNA-based profiles at each time. In another hand,

oil+emulsifier profiles changed from 65 to 93 h but showed similar profiles at 93 and 134 h,

with DNA- and RNA-based profiles found in separated sub-clusters (Fig. 4A).

147


Figure 4: UPGMA dendrograms generated from the DNA and RNA-based CE-SSCP patterns

of bacterial communities originated from (A) OLIG and (B) POLL in four different

conditions: control, oil, oil+nutrients (Nutrients), oil+emulsifier (Emulsifier) at different times

(0, 65, 93 and 134h for OLIG and 0, 40, 65 and 114h for POLL).

In the POLL experiments, UPGMA dendogram showed two different clusters with (i)

control and oil only and (ii) nutrients or emulsifier conditions (R=0.822, p=0.001) (Fig. 4B).

Control and oil samples were closer than in the OLIG microcosms and DNA- and RNA-based

profiles evolved separately during the course of the experiment. Until 65 h, oil+nutrients and

oil+emulsifier profiles were separated into two sub-clusters where DNA- and RNA-based

fingerprints of a given sample were closed. An important shift occurred after 65 h for both

DNA- and RNA-based oil+nutrients and oil+emulsifier profiles (Fig. 4B).

Changes in total nanoeukaryotic community structure

Total nanoeukaryotic community structures were studied by 18S rDNA-based CE-SSCP

analysis. As for bacterial community structure, eukaryotic community structures were

different in OLIG and POLL (data not shown, R=0.505, p=0.001). At the beginning of the

experiment, the number of OTUs in the OLIG microcosm was higher than in the POLL

microcosm (Table 1). During the 134 h of incubation, the number of OTUs decreased

dramatically in the OLIG experiment (from 23 to 7 ± 1, n=4), while it remained more stable

in the POLL microcosm (from 13 to 9 ± 1, n=4). In both sites, oil addition alone had no

important effect on the number of OTUs, relatively to what was observed in the control

during the incubation (11 ± 3, for OLIG control, 12 ± 4 for OLIG oil, 10 ± 2.6 for POLL

control, 12 ± 1.7 for POLL oil, with n=3 in each condition). Biostimulation, and in particular

with emulsifier addition, induced an important decrease in the number of OTUs in the OLIG

site (from 23 to 6 in less than 65 h in the oil+emulsifier condition) that was less important in

the POLL site (from 13 to 9 in less than 40 h). In both OLIG and POLL, the HNF community

structure evolved during the incubation time (Fig. 5). Whereas no clear tendency was found in

the OLIG microcosms since specific conditions did not cluster distinctly, in the POLL

microcosms Control+Oil and Nutients+Emulsifier clustered in two groups after 65h

(R=0.333, p=2.9).

Figure 5: UPGMA dendrograms generated from the DNA-based CE-SSCP patterns of

eukaryote communities from (A) OLIG and (B) POLL in four different conditions: control,

oil, oil+nutrients (Nutrients), oil+emulsifier (Emulsifier) at different times (0, 65, 93 and 134h

for OLIG and 0, 40, 65 and 114h for POLL).

149


Discussion

Influence of pollution history in the response of bacterial and nanoeukaryote communities to

the addition of oil only.

Overall, the addition of crude oil had a more visible effect on the OLIG compared to

POLL bacterial communities. As previously observed in other pristine environments, the

pollution in the OLIG site induced a dramatic decrease in both total (DNA-based) and

metabolically active (RNA-based) bacterial OTUs (Table 1) (Bordenave et al. 2007), which

was less marked in the chronically polluted POLL experiments. Moreover, the addition of oil

in the OLIG microcosms induced an increase of bacterial OTUs detected only on the DNA,

but not on the RNA level (DNA+RNA-), suggesting that some OTUs which originated from

this pristine environment became much less active to a point where they could not be detected

on the RNA-based CE-SSCP profiles. This situation was observed together with a large

increase in the proportion of metabolically active OTUs in the bacterial community, as

revealed by the remarkable increase of OTUs found at the RNA level but not at the DNA

level (Fig. 3). The contribution of these populations to the total community in terms of cell

numbers was probably too low for detection at the DNA level, but due to their high metabolic

activity and the accompanying 16S rRNA synthesis, these OTUs were detectable at the RNA

level (Moeseneder et al. 2001; Moeseneder et al. 2005; Lami et al. 2009). Our results

reinforce the hypothesis that the addition of oil in a pristine environment induced an increase

of the activity of given species and the inactivation of other petroleum-sensitive bacteria

(Head et al. 2006; Bordenave et al. 2007; Cappello et al. 2007; Coulon et al. 2007). Such

tendencies were less visible in the POLL microcosms (Table 1 and Fig. 3), suggesting that the

tolerance to oil within a bacterial community may be closely linked to their previous exposure

to pollution. Even if adaptation or intolerance to oil have already been observed in culture

conditions (Dott et al. 1989), our culture-independent approach, combining 16S rDNA and

16S rRNA-based analysis, has confirmed that pollution history can be a determinant

parameter in the response of bacteria and nanoeukaryotes communities.

The use of indirect gradient multivariate analysis revealed that the influence of the

pollution history mainly affected the timing of the bacterial community structure changes in

response to addition of oil only. UPGMA dendrograms showed clear changes after 65 h of oil

exposure in the OLIG microcosms, whereas faster changes (within 40 h) were found for

POLL bacterial communities (Fig. 4). This result is in accordance with previous hypothesis

suggesting a longer lag period for bacteria originated from pristine sites to adapt to oil

pollution (Head et al. 2006; Maila et al. 2006; Bordenave et al. 2007). In our experiment, the

changes in bacterial community structures coincided with the peaks of bacterial abundance

observed in both OLIG and POLL microcosms (Fig. 2). The selected populations on the

newly available carbon source peaked two days later in the OLIG (maximum abundance of

5.5 106 cells mL

-1 at 93 h) compared to the POLL microcosms (maximum of 5.5 10

6 cells mL

-

1 at 40 h). These changes concurred also with differential capacities of petroleum hydrocarbon

degradation between OLIG and POLL. In accordance with general trends observed after oil

pollution (Head et al. 2006), we found that n-alkanes were at first degraded (more than 40%

of n-alkanes degradation occurred in the first 62 h), followed by the degradation of the more

recalcitrant PAH fraction (less than 15% of PAH degradation in the first 62 h and up to 60%

after 200 h). The influence of pollution history on oil degradation was mainly visible on the

PAH fraction which was degraded more rapidly and twice more in POLL compared to OLIG

(Fig. 1). These results imply that bacterial communities subjected to previous hydrocarbon

exposure are more efficient in the degradation of the PAH fraction of the oil, relating to the

complex enzymatic machineries needed for the degradation of such recalcitrant compounds

(Riis et al. 1995). Our results agree with recent genomic and transcriptomic analysis revealing

higher PAH dioxygenase diversity in a chronically contaminated, compared to a pristine,

microbial mat (Bordenave et al. 2008).

Interestingly, the pollution history influenced also the response of nanoeukaryotic

communities (≤10 µm) to the addition of oil alone. The number of nanoeukaryotic OTUs

decreased drastically in pristine OLIG microcosms, whereas it remained more stable for the

pre-exposed POLL communities immediately after oil addition (Table 1). Changes in

nanoeukaryotic community structure occurred more rapidly in the POLL (between 40 h and

65 h) compared to the OLIG (between 65 h and 93 h) (Fig. 5). Successively to these changes

in community structure, the abundance of the opportunistic nanoeukaryotes peaked at 114 h in

the POLL (9.0 102 cells mL

-1), whereas no clear peak was found in the OLIG microcosms

(Fig. 2). Our results show that a small proportion of HNF could survive in oil-polluted

seawater (Andrews et al. 1974; Dalby et al. 2007). The peak of opportunistic nanoeukaryote

abundance in the POLL microcosm occurred following the peak of bacterial abundance,

revealing a classical prey-predator relationship (Pernthaler 2005). However, we could not find

any direct link between the peak of nanoeukaryote abundance or changes of nanoeukaryote

community structure on the evolution of the bacterial community structure, as well as any

negative or positive feedbacks on oil degradation. Overall, the addition of oil alone did not

result in an important increase in bacterial abundance or their predators compared to

151


biostimulation experiment (see below). Further studies are needed to address the role of

nanoeukaryote predators on oil biodegradation along with grazing experiment (Kota et al.

1999; Matz et al. 2003).

Response of bacteria and HNF communities after biostimulation by nutrients and an

emulsifier.

Biostimulation by nutrients or emulsifier addition on oil polluted microcosms did not

relieve the influence of the pollution history on the response of bacterial and eukaryotic

communities, which remained faster in the POLL microcosm compared to OLIG (Fig. 4 and

5). The magnitude of the increase in the activity of given OTUs and the inactivation of other

petroleum-sensitive bacteria was similar in biostimulated conditions compared to oil addition

alone (Fig. 3). However, UPGMA dendrograms showed that biostimulation with nutrients or

emulsifier selected different bacterial community assemblages with low similarities with the

control and oil alone bacterial communities (Fig. 4). This tendency was found for both OLIG

and POLL bacterial community structures, even if the shift was more rapid for the

communities in the POLL chronically polluted site. Interestingly, similar bacterial community

assemblages were found at both DNA and RNA levels after biostimulation in both OLIG and

POLL, a situation that was not observed in the control or oil alone conditions. This suggests

that independently to the pollution history of the site, biostimulation stirred metabolically

active bacterial community assemblages. In our study, this change led to a better

biodegradation of n-alkanes (disappearance in 134 h in the OLIG and 200 h in the POLL) as

well as PAH (almost disappearance in the POLL in 200h and 12% of PAH degraded more

than control in the OLIG) (Fig. 1). These results are in accordance with previous studies that

have established clear changes in bacterial communities after biostimulation (MacNaughton et

al. 1999; Röling et al. 2002; Coulon et al. 2007) and found similar 16S rDNA- and rRNA-

based assemblages at the end point of a biostimulation experiment (Rodríguez-Blanco et al.

2009). To our knowledge, we present here the first results on the influence of the pollution

history on both total and metabolically active bacterial community responses under two

biostimulation assays.

Surprisingly, the bacterial assemblages selected after inorganic nutrients addition or

Alasan bioemulsifier addition, generally clustered in a same group (Fig. 4). It is commonly

accepted that inorganic nutrients resources, mainly nitrogen and phosphorus, are limiting

factors of oil degradation by bacteria (Atlas et al. 1972; Swannell et al. 1996). For example,

some opportunistic species such as oil-degrading Alcanivorax populations are able to grow on

petroleum only when nutrient resources are sufficient (Cappello et al. 2007). Another limiting

factor is the low availability of oil for bacterial degradation; a problem that can be solved by

the use of emulsifiers. The Alasan emulsifier is a high-molecular-weight molecule isolated

from Acinetobacter radioresistens. Its emulsifying activity, resulting from the interaction of

proteins and polysaccharides, gives extremely stable oil-in-water emulsions, including: n-

alkanes with chain lengths of 10 or higher, alkyl aromatics, liquid paraffin and crude oil

(Navon-Venezia et al. 1995). It has already successfully been used both to enhance PAH

biodegradation (Barkay et al. 1999) and as a carbon and energy source in bacterial strain

isolation (Navon-Venezia et al. 1998). Besides its simple emulsifying effect, the chemical

structure of Alasan emulsifier may provide not only a fresh carbon and energy source, but

also an organic nutrient input for bacteria (Navon-Venezia et al. 1998). That may explain the

similar influence of nutrient addition or Alasan emulsifier addition on the bacterial

community structure observed in our study. It is difficult from our experimental procedure to

differentiate the relative actions of the Alasan bioemulsifier as to whether it acts primarily as

an emulsifier, a carbon or an organic nutrient source for bacterial communities.

As found in oil alone treatments, the changes in bacterial communities after

biostimulation was concomitant with a peak of bacterial abundance that occurred more

rapidly in the POLL compared to OLIG. The peaks of bacterial abundance were two to three

times higher than in the oil alone treatments, especially for the nutrient amendment. In both

OLIG and POLL, bacterial peaks of abundance were immediately followed by peaks of their

HNF predators, which were up to 10 times more abundant than in the oil alone treatments. As

observed in other pristine environments (Fenchel 1982), HNF controlled bacteria within less

than 48 hours of the height of their outbreak. Moreover, molecular analysis showed clear

changes in nanoeukaryotic community structures following the peak of bacteria (Fig. 5) with

a clear decrease in their OTU numbers (Table 1). It is generally accepted that HNF grazing on

bacteria is size-selective (Šimek et al. 1997; Hahn et al. 1999; Jurgens et al. 1999) and del

Gorgio et al. (1996) estimated that grazing rates on metabolically active bacteria could be four

or more times higher than those on inactive bacteria. Other authors found biochemical prey-

recognition mechanisms via specific cell surface epitopes, suggesting a possible grazing on

specific bacterial OTUs (Wootton et al. 2007; Martel 2009). We were unable to verify this

hypothesis in our experiment as we lacked significant evidence showing any important

changes in bacterial community structure relative to the variations in HNF abundance in either

OLIG or POLL microcosms (Fig. 5).

153


Under biostimulation, we found a decrease in degradation rates of total hydrocarbons

that coincided with the maximum of HNF abundance; a situation that was not found in the oil-

alone treatment where bacterial and HNF abundances were 2-fold lower. These results

reinforce the role of HNF predation on oil bacterial degradation already suggested in a

previous study on oil contaminated aquifer sediment (Kota et al. 1999) and confirm that HNF

can compromise the positive effect of biostimulation on hydrocarbon biodegradation.

Although the prey-predator relationship between bacteria and their HNF grazers is well

known in pristine marine environments, this relationship remains under-investigated in crude

oil polluted marine environments. Our results clearly show the responsive features of oil-

tolerant nanoeukaryotes and their grazing activity should be taken into account in future in

situ bioremediation practices. Further studies are needed to examine the effect of such

microbial responses to higher trophic levels.

Acknowledgements

The present study was conducted in the framework of COMMODE project (Communities of

Marine Micro-organisms for Oil Degradation, CE VK-CT2002-00077) that aimed to increase

our understanding of the dynamics of natural and anthropogenic remediation of crude oil-

polluted systems. We thank F. Ghigui and F. Saury for their contribution on data analysis and

G. Péma and S. Tarte for helpful comments on the manuscript. The experimental setting was

further supported by the EPEAEK II – ARXIMIDIS I project, co-funded by Greece and the

European Community.

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159

EFFET DU « TOP-DOWN » SUR LES COMMUNAUTES

BACTERIENNES EN PRESENCE DE PETROLE

CHAPITRE 4

161 Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés bactériennes en présence de pétrole

Chapitre 4 : Effet du « top-down » sur les communautés

bactériennes en présence de pétrole

1. Préambule

Nous venons de voir que la prédation des bactéries par les protozoaires était un facteur à

prendre en compte dans les expériences de biodégradation et de biostimulation en particulier.

Pour autant, le « top-down control » n‘est pas uniquement exercé par les protozoaires mais

aussi par les virus, un compartiment encore moins pris en compte dans les études de

bioremédiation. Les seules études sur le sujet n‘ont pas toujours pu estimer la part de

responsabilité du « top-down » dans la structuration et l‘activité des communautés

bactériennes polluées parmi les autres facteurs et en particulier les ressources en sels nutritifs

(« bottom-up »). Pour estimer l‘effet exclusif du « top-down » sur la biodégradation des

hydrocarbures et s‘afranchir de contrôle « bottom-up », nous avons imaginé une expérience

originale en mésocosmes (400 L) consistant à simuler un déversement de pétrole sur un

échantillon naturel d‘ordinaire peu soumis à la pollution pétrolière dans des conditions non-

limitantes en sels nutritifs maintenues tout au long de l‘expérience (15 jours). En comparaison

avec un bac non pollué, l‘analyse de l‘évolution de la structure des communautés bactériennes

ainsi que leur activité en période de forte prédation et lyse virale avait pour objectif de

déterminer l‘effet négatif ou positif du « top-down » sur la biodégradation des hydrocarbures.

Ainsi nous avons pu révéler un contrôle de type « top-down » largement dominé par les virus

ayant pour effet d‘importants remaniements des communautés bactériennes à la fois en termes

de biomasse et de structure. Nous avons utilisé la résolution d‘un pyroséquençage massif pour

identifier les espèces bactériennes stimulées par l‘apport de pétrole puis sensibles ou

résistantes à la prédation par les protozoaires ou la lyse virale. Certaines groupes bactériens se

sont ainsi montrés particulièrement sensibles à la prédation et/ou la lyse viral comme le genre

Vibrio, alors que d‘autres au contraire comme Percisivirga, Oleispira et Methylophaga,

s‘avérèrent résistantes, révélant leur rôle central dans la dégradation du pétrole dans nos

conditions. Finalement la forte influence des virus n‘a pas provoqué de diminution dans la

biodégradation des hydrocarbures par les bactéries puisque la pression de prédation a induit

un regain d‘activité globale chez celle-ci. Ce résultat original souligne l‘importance de

prendre en compte non seulement le compartiment bactérien mais aussi la boucle microbienne

dans son ensemble pour mieux comprendre le processus de biodégradation.


2. Article 3: Strong evidence of top-down control on biostimulated diesel-degrading

bacterial communities


, Daniela Böttjer3,4

, Agathe Tallarmin5, Catherine Guigue

5,

Pascal Conan1,2

, Mireille Pujo-Pay1,2

, Madeleine Goutx5, Jean-François Ghiglione

1,2


sur-Mer, France;


Mer, France;

(3) Department of Oceanography, School of Ocean and Earth Science and Technology,

University of Hawai‘i at Mãnoa, Honolulu, Hawaii, USA;

(4) Center for Microbial Oceanography, University of Hawai‘i at Mãnoa, Honolulu, Hawaii,

USA ;

(5) Centre d'Océanologie de Marseille, Campus de Luminy, 13 288 Marseille Cedex 9, France

Correspondence:




88 73 98


Running title: Influence of pure ―top-down‖ control on oil-polluted bacteria.

Keywords: Bacterial diversity, bacterial activity, pure ―top-down‖ control

Abstract

Both protistan grazing and viral lysis on bacteria (―top-down‖ control) has often been

assumed to play a pivotal role in the efficiency of oil biodegradation. Nevertheless, their

concomitant impact on bacterial assemblages involved in oil-biodegradation remains largely

unknown. We designed a mesocosm experiment (400 L) to investigate the effect of

heterotrophic nanoflagellates (HNF) and bacteriophages on bacterial abundance, community

structure and activities under unlimited nutrient condition and diesel pollution. The addition

of diesel together with inorganic nutrients resulted in a 10-fold increase in bacterial

abundance after seven days of incubation. We then observed a classical prey-predator cycle

that was more explicit in the diesel-amended compared to the control mesocosm. The ―top-

down‖ control was almost exclusively dominated by viral lysis rather than HNF predation

(77.73%). Massive pyrosequencing showed that some taxonomic groups, such as Vibrio, that

became dominant after oil addition, were particularly sensitive to viral predation, a sensitivity

that induced drastic shift in bacterial community structure. However, the ―top-down‖ control

resulted in an increase of bacterial richness that counterbalanced its dramatic and rapid

decrease after oil addition. Some ―predation-resistant‖ bacterial genera such as Percisivirga,

Oleispira and Methylophaga dominated the diesel-polluted bacterial community after the high

predation episode, revealing their pivotal role in oil polluted systems. Even if chemical

analysis showed relatively constant biodegradation rate during the course of our experiment,

we demonstrated that ―top-down‖ effect controlled the kinetics of bacterial carbon uptake and

ecto-enzyme activity through driving bacterial diversity. These results underline the

importance of taking into account not only the bacterial compartment, but also the entire

microbial loop to better understand the factors influencing the efficiency of biostimulation

strategies.


Introduction

For several decades, there has been a primordial challenge in understanding and

potentially enhancing natural biodegradation of hydrocarbons in environmental microbiology.

In oil spill countermeasure efforts, the biostimulation via the addition of nutrients and/or

surfactant molecules is a privileged option (Röling et al. 2002; Xia et al. 2006; Rodríguez-

Blanco et al. 2010). In natural oil biodegradation systems, hydrocarbonoclastic bacteria

exhibit a high mineral nutrient dependency under conditions of carbon excess such as in oil

spill scenarios (Smith et al. 1998). The biostimulation by nutrient addition is now the most

commonly used strategy to favor bacterial petroleum elimination. However several studies

underlined that its effectiveness depends on uncontrolled abiotic and biological factors, which

remain underestimated in bioremediation assays (Atlas 1995).

Grazing by heterotrophic nanoflagellates (HNF, size ranging 2-10 μm) and viral-

mediated lysis (also called ―top-down‖ control) have both been assumed to drive bacterial

abundance, diversity and activity in natural (Suzuki 1999; Weinbauer et al. 2004; Longnecker

et al. 2010) as well as in oil polluted environments (Kota et al. 1999; Danovaro et al. 2003).

Nevertheless, simultaneous estimates of the effects of grazing and lysis on bacterial

communities involved in oil-biodegradation remain relatively rare. The few available data so

far show that both HNF and viruses could survive during oil pollution, increase their

abundance in eutrophic and/or oil polluted zones, thereby shaping bacterial abundances

(Weinbauer et al. 1993; Wilhelm et al. 1999; Gertler et al. 2009). In addition, high

abundances of HNF and viruses in nutrient rich areas have raised the idea that top-down

control not only impacts bacterial abundances but also bacterial community structure (Jurgens

et al. 1999; Pernthaler 2005; Bouvier et al. 2007), as proposed by several examples of host-

specificity (Gonzalez et al. 1990; Jurgens et al. 1999; Weinbauer et al. 2004). Abundant

species are more likely to be exposed to predation than rare species because of encounter

probability, resulting in drastic changes in bacterial community structure. This theory has

been established as the ―killing the winner‖ in which the renewing and the maintaining of the

bacterial diversity and metabolic capacities reveal the positive effect of the predation

(Thingstad et al. 1997; Thingstad 2000; Beardsley et al. 2003). The impact of predation on

bacterial activity is more contrasted. On one hand, predation prevents bacteria to enter the

stationary phase and thus would maintain the global metabolic activity (del Giorgio et al.

1996). On the other hand, predation of the most active bacteria would select some dormant or

less active cells, thereby decreasing the activity of the total bacterial community (Hahn et al.

2001). Except for some studies that reveal HNF increasing the remineralization of some

polycyclic aromatic hydrocarbons (Mattison et al. 2005; Tso et al. 2006), the actual impact of

HNF or viruses on bacterial oil degradation has to date been largely ignored. Furthermore, the

concomitant effects of viruses and protozoa on bacterial communities are even more difficult

to assess notably because they sometimes compete for the resource in bacteria (Miki et al.

2008) and because viruses can also infect protozoa (Pernthaler 2005), which adds a level of

difficulty by studying interactions. Top-down control of bacteria by HNF and viruses in

aquatic environments is essential to understand, especially in oil polluted seawaters that are

complex and poorly understood and where biological mediation might be used to fix

anthropogenic ecological disasters in particular. Special attention should be focused on the

interactions between bacteria and their predators in oil contaminated microbial assemblages

for a better appreciation of bioremediation assays.

In most marine environments, hydrocarbonoclastic bacteria (HCB) are present in low

abundance when carbon sources are in a steady-state (Yakimov et al. 2007). However, in oil

pollution scenario, when petroleum is toxic for most other non-degrading bacteria, HCB are

able to grow rapidly and ultimately dominate the bacterial community (Head et al. 2006),

representing a natural way to ―clean-up‖ polluted ecosystems (Yakimov et al. 2007). Since the

development of culture-independent 16S rDNA-based methods, numerous studies have

monitored both, active and total fractions of the bacterial community after the addition of oil

(Rodríguez-Blanco et al. 2010). Generally, the oil pollution and eventually bio-stimulation

induce radical shifts in the community accompanied by a reduction of the diversity and a

selection of oil-degrading bacteria (Head et al. 2006). Some studies have even investigated the

composition of bacterial communities involved in oil-degradation and have retrieved

Alcanivorax (Yakimov et al. 1998), Cycloclasticus (Dyksterhouse et al. 1995), Marinobacter

(Gauthier et al. 1992), Neptunomonas (Head et al. 1999), Oleiphilus (Golyshin et al. 2002)

and Oleispira (Yakimov et al. 2003) as typical genera of hydrocarbonoclastic bacteria.

To evaluate the effect of both HNF grazing and viral infection on abundance,

community structure and activity of bacteria involved in diesel-degradation, we designed a

diesel mesocosm experiment in which the classical nutrient limitation observed in oil polluted

systems was excluded. Bacterial abundance was monitored by flow cytometry and bacterial

activity was estimated by bacterial production and ectoenzyme activity measurements. The

highly sensitive and reproducible capillary electrophoresis single strand conformation

polymorphism (CE-SSCP) technique (Ghiglione et al. 2005) enabled us to monitor the

temporal changes of both total (based on 16S rDNA) and active (based on 16S rRNA)

bacterial community structure over the time course of the incubation while the high efficient


pyrosequencing technique allowed the identification of bacteria to the genus level that were

present at each critical point of the experiment. Complementary grazing experiments together

with viral abundance and viral-induced bacterial mortality estimates enabled us to evaluate

the impact of HNF and viruses onto bacteria involved in the degradation of pollutants. To the

best of our knowledge, this is the first study that examines simultaneous effects of HNF and

viruses onto bacteria in a nutrient non-limited, diesel-polluted assay.

Materials and Methods

Mesocosm design

Surface seawater was collected from the bay of Banyuls-sur-Mer (North-western

Mediterranean Sea) in March 2009 into clean, acid-washed 20 L polycarbonate bottles. The

seawater was filtered through a 50-µm nylon membrane to remove larger organisms and

poured into two 400 L resin tanks. One of those tanks served as the control mesocosms (no oil

was added to the surface seawater) while the other served as the polluted treatment (50 mL of

diesel were added). Due to the toxicity of the diesel substance and the resulting steam of

hydrocarbon and hazardous waste water produced, we decided to limit this study to a single

polluted large-scale mesocosm accompanied by an unpolluted control. Both mesocosms were

kept in the dark at in situ temperature (16°C) and incubated for 14 days. Small aquarium

pumps were installed to ensure that the mesocsom tanks were continuously mixed throughout

the incubation period. The nitrogen and phosphorus inorganic nutrients (NO3, NO2, NH4,

PO4) were daily quantified and adjusted to a constant environmental concentration in each

mesocosm in order to avoid nutrient-limitation. Samples for nutrients were collected into

polyethylene flasks in duplicate, immediately poisoned with HgCl2 (10 mg L-1

) and stored at

4°C in the dark until further analyses on a Bran Luebbe III autoanalyser according to Tréguer

et LeCorre (1975). Measurement accuracy was ±0.05, ±0.05, ± 0.02, and ±0.02 µM for

nitrates, silicates, ammonium, nitrites and phosphates, respectively.

Bacterial abundance

Total bacterial counts were determined by flow cytometry (Lebaron et al. 1998).

Briefly, 2 mL seawater samples were fixed with 2% formaldehyde for at least 1 h at 4°C. A 1

mL sub-sample was incubated with SYBR Green I (final concentration 0.05% [v/v] of the

commercial solution) for at least 15 min at 20°C in the dark and analysed with a FACS

Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) equipped with an air-cooled Argon

laser (488 nm, 15 mW). Stained cells were enumerated according to their side-angle-scattered

light (SSC) and induced green fluorescence light (GFL) collected through a 530 ± 30 nm

bandpass filter. Yellow–green fluorescent beads (1-μm diameter, Polysciences) were

systematically added to each analyzed sample to normalize SSC and GFL emission. Data

acquisition and analysis were conducted using the software Cell-Quest (Becton Dickinson).

Acquisition was triggered by GFL. The volume analyzed and the subsequent estimation of


cell concentrations were determined by measuring the remaining volume of sample and

subtracting it from the initial volume. Sheath fluid was seawater filtered through a 0.22 μm

pore size membrane.

Nucleic acid extraction, 16S PCR amplification and CE-SSCP analysis

Samples for bacterial diversity analysis were taken daily during the course of the

experiment. One liter of seawater was filtered on 0.2 µm-pore-size filter (47 mm, PC,

Nucleopore) and frozen until nucleic acid extraction. DNA and RNA extractions and 16S

cDNA synthesis were performed as previously described (Ghiglione et al. 2009). Both DNA

and cDNA served as a template for PCR amplification of the variable V3 region of the 16S

rDNA using w49F and fluorescently 5‘-labeled with phosphoramidite (TET, Eurogentec)

w34R primers according to Ghiglione et al. (Ghiglione et al. 2005). CE-SSCP and analysis of

the electropherograms were performed as described in a previous paper (Ghiglione et al.

2008). All peaks were checked manually for correct retention time (i.e. 1 OTU, ±6 retention

time AU) and shape. Electrophoregrams were transferred to the SAFUM software (Zemb et

al. 2007) to render a profile of fluorescence intensity as a function of retention time per

sample. It allowed the comparison of CE-SSCP profiles based on the presence and intensity

of each individual peak and analysis using indirect multivariate analysis. Similarity matrices

based on Bray-Curtis distances and ordination analyses along with their corresponding

dendrograms were generated by the unweighted pair group method using average linkages

(UPGMA) by using the PRIMER 5 software (PRIMER-E, Ltd., UK).

Pyrosequencing analysis

Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP) was performed as

described previously using Gray28F 5‘TTTGATCNTGGCTCAG and Gray519r 5‘

GTNTTACNGCGGCKGCTG (Dowd et al. 2008). Initial generation of the sequencing

library was accomplished by a one-step PCR with a total of 30 cycles, a mixture of Hot Start

and HotStar high fidelity taq polymerases, and amplicons originating and extending from the

28F for bacterial diversity. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing analyses utilized

Roche 454 FLX instrument with Titanium reagents, titanium procedures performed at the

Research and Testing Laboratory (Lubbock, TX) based upon RTL protocols.

Metabolic bacterial activity

Both intra- (heterotrophic prokaryotic production, henceforth referred to as BP for

―bacterial production‖) and extra-cellular (exoenzymatic aminopeptidase) bacterial activities

were measured during the course of experiment. The results are expressed according to the

activity per cell.

Bacterial production was estimated by measuring 3H-leucine (a precursor for proteins)

incorporation rates into proteins (Kirchman et al. 1985; Chin-Leo et al. 1988), using the

centrifugation method (Smith et al. 1992) in 2 mL microtubes, and thus allows estimating

biomass synthesis. Triplicated 1.5-mL samples and a trichloracetic acid (TCA) killed control

were spiked with a mixture of [4,5 3H] leucine solution (Perkin Elmer, specific activity of

115.4 Ci mmol-1

) and non-radioactive leucine at final concentrations of 16.2 and 6.7 nM,

respectively. This concentration was experimentally determined to be saturating. All samples

were incubated 2 hours in the dark at the in situ temperature. Previous experiments had shown

leucine incorporation to be linear over these time periods. The reaction was terminated with

TCA (final concentration 5%) and samples were added bovine serum albumin (final

concentration of 100 mg L-1

) to improve protein precipitation. A first centrifugation run was

conducted at 13,200 rpm for 15 minutes. The supernatant was discarded, and 0.5 mL of a 5%

TCA solution were added to all samples before the second and centrifugation run conducted

in similar conditions. After removal of the supernatant, 0.5 mL of a 70% ethanol solution

were added. This step was followed by a centrifugation run at 13,200 rpm for 10 minutes. The

supernatant was removed and 2 mL of PCS scintillation cocktail (GE Healthcare) were added

per tube. Radioactivity was counted on a tri-CARB 1500 Packard liquid scintillation counter.

Quenching was corrected by internal standard and control counts were subtracted. The mean

coefficient of variation of triplicated measurements was 3%. Cell-normalized leucine

incorporation rates (BP) were calculated by dividing bacterial production rates by cell

abundance.

Ectoenzymatic aminopeptidase activity (AMPase) was measured using L-leucine-

7amido 4 methyl coumarin (Leu-MCA) as a fluorometric model substrate, according to

Hoppe‘s protocol (Hoppe 1983). A 8 mM stock solution was prepared in methycellosolve and

stored at −20°C. For triplicate measurements, 390 µL samples were supplemented with 10 µL

of the fluorogenic substrate (200 µM final concentration) in 48-well sterile microplates. This

analogue substrate concentration of Leu-MCA was representative of saturating concentration;

this was verified with calibration kinetics during the mesocosm experiment where a large set

of concentrations (from 0.1 to 250 µM) and times (from 1 to 10 h) were tested (data not

shown). Incubations were run in the dark in thermostated incubators reproducing in situ


temperature during 5 h. Boiled water blanks were run to check for abiotic activity. The

reaction was stopped using 50 µL of SDS 20% and samples were stored at -20°C until

fluorescence measurement. Release of the product of AMPase activity (MCA) was followed

by measuring the increase of fluorescence at 365 nm excitation wavelength and 450 nm

emission after an addition of 550 µL of a borate buffer (pH=11) with a microplate

spectrofluorometer (1420 Multilabel counter, VICTOR3, PerkinElmer) calibrated with

prepared standards of MCA solution diluted in <0.2-μm filtered seawater.

Hydrocarbon analysis

Oil hydrocarbon composition was determined in the mesocosm in which the diesel

was added. We measured the concentrations of aliphatic hydrocarbons (AHs) and polycyclic

aromatic hydrocarbons (PAHs). AHs consist of a series of resolved compounds, i.e the sum of

a series of n-alkanes (linear hydrocarbon chains) and 2 isoprenoids, pristane and phytane.

Concerning PAHs, we determined the concentrations of 16 priority compounds listed by the

European Union and the US Environmental Protection Agency. One liter of mesocosm total

water was sampled at time zero, 3, 8 and 12 days after diesel addition and treated like

dissolved water according to Guigue et al. (2011). Briefly, hydrocarbons were extracted by

liquid-liquid extraction. Extracts were then purified on silica column to separate AHs from

PAHs. Deuterated standard mixtures were introduced prior to extraction to assess the

recoveries of analytical procedures and to perform quantization accuracy. All solvents were of

organic trace analysis quality (Rathburn, Interchim). AHs and PAHs were analyzed in a gas

chromatograph-flame ionization detector (GC-FID) (AutoSystem XL, Perkin Elmer, USA)

equipped with a HP-5 column (25 m x 0.32 mm x 0.52 µm, J&W Scientific, Agilent

Technologies, USA). To distinguish between physical removal and biodegradation,

hydrocarbons concentrations were normalized relative to pristane, a known biodegradation-

resistant compound present in petroleum.

Viral abundance

Viruses were enumerated by epifluorescence microscopy using the SYBR Green

method (Noble et al. 1998). One mL of preserved seawater samples (2% glutaraldehyde final

concentration, stored at 4°C) were filtered under subdued light onto 0.02 µm Anosdisc filters

(Whatman®). When filters were dry, they were removed from the frits (with vacuum still on),

carefully placed face up on a drop of diluted SYBER Green in a clean polysterene Petri dish

and incubated for 30-45 min in the dark at room temperature. After, the excess stain was

removed from the filter by softly dabbing its back on a Kim Wipe® and filters were mounted

on microscope slides and covered with a drop of 50% glycerol, 50% phosphate buffered

saline (PBS, 0.05 M Na2HP04, 0.85% NaC1, pH 7.5) with 0.1 % p-phenylenediamine (Sigma

Chem. Co., made fresh daily from frozen 10 % aqueous stock).

Phage infected bacteria

Samples for the determination of viral induced bacterial mortality (VIBM) were

collected at the same time when a grazing experiment was carried out from each mesocosm.

30 mL seawater samples were preserved with glutaraldehyde (EM grade; 2% final

concentration) and stored in sterile polypropylene centrifuge tubes at -20°C. Subsequently,

the preserved samples were centrifuged for 30 min at 11°C at 25 000 rpm (SW 28 rotor) for

transmission electron microscopy. Each pellet was transferred onto 300 mesh electron

microscope grids (with carbon coated Formvar film), stained for 10s with 0.5% uranyl

acetate, destained 3 times 10s in purified water (Milli-Q®

, Millipore), air-dried and analyzed

under a transmission electron microscope at 25 000 to 50000 X magnification at an

accelerating voltage of 80keV. In each sample, between 600 and 1000 prokaryotes in

randomly chosen microscopic fields were examined for the enumeration of infection.

Prokaryotes were scored as infected when they contained at least 5 intracellular viruses. In

order to determine VIBM, the frequency of infected cells (FIC) was estimated from the

frequency of visibly infected cells (FVIC) applying the conversion factors of Proctor et al.

(1993) with the model of Binder (1999), assuming that infected and uninfected cells are

grazed equally.

Heterotrophic nanoflagellate (HNF) abundance

For the analysis of the HNF, 50 mL of seawater were fixed with glutaraldehyde (1%

final concentration) and stored in the dark at 4°C. Within < 10 days, those samples were

stained with 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) at a final concentration of 0.01%, and

filtered on black polycarbonate filters (0.8 µm) supported by 0.45 µm cellulose filters. The

polycarbonate filters were then mounted on slides and stored at –20°C in the dark until

analysis. They were examined at 1000 X magnification with an epifluorescence microscope

(Olympus Provis AX70).

Grazing experiment


Grazing upon heterotrophic bacterial assemblages was estimated using the seawater

dilution technique (Landry et al. 1982). This approach had been chosen since it involves

minimal manipulation of seawater samples, does not require the use of radioisotopes, and

measures grazing on natural bacterial population. Grazing experiments were carried out with

seawater from both, the control (at T0, T3, T5, T8, and T12) and the diesel amended (at T0,

T3, T10, and T14) mesocosm. 15 L of seawater was sampled from each mesocosm by

siphoning and collected into acid-washed 20 L polycarbonate carboys. Immediately after

collection, the carboys were transferred to a temperature-controlled room (adjusted to the in

situ temperature of the mesocosm tanks) where subsequent incubations were carried out. In

there, nearly half of the collected seawater was kept while the other half was filtered through a

filter capsule (0.8/0.2 µm; Pall Life Science) to obtain filtered seawater. Subsequently,

different proportions of unfiltered (<50 µm) and filtered (0.2 µm) seawater were prepared

(ratios of filtered to unfiltered seawater: 100, 75, 50 and 25%) and distributed into 1 L

polycarbonate bottles (triplicates per dilution). Bottles were incubated for 24h at 16°C, under

a 12:12 h light/dark cycle and rotated end over end at 0.5 rpm in order to keep predators and

prey in suspension. Samples to estimate prey (bacteria) and predators (HNF) abundances were

taken from each bottle at the beginning (h0) and end (h24) of the incubation and samples were

treated as described above. Grazing rates of HNF on bacteria were calculated using the

exponential growth model as described in Landry and Hasset (1982). The instantaneous rate

coefficients of HNF grazing (g) and bacterial growth (k) were obtained from the linear

regression of the apparent growth rate (l/t*ln (CT/C0) = k-g) plotted against the dilution factor.

The estimated k and g values were subsequently used to calculate the percentage of potential

bacterial production removed by the HNF following the equations provided in Verity et al.

(2002).

Results

Successive changes in bacterial, HNF and viruses abundances

In both mesocosms, the evolution of bacterial, HNF and viral abundances displayed

oscillations characterized by two different phases. The first phase (that we term phase A) was

marked by an increase in bacterial abundances from 4.38 105 to 1.17 10

7 cell mL

-1 in the

polluted over the first 7 days and 4.38 105 to 4.36 10

6 cell mL

-1 in the control mesocosm over

the first 4 days of the incubation period (Fig. 1A). During this phase the abundances of HNF

and viruses were at their minimum. The second phase (phase B) showed first a simultaneous

increase of HNF and viruses together with a decrease in bacteria that was subsequently

followed by a maximum of HNF (5.63 104 and 9.1 10

3 cell mL

-1 at T11 and T10 in polluted

and control respectively) and viruses (4.43 108 and 5 10

7 units mL

-1 in polluted and control

respectively) along with a minimum of bacterial abundance. Afterwards, HNF and viral

abundances diminished while bacterial abundances increased anew (Fig. 1A).

Figure 1 : Evolution of abundances of bacteria, HNF and virus along the experiment (A)

together with cell-normalized bacterial production and aminopeptidase extracellular activity

(B).


Overall, at any time of the experiment, the abundances of bacteria, HNF and viruses

were i) higher and ii) peaked later in the polluted compared to the control mesocosm (T5 and

T7 for bacteria, T10 and T11 for HNF and T10 or T14 for viruses in control and polluted,

respectively) (Fig. 1A).

Evaluation of HNF and viruses predation rates

At the beginning of the experiment, the virus-to-bacterium ratio (VBR) was 24.5

(Table 1). During the incubation period, the evolution of the VBR was similar in both

mesocosms, but the ratio was always higher in the polluted than in the control. The VBR

decreased until T8 in the polluted (11.66) and T5 in the control (4.32) before peaking at T10

in the polluted (232.36) and T8 in the control mesocosm (178.38). The frequency of infected

cells (FIC) followed a similar trend (Table 1) and peaked at the exact same days of the

experiment as described for the VBR. Only a slight difference in FIC between the starting day

and T8 was observed in the control (from 0.04 to 0.05), whereas FIC increased about 10-fold

in the polluted mesocosm between T0 and T10 (from 0.04 to 0.4). Consequently, the

maximum percentage of bacterial production removed due to viral lysis (VIBM) was 77.73%

at T10 in the polluted compared to only 8.11% in the control mesocosm at T8 (Table 1).

Table 1: Rates of the impact of virus and HNF on bacterial abundance and production

estimated by grazing experiment and virus microscopic counting.

The grazing impact on bacterial production was always less compared to the

percentage of bacterial production removed by viruses in both mesocosms (Table 1). Only a

maximum of 2.9% (T5) and 1.7% (T10) of the bacterial production was removed by grazing

in the control and polluted mesocosms, respectively (Table 1). Thus, viral lysis affected ~ 3

times more the bacterial production in the control and ~ 45 times more in the polluted

mesocosm than HNF grazing.

Cell-normalized bacterial activity and diesel degradation

Bacterial production (BP) was always approximately 5-fold higher than the

ectoenzymatic aminopeptidase activity (AMPase) but they showed similar trends in both

mesocosms (Fig 1B). After a slight increase of the activity in the early stage of the experiment

(BP around 2 10-18

mol Leu cell-1

h-1

and AMPase around 10 10-17

mol Leu cell-1

h-1

before

the day 2), the intra- and extra-cellular activities were at their lowest level until day 9 in the

polluted mesocosm (BP at 1.01±0.41 10-18

mol Leu cell-1

h-1

, n=7 and AMPase at

mean=1.46±0.95 10-17

mol Leu cell-1

h-1

, n=7) and day 6 in the control (BP at 4.3±1.55 10-19

mol Leu cell-1

h-1

, n=4 and AMPase at mean=2.04±0.73 10-17

mol Leu cell-1

h-1

, n=4) (Fig.

1B). The maximum of specific bacterial activity peaked during the same days when HNF and

viruses show their maximum abundances in both mesocosms (Phase B, Fig. 1). This

maximum was obtained at day 10 for the AMPase (3.22 10-16

mol Leu cell-1

h-1

) or day 11 for

the BP (7.3 10-18

mol Leu cell-1

h-1

) in the polluted mesocosm and day 8 for the control (BP at

9.36 10-18

mol Leu cell-1

h-1

and AMPase at 4.6 10-16

mol Leu cell-1

h-1

). Finally, the specific

bacterial activity decreased at the same time as the HNF and viral abundances (Fig. 1).

The diesel was continuously degraded along the mesocosm experiment. The

biodegradation rate of aliphatic hydrocarbons (2.64 mg l-1

at time zero) was constant from the

beginning to the end of the experiment (30.11 µg L-1

day-1

). This degradation represented a

total of 204 mg n-alkanes degraded, then 2.13 mg L-1

remained after 17 days of incubation.

The biodegradation rate of PAHs (64 µg L-1

at time zero) was also constant from the day 3 to

the end of the experiment (0.94 µg L-1

day-1

), for a total degradation of 6.4 mg and 48 µg l-1

remaining after 17 days of incubation.

Evolution of total (16S rDNA) and active (16S rRNA) bacterial community structure

Bacterial community structure from control and polluted mesocosms were dissimilar

(data not shown) but their evolutions showed similar trends during the time course of the

experiment (Fig. 2). During phase A, bacterial community structures were completely

transformed in both mesocosms (Fig. 2 and 3). This change was accompanied by a decrease in

both CE-SSCP and pyrosequencing OTUs that was more marked in the polluted mesocosm

(36 peaks detected in CE-SSCP profile and 795.2 for the Chao1 at T0 to 11 and 391.2 at T7 in


the polluted and, 20 and 709.1 at T5 in the control with CE-SSCP and pyrosequencing

techniques respectively) (Fig. 3).

Figure 2: UPGMA dendrograms generated from the DNA and RNA-based CE-SSCP patterns

of bacterial communities originated from control or polluted mesocosm. Time series are

indicated by Tx samples.

First clusters formed by samples from T1 to T9 (both total and active fractions) in the

polluted mesocosm or from T1 to T6 for the total fraction and from T1 to T5 for the active

fraction of the control represented to the phase A of the experiment (Fig. 2). Those samples

corresponded to the increasing period of bacterial abundance in each mesocosms (Fig. 1A).

During phase B (decrease of bacterial abundance together with HNF and virus increase) the

bacterial community structures changed radically between T9 and T10 in the polluted

mesocosm and between T6 and T7 in the control (Fig. 2 and 3). This second phase was also

marked by an increase in the number of both detected CE-SSCP (from 11 to 22 between T7

and T10) and pyrosequenced OTUs (Chao1= 391.2 and 530.8 at T7 and T10 respectively) in

the polluted mesocosm (Fig. 3A and Table 2) and a clear change in the most abundant OTUs

in the polluted mesocosm as well as in control (Fig. 3A and 3B). Last, the community

structures in both polluted and control evolved few until the end of the experiment (Fig. 2).

Figure 3: 16S rRNA bacterial analysis in initial seawater (Time 0), Control after 5 and 8 days

and polluted mesocosm after 7 and 10 days of incubation. A) DNA-based and RNA-based

CE-SSCP profiles, B) Taxonomic distribution (Genus_specie) for tags represented at least 1%

of total community. The remaining tag sequences are grouped in ―others‖.


Table 2: Patterns of bacterioplankton community structure

of 16S rRNA tag sequences from control and polluted

mesocosms.

Figure 4: Rarefaction

curves of tag sequences.

Bacterial community composition

The bacterial community composition was determined from DNA samples by

pyrosequencing at the critical points of the experiment: T0 (natural seawater), T7 and T10 in

the polluted and T5 and T8 in the control that corresponded to the maximum and minimum in

bacterial abundances. Among the samples, we found 16 key OTUs that evolved differently

during the incubation depending on the treatment and the two phases of the experiment. First

of all, the initial bacterial community of environmental seawater was mainly composed of

Alphaproteobacteria (70%) that were dominated (54.9%) by the Pelagibacter genus (Fig 3B).

This OTU completely disappeared in both mesocosms after the beginning of the experiment.

It was replaced by the Vibrio Gammaproteobacteria with percentages that represented up to

66.8% and 22.3% of the bacterial community at the maximum bacterial abundance in the

polluted and the control mesocosms, respectively. Despite its dominancy, this OTU was in

turn eliminated during the phase B (Fig. 5). Our mesocosm experiment was also characterized

by some OTUs that increased proportionally in the control but not in the polluted mesocosm

during phase A and that decreased during phase B. Such OTUs belonged to the classes of

Alphaproteobacteria or Flavobacteria with Flabobacterium, Roseobacter, Polaribacter,

Ruegeria and Cellulophaga genera contributing 19.4%, 18.6%, 7.7%, 4.2% and 3.2% in the

control at T5. Those OTUs formed the set of OTUS ―A‖. Another group of OTUs represented

by the Sulfitobacter, Roseovarius and Loktanella genera (set of OTUs ―B‖) belonging to the

Alphaproteobacteria class increased only a little during phase A, but became particularly

abundant in the control mesocsom during phase B with relative abundance of 30.1%, 23.9%

and 7.2% respectively (Fig. 3B). On the contrary, the group of Gammaproteobacteria was

composed of Pseudoalteromonas, Phaeobacter and Alteromonas (set of OTUs ―C‖)

representing respectively 4.8%, 6.4% and 1.9% of the total community. Group C was only

predominant during phase A in the polluted mesocosm and maintained or alternatively

decreased during the second phase (Fig. 5). Finally, a last set of OTUs (―D‖) was formed by

the Percisivirga flavobacteria, and the two Gammaproteobacteria Oleispira and

Methylophaga that were the only genera being mostly found in the polluted mesocosm during

phase B with 42.3%, 13.6% and 7.6% of the total community, respectively (63% of the

community, Fig 3B and Fig. 5).

Figure 5: Frequency of individual tag sequences for some particular genera along the

experiment.


Discussion

Impact of pure top-down control on bacterial abundance

The effect of diesel addition under constant concentration of inorganic nutrients led to

a ten-fold increase in bacterial abundance in less than seven days (2-fold increase in five days

in the control, Fig 1A). During this first phase (Phase A), the peak of bacterial abundance was

observed two days later in the polluted mesocosm (T7) compared to the control (T5). This

might be attributable to the much higher and longer increase of the bacterial abundance in the

polluted mesocosm compared to the control (Fig. 1A) than to a delay in the response of

bacteria to diesel addition (the bacterial abundance at T5 was approximately the same in

control and polluted mesocosms). This was in agreement with previous biostimulation studies

in which new carbon sources together with inorganic nutrients highly stimulated bacterial

abundance (Kasai et al. 2002; Delille et al. 2009). In a second phase (Phase B), bacterial

growth was stopped as a result of increasing abundances of HNF and viruses (1-day delayed

in the polluted mesocosm compared to the control) which were 6-fold higher in the polluted

compared to the control mesocosm (Fig. 1A). The rapid increase in HNF and viruses led to a

drastic decrease of the bacterial abundances to concentrations that were similar to those found

at the beginning of the experiment. While HNF abundances reached a maximum on day 11 in

the polluted mesocosm, viruses still showed a slight increase until the end of the experiment

(14 days) (Fig. 1A). Such succession in bacterial, HNF and viral peaks of abundance are

described as a classical prey-predator cycle (Pernthaler 2005). It was clearer in the diesel

amended treatment, suggesting a pivotal role of HNF and/or viruses in controlling bacterial

concentration during oil pollution scenarios (Fig. 1A). It is well known that HNF and viruses

represent one of the main forces driving bacterial abundances in marine ecosystems (Fuhrman

et al. 1995; Zhang et al. 2007) and their pivotal role in oil polluted environments has already

been underlined (Kota et al. 1999; Danovaro et al. 2003). Nevertheless, only few studies have

experimentally evaluated the effect of grazing on bacteria under oil-degradation conditions

(Dahl et al. 1983; Bak et al. 1987) and only few studies monitored viruses along with bacteria

and HNF in a unique mesocosm experiment (Ohwada et al. 2003; Toyoda et al. 2005).

Toyoda et al. (2005) observed an increase in the number of bacterial cells after the addition of

Bunker-A oil or kerosene that was followed by a propagation of either HNF or viruses

according to the type of oil. Our experiment is thus the first to reveal comparable amplitude in

the development of HNF and viruses in oil-polluted environment.

Although both, HNF and viruses increased in a response to the increase of bacterial

cells, our grazing experiments revealed that HNF were affected few the bacterial assemblages

(maximum of 1.7% at T10 and T14 in the polluted mesocosm and 2.9% at T5 and T12 in the

control, Table 1). In contrast, a much larger fraction of bacterial production (maximal 77.7%

in the polluted and 8.1% in the control) was removed by viral lysis (~45 times more in the

polluted and 6 times more in the control, Table 1). The top-down control was clearly exerted

by viruses, which thereby were responsible for a high turnover in the bacterial community and

in particular when diesel was added. Even though viruses have previously been identified as

most abundant ―life forms‖ in aquatic systems and important agents of bacterial-mortality

besides phagotrophic protists (Wommack et al. 2000), our results are original because data

about the impact of viruses on bacteria in oil-polluted ecosystem are extremely rare. Some

studies attempted to explain same kind of virus prevalence in eutrophic systems (Weinbauer

et al. 1993; Wilhelm et al. 1999). For example, Williamson et al. (Williamson et al. 2002)

found that in 22% of their microcosm experiments, viruses could increase after inorganic

phosphate enrichment, the high nutrients quantity stimulating directly viral multiplication.

Another explanation could been found in some studies underlining the induction of lytic cycle

in lysogenic bacteria by some common organic pollutants like PAH (Jiang et al. 1996;

Cochran et al. 1998). Indeed, Bunker C fuel oil, phenanthrene, naphthalene and pyrene were

characterized as agents inducing natural bacterial communities capable of increasing viral

direct counts from 129% to 345% of the non-induced control (Jiang et al. 1996). Finally, the

presence of viruses itself could be negative for flagellates and allow viruses to take the

advantage in their competition relationship for bacterial preys because it seems highly

probable that viruses can also infect protozoa (Pernthaler 2005). The immediate response of

both HNF and viruses to the increase of bacteria stimulated by the diesel addition, and the

high extent to which viruses control bacterial strongly recommends that viral lysis as one of

the possible bacterial loss processes must be considered in future oil biostimulation assays.

Impact of pure top-down processes on bacterial activity

Metabolic bacterial activity was also impacted by HNF and virus predation. Both cell-

normalized bacterial production (BP) and the aminopeptidase activity (AMPase) were at their

minimum level during the increasing phase of bacterial abundance (phase A). Bacterial

activity was multiplied 20-fold for the BP and 16.5-fold for the AMPase in polluted

mesocosms when bacterial abundance decreased under predation pressure (T7 to T11, Fig. 1).

Grazing and viral lysis often contribute to the release of free enzymes in natural waters


(Karner et al. 1994; Bochdansky et al. 1995). AMPase may have been overestimated in the

present mesocosm experiment because of free enzymes released in the seawater through lysis

and grazing that could have remained active even if they were not attached to bacteria during

this period. However, this observation did not alleviate the renewal of cell-normalized

bacterial activity during the high predation episode as the BP (an intra-cellular activity)

followed the same tendencies. Studies about the impact of predation on single-cell bacterial

activity in seawater are relatively rare (Hahn et al. 2001) and totally inexistent in oil polluted

context. Moreover, viruses and HNF are not considered equitably for this question. The few

available data showed contrasted results: some authors found that bacteria escape grazing

either by reducing their size and activity, or their metabolic activity only (del Giorgio et al.

1996) while others showed that the grazing increased with cell-normalized activity (Šimek et

al. 1990; Posch et al. 1999). We observed in both tanks a grazing and lysis-mediated increase

in bacterial activity between T5 and T9. This increase could be explained by two mechanisms.

Firstly, the predation would reduce the intra- and inter-species bacterial competitions (by

notably the ―killing the winner‖ model) that would allow a better supply of carbon, nitrogen

and phosphorus per cell and would increase the specific bacterial activity (Hahn et al. 1999;

Posch et al. 1999). Secondly, as in our experiment, the nutrient concentration was maintained

at a natural in situ level, bacterial communities should not have been limited in nitrogen, and

phosphorus nutrients. However, we suggest that grazing and lysis-resistant bacteria would

have benefited of the extremely labile molecules (sterols, fatty acids, amino acids…) liberated

by phagotrophes and lysed cells. Indeed, Middelboe et al. (2003) showed that viral lysis was a

source of labile organic matter that bacteria could easily utilize. Certainly because of this

higher metabolic bacterial activity, the activity of diesel degradation was maintained during

the predation episode. The measurement of diesel compounds along the experiment showed

that both n-alkanes (most degradable hydrocarbons that compose the majority of the

petroleum) and PAH (polycyclic aromatic hydrocarbon that compose the less degradable

fraction of the petroleum) were degraded continually during the incubation with no increase

or decrease of the degradation rate at any moment. As some studies have shown that predation

could negatively impact the oil biodegradation (Kota et al. 1999) the initial hypothesis of the

present work could have been that HNF and viruses predation would have a repercussion on

bacterial activity and diesel elimination. However, as in other studies demonstrating the

positive effect of predation in alkylbenzenes (Mattison et al. 2005) or phenanthrene

mineralization experiment (Tso et al. 2006), the degradation of hydrocarbons was not

impacted by the predation in our experiment. One of the most plausible hypothesis for

explaining such results could be that the liberation of labile organic matter by phagotrophic

protozoan and lysed bacteria may have allowed a renewing in the bacterial activity that may

have promoted the hydrocarbon degradation. The improvement of the degradation of

refractory organic matter by addition of easily degradable product is well known as ―priming

effect‖ in soil studies (Fontaine et al. 2003). However, until now, this effect was not really

investigated in aquatic environments. Recently, Guenet et al. (2010) examined a large amount

of studies showing indirectly ―priming effect‖ in seawater experiment and suspected this

effect to be prevalent in aquatic environments (Guenet et al. 2010). We suggest that such

mechanisms could be particularly important in the biodegradation of recalcitrant hydrocarbon.

Impact of pure top-down control on bacterial community structure

Overall, the addition of diesel and the effect of predation were the two factors driving

the bacterial community structure. The natural seawater collected at the beginning of the

experiment was mostly composed of Alphaproteobacteria (70%, data not shown) from the

Pelagibacter genus (58.18%), that has been identified as the most abundant bacterium in the

marine environment (Morris et al. 2002). Despite its prevalence, this genus did not survive to

the effects of petroleum that generally promotes only the few members of the bacterial

community that are capable to metabolize the hydrocarbons (Cappello et al. 2007) and/or

confinement, that has been previously recognized to alter bacterial community structure (Agis

et al. 2007). As in previous studies, this initial change was accompanied by a diminution of

the number of OTUs (Bordenave et al. 2007) that was visible, for the first time in our

experiment, with a pyrosequencing analysis (399 at T0 to 209 at T7 in the polluted

mesocosm, Table 2). The specific negative effect of petroleum was observed in the

contribution of Flavobacterium, Ruegeria, Roseobacter, Polaribacter and Cellulophaga

genera (set of OTUs A) that decreased during phase A only in the polluted mesocosm (Fig. 5).

After the reduction of species richness, the bacterial community little evolved (Fig. 2).

Bacterial multiplication led to the dominance of Vibrio-like OTU that reached 76.35% and

28.35% of the total community in the polluted and control mesocosm, respectively (Fig. 3B).

In the present mesocosm study, these bacteria clearly benefited from the confinement of the

seawater, the nutrient addition and the high carbon quantity available especially in the

polluted tank (Beardsley et al. 2003). Phase A was also marked by the increase in the

percentage of some specific OTUs in each mesocosm. In the polluted mesocosm, the most

represented OTUs were the Pseudoalteromonas, Phaeobacter and Alteromonas genera (set of

OTUs C), that certainly took advantage of the diesel addition (Al-Mallah et al. 1990; Hedlund


et al. 2006; Gertler et al. 2009). In both mesocosms, the dominant OTUs and particularly the

Vibrio genus exhibited low cell-normalized activity when bacterial abundances reached their

maximum (Fig. 1). However the active bacterial community structures (RNA-based CE-SSCP

profiles, Fig. 3A) were relatively similar to the total bacterial community structures (DNA-

based CE-SSCP profiles, Fig. 3A). This implied that despite their low metabolic activity, the

OTUs that were the most active were the dominant OTUs among the communities. Our

results reinforce the hypothesis according to which the addition of oil together with the

confinement effect induced a redistribution of the bacterial community structure by an

increase in active opportunist bacteria and an inactivation of other sensitive bacteria (Head et

al. 2006; Bordenave et al. 2007; Cappello et al. 2007; Coulon et al. 2007).

Most abundant and active OTUs were radically removed due to the high predation

pressure starting during phase B. Indeed, from day 7 in the polluted treatment and the day 5 in

the control treatment, the simultaneous increase of HNF and virus abundances not only

crashed the bacterial abundances down (Fig. 1) but also modified substantially the bacterial

community structure (Fig. 2 and 3). This change was first notable in the active fraction (RNA-

based) of the bacterial community that has previously been shown to be more sensitive to

variations (Moeseneder et al. 2001). Some abundant, ‗predation-sensitive‘ bacteria such as the

Vibrio genus in both mesocosms together with OTUs from the set of OTUs A in the control

and some OTUs from the set of OTUs C in the polluted mesocosm disappeared under the high

predation pressure (Beardsley et al. 2003). Without those OTUs, the bacterial community

diversified and the total number of OTUs increased (Thingstad 2000; Beardsley et al. 2003)

resulting in a richer bacterial diversity. Predation was thus a diversification factor of the

bacterial community, in particular in the context of diesel pollution. Here, we present the first

evidence of the parallel effects of HNF and viruses on the bacterial community structure in an

oil-polluted approach. Viral lysis was clearly the top-down process controlling bacteria in our

experiment. This might on the one hand be explained by the host-specificity of aquatic viruses

and on the other hand by the ―killing the winner‖ theory in which protists and viruses impact

preferentially the most abundant bacteria (Thingstad 2000; Beardsley et al. 2003). Since the

encounter between a virus or a protist and its host is unpredictable, the probability of

encounter is as larger as the host population is abundant, thus predominant bacterial groups

are preferentially predated (Thingstad et al. 1997). Previous studies have shown that a

moderate top-down control is fundamental for shaping and maintaining natural bacterial

diversity, even in oligotrophic systems (Weinbauer et al. 2004; Corno et al. 2008). We

suggest that this might be particularly important in oil polluted systems where the

conservation of high metabolic capacities of a complex bacterial community is crucial for the

degradation of complex mixtures of hydrocarbons such as diesel (Van Hamme et al. 2000).

The diversification effect of predation presented in this study presents the first evidence of the

specificity of viruses for particular bacterial genera and its positive on the diversity richness

of the bacterial community.

Since the most abundant OTUs were removed by predation, the ―predation-resistant‖

bacteria that were of minor importance in terms of their contribution when maximal bacterial

abundances were obtained became proportionally dominant after the predation episode. In

addition, the major OTUs of the total community (DNA-based CE-SSCP profile) were not the

most represented OTUs in the active fraction (RNA-based CE-SSCP profile) and we

suspected that it was highly probable that such predation-resistant bacteria presented low

metabolic activity, what in turn might explain their resistance to predation (Lenski 1988;

Middelboe 2000). In the control mesocosm, this might be the case for the genus Sulfitobacter

(32.25%, Fig. 3B) that can be expected in seawater originating from the Banyuls-sur-Mer bay

enriched with inorganic nutrients as this was the way it was isolated several years ago (Pukall

et al. 1999). The present result improved our understanding on this genus by underlining its

predation-resistance capacity under mesocosm conditions. Bacteria of the genera Roseovarius

and Loktanella (set of OUT B) also demonstrated that their resistance against predation and

increased in the control. The predation-resistant bacteria in the polluted mesocosm were

different as they were composed by OTUs from the set of OTUs D, Percisivirga (49.55%),

Oleispira (16.77%) and Methylophaga (9.17%) genera (Fig. 3B). Interestingly, Percisivirga is

not an attested hydrocarbon-degrading bacterium, but might have instead benefited from the

high quantity of organic compounds liberated by the degradation of diesel in the Phase A

and/or lysis and grazing (Fuhrman et al. 1995; Cottrell et al. 2000; Kirchman 2002).

Furthermore, the pyrosequencing analysis revealed that some OTUs such as from the genera

Phaeobacter and Roseobacter did not change significantly in the polluted mesocosm (Fig.

3B). We assume that these bacteria may have been quite sensitive to predation because if they

had resisted, their proportion would have increased among the community as it was shown for

the genus Percisivirga. On the contrary, some different OTUs associated with Oleispira and

Methylophaga appeared after the predation episode. As the active fraction of the bacterial

community was dominated by few OTUs that were not well represented in the total

community, the high cell-normalized activity would have been assumed by such non-

dominant OTUs. They not only resisted to the predation but also proliferated when bacterial

abundance, and consequently the competition between species, was lower. Bacteria of the


genus Oleispira are obligate hydrocarbonoclastic bacteria and have previously been shown to

be involved in the degradation of diesel (Golyshin et al. 2010) and also, the Methylophaga

genus, a methylotrophic bacteria has been detected in previous hydrocarbon degradation

experiment (Yakimov et al. 2004; Redmond et al. 2010). It is highly probable that both could

have benefited from the decomposed molecules coming from the diesel degradation. The

presence of those two genera showed that part of the oil-degrading bacteria are able to survive

and even become dominant under high HNF and virus predation pressure, revealing their high

potential in oil-contaminated environments and biostimulation assays. A particular attention

should be paid to such predation-resistant oil-degrading bacteria in oil-polluted environments.

Conclusion

The present study shows that viral-mediated bacterial mortality induces the

diversification of the bacterial community together with an increase of the bacterial metabolic

activity, thereby maintaining the diesel biodegradation at a constant level. Thus, the viral lysis

as a loss process has a strong impact on bacterial communities (on both abundance and

community structure) but this effect could not disturb the diesel biodegradation and allow a

renewing in the bacterial community. Our integrative study shows that the entire microbial

loop should be systematically considered in biostimulation assays to better adapt strategies of

bioremediation to specific environments.

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195

IDENTIFICATION DES BACTERIES HAP-DEGRADANTES

MARINES PAR STABLE ISOTOPE PROBING

CHAPITRE 5

197 Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes marines par Stable Isotope Probing.

Chapitre 5 : Identification des bactéries HAP-dégradantes

marines par Stable Isotope Probing.

1. Préambule

Une des difficultés majeures dans les études de bioremédiation est notre capacité à

identifier les bactéries responsables de la dégradation des hydrocarbures. Tout l‘intérêt des

approches de biostimulation est d‘arriver à augmenter l‘activité des bactéries

hydrocarbonoclastes, mais encore faut-il pouvoir les distinguer parmi la communauté

bactérienne totale. Dans le cas où cela n‘est pas possible, les stratégies de biostimulation

reviennent à ajouter en aveugle des substances de concentrations et compositions

extrêmement variables sans avoir la garantie de l‘effet positif escompté sur les bactéries

hydrocarbonoclastes et avec des effets potentiellement non désirés sur l‘ensemble de la

communauté bactérienne. Il est donc primordial de connaitre les cibles de la biostimulation

pour garantir un résultat positif de celle-ci.

D‘un point de vue plus fondamental, l‘identification des bactéries hydrocarbonoclastes

permet également de mieux comprendre le phénomène d‘élimination des hydrocarbures en

milieu marin. De manière générale, l‘attribution de fonctions particulières à certains groupes

bactériens spécifiques est un enjeu primordial de l‘Ecologie microbienne.

L‘approche traditionnelle pour isoler et étudier les bactéries responsables de fonctions

particulières dans l‘environnement est la culture cellulaire. Mais cette méthode présente un

inconvénient majeur, puisqu‘elle ne permet de révéler la diversité de moins de 1% des

bactéries marines. Malgré ses nombreux avantages pratiques, elle n‘est donc absolument pas

adaptée à l‘étude des communautés bactériennes hydrocarbonoclastes naturelles. Récemment

des alternatives à la culture ont été trouvées. C‘est notamment le cas des méthodes de

radiographie, présentées en introduction. Les approches de méta-génomique, transcriptomique

et protéomiques sont également d‘une grande utilité dans l‘étude des communautés

bactériennes. Mais une des méthodes privilégiées pour aborder spécifiquement cette question

est depuis quelques années le marquage de l‘ADN des communautés bactériennes d‘intérêt

par des isotopes stables ou « DNA-Stable Isotope Probing » (DNA-SIP). Cette technique a été

mise au point et largement employée dans les études du sol depuis une dizaine d‘années.

Paradoxalement, elle a été très peu utilisée pour l‘étude des communautés bactériennes

marines. Cela s‘explique d‘abord par les divergences d‘approches entre l‘Ecologie terrestre et

l‘Ecologie marine mais aussi et surtout par la difficulté d‘appliquer la technique en milieu

liquide. Pourtant cette avancée méthodologique semblait particulièrement prometteuse pour la

découverte de bactéries hydrocarbonoclastes en milieu marin. Des études sur les bactéries

méthylotrophes marines impliquant le DNA-SIP ayant ouvert la voie avec succès, il restait à

tester la méthode pour l‘étude des bactéries hydrocarbonoclastes. Nous présentons donc ici (i)

un chapitre de livre sur le principe général de la méthode et ses implications en guise

d‘introduction et (ii) une première étude de DNA-SIP en milieu marin pour l‘identification

des bactéries phénanthrène-dégradantes (une molécule indicatrice de pollution pétrolière

particulièrement surveillée par l‘agence de protection environnementale). L‘expérience de

DNA-SIP a été réalisée sur trois échantillons naturels provenant d‘environnement ayant des

niveaux de pollution pétrolière différents. L‘analyse des fractions d‘ADN enrichies en 13

C a

montré que quelle que soit l‘origine de l‘échantillon, Cycloclasticus sp. était toujours retrouvé

majoritairement après l‘ajout de phénanthrène. Par contre, d‘autres genres majoritaires moins

dominants (1% de la fraction 13

C) étaient spécifiques de chaque environnement échantillonné.

Ces résultats suggèrent que certaines bactéries opportunistes soient particulièrement

compétitives pour la dégradation des hydrocarbures quel que soit l‘origine du site considéré

en Méditerranée NO, tel que Cycloclasticus sp. qui est d‘ailleurs retrouvé dans de très

nombreux sites pollués, alors que d‘autres sont au contraire spécifiques de certaines

conditions environnementales.

Figure 27 : Photo des erlenmeyers ayant servis à l’incubation des bactéries avec le phénanthrène marqué

au 13

C durant l’expérience de DNA-SIP. Les erlenmeyers les plus jaunes sont ceux dans lesquels les

bactéries hydrocarbonoclastes se sont développées.


2. Chapitre de livre: Monitoring of oil-degrading bacteria by stable isotope probing.

Multi-author publication project on the Encyclopedia of Aquatic ecotoxicology (Férard, J.F.

and Blaise, C., editors.

List of authors : Caroline Sauret1,2

and Jean-François Ghiglione1,2

1-CNRS, UMR 7621, LOMIC, Observatoire Océanologique, F-66651, Banyuls/mer, France

2-UPMC Univ Paris 06, UMR 7621, LOMIC, Observatoire Océanologique, F-66650,

Banyuls/mer, France

Note pour le lecteur: les mots en bleu sont définis dans le glossaire à la fin de ce chapitre de livre.

Definition

Utilization of new molecular techniques for the identification of oil-degrading bacteria

Matching bacterial taxa with specific metabolic capacities in natural environments remains

one of the biggest challenges for microbial ecologists. Stable Isotope Probing (SIP) coupled

with uncultured-based molecular biology techniques is a new powerful approach allowing the

identification of a microbial consortium actively involved in specific biogeochemical

processes, such as hydrocarbon biodegradation. This method relies on the uptake of stable

isotope-enriched substrates (13

C-phenanthrene or a mix of 13

C-petroleum hydrocarbons, for

example) by microorganisms able to metabolize and incorporate these substrates into their

cellular components (DNA, RNA, polar lipid derived fatty acids, amino acids and protein)

with minimum disturbance for microorganisms. Separation of isotope-enriched DNA or RNA

(heavy) from others (light) is performed by density gradient ultracentrifugation after nucleic

acid extraction and the phylogenetic affiliation of heavy nucleic acid sequences reveals the

composition of the hydrocarbonoclastic microbial community.

Historical overview

The ultimate degradation of complex petroleum hydrocarbons in the environment

mainly depends on the complementary metabolic capabilities of different hydrocarbonoclastic

bacteria (Head et al. 2006). For a long time, the difficulty for microbial ecologists to

discriminate microbes responsible for in situ oil-biodegradation processes has been hampered

by the high complexity of microbial assemblages and the limitations of culture-based

identification methods. The cultivation of microorganisms is still a very useful technique for

the discovery of new hydrocarbonoclastic bacterial strains (Prince 2005; Rodriguez-Blanco et

al. 2010b) but remains clearly incomplete since it allows the identification of only 0.1 to 1%

of the total bacterial community (Giovannoni et al. 1990). The appearance of polymerase

chain reaction (PCR)-based molecular approaches (16S rRNA gene or functional gene-based

methods) from in situ DNA extracts has allowed to shunt culture-dependent biases to explore

the spatial and temporal variation of microbial assemblages in soil (Ranjard et al. 2003) as

well as in seawater (Ghiglione et al. 2005; Ghiglione et al. 2007; Ghiglione et al. 2008; Lami

et al. 2009). With these approaches, links between changes in bacterial community structure

and oil-biodegradation have been demonstrated (Rodriguez-Blanco et al. 2010a). However,

direct identification of hydrocarbonoclastic bacteria was not feasible by using classical

molecular methods. Hanson et al. (1999) first revealed toluene-degraders identity from in situ

soil samples by using stable isotope probing (SIP) with 13

C-toluene labeled substrates.

Originally developed by Meselson and Stahl (1958) to demonstrate the semi-conservative

mechanism of DNA replication, SIP technique has received a growing interest in the last ten

years because of its potential to be coupled with new molecular methods to identify organisms

involved in the metabolism of a given substrate. Until now, the technique has been principally

used in soil and sediment, whereas studies in seawater are scarce (Neufeld et al. 2008).

Several authors suggested that SIP coupled with new metagenomic tools is leading to major

progress in microbial ecology for its potential to reveal new diversity-function relationships of

uncultivated microorganisms (see Chen and Murrell 2010 for a review).

Protocol

Nucleic acid-stable isotope probing (NA-SIP) first consists in setting up a microcosm

or an in situ incubation of an environmental sample with a stable isotope-labeled molecule

(see Fig. 1 for a global view of SIP protocol). The stable isotope can be 13

C, 15

N, 2H,

18O but

the carbon atom is the most commonly used in oil-degradation NA-SIP studies since it is the

most important element in hydrocarbons and nucleic acids. An important step concerns the

incubation period with the labeled substrate that should be optimized for sufficient

intracellular stable-isotope incorporation but not too long to avoid unspecific incorporation by

cross-feeding. Incubation time is comprised between a couple of hours and 2 months

according to the hydrocarbonoclastic capacity of the environmental sample and the


bioavailability of the substrate. The success of the experiment is improved by the utilization

of totally labeled substrate (i.e. stable isotope enrichment of all carbon atoms). Separation of

heavy and light nucleic acids is performed in cesium chloride (for DNA recovery) or cesium

trifluoroacetate (for RNA recovery) by isopycnic ultracentrifugation step (from 10 to 90

hours) using vertical, near-vertical and more occasionally fixed-angle rotors. Before

ultracentrifugation, extracted DNA or RNA can be systematically spiked with a marker (such

as Escherichia coli DNA or RNA if this species is not present in the environmental sample) as

a control for the ultracentrifugation separation efficiency of labeled and unlabeled-nucleic

acids. Recovery of light and heavy bands can be performed by different methods. Some

operators localize the two bands by ethidium bromide incorporation and observation with a

trans-illuminator for direct sampling of the bands. Others retrieve fractions of the gradient by

pricking the bottom of the centrifuge tube with a needle or by successive pipetting on the top

of the tube. Then classical DNA or RNA quantification allows the recovery of the light and

heavy nucleic acid fractions. In both cases, a purification step eliminates cesium chloride

(CsCl) from DNA or cesium trifluoroacetate (CsTFA) from RNA for subsequent analysis. A

large panel of molecular techniques can be used to identify the hydrocarbonoclastic bacteria

from the purified stable isotope labeled-DNA or -RNA. All of them are based on PCR or

reverse transcription-PCR amplification of the 16S rRNA gene of the heavy fraction of DNA

or RNA, respectively. Difference in the nucleic acid composition of labeled DNA or RNA can

be observed by classical molecular fingerprinting methods such as DGGE (Röling et al.

2002), CE-SSCP (Rodríguez-Blanco et al. 2009), ARISA (Maron et al. 2005) or T-RFLP

(Bordenave et al. 2007) coupled with the taxonomic identification of bands or peaks. A better

picture of the diversity with a better coverage can be obtained by clone library (Giovannoni et

al. 1990) or by the new massively parallel pyrosequencing technology (Rogers and Venter

2005).

A comprehensive view of the experiment requires that several parameters be measured

before and/or during the course of incubation (Fig. 1). First, the assimilation of the substrate is

followed by chemical analysis such as gas chromatography coupled with a mass spectrometer

(GC/MS) or by a remineralization experiment following the decrease of 14

C-labeled substrate

by radiorespirometry with a liquid scintillation analyser (LSA) (Singleton et al. 2006). Such

analysis gives indication about the amount of labeled substrate degraded during the course of

the experiment and about the optimal substrate concentration and optimal time for NA-SIP

incubation. Second, the evolution of total bacterial abundance is often followed by

microscopy counting in order to determine a minimal bacterial abundance for DNA

extraction. Eventually, the quantification of hydrocarbonoclastic microorganisms can be

performed in parallel by using the most probable number (MPN) method based on the

incubation of replicated cultures across several serial dilution steps with the substrate (Delille

et al. 2009). A more precise estimation can be done by real-time PCR (if specific PCR

primers are available), a quantitative method for the determination of copy number of genes

involved in the transformation of the substrate (Singleton et al. 2006).

Figure 1: Typical procedure of stable isotope probing for monitoring oil-degrading bacteria.

See references: Neufeld et al. (2007) and Whiteley et al. (2007) for complete DNA and RNA-

SIP protocols, respectively.


Applications

Stable isotope probing requires no foreknowledge about the studied microorganisms,

no cultivation step and minimizes the disturbance of the microbial population. It is not a

complicated technique to implement and it offers many advantages. Even if we focus herein

on its evident application to monitor oil degraders in situ, it can be applied to many other

topics, as long as labeled substrates are available and can be incorporated by bacteria. Until

now, NA-SIP has been successfully employed to explore soil or sediment bacterial

communities (Table 1) but its use in marine environment has only been performed to explore

active marine methylotrophs (Neufeld et al. 2008). The identification by NA-SIP of marine

bacteria able to degrade recalcitrant hydrocarbons such as polycyclic aromatic hydrocarbons

(PAH) with more than four rings is in process (Ghiglione, personal communication).

DNA-SIP analysis is undertaken with a range of 250 ng to 10 µg of DNA per milliliter

of CsCl. High concentrations of loaded DNA allow easier visualization/recovery of heavy and

light bands and allow further investigation by a wide range of molecular analysis methods. It

enables the monitoring of oil degraders within the entire bacterial community based on their

16S rRNA genes affiliation. RNA-SIP can offer the same sequence-based phylogenetic

resolution as DNA-SIP. Its main advantage is reduction of incubation time due to its faster

synthesis, which is of particular interest for natural samples containing active but non

replicating cells or with low bacterial growth rates. It increases the sensitivity of the technique

by labeling more efficiently and rapidly the RNA biomarkers (up to 6.5 times faster,

Manefield et al. 2007). However, RNA-SIP is limited to a maximum loading of 500 ng of

RNA per mL of CsTFA, a sufficient concentration for the 16S rRNA analysis that constitutes

the major fraction of the RNA, albeit more laborious for mRNA-based analysis. Such a

constraint complicates its recovery and its analysis making the labeled-transcriptome

exploration relatively complicated at this time, even if it represents an exciting challenge for

the future (Dumont et al. 2005). Only one study thus far has managed to partially reveal the

transcriptome of hydrocarbonoclastic bacteria in a polyaromatic hydrocarbon-contaminated

environment by using an mRNA-SIP approach (Huang et al. 2009). Advance information on

the succession of populations using the labeled substrate can be obtained by coupling the

advantages of the use of DNA- and RNA-based SIP, as proposed by Lueders et al. (2004) and

Manefield et al. (2007).

Table 1: Overview of studies using DNA/RNA-SIP for identification of active hydrocarbon-degraders.

Substrate Environment Biomarker Phylogenic groups identified Biomarker analysis Additional study features Reference

13C-naphthalene

PAH-contaminated

sediments DNA Polaromonas vacuolata T-RFLP

Discovery of a bacterium hosting a naphthalene dioxygenase

gene Jeon et al. 2003

13C-naphthalene

13C-caffeine

13C-phenol

13C-glucose

Agricultural experimental

soil DNA Pseudomonas, Acinetobacter and Variovorax T-RFLP

Use of a mix of 13C-labeled compounds minimizing

microbiological artifacts caused by nutritional disturbance

Padmanabhan et al.

2003

13C-benzoate Sediment DNA

No identification

(Study of the activity of benzoate-utilizing

denitrifying population)

T-RFLP Use of Archaeal carrier DNA in the density gradient

reducing labeling incubation time Gallagher et al. 2005

13C-naphthalene

13C-phenanthrene

Bioreactor treating PAH-

contaminated soil DNA Acidovorax, Pseudomonas and Ralstonia DGGE

Use of DNA from E. coli K-12 as an indicator of separation

efficiency of 12C and 13C-DNA during ultracentrifugation Singleton et al. 2005

13C-naphthalene

13C-glucose

Soil DNA Acidovorax, Pseudomonas and Intrasporangium Real-time-T-RFLP Adaptation of a quantitative assay for linking microbial

community function (Q-FAST) and structure T-RFLP Yu and Chu 2005

13C-methane Forest soil DNA Methylocystis

Cloning in bacterial artificial

chromosome plasmid

Methane mono-oxygenase operon revealed by metagenomic

tools Dumont et al. 2006

13C-benzene

Gasoline-contaminated

groundwater RNA Azoarcus DGGE

Supplementation by 13C-benzene and an electron acceptor

(benzene degradation under denitrifying conditions) Kasai et al. 2006

13C-pyrene Bioreactor treating soil DNA Sphingomonas, β and ϒ-Proteobacteria DGGE and real-time PCR

Use of DNA from E. coli K-12 as an indicator of separation

efficiency of 12C and 13C-DNA during ultracentrifugation Singleton et al. 2006

13C-benzene Coal gasification soil DNA

Deltaproteobacteria, Clostridia and

Actinobacteria T-RFLP and real-time PCR

Evidence of a novel clade of Gram-positive iron-reducers in

anaerobic benzene degradation Kunapuli et al. 2007

13C-phenanthrene

13C-pyrene

Bioreactor treating soil DNA Acidovorax DGGE and real-time PCR Mixture of 13C-substrates Singleton et al. 2007

13C-methane Acidic peatlands DNA Methylocystis and Methylocella/Methylocapsa

DGGE and MDA for a fosmid

metagenomic library Discovery of a methanol dehydrogenase Chen et al. 2008

13C-pyrene PAH-contaminated Soil DNA β and ϒ-Proteobacteria DGGE SIP coupled with biostimulation assays Jones et al. 2008

13C-benzoate Agricultural soil RNA

Pseudomonas, Bacillus, Acinetobacter,

Variovorax and Burkholderia DGGE Resource availability influence on bacterial diversity

Langenheder and

Prosser 2008

13C-benzoic acid Agriculture soil DNA Burkholderia

T-RFLP, real-time PCR,

isolation/cultivation

Use of MPN-PCR technique to quantify a close relative of

the species Burkholderia

Pumphrey et al.

2008

13C-benzene

BTEX-contaminated

Groundwater RNA Acidovorax and Malikia DGGE

Comparison between community fingerprinting technique

and SIP

Aburto and Ball

2009

13C-toluene

BTEX-contaminated

aquifer RNA Desulfocapsa T-RFLP Combination of in situ microcosm and SIP technique Bombach et al. 2009

13C-benzene Coarse sand DNA

Cryptanaerobacter/Pelotomaculum

ξ-proteobacteria T-RFLP

Relationship between methane production and benzene

degradation Herrmann et al. 2009

13C-naphthalene Groundwater RNA Pseudomonas Acidovorax

DGGE and FISH-Raman

microspectroscopy mRNA analysis Huang et al. 2009

13C-toluene Agricultural soil DNA Organism belongs to the candidate phylum TM7 T-RFLP Identification of a novel toluene-degrading bacterium Luo et al. 2009

13C-benzene Lotus field soil DNA Hasda-A DGGE and real-time PCR

Putative identification of a novel benzene-degrading

bacterium Sakai et al. 2009

13C-toluene BTEX-contaminated soil DNA Polaromonas T-RFLP and real-time PCR First Polaromonas strain growing on toluene Sun et al. 2010

13C-xylene Groundwater DNA Ramlibacter, Paenibacillus and Bacillus T-RFLP Identification of novel m-xylene degrading bacteria Xie et al. 2010


Conclusion/prospective

Stable Isotope Probing is a powerful technique to open the ―microbial black box‖ by

matching diversity of bacteria and their hydrocarbonoclastic function in natural environments.

SIP technique offers a large potential in terms of prospects. For example, a modification of

SIP technique enabled the identification of active predators of stable isotope labeled

Prochlorococcus and Synechococcus (the two most abundant marine cyanobacteria) in

surface waters of the Pacific Ocean (Frias-Lopez et al. 2008). This assay opens up the field of

exploring the diversity of bacterial predators responsible for ―top-down‖ control of

hydrocarbonoclastic bacteria during oil spill pollution events (Kota et al. 1999).

Limitation of resources known as ―bottom-up control‖ has also received very little

attention thus far in SIP studies. Nutrient resources have a direct effect on oil-biodegradation

processes by limiting hydrocarbonoclastic bacterial activities (Atlas et al. 1972) and addition

of nutrients has been successfully used to improve oil degradation in natural environments.

However, very few studies have addressed the question of which bacteria were responsible for

such biostimulation. Kasai et al. (2006) showed that supplementation of groundwater with

13C-benzene together with or without nitrate as electron acceptor resulted in a selection of a

phylotype affiliated with the genus Azoarcus, a denitrifying bacterium able to degrade

benzene only when nitrate was added. In contrast, Jones et al. (2008) found that pyrene-

degrading bacterial diversity remained unchanged under nitrogen amended conditions in an

aged PAH-contaminated soil, even if biostimulation increased the rate of pyrene degradation.

Further comparison between species labeled by 13

C-hydrocarbon, or nutrients + 13

C-

hydrocarbon should be conducted for a better identification of nutrient-limited bacteria in oil

biodegradation processes.

Another promising prospect can involve detection of rare species and that of novel

enzymes and bioactive compounds by coupling DNA-SIP with new metagenomic approaches.

To our knowledge, pre-screening of the metagenomic library based on hydrocarbon substrate

incorporation has never been tried, even if this approach has already been used for

polychlorinated biphenyl (PCB) degrading-bacteria identification (Sul et al. 2009). The

application of SIP and metagenomic tools is largely conceivable to investigate

hydrocarbonoclastic bacterial genes such as PAH dioxygenase (Cebron et al. 2008) especially

because of the recent improvement of the sequencing technique with massively unparallel

pyrosequencing technologies (Rogers and Venter 2005). Coupling SIP and metagenomics

holds promise for extending the SIP application tool-box to expand discoveries in the

exploration of functional microbial communities.

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Specific abbreviations of the book chapter

ARISA : automated ribosomal intergenic space analysis

BTEX: benzene, toluene, ethylbenzene and xylene

CE-SSCP: capillary electrophoresis - single strand conformation polymorphism

CsCl: cesium chloride

CsTFA: cesium trifluoroacetate

DGGE : denaturing gradient gel electrophoresis

DNA : desoxyribonucleic acid

FISH: fluorescent in situ hybridization

GC/MS : gaz chromatography / mass spectrometer

LSA : liquid scintillation analyzer

MDA: multiple displacement amplification

MPN : most probable number

mRNA : messenger ribonucleic acid

NA-SIP : nucleic acid-stable isotope probing

PAH: polycyclic aromatic hydrocarbon

PCB: polychlorinated biphenyl

PCR : polymerase chain reaction

PLFA: phospholipid fatty acid

RNA : ribonucleic acid

SIP: stable isotope probing

16S rRNA: 16S ribosomal ribonucleic acid

T-RFLP : terminal-restriction fragment length polymorphism

Specific glossary of the book chapter

16S rRNA gene A gene that encodes for the ribosomal RNA of the small sub-unit

of the ribosome involved in the translation of messenger RNA

sequences into amino acid chains in prokaryotes. This gene is

universally present but sufficiently variant to allow comparison

among all bacterial taxa. Many molecular tools are based on its

phylogenic resolution capacity.

Bacterial taxon

(plurial: bacterial taxa)

A population, whether named or not, of organisms which are

usually inferred to be phylogenetically related and having

characters in common which differentiate the unit (e.g. a

geographic population, a genus, a family, an order) from other

such units. A taxon encompasses all included taxa of lower rank

and individual organisms. Today, bacterial taxa are largely

defined by their 16S rRNA gene sequence variations.

Biostimulation Modification of an environment carried out to stimulate

indigenous bacteria capable of degrading pollutants. This can be

done by addition of various limiting nutrients or electron

acceptors, such as phosphorus, nitrogen, oxygen, or even carbon

sources.

Cross-feeding Synthrophic interaction in which an organism depends on or

benefits from one or more growth factors or nutrients provided by

another organism.

Cultivation Refers to various methods for multiplying microbial organisms by

letting them reproduce in predetermined culture media under

controlled laboratory conditions. It allows isolating organisms

from a complex environmental sample and maintaining them in

pure culture.

Density gradient A solution in which the concentration of solute is lowest at the top

and gradually becomes denser towards the bottom.

Molecular

fingerprinting methods

Methods that give a snapshot of the entire microbial community at

once, by differential electrophoretic migration on agarose or

polyacrylamide gels, which depend on their size fragments (T-


RFLP, ARISA, LH-PCR) or sequence variations (DGGE, CE-

SSCP). The result is a profile (fingerprint) of the community

structure that can be compared to other samples treated in the

same way.

Hydrocarbon

biodegradation

Total or partial decomposition of hydrocarbons by biological

processes, which results in a minor loss of functional groups,

fragmentation into components, or in a complete degradation to

CO2 and minerals. Hydrocarbon biodegradation is mainly

performed by bacteria.

Hydrocarbonoclastic Refers to the ability of certain microorganisms to metabolize one

or several hydrocarbons.

Metabolic capacities All chemical reactions carried out in aid of specific enzymes

within a cell.

Metagenomics Studies that aim to characterize the partial or entire genomes of

whole communities of organisms rather than individual species.

Microbial consortium Physical association of two or more different microorganisms

interacting through the exchange of signals and molecules.

Molecular approaches Methods based on the exploration of genetic material pools (gene

structure and function), by opposition to culture-based methods.

Most probable number

(MPN)

A method for quantifying a functional group out of a total

bacterial community. This method is based on the

dilution/extinction cultivation technique with a particular substrate

and results are given by using a correspondence table giving the

most probable number of bacteria able to grow on this substrate.

Phylogenetic affiliation Positioning an organism on the basis of its evolutionary distance

to the closest related microorganism using their gene sequence

homologies (16S rRNA genes in general).

Polymerase chain

reaction (PCR)

A molecular technique using a polymerase enzyme to

exponentially amplify a DNA fragment until thousands or even

millions of copies of the sequence. PCR is the basis of a wide

range of genetic analyses avoiding limitations in DNA quantities.

Pyrosequencing A massively parallel DNA sequencing method based on the

sequencing-by-synthesis principle, which relies on efficient

detection of the sequential incorporation of natural nucleotides

during DNA synthesis. Due to the short read length generated by

the 454 platform and in order to increase sequencing capacity,

new strategies for exploring microbial diversity by 16S

pyrosequencing are currently being developed. While the first

generation 454 Life Sciences apparatus (GS20) provided up to 25

megabases of data in a single run with an average read length of

100 base pairs (bp), the new GS FLX Titanium provides up to 400

megabases of data in a single run with an average read length of

400 bp. The widespread availability of 454 pyrosequencing, a

technology roughly an order of magnitude less expensive than

classical Sanger sequencing in terms of cost per base, has changed

the landscape of genomics.

Real-time PCR

(quantitative PCR):

A technique used to amplify and simultaneously quantify a

targeted DNA molecule as absolute number of copies or relative

amount when normalized to DNA input or additional normalizing

genes. The procedure follows the general principle of a

polymerase chain reaction. Its key feature is that the amplified

DNA is detected as the reaction progresses in real time, a new

approach compared to standard PCR, where the product of the

reaction is detected at its end.

Stable isotope-labeled

molecule

A non-radioactive natural or synthesized stable molecule

containing one or several atoms enriched in one or several

neutrons. Different isotopes of the same element have nearly the

same chemical characteristics and therefore behave almost

identically in biology. The mass difference, due to a difference in

the number of neutrons, leads to a partial separation of the light

isotopes (unlabeled molecules) from the heavy isotopes (labeled

molecules) during physical processes such as ultracentrifugation.


3. Article 4: Dominance of Cycloclasticus sp. as key phenanthrene degrader in

pristine and chronically oil polluted coastal seawaters revealed by DNA-stable

isotope probing and massive pyrosequencing.


, Gilles Vétion1,2

, Catherine Guigue3, Jean-François

Ghiglione1,2


sur-Mer, France;


Mer, France;

(3) Centre d'Océanologie de Marseille, Campus de Luminy, 13 288 Marseille Cedex 9,

France

Correspondence:




88 73 98


Running title: Identification of phenanthrene-degrading bacteria in seawater by SIP.

Keywords: Stable Isotope Probing, seawater, Cycloclasticus, pyrosequencing

Abstract

We present here the first study combining DNA stable isotope probing and massive

parallel pyrosequencing to identify pelagic phenanthrene-degrading bacteria in three coastal

sites of the NW Mediterranean Sea with various pollution levels. Analysis of natural seawater

and 13

C-enriched versus 12

C-bacterial communities revealed that one week incubation with

phenanthrene induced a decrease in bacterial richness together with the emergence of specific

phenanthrene-degrading bacteria that were rare or not detectable in the initial sample.

Cycloclasticus sp. was systematically found in the three environments to be dominant in the

13C fraction, revealing its pivotal role in phenanthrene biodegradation in the NW

Mediterranean Sea. We also found other dominant genus of phenanthrene-degraders (> 1% of

the community) such as Oceanibaculum, Paracoccus, Atleromonas and Sneathiella, but their

repartition were more site specific, suggesting an influence of the pollution history of the site.


Introduction

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are one of the most hazardous substances of

petroleum. Because of their potential carcinogenicity and mutagenicity (ATSDR, 1995), the

Environmental Protection Agency (EPA) has classified many high-molecular-weight PAHs

(4-6 benzene rings) in its observation priority pollutant list. PAH mostly result of fossil fuel

combustion as by-products of industrial processing (Cerniglia 1992). The sources of

contamination by PAHs in natural environment are numerous (natural oil seeps, refineries

pollution, accidental of volunteer spills from tankers) and the high quantities of PAH in some

industrialized areas represents a real problem for human health (Thakker et al. 1985). Their

elimination could be achieved by physical processes like volatilization, photo-oxidation and

chemical oxidation but the better way to clean up PAHs contaminated sites is the microbial

biodegradation (Andreoni et al. 2009). Nevertheless, more PAHs present high-molecular-

mass more they are hydrophobic and have the tendency to adsorb to organic materials

(Gauthier et al. 2003). In consequence, they present low bioavailability for bacteria and

remain particularly persistent in natural environments (Hughes et al. 1997). Since several

years, a privileged way to improve the natural biodegradation of PAH has consisted to

biostimulate the indigenous hydrocarbonoclastic bacteria by nutrients addition. However,

even if this technique has proven its efficiency, it can remain uncertain because of our

ignorance of natural system functioning and bacteria involved in PAH biodegradation in

particular. For a long time, the difficulty to discriminate microbes responsible for in situ

PAH-biodegradation has been hampered by the high complexity of microbial assemblages

and the limitations of culture-based identification methods. Indeed, in a research effort, many

PAH degrading bacterial strains have been isolated from various environments (Juhasz et al.

2000; Rodriguez-Blanco et al. 2010) but it is highly probable that a large part of PAH

metabolism capabilities of natural assemblages remains ignored as the cultivation methods

allow the isolation of only 0.1% to 1% of bacterial communities in marine environments

(Giovannoni et al. 1990). In the last years, the 16S rRNA PCR-based molecular methods have

given access to molecular compositions of bacterial communities involved in PAH

degradation by shunting culture-dependent biases with relatively high success (Andreoni et al.

2004; Chang et al. 2007; Chang et al. 2010; Niepceron et al. 2010). In this studies some

variations in bacterial community structure have been attributed to PAH contamination.

However, the affiliation of PAH-metabolism to specific bacterial species was not feasible by

using such classical methods. Recently, the use of stable-isotope probing (SIP) to soil and

sediment in PAH-degradation studies has considerably facilitated the identification of PAH-

degrading microorganisms (Hanson et al. 1999; Singleton et al. 2005). New micro-organisms

have for example been found in naphthalene, phenanthrene or pyrene enriched bioreactor

treating soil (Singleton et al. 2005; Singleton et al. 2006). Moreover, recently the new high-

throughput pyrosequencing method has allowed a better identification of PAH-degrading

bacteria in previous soil biodegradation study by capturing the largest amount of available

genetic resources present in the sample avoiding cloning biases (Dos Santos et al. 2011;

Singleton et al. 2011). The coupling of SIP and pyrosequencing has also proved its efficiency

in the exploration of nitrogen-incorporating bacteria in petroleum-contaminated arctic soils

and anthracene-degrading bacteria (Bell et al. 2011; Jones et al. 2011). But surprisingly, the

labeling with stable isotope has been employed in seawater only for the identification of one-

carbon compounds degraders (Neufeld et al. 2007). The potential of such method in the

identification of PAH-degraders in seawater is high and this field of investigation remains

totally opened. Moreover, even if PAH-degrading bacteria are ubiquitous in natural

environment (Leahy et al. 1990; Yakimov et al. 2007), their representativeness and

composition is probably variable between contrasted sites. The PAH addition on either

pristine or oil-acclimated bacterial communities could give complementary results in SIP

study according to their metabolic capacities (Pelz et al. 2001). Except for some studies as in

denitrifying aquifer or sediments (Pelz et al. 2001; Gallagher et al. 2005), this way of

investigation has also been poorly explored.

We designed a DNA-SIP experiment with 13

C-phenanthrene in three contrasted

seawaters originated from sites submitted to various level of PAH pollution. The

identification of phenanthrene-degrading and non-degrading bacterial communities was

realized by the recent FLX pyrosequencing technology. This study consists in the first

revelation of PAH-degrading bacteria in surface seawater environment by stable-isotope

probing.


Materials and methods

Sample collection

Seawater samples were collected from the North Western Mediterranean Sea (France) at i) the

SOLA station (42° 31‘ N, 03° 11‘ E) located in Banyuls-sur-mer bay in January 2010, ii) the

Fos-sur-Mer gulf (43°24‘' N, 04°59‘ 'E) and iii) the SOFCOM station (observation station of

the Frioul island for the oceanographic center of Marseille, 43°14‘ N, 05°17‘ 'E) in June 2010.

The Banyuls-sur-Mer bay and the SOFCOM station were considered to be pristine sites

whereas the Fos-sur-Mer gulf was chosen as a chronically oil contaminated site, as it is

bordered by coastal oil refineries and characterized by a heavy tanker traffic transporting

crude and refined oil (Le Dréau et al. 1997). For the three experiments, seawater was filtered

on 2µm (47mm, PC Nucleopore) in order to remove larger microorganisms and high-size

particles. Some sub-samples were sampled for initial bacterial abundance counting (see

below) and 5L were filtered on 0.2µm (47mm, PC Nucleopore) for an initial DNA extraction.

One liter was also filtered on 0.2µm and autoclaved 1h at 110°C to prepare the abiotic

control.

Labeling bacteria with phenanthrene stable isotope

Three stock solutions were prepared in dichloromethane at 100, 10 and 1mg mL-1

. The 13

C14-

phenanthrene (99% atom 13C, Sigma-Aldrich) was also prepared in dichloromethane at 10

mg mL-1

concentration. All the experiments were done in pre-calcined 500 mL Erlenmeyer

flasks. Flasks were prepared in sterile condition for three 12

C-Phe (Sigma-Aldrich)

concentration (100, 10 and 1mg L-1

), for 13

C-Phe (99% atom 13

C, Sigma-Aldrich) at 10 mg L-

1, for a biologic control without Phe and for an abiotic control with 10mg L

-1 12

C-Phe. A total

of 25 flasks were necessary for the time series, i.e.day zero, day 3, day 7, day 14, day 21 and

day 28. When dichloromethane from Phe solutions was totally evaporated, flasks were filled

with 250 mL 2µm-filtered seawater and hermetically sealed with Teflon caps. One flask of

each Phe concentration was sacrificed for initial Phe measurement. The rest was incubated in

a dark and in situ temperature under 300 rpm magnetic agitation. At each incubation time,

sub-samples were collected for bacterial counting, the flasks were then frozen until Phe

extraction or the seawater was filtered on a 0.2 µm pore-size filter (47mm, PC nucleopore) for

DNA extraction. The 13

C-Phe enriched flasks were stopped after seven days of incubation.

Phenanthrene quantification

The quantification of in situ phenanthrene and total PAH concentration was performed

according to Guigue et al. (2011). Briefly, dissolved PAHs present in the fraction < 0.7 µm

were extracted from seawater by liquid-liquid extraction with CH2Cl2 (3 x 50 ml per liter).

Organic extracts were then purified on silica to isolate the PAHs fraction. Deuterated standard

mixtures were introduced at different stages of the protocol and used as surrogates to assess

the recoveries of analytical procedures and to perform quantitation accuracy. All solvents

were of organic trace analysis quality (Rathburn, Interchim). PAHs fraction were analyzed by

gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS) (TraceISQ, ThermoElectron) equipped with

a TR-5 MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm, Thermofisher) and operating at an

ionization energy of 70 eV for a m/z range of 50-400, using hydrogen as carrier gas at a flow

rate of 1.2 mL min-1

. Compounds were identified by reference to the analysis of standard

mixtures (04071, Fluka and 47543-U, Supelco among others). Blanks were run by analysing

solvents. All concentration values were blank and recovery corrected. The concentrations of

17 parent PAHs were determined, namely naphthalene (Naph), acenaphtylene (Acy),

acenaphtene (Ace), fluorene (Flu), dibenzothiophene (DBT), phenanthrene (Phe), anthracene

(Ant), fluoranthene (Flt), pyrene (Pyr), benzo[a]anthracene (BaA), chrysene (Chr),

benzo[b]fuoranthene (BbF), benzo[k]fuoranthene (BkF), benzo[a]pyrene (BaP),

dibenzo[a,h]anthracene (DBA), benzo[g,h,i]perylene (BP) and indeno[1,2,3-cd]pyrene (IndP).

For the Phe degradation experiment, the Phe extraction was performed first adding a pyrene

solution as a co-extraction standard, previously prepared as Phe. Both aromatic hydrocarbons

were extracted in 20mL dichloromethane in cold conditions. After evaporation of the solvent

in 45°C speed-vac, hydrocarbon powder was re-suspended in ultra-pure toluene solvent.

Extracts were injected at 300°C in a gaz chromatographic capillary column (VF-5ms, Varian)

which was coupled with a mass spectrometer (GC-MS Varian 2100T). The migration

program consisted to 1 min at 60°C, an increase phase at 5°C min-1

and 45 min at 200°C. The

molecules were quantified according to standard calibration solutions of pyrene and Phe. The

simultaneous quantification of Phe and pyrene provided the extraction yield that was always

under 80% of recuperation. The quantification in abiotic controls allowed the estimation of

the physical disappearance of Phe during the incubation time of the experiment.

Bacterial abundance

Total bacterial counts were determined by flow cytometry according to Ghiglione et al.

(2005). Briefly, 2 mL seawater samples were fixed with 2% formaldehyde for at least 1 h at


4°C. A 1 mL sub-sample was incubated with SYBR Green I (final concentration 0.05% [v/v]

of the commercial solution) for at least 15 min at 20°C in the dark and analysed with a FACS

Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) equipped with an air-cooled Argon

laser (488 nm, 15 mW). Stained cells were enumerated according to their side-angle-scattered

light (SSC) and induced green fluorescence light (GFL) collected through a 530 ± 30 nm

bandpass filter. Yellow–green fluorescent beads (1-μm diameter, Polysciences) were

systematically added to each analyzed sample to normalize SSC and GFL emission. Data

acquisition and analysis were conducted using the software Cell-Quest (Becton Dickinson).

Acquisition was triggered by GFL. The volume analyzed and the subsequent estimation of

cell concentrations were determined by measuring the remaining volume of sample and

subtracting it from the initial volume. Sheath fluid was seawater filtered through a 0.22 μm

pore size membrane.

Nucleic acid extraction

The procedure used for extraction of chromosomal DNA was a modification of that described

by (Fuhrman et al. 1988). This procedure employs an enzymatic and detergent-based lysis,

which is a relatively gentle method that avoids excessive shearing of DNA, produces DNA of

suitable quality for PCR and reduces the risk of chimera formation during PCR (Madrid et al.

2001). The frozen 0.22 μm pore-size filters were cut with sterilized scissors into small strips

and vortexed briefly in 840 μL of alkaline lysis buffer (50 mM Tris hydrochloride pH 8.3, 40

mM EDTA, 0.75 M sucrose). Cell lysis was accomplished by an initial incubation for 45 min

at 37°C after adding 50 μL of freshly prepared lysosyme solution (20 mg mL–1

), and a second

incubation at 50°C for 10 min after adding 100 μL of 10% sodium dodecyl sulfate and 10 μl

of proteinase K (20 mg mL–1

). The lysate was extracted with an equal volume of

phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) and with an equal volume of

chloroform:isoamyl alcohol (24:1). The nucleic acids were precipitated with 1 volume of

isopropanol at –20°C overnight, rinsed with 70% ethanol before resuspending in TE buffer

(10 mM Tris, 1 mM EDTA). The molecular size and the purity of the DNA were analysed by

agarose gel electrophoresis (1%) and the DNA was precisely quantified by the Quant-iTTM

Picogreen® dsDNA kit (Invitrogen) according to manufacturer recommendations.

DNA-SIP gradient fractionation

The preparation of gradient was performed at 20°C. From each sample, 1-2 µg of total

extracted DNA was mixed with TE buffer until 540 µL total volume. 4.7 mL of a cesium

chloride (CsCl) solution prepared in sterile TE at 1.80 g mL-1

were added to the DNA

solution. The density was precisely adjusted to 1.715 g mL-1

by successive addition of TE or

CsCl stock solution. The final mix was loaded in 4.9 mL Opti-seal polyallomer

ultracentrifuge tubes (Beckman Coulter) with sterile syringe and needle avoiding bubbles.

The tubes were centrifuged 40h at 20°C and 44500rpm (180000 gav) in a Vti 65.2 vertical

rotor (Beckman Coulter). Gradient were fractionated into ~200 µL fractions by replacing the

gradient by sterile water and collecting fractions by the bottom of the tubes with minimal

disturbance (Lueders 2010). DNA was then quantified in each fraction by Quant-iTTM

Picogreen® dsDNA kit (Invitrogen). The fractions containing heavy or light DNA were

purified with the Geneclean Turbokit (MPbio) according to manufacturer instructions then re-

suspended in ultra-pure water and stored at -80°C until analysis.

Pyrosequencing analysis of light and 13

C-enriched DNA

Initial seawater together with heavy and light DNA fractions of the SIP experiment

were analyzed by pyrosequencing. Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing

(bTEFAP) was performed as described previously using Gray28F

5‘TTTGATCNTGGCTCAG and Gray519r 5‘ GTNTTACNGCGGCKGCTG (Dowd et al.

2008) amplifying 400bp of the V6 region of the 16S rRNA gene. Initial generation of the

sequencing library was accomplished by a one-step PCR with a total of 30 cycles, a mixture

of Hot Start and HotStar high fidelity taq polymerases, and amplicons originating and

extending from the 28F for bacterial diversity. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing

analyses utilized Roche 454 FLX instrument with Titanium reagents, titanium procedures

performed at the Research and Testing Laboratory (Lubbock, TX) based upon RTL protocols.

Sequences were processed and analyzed using the Qiime software (Caporaso et al. 2010).

Briefly, samples were denoised using the Ampliconnoise program and checked for chimeras

using Perseus (Quince et al. 2011). The resulting clean sequences were clustered using into

Operational Taxonomic Units (OTUs) at a 97% sequence identity level using the Uclust

algorithm (Edgar 2010). A representative sequence from each OTU was classified using the

RDP classifier (Wang et al. 2007) using the Greengeenes training set. Phylogenetic trees used

for Unifrac (Lozupone et al. 2005; Lozupone et al. 2007) analysis was constructed using

FastTree (Price et al. 2009 ) using sequences that had been aligned with PyNAST (Caporaso

et al. 2010 ) and filtered using the lanemask.


Results and discussion

Methodological considerations for SIP seawater experiment

The lack of complete understanding regarding the full breadth of hydrocarbon-

degrading species and their ecological functioning in PAH removal from contaminated waters

was recently underlined (Gutierrez 2010; Gutierrez 2011). These authors proposed the use of

DNA-based SIP to identify marine bacterial PAH-degraders. So far, only studies on

methylotrophic bacteria have used this technique in seawater (Neufeld et al. 2007; Neufeld et

al. 2008). Nucleic-acid-SIP (NA-SIP) dealing with bacterial communities degrading

petroleum compounds generally incubated 0.1-10 µmol of enriched-substrate with one gram

or milliliter of soil or sediments in tens grams containing flasks during from 3 to 86 days, but

more generally during one to two weeks (Lueders 2010). As the bacterial abundance in such

environments is around 108-10

9 cells per gram, the quantities of natural sample and enriched

molecule is largely sufficient to obtain completely labeled NA. Most of the time, authors

obtained several micrograms of total NA after 13

C-pulse that comprise a majority of

unlabelled NA and a minor quantity of labeled molecule that was considered as representative

of expected in situ concentrations. According to our own experiment and previous study, it

seemed more complicated to obtain such result from seawater environment (Neufeld et al.

2007). In our study, we first performed a Phe degradation kinetic to estimate the optimal

concentration of Phe and the optimal incubation time in order to obtain enough 13

C-enriched

DNA in a minimum amount of time to avoid cross-feeding (Lueders 2010). In order to allow

a sufficient labeling, we added 10 mg L-1

of 13

C-Phe, which is 10 to 100 times more than

generally used in simulation of Phe addition by oil spills (Castle et al. 2006; Teira et al. 2007).

It permitted to obtain 1.3 to 10µg of DNA, out of 2 to 5 106 bacterial cells mL

-1 in 7 days, a

quantity that allowed an optimal separation of heavy and light DNA fractions. However,

among this quantities we found an higher concentration of 13

C-DNA compared to 12

C-DNA

(data not shown) whereas it should have been the opposite. Neufeld et al. (2007) found similar

results after 6 days exposition of 5 mmol of 13

CH3OH in 4L seawater, where DNA was almost

entirely composed of 13

C-DNA. This evolution of bacterial community composition under

substrate amendment is not really a problem as it is representative of what could append in

natural environments under sudden input like oil spill for example. The use of SIP for the

investigation of specific biogeochemical processes in natural seawater is promising and the

success of seawater SIP studies would reside in the improvement of experimental design, but

for the moment as some other authors, we believe that such cultivation-independent methods

of identifying specific degraders in complex systems are inherently much less biased than

isolation on plate media (Singleton et al. 2006).

Bacterial community dynamic under phenanthrene pollution and taxonomic identification

Pelagibacter genus was the major group at the beginning of the experiment with 71.6,

64.0 and 64.8% of the total communities in FOS, SOFCOM and BANYULS, respectively

(Fig. 1). The other species never exceeded 10% of total communities. After 7 days incubation

with Phe, we observed a radical shift in thebacterial community structures in the three sites

that led to the disappearance of Alphaproteobacteria (especially Pelagibacter) and

Bacteroidetes together with the dominance of Gammaproteobacteria and more specifically

the Cycloclasticus genus in all 13

C-enriched fractions (Fig. 1). Castle et al. (2006) also found

that 3 days after the naphthalene exposure, both Alphaproteobacteria and Bacteroidetes

became undetectable with fluorescent in situ hybridization (FISH). Teira et al. (2007)

proposed that this significant decrease was due to the toxicity of hydrocarbon chemicals. Such

hypothesis was reinforced by the results from Labbé et al. (2007) who revealed that

Alphaproteobacteria was twice higher in pristine than in hydrocarbon-contaminated Alpine

soils. On the contrary, Gammaproteobacteria have already been identified as major group in

confined seawaters (Eilers et al. 2000; Beardsley et al. 2003) and most of aerobic

hydrocarbon-degrading bacteria belong to Gammaproteobacteria group (Head et al. 2006).

Ellers et al. (2007) showed that the relative abundance of Alteromonadaceae, an important

member of the Gammaproteobacteria could significantly increase after water enclosure in

mesocosms. In our experiment, Glaciecola, an Alteromonadaceae, was predominant in the

non-enriched fractions of the three bacterial communities. This genus has already been found

in oil contaminated sites (Brakstad et al. 2008) and can even degrade the tetradecane

(Yakimov et al. 2004), but did not metabolized the Phe in our experiment. Many studies have

investigated the bacterial community composition in oil contaminated sites (Yakimov et al.

2004; Brakstad et al. 2005; Brakstad et al. 2008). It is tempting in such case to allocate a

hydrocarbon-degradation function to the key members of the community, making the

hypothesis that if there are predominant over the bacterial community, it could be because of

their selective advantage for the hydrocarbon resource. However, our results demonstrate that

some genera such as Glaciecola could be well represented in a total bacterial community

subjected to toxic compounds, but without being involved in its degradation. This observation

suggests that some genera can be unaffected by the hydrocarbon toxicity and second could


benefit of the ambient conditions, representing a serious competitor to hydrocarbon-degrading

bacteria for the nutrients resources for example (Smith et al. 1998).

Table 1: Caracteristcs of SIP samples (bacterial abundance, PAH quantities in situ and during

the experiment) and summary of tag sequencing. The number of reads for tag sequencing

listed was the total number generated. All of the diversity statistics for tag sequencing are

reported following clustering of this data set at a distance of 0.03 and re-sampling to the

sample with the lowest number of reads (3715 tags). Richness indexes (Chao1 and ACE)

were calculated at the 3% difference level between 16S rRNA gene fragments.

Cycloclasticus genus as a key PAH-degrading bacteria in marine environments

While the initial seawaters contained no detectable member of the Cycloclasticus

group, this genus represented 56.6, 88.6 and even 99.0% of total Phe-degraders (13C-enriched

fractions) after one week incubation in FOS, SOFCOM and BANYULS respectively (Fig. 1).

The dominance of Cycloclasticus was accompanished with a drastic decrease in bacterial

richness after phenanthrene addition (from more than 345 to less than 106 species in the three

environments, as estimated by Chao1). A decrease in bacterial richness together with a strong

selection of hydrocarbon-degrading bacteria is a classical trend after hydrocarbon exposure

(Röling et al. 2002; Castle et al. 2006). Both qualitative (fingerprint) and quantitative methods

(FISH and qPCR) have been employed to explore the structural changes that occur in natural

marine bacterial communities after oil pollution (Denaro et al. 2004; Yakimov et al. 2004;

Castle et al. 2006; Coulon et al. 2007; McKew et al. 2007). However, until now, very few

studies have investigated the dynamic of bacterial communities under oil pollution by the

massively parallel pyrosequencing (Dos Santos et al. 2011) or coupled this technique to SIP

experiments (Bell et al. 2011; Jones et al. 2011). By using this high-throughput sequencing,

we could reveal 40-64% of the total diversity in all samples meaning that even with this

efficient method, half of the community diversity could be not sampled (Table 1). Muyzer et

al. (1993) and Casamayor et al. (2000) indicated that only the species which make up >1% of

the total cell number could be detected with actual PCR-dependent methods and taxa that

comprise <0.1% were difficult to retrieve. This actual limitation explained why we could not

found the PAH-degraders and the Cycloclasticus genus in particular in the initial seawater.

This observation also demonstrate that the ―seed bank‖ theory is particularly well adapted to

hydrocarbonoclastic bacteria (Pedrós-Alió 2006). Indeed, our results revealed that some key

members of the PAH-degrading community belonging to the ―seed bank‖ were opportunistic

species that grew under appropriate conditions becoming the ―core species‖ in oil polluted

environments. SIP coupled with new pyrosequencing technologies is the only technique to

study the dynamic of key members of the in situ community able to respond to oil pollution

and permits a better evaluation of their potential in natural conditions (Dumont et al. 2005).

The Cycloclasticus dominancy in the three 13

C-enriched fractions was not surprising and

reinforced the general observations made on this key genus for the PAH natural removing.

Cycloclasticus bacteria was first isolated in 1995 for the degradation of numerous low-

molecular-weight PAH such as naphthalene, alkyl naphthalene, biphenyl, phenanthrene,

fluorine and anthracene (Dyksterhouse et al. 1995). This genus cannot grow on classical sugar

and amino acids like lactate, alanine, proline, glucose and fructose, which makes it, a

preferential hydrocarbon-degrading bacteria. It was demonstrated that this genus degrades

more efficiently C1-2 alkyl aromatic hydrocarbons than some other PAH-degrading bacteria

such as Marinobacter, Pseudomonas and Sphingomonas (Kasai et al. 2002), a capacity that

could explain its systematic dominance in PAH-contaminated sites. Numerous papers have

identified the Cycloclasticus genus has as a key member of the PAH-degradation in various

environments (Geiselbrecht et al. 1996; Kasai et al. 2002; McKew et al. 2007) accounting

even for up to 25% of the total bacterial populations in severely oil-polluted waters

(Maruyama et al. 2003; Harayama et al. 2004). Like in our experiment, Teira et al. (2007)

observed a quick response of bacteria belonging to the genus Cycloclasticus after PAH

addition, reaching a maximum abundance in about 3 days. This genus was also retrieved in

pyrosequencing datas after a simulated oil spill in pristine mangrove sediments and was


proposed as an PAH-pollution indicators (Dos Santos et al. 2011). All those observations

make Cycloclasticus a primordial group in the natural elimination of low-molecular-weight

PAHs. We demonstrated here for the first time the potential of this dormant bacterium in

natural seawater by Stable Isotope Probing and confirmed its prevalence in various PAH-

contaminated marine sites.

Figure 1: Taxonomic distribution (Class_Order_Family_Genus) of re-sampled tag sequences

from initial seawaters, 12

C- and 13

C-SIP fractions in the three contrasted sites. NA are for

Non-attributed sequences. OTUs representing less than 1% of the total community are

grouped in ―others‖.

Importance of seawater origin in the response of phenanthrene degrading bacterial

communities.

Differences between the three environments were also found in their bacterial

community composition. Initial bacterial community was richer in the BANYULS station

than the two others (380, 177 and 150 detected OTUs in BANYULS, FOS and SOFCOM

respectively, Table 1). Phe addition resulted in a drastic decrease of bacterial richness except

in the FOS station where an increase in the number of observed OTUs was found for the

background community fraction. FOS was the most diversified site after Phe exposure

(Simpson = 0.92 and 0.53, 0.34 and 0.21 or 0.54 and 0.02 for 12

C and 13

C fraction in FOS,

SOFCOM and BANYULS sites respectively), suggesting a less dramatic effect of the PAH on

the bacterial community than in other seawaters. In this site, phenanthrene non-degrading

bacteria probably resisted to the toxic effects of hydrocarbon chemical because of their

chronicle exposition to petroleum and were able to grow in confined conditions (see Sauret et

al. submitted).

Moreover, if the most dominant OTUs were the same in the three environments

(Glaciecola in the 12

C fractions and Cycloclasticus in the 13

C fractions), other dominant

species (>1% of the total community) were different between sites, revealing some site

specific organisms. Phenanthrene-degraders belonging to Oceanibaculum and Paracoccus

were mostly found in SOFCOM site whereas Alteromonas and Sneathiella were mostly

retrieved in FOS seawater. 13

C-enriched dominant bacterial community from BANYULS was

totally dominated by the Cycloclasticus genus. Alteromonas is an attested hydrocarbon-

degrader. Recently, the complete genome of the PAH-degrading bacterium Alteromonas sp.

strain SN2 was sequenced (Jin et al. 2011). Alteromonas intervened also in the PAH-

degrading bacterial community from deep sea sediments of the middle Altantic Ridge (Cui et

al. 2008) or Indonesian seawater (Harwati et al. 2007). Paracoccus is also known for utilizing

hydrocarbons as a carbon source. This genus was even associated with gravel particules in

Arabian Gulf coasts for the degradation of petroleum (Radwan et al. 2010). Thus, their

presence in our Phe-degrading bacterial communities was not surprising. Oceanibaculum has

already been found in a PAH-polluted hydrothermal field sediment (Lai et al. 2009; Dong et

al. 2010) and Sneathiella has even been identified in an oil reservoir in the North sea (Bødtker

et al. 2009) but, until now, such bacteria have never been recognized as PAH-degraders. We

showed here their capacity to metabolize the phenanthrene or its by-products. Our result

showed that even under the same conditions, some bacterial genus selected for the Phe

degradation where different in each environment, revealing the specificity of particular

bacteria for specific environmental conditions.

Conclusion

We showed in the present study that the Stable Isotope Probing technique is adaptable to the

exploration of PAH-degrading marine bacteria. Such technique is promising to improve our

understanding on oil elimination natural process in aquatic environments.


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DISCUSSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES

CHAPITRE 6

239 Chapitre 6 : Discussions générales et perspectives

Chapitre 6 : Discussions générales et perspectives

En se basant sur les résultats originaux des travaux exposés dans les chapitres précédents,

ce dernier chapitre a pour objectif de discuter et d‘envisager des perspectives réalistes autour

de 4 questions fondamentales qui ont été abordées dans cette thèse.

1. Quelle est l‘importance de la richesse bactérienne spécifique dans la biodégradation

des hydrocarbures ?

D‘après les nombreuses études décrites dans la bibliographie, nous savions avant

d‘entamer ce travail de thèse que le pétrole avait un impact sur la structure des communautés

bactériennes marines. C‘est donc sans surprise que cet impact a été retrouvé à la fois dans

l‘étude in situ (Chapitre 2) et dans les expériences en laboratoire présentées dans ce manuscrit

(Chapitres 3, 4 et 5). Nos travaux ont permis de démontrer statistiquement que dans

l‘environnement, le pétrole est un facteur qui contribue significativement à la structuration des

communautés bactériennes. Lors de déversement soudain, le pétrole fait disparaitre les

groupes bactériens sensibles à sa toxicité et stimule les bactéries hydrocarbonoclastes,

induisant un fort changement de structure de communauté. Ces observations soutiennent

l‘idée que la plasticité métabolique des communautés bactériennes contribue à la mise en

place d‘un consortium bactérien performant pour la dégradation des hydrocarbures. Toutefois

s‘il est relativement aisé d‘observer les changements de structure de communauté et/ou de

diversité bactérienne après un apport de pétrole, il est en revanche plus complexe de

déterminer à quel point la diversité bactérienne influence en retour l‘efficacité de

biodégradation. Des pistes de réponses ont pu être obtenues par l‘expérience que nous avons

effectuée en microcosme (Chapitre 3). En testant expérimentalement l‘effet de l‘historique de

pollution d‘un site sur la réponse des communautés bactériennes à un apport de pétrole, nous

avons pu voir qu‘un assemblage bactérien subissant des pollutions chroniques s‘adaptait plus

rapidement aux hydrocarbures, les dégradait plus vite et était plus performant dans le

métabolisme des composés les plus complexes par rapport à une communauté n‘ayant jamais

était confrontée à une pollution pétrolière. Supposant que cette communauté bactérienne

possédait déjà en grand nombre de bactéries hydrocarbonoclastes avant la pollution, nous

avons pu en déduire que la diversité bactérienne était un facteur clé dans la dégradation des

pétroles. Les expériences en microcosmes et mésocosmes ont également montré que la

communauté bactérienne voyait sa richesse diminuée après ajout de pétrole, sans qu‘il n‘y ait

d‘influence sur les taux de dégradation des hydrocarbures (Chapitres 3 et 4). Nous avons vu

également dans le chapitre 5 que la richesse des bactéries capables de dégrader certains

hydrocarbures était très réduite (dominance très nette de Cycloclasticus sp. dans la

dégradation du phénanthrène, par exemple). A ma connaissance, il n‘existe pas à ce jour

d‘étude publiée ayant estimé expérimentalement un niveau de richesse minimum d‘une

communauté bactérienne naturelle pour la dégradation des hydrocarbures.

Pour cela, il conviendrait de tester la capacité de dégradation des hydrocarbures de

plusieurs assemblages bactériens possédant des niveaux de richesse différents. Cette question

fondamentale a déjà été explorée à partir de consortia bactériens de niveaux richesse variables

reconstitués expérimentalement en mélangeant plusieurs souches bactériennes cultivables

(McGrady-Steed et al. 1997). Néanmoins ce type d‘expérience se heurte à un problème

majeur à savoir la représentativité des souches cultivables choisies par rapport à des

communautés naturelles complexes. Nous proposons ici une alternative à travers une

expérience préliminaire en guise de perspectives d‘étude et nous en exposons ici le principe et

les premiers résultats. La méthode que nous avons choisi consiste à manipuler artificiellement

la richesse d‘une communauté naturelle en utilisant la méthode de « dilution-extinction »

(Gomez et al. 2004) et à tester sa capacité de dégradation d‘un HAP modèle, le phénanthrène.

Figure 28 : Principe général de l’expérience de dilution-extinction.

Une condition requise à cette étude était d‘obtenir des cultures d‘eau de mer présentant des

richesses spécifiques en bactéries naturelles de plus en plus faibles, mais dont les biomasses


étaient identiques. Nous avons donc dilué de l‘eau de mer prélevée dans la baie de Banyuls

sur mer en deux phases successives et attendu que les bactéries se développent jusqu‘à une

même concentration dans toutes les dilutions pour ajouter du phénanthrène dans l‘ensemble

des microcosmes (Fig. 28). Avant et après incubation avec l‘hydrocarbure, une analyse de

structure de communauté a été réalisée par CE-SSCP, l‘abondance bactérienne a été mesurée,

la concentration en phénanthrène dosé et des mesures d‘activités ectoenzymatiques

bactériennes ont été réalisées avant l‘ajout du phénanthrène (l‘ensemble des protocoles

utilisés dans cette expérience ont été présentés dans les précédentes études).

Nos résultats ont montré tout d‘abord que quel que soit le niveau de dilution, il était

possible d‘obtenir des cultures ayant une abondance bactérienne du même ordre de grandeur

(entre 1 et 4.106 cellules.mL

-1) dans un intervalle de temps relativement court. Ensuite

l‘objectif de diminution artificielle de la richesse par dilutions successives mesuré par le

nombre de pics CE-SSCP a été partiellement atteint. Si la diminution de diversité était

évidente pour la première étape de dilution, la deuxième étape n‘a pas permis d‘atteindre

l‘extinction et il serait nécessaire de reproduire cette expérience en faisant une troisième étape

de dilution de manière à obtenir un nombre minimum d‘espèces (mesuré cette fois par une

analyse plus poussée en pyroséquençage massif). Néanmoins, les premières estimations de

mesure d‘activités enzymatiques extracellulaires cellule-spécifique ont montré que l‘activité

métabolique des communautés bactériennes de richesse différente étaient différentes, comme

le montre la figure 29. Par exemple l‘échantillon naturel présentait une activité extracellulaire

de type aminopeptidase élevée et lipase très faible. La dernière dilution, de richesse plus

faible, présentait au contraire une activité aminopeptidase faible et lipase élevée (Fig. 29).

Figure 29 : Mesures d’activités enzymatiques extracellulaires dans les 11 dilutions différentes. Protocole

indiqué dans l’article 3 de ce manuscrit.

Nos résultats ont également montré une baisse de la richesse après l‘ajout du

phénanthrène dans les différentes cultures, correspondant à l‘effet classique des hydrocarbures

sur les communautés bactériennes marines (Fig. 30).

Figure 30 : Evolution des profils CE-SSCP dans les différentes dilutions successives, avant et après ajout

de phénanthrène. En rouge, sont représentés les nombres de ribotypes détectés dans chaque profil. Ce

nombre diminue au cours de dilutions et diminue encore dans chaque dilution après ajout de

phénanthrène.

Malheureusement, le dosage du phénanthrène pour l‘estimation de l‘activité de

biodégradation de ce composé n‘a pu être réalisé correctement et n‘a pas permis de conclure

sur l‘effet de la diminution de la richesse sur la dégradation des hydrocarbures. Néanmoins,

l‘expérience de dilution envisagée ici présente un certain nombre de résultats encourageants.

Au-delà de son originalité, la technique de dilution/extinction semble être appropriée pour

reconstituer artificiellement un gradient de richesse bactérienne, même si certaines

améliorations dans le protocole expérimental doivent encore être apportées. Ces résultats


montrent pour l‘instant que les activités testées sont sensibles à cette diminution de richesse.

Plusieurs perspectives à ce travail sont donc envisagées. Il faudra tout d‘abord répéter cette

expérience pour estimer la reproductibilité des résultats obtenus en effectuant une analyse

plus poussée de la diversité bactérienne à l‘aide de la technique de pyroséquençage et bien sûr

doser l‘activité de dégradation du phénanthrène qui a fait défaut dans nos tests préliminaires.

En cas de résultat positif, l‘expérience pourrait être réalisée à partir de communautés

naturelles provenant d‘autres environnements, y compris des environnements chroniquement

pollués. Des résultats différents en terme de lien entre « diversité » et « fonction » pourraient,

en effet, être trouvés tel que nous avons pu le mesurer dans le chapitre 3 de ce manuscrit.

2. Comment améliorer la bioremédiation des hydrocarbures ?

A la fois par le passé et dans l‘étude présentée dans ce manuscrit, il a été montré que les

communautés bactériennes naturelles étaient souvent limitées par les ressources en nutriments

inorganiques. Une des méthodes actuellement privilégiée pour la remédiation des

hydrocarbures est la biostimulation des communautés bactériennes autochtones par l‘ajout de

sels nutritifs. Au cours de notre étude en microcosmes, nous avons pu voir que la

biostimulation permettait à certains groupes bactériens d‘être plus actifs, qu‘elle permettait

d‘augmenter l‘abondance bactérienne et que la dégradation des hydrocarbures en était

accélérée (Chapitre 3). Cette étude a également révélé que la biostimulation n‘affranchissait

pas seulement les bactéries de la limitation par les ressources nutritives mais induisait

également des changements de structure de communauté. Cette observation vient renforcer

l‘hypothèse que l‘ajout de sels nutritifs stimule certains groupes bactériens et pas d‘autres en

fonction de leur besoins métaboliques respectifs. Cet effet variable de la biostimulation sur les

différents groupes bactériens aurait pour effet de rendre plus compétitifs les groupes

initialement limités par les ressources inorganiques, phénomène qui serait à l‘origine des

changements de structure de communauté. Ce constat soulève notre difficulté à prédire les

effets de la biostimulation sur les assemblages bactériens, le problème de la reproductibilité

dans les résultats et donc l‘efficacité et la fiabilité de la méthode. Cette contrainte est d‘autant

plus valable dans le cas des biostimulants/bioemulsifiants car leurs effets sur les

communautés bactériennes semblent encore plus difficiles à prévoir en raison de la diversité

et de la complexité des molécules employées. Dans notre étude, le biostimulant utilisé a eu à

peu près les mêmes effets sur les communautés bactériennes et la dégradation des

hydrocarbures que les nutriments inorganiques. Toutefois, ce résultat n‘empêche pas que le

phénomène de stimulation des bactéries par ajout de biostimulant fasse intervenir des

mécanismes tout autres que dans le cas des nutriments. Comme cela a été évoqué en

introduction, il est probable que ce type de molécules organiques composées de carbone,

d‘azote et de phosphore offrent aux bactéries des sources de nutriments facilement

dégradables, induisant chez elles un regain d‘activité et par voie de conséquence une

meilleure dégradation des hydrocarbures. Mais ce « priming effect » n‘est encore qu‘à l‘état

d‘hypothèse. En raison de notre manque de connaissances sur le sujet, la méthode de

biostimulation par les nutriments inorganiques d‘abord mais surtout par les molécules

organiques complexes comme les biostimulants/bioémulsifiants souffre de son manque de

reproductibilité dans les résultats et son manque de spécificité pour chaque environnement

pollué.

Pour trouver des solutions à cette contrainte, plusieurs pistes sont envisageables. D‘abord,

une étude plus approfondie des communautés bactériennes biostimulées devrait permettre de

mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans la stimulation de certains groupes

bactériens, paramètre qui fait cruellement défaut dans les nombreuses études qui se sont

penchées sur cette question. Il s‘agirait d‘identifier clairement les espèces bactériennes

répondant favorablement à l‘ajout de nutriments et celles qui sont insensibles à ce type de

traitement.

Ensuite, il a été remarqué que lors de catastrophes pétrolières comme celle de l‘Exxon

Valdez, les produits employés pour la biostimulation sont généralement des mélanges de

molécules (ex : Inipol EAP22) qui en raison de leur complexité peuvent présenter des niveaux

d‘efficacité variables. Une des raisons pouvant expliquer cela est le manque de connaissances

de leur impact sur les communautés bactériennes elles-mêmes. Si leur effet sur la

biodégradation est largement testé, leur impact, en terme de toxicité notamment, sur les

microorganismes est largement ignoré. Des expériences intégrées (suivi de l‘abondance, de la

diversité et de l‘activité bactérienne) avec ce type de produits commerciaux devraient être

testées pour un meilleur emploi dans les stratégies de biostimulation.

Enfin, il existe généralement un paradoxe entre les essais de biostimulation et le processus

de biodégradation. Comme cela a été souligné en introduction, la biodégradation des

hydrocarbures est un processus qui peut être long et qui se fait en plusieurs étapes selon

l‘alternance de différents groupes bactériens possédant des métabolismes variables. Or la

plupart du temps, la biostimulation se fait selon un ajout unique d‘une grande quantité de

nutriments et/ou bioémulsifiants juste après le déversement de pétrole. Cette méthode soulève

deux problèmes. Tout d‘abord, par notre manque de connaissance sur les doses de nutriments

à appliquer, un tel ajout pourrait dans certain cas induire le développement excessif du


phytoplancton et conduire à une eutrophisation du milieu. D‘autre part, il est probable que la

biostimulation profite aux bactéries initialement sélectionnées par les hydrocarbures, que les

sels nutritifs s‘épuisent rapidement et que finalement la biostimulation n‘ait qu‘un effet

temporaire et ne favorise la biodégradation que des composés les plus facilement dégradables.

Il serait donc intéressant de tester les effets de la biostimulation par ajouts successifs de

quantités de nutriments adaptées aux besoins de la communauté bactérienne

hydrocarbonoclaste. Comme cela a été fait dans l‘expérience en mésocosmes présentée dans

le chapitre 4, il s‘agirait de doser à intervalle réguliers les quantités d‘azote et de phosphore

contenues dans le milieu et d‘ajuster leurs concentrations à des niveaux optimaux.

3. Quel est l‘impact du « top-down » sur la biodégradation des hydrocarbures et sa

relation avec le contrôle de type « bottom-up » ?

Une des originalités de ce travail de thèse a été d‘étudier l‘impact des facteurs de type

« top-down » sur les communautés bactériennes marines impliquées dans la dégradation des

hydrocarbures, une question très peu abordée dans la littérature. Notre étude a révélé que la

prédation par les protozoaires et la lyse virale jouaient un rôle important dans la structuration,

l‘abondance et l‘activité des communautés bactériennes impactées par le pétrole. Dans nos

conditions, les virus étaient largement responsables de cet effet « top-down », suggérant qu‘ils

étaient davantage capables de résister aux effets toxiques du pétrole que les protozoaires. Un

tel effet des virus sur les bactéries aurait pu être un frein à la biodégradation des

hydrocarbures. Au contraire, les virus se sont révélés être à l‘origine d‘un renouvellement

dans la communauté bactérienne et d‘une stimulation de son activité. Cela a permis une

dégradation constante des hydrocarbures indépendamment des variations importantes

d‘abondance bactérienne. Ce premier résultat devra être répété par d‘autres études similaires.

Dans notre expérience, compte tenu du manque d‘informations sur le sujet, nous avions

choisi d‘évaluer l‘effet du « top-down » seul, sans interférence avec les autres paramètres sur

les bactéries de manière à le caractériser plus facilement. Toutefois, dans l‘environnement, les

communautés bactériennes sont influencées par une multitude de paramètres qui agissent tour

à tour ou simultanément et la prédation par les protozoaires ou la lyse virale font partie

intégrante de ce jeu de facteurs environnementaux (voir chapitre 1). Dans les stratégies de

bioremédiation, ces facteurs ne peuvent pas être considérés séparément. Une des principales

interactions à appréhender serait d‘évaluer la part relative du contrôle des communautés

bactériennes par le « top-down » et le « bottom-up ». En effet, dans la mesure où les virus

sont capables de diminuer drastiquement l‘abondance bactérienne, induire des

bouleversements dans la structure des communautés et stimuler l‘activité des bactéries, la

réussite des essais de biostimulation pourrait largement dépendre de ce paramètre. Quelques

éléments de réponse ont été apportés dans l‘étude en microcosme présentée dans le chapitre 3.

Dans cette étude, la biostimulation a d‘abord permis une meilleure dégradation des

hydrocarbures par rapport à la condition sans ajouts d‘agents stimulants. Ensuite, bien que les

protozoaires aient limité l‘abondance bactérienne, aucun changement de structure de

communauté dans les microcosmes enrichis en sels nutritifs ou bioémulsifiant n‘a pu être

attribué à la prédation. Par contre, une légère baisse dans la dégradation des hydrocarbures a

été relevée lorsque l‘abondance des prédateurs était maximale, révélant l‘impact

potentiellement négatif du « top-down » dans les essais de biostimulation.

Pour évaluer concrètement quel est l‘effet de la prédation et de la lyse virale dans

l‘efficacité de la biostimulation sur la dégradation des hydrocarbures il faudrait mettre en

place une expérience en condition contrôlée en testant différentes combinaisons de conditions

par élimination des protozoaires et virus (utilisation de sacs à dialyse permettant d‘éliminer

tour à tour les microorganismes indésirables selon un système de filtration différenciel) et

ajout de sels nutritifs ou d‘autres molécules biostimulantes. Voici une combinaison qui

pourrait être réalisée sur des microcosmes de volume moyen (environ 50L). L‘expérience

consisterait à comparer des conditions avec l‘effet du « top-down » seul, l‘effet du « bottom-

up » seul, les deux ou aucun, avec ou sans pétrole (Tableau 11).

Microcosmes contrôles Microcosmes pollués par le pétrole Témoin abiotique

Eau de mer pré-filtrée sur 10µm Oui Oui Oui mais stérile

Pétrole Non Oui

Protozoaires et virus Non Oui Non Oui Non Oui Non Oui Stérile

Sels nutritifs ou bioémulsifiant Non Non Oui Oui Non Non Oui Oui Stérile

Tableau 11 : Conditions proposées pour la mise en place d’une expérience visant à tester l’impact du

« top-down » sur l’efficacité des approches de biostimulation.

Le protocole général serait du même type que celui qui a été mis en place dans l‘expérience

du chapitre 4 (mésocosmes). Il s‘agirait de suivre l‘évolution de l‘abondance bactérienne au

cours de l‘incubation, les changements de structure de communauté au moins, la diversité

bactérienne par pyroséquençage, éventuellement l‘activité bactérienne par mesure de

production bactérienne, et surtout doser les hydrocarbures pour suivre la biodégradation en

relation avec le dynamisme des différents compartiments microbiens. De cette façon, il serait


possible de savoir si l‘efficacité de la biostimulation dépend en partie des effets du « top-

down » sur les bactéries, encore une fois dans le but de comprendre et d‘améliorer les

stratégies de bioremédiation. Des analyses multivariées directes permettraient de valider

statistiquement les hypothèses proposées dans ce type d‘étude, en appliquant la notion de

partition de la variance des analyses canoniques de correspondance (CCA variation

partitioning) pour les facteurs « bottom-up » et « top-down ».

4. Comment caractériser les assemblages microbiens impliqués dans la dégradation du

pétrole ?

Comme alternative à la culture, nous avons vu qu‘il était possible de réaliser des

expériences de Stable Isotope Probing couplées aux nouvelles méthodes de séquençage pour

identifier les bactéries hydrocarbonoclastes marines. L‘adaptation de cette technique au milieu

liquide, telle qu‘elle a été présentée dans le chapitre 5 ouvre la porte à de nombreuses

applications.

Nous avons par exemple souligné la pertinence de la prise en compte du contrôle de type

« top-down » tout au long de ce manuscrit. Le DNA-SIP pourrait être un outil extrêmement

utile dans cette recherche. Comme cela a été fait avec des cyanobactéries (Frias-Lopez et al.

2008), il serait possible d‘incuber de l‘eau de mer contenant bactéries, protozoaires et virus

avec un hydrocarbure marqué au carbone 13. Les bactéries incorporeraient l‘isotope stable,

les protozoaires et les virus se « nourriraient » de ces bactéries marquées et seraient à leur tour

enrichis en 13

C. L‘analyse simultanée de la diversité bactérienne (gène de l‘ARNr 16S), de

celle des protozoaires (gène de l‘ARNr 18S) et de celle des virus (gènes de polymérases)

révélerait à la fois la diversité des bactéries hydrocarbonoclastes (spécifiques du substrat

utilisé) mais aussi l‘identité des prédateurs de ces bactéries. Par comparaison avec les

protozoaires et virus non marqués, il serait possible de savoir si les prédateurs sont

spécifiques de leur proie ou non.

Une deuxième application possible serait la recherche de bio-indicateurs de pollution

pétrolière en utilisant un jeu d‘amorces spécifiques des bactéries retrouvées dans la fraction

enrichie en 13

C. Le DNA-SIP donne accès à un grand nombre de séquences de bactéries

hydrocarbonoclastes en une seule analyse. Or la création d‘amorces spécifiques se heurte

toujours au problème de limitation en séquences disponibles. Même en prenant les séquences

des bactéries hydrocarbonoclastes cultivables et des séquences environnementales provenant

de milieux pollués, le nombre de séquences reste limité, comme on l‘a vu dans l‘emploi de la

q-PCR dans l‘étude in situ (chapitre 2). Se pose alors le problème de la trop grande spécificité

des amorces dessinées ou alors de leur manque de spécificité en raison de la difficulté à

identifier les bactéries hydrocarbonoclastes dans l‘environnement. Le DNA-SIP couplé au

pyroséquençage pourrait fournir rapidement un nombre très important de séquences

spécifiques de la fonction ciblée. La création d‘amorces en serait alors grandement facilitée. Il

faudrait tester des amorces ciblant une région du gène de l‘ARNr 16S propre à certaines

bactéries hydrocarbonoclastes, sans garantie que cela puisse fonctionner, ou des amorces

spécifiques de gènes de dégradation des hydrocarbures, approches qui auraient certainement

plus de succès.

Enfin, une perspective particulièrement prometteuse consisterait à coupler le DNA-SIP à la

métagénomique pour l‘étude des communautés bactériennes hydrocarbonoclastes. La

métagénomique a déjà révélé l‘immense diversité génétique des communautés microbiennes

complexes en milieu marin (Venter et al. 2004). Néanmoins, avec l‘approche de séquençage

à haut débit (« shotgun »), il n‘est pas toujours possible de relier les gènes aux

microorganismes identifiés taxonomiquement en raison de la complexité des assemblages et

le manque de génomes existants comme base pour l‘assemblage des contigs. Dans une

expérience de DNA-SIP, les métagénomes enrichis en isotope lourd seraient présélectionnés

pour une fonction particulière. Ainsi les gènes d‘intérêt pourraient être récupérés à partir de

bibliothèques métagénomiques réduites, ce qui augmenterait considérablement la possibilité

de relier l‘information génétique à des espèces microbiennes distinctes. Une telle approche a

déjà été tentée avec succès pour l‘étude des bactéries dégradant les PCB (Sul et al. 2009). Les

auteurs ont réussi à construire une banque de 1568 cosmides à partir de la fraction ADN

enrichie en 13

C. Cette banque a permis de découvrir des gènes fonctionnels provenant de

microorganismes capables de métaboliser les PCB non cultivés à ce jour. Le couplage des

approches de métagénomique avec la méthode du DNA-SIP permettrait d‘accéder à une

meilleure caractérisation des bactéries hydrocarbonoclastes au sein des communautés

naturelles et de découvrir de nouvelles voies métaboliques pour la dégradation des

hydrocarbures.

249 GLOSSAIRE

GLOSSAIRE

Allochtone : Se dit d‘une ressource qui provient de l‘extérieur du milieu étudié.

Bioaugmentation : addition de microorganismes dans des sites pollués pour favoriser

l‘élimination des composés toxiques.

Biodégradation : dégradation partielle ou totale d‘une molécule sous l‘action

biologique d‘organismes tels que les bactéries.

Bioremédiation : Utilisation d‘organismes comme les plantes ou les bactéries pour

faciliter l‘élimination des substances toxiques dans les environnements pollués.

Biostimulation : addition de sels nutritifs ou agents capable de stimuler l‘activité

bactérienne dans des sites pollués pour favoriser l‘élimination des composés toxiques.

Chao 1 : Test statistique non-paramétrique qui permet d‘obtenir la richesse en espèces

d‘un environnement.

Diversité : Distribution des individus ou biomasses selon des espèces définies à un

moment donné, dans un écosystème donné.

Dynamique de communauté : Variations de taille et de composition des

communautés qui résulte de l‘effet de plusieurs forces (comme les changements de

climat, les ressources en sels nutritifs, la prédation, etc…) capables de contrôler et

réguler les communautés durablement.

Ecotoxicologie : branche de la toxicologie qui étudie les effets toxiques provoqués par

les substances naturelles ou les polluants d‘origine synthétique sur les constituants des

écosystèmes animaux, y compris l‘homme, végétaux et micro-organismes, dans un

contexte intégré (Truhaut, 1977).

Equitabilité (Eveness) : composante de la diversité qui considère la distribution des

espèces dans un échantillon.

Hydrocarbonoclaste : adjectif faisant référence à certains organismes tels que les

bactéries pouvant dégrader les hydrocarbures.

Hydrocarbures : Composés organiques comprenant uniquement des atomes

d‘hydrogène et de carbone.

Kérogène : substance intermédiaire entre la matière organique et

les combustibles fossiles ; à ne pas confondre avec le Kérosène qui est un mélange

d'hydrocarbures contenant des alcanes de formule chimique allant de 10 à 14 atomes

de carbone et issu du raffinage du pétrole.

Microcosme/mésocosme : Système d‘incubation en laboratoire plus ou moins

complexe, construit pour simuler les conditions environnementales.

Minéralisation : transformation des composés organiques en formes inorganiques

(minéraux), le plus souvent sous forme de dioxyde de carbone, ammoniac et acide

phosphorique.

Operational Taxonomic Unit (OTU) : désigne des taxa partageant des caractères

(morphologiques, génétique,…) communs.

Pétrole : huile naturelle, généralement de densité inférieure à 1, composée de milliers

de composés essentiellement de type hydrocarbures. Sa provenance et son degré de

raffinage déterminent sa composition, sa couleur (du noir goudronneux au transparent)

et son utilisation.

Pollution : dégradation de l‘environnement par des substances naturelles, chimiques

ou radioactives, des déchets, ou des nuisances diverses (biologiques, lumineuses,

thermiques, sonores, etc.). Bien qu‘elle puisse avoir une origine entièrement naturelle

(éruption volcanique, par exemple), elle est principalement liée aux activités

humaines.

Prédation : mode de nutrition qui consiste à s‘emparer d‘une proie animale ou

végétale pour l‘ingérer et se nourrir de sa substance.

Phénanthrène : hydrocarbure aromatique polycyclique composé de trois cycles

benzéniques, relativement soluble dans l‘eau et biodégradable, que l‘on trouve dans le

pétrole brut. Le phénanthrène peut prendre plusieurs formes selon son degré de

substitution par des groupes alkyles.

Polluant : substance en quantité anormale dans l‘environnement, la plus part du temps

issue de l‘activité humaine, à l‘origine de la dégradation de l‘air, de l‘eau ou de la

terre, généralement toxique pour la faune et/ou la flore.

Richesse : composante de la diversité qui considère le nombre total d‘espèces

présentes dans un échantillon.

Surfactant : Agent tensio-actif permettant de réduire la tension de surface entre deux

liquides comme par exemple un émulsifiant favorisant le mélange pétrole-eau.

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283 ANNEXE

ANNEXE

Activité d’enseignement

2009 et 2010 : Participation à des enseignements du MASTER des sciences et technologies de

l‘UPMC.

Unité d‘enseignement FLUMECO : Fonctionnement des écosystèmes côtiers Méditerranéens

(Master 2, spécialité OEM) proposé à l‘Observatoire Océanographique de Banyuls.

6h de conférence, 60h de TP/TD sur le thème de l‘impact des hydrocarbures pétroliers sur les

communautés bactériennes marines.

Missions scientifiques

1. JEST: 15 jours : Lagune de Terminos (Mexique)

Projet: Joint Environmental Study of Terminos lagoon: Cycles hydro-biogéochimiques,

transferts et impacts écotoxicologiques

Responsable du projet: Christian GRENZ, CNRS, IRD, Mexico

2. IBISCUS: 2 fois 15 jours: Baie de Marseille (France)

Projet : Indicateurs biologiques et chimiques de contaminations urbaines en milieu marin.

Responsable du projet : Madeleine GOUTX, CNRS, Marseille

3. CASCADE: 3 semaines sur le N/O Atalante : Golfe du Lion (France)

Projet: Cascading, Storm, Convection, Advection, and Down-welling Events

Responsable du projet : Xavier Durrieu de Madron, CNRS-UPVD, Perpignan

Communications scientifiques, congrès et séminaires

1. Congrès de l‘Association francophone d‘écologie microbienne (AFEM). Lyon,

France, 2009.

Poster : Influence de la récurrence des pollutions sur la réponse des communautés

bactériennes et nanoeucaryotes marines au pétrole et à la biostimulation.

2. Doctoriales organisées par l‘UPMC en partenariat avec le CEA. Gig-sur-Yvette,

France, 2009.

Les Doctoriales consistent à découvrir par la pratique les enjeux de l‘innovation et de la

création d‘entreprise. Durant 5 jours en séminaire résidentiel, 60 doctorants de tout horizon

disciplinaire, répartis en groupes, développent une « idée innovante » en la transformant en un

projet de création d‘entreprise. À la fin du séminaire, chaque groupe présente son projet

devant un jury de professionnels de l‘innovation et de l‘entreprise.

3. Congrès Biomicroworld. Lisbonne, Portugal, 2009.

Communication orale: Influence of predation by flagellates on the bacterial response to crude

oil input in unpolluted oligotrophic and chronically oil-polluted mesotrophic Mediterranean

sites.

4. Rencontres exobiologiques pour doctorants (RED‘10). Teich, France, 2010.

Ces rencontres s'adressent à tout étudiant français ou francophone préparant une thèse en

Sciences de la Terre et de l'Univers, Sciences Chimiques, Sciences de la Vie, Bioinformatique

ou Épistemologie, et désirant acquérir une formation interdisciplinaire en exobiologie afin de

compléter sa formation initiale et de pouvoir aborder les questions touchant aux origines de la

vie sur Terre, à son évolution et à sa distribution dans l‘Univers.

5. Congrès FEMS microbiology. Genève, Suisse, 2011.

Poster: Underestimated role of flagellates and viruses predation (top-down control) on oil-

degrading bacterial communities under biostimulation conditions

285 ANNEXE

Poster AFEM (2009)

Poster FEMS (2011)

287 ANNEXE

Titre : Ecologie des communautés bactériennes marines soumises à une pollution pétrolière:

influence des facteurs environnementaux, de la prédation et de la récurrence des pollutions.

Résumé : Les catastrophes pétrolières, comme celle survenue récemment dans le Golfe du

Mexique, marquent invariablement l‘attention du public. Malgré les réglementations

gouvernementales instaurées à la suite de ces accidents, plusieurs centaines de millions de tonnes

de pétrole continuent d‘être déversées chaque année dans les Océans de manière volontaire ou

accidentelle, présentant des risques majeurs pour la santé humaine et l‘environnement. Parmi les

méthodes employées pour la remédiation des hydrocarbures, la biostimulation des bactéries

hydrocarbonoclastes par ajout de nutriments est une approche privilégiée. La réussite de cette

méthode nécessite une connaissance la plus complète possible des microorganismes en jeu et des

facteurs environnementaux qui les influencent. Dans ces travaux de thèse, nous avons tout

d‘abord évalué in situ l‘importance relative du pétrole parmi d‘autres facteurs physico-chimiques

sur la structuration des communautés bactériennes totales et actives ainsi que sur l‘abondance des

bactéries hydrocarbonoclastes en milieu portuaire chroniquement soumis à des pollutions

pétrolières. Dans un second temps, une étude en conditions contrôlées simulant une pollution

accidentelle nous a permis de démontrer que les caractéristiques d‘un site, précédemment soumis

ou non à une pollution chronique, ont une influence directe sur la cinétique de réponse des

communautés bactériennes et leur capacité à dégrader un pétrole complexe en condition de

biostimulation. Une attention particulière a également été portée sur l‘effet des facteurs de

régulation des communautés bactériennes de type « top-down » (prédation par les protozoaires et

lyse virale) sur la biodégradation des hydrocarbures, révélant notamment un rôle prépondérant des

virus dans le contrôle des communautés bactériennes impactées par le pétrole. Enfin, l‘adaptation

au milieu marin d‘une méthode récente de marquage des ADN par isotopes stables (DNA-Stable

Isotope Probing) couplée au pyroséquençage nous a permis de décrire précisément la diversité des

bactéries associées à la dégradation du phénanthrène, révélant la dominance de Cycloclasticus sp.

dans les sites étudiés.

Mots clés : Diversité bactérienne, pétrole, biostimulation, prédation, lyse virale, DNA-SIP

Title: Ecology of oil-impacted marine bacterial communities: influence of environmental factors, predation and recurrence of oil pollution.

Abstract: Oil spills such as the recent disaster in the Gulf of Mexico are always dramatic for the

public opinion. Despite governmental rules, hundreds of millions tons of petroleum enter

voluntary or accidentally the oceans every year, causing major risks for human safety and

environment. Among the techniques available for the remediation of the pollution, biostimulation

of hydrocarbonoclastic bacteria by nutrient addition is a privileged approach. The success of this

method requires a complete knowledge of the microorganisms involved and of the environmental

factors controlling them. In the present work, we first evaluated in situ the relative importance of

petroleum among other physico-chemical parameters in the total and active bacterial community

structure and on the abundance of hydrocarbonoclastic bacteria in chronically polluted coastal

seawaters. Second, we simulated an oil spill under controlled laboratory condition revealing that

the recurrence of oil pollution had an effect on the kinetic of bacterial response to the oil input and

on the biodegradation processes under biostimulation conditions. A particular attention was paid

on the ―top-down‖ effect (protozoan predation and viral lysis) on hydrocarbon biodegradation,

revealing the dominance of viruses in the control of oil impacted bacterial communities. Finally,

the adaptation of the DNA-Stable Isotope Probing method for marine systems coupled with

massive parallel pyrosequencing allowed us to describe precisely the bacterial diversity associated

with phenanthrene biodegradation, revealing the prevalence of Cycloclasticus sp. in our studied

sites.

Keywords: Bacterial diversity, petroleum, biostimulation, predation, viral lysis, DNA-SIP

Caroline SAURET - obs-banyuls.fr

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